CN111183230A - 方法和装置 - Google Patents

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Abstract

确定样品中的阈值浓度的白细胞的存在的方法，所述方法包括(i)使所述样品与包含(a1)指示剂化合物的白细胞检测剂接触；和(ii)检查所述白细胞检测剂以确定是否存在白细胞。

Description

方法和装置
本发明涉及用于检测白细胞和优选还有微生物、例如细菌的方法和装置。增加的白细胞浓度可以与感染且特别是与腹膜炎相关。
升高的白细胞水平(白细胞增多)是炎性应答的体征。增加的白细胞经常指示感染，但也可由于非感染性疾病、损伤、肿瘤或药物的副作用而发生。
因此，在许多情况下，提供升高的白细胞水平的早期指示的简单检测将非常有益。早期检测可以帮助诊断并导致更快的治疗和更好的患者结果。
具体而言，升高的白细胞水平可以指示微生物感染。
感染的快速、可靠和准确的检测是治疗和预防感染两者的至关重要的部分，且特别是在治疗和预防经历腹膜透析的患者的感染中。
能够检测患有肾衰竭的患者中的感染是特别重要的。具有晚期慢性肾衰竭的患者可以通过接受两种形式的肾替代疗法(RRT)(即：腹膜透析(PD)和血液透析(HD))来治疗。
HD是英国和许多其他国家中最常用的RRT，尽管事实上PD既对患者来说更方便(它可以在家中进行并为患者给予最大的自由和灵活性)且又需要更少的就医次数且更不昂贵。然而，PD比HD具有更大的严重感染的风险，并且经常到感染变得明显时，它可以是威胁生命的。
目前，患者依赖于疼痛和发热的非特异性症状，和/或注意到他们的透析流出物是混浊的，以提醒他们感染。PD患者通常被指示在其PD流出物袋后面夹持一页文本(报纸等)，并且如果文本被遮蔽(即，被变得混浊的流出物遮蔽)，则建议他们联系他们的临床医生。这种方法的问题是评估有点主观。此外，当感染最初发展时，PD流体可能是透明的，并且情况经常是这样的，到观察到混浊时，感染可能是充分发展的并且已经变成对健康的严重风险。
本发明的目的是提供装置和方法，其可用于清楚地提醒用户，并且在较早阶段，提醒用户样品中存在高水平的白细胞。
根据本发明的第一方面，提供了确定样品中的阈值浓度的白细胞的存在的方法，所述方法包括(i)使所述样品与包含(a1)指示剂化合物的白细胞检测剂(detectionmeans)接触；和(ii)检查所述白细胞检测剂。
本发明涉及确定样品中的白细胞的存在的方法。所述样品可以是其中可以存在此类细胞的任何材料。合适地，所述样品是体液的样品。优选地，所述样品选自血液或其组分、粘液、唾液、尿液、脓液、痰、伤口渗出液、胸膜流体和来自腹膜腔的流体。
优选地，所述样品选自血液或其组分、粘液、唾液、尿液、脓液、痰、伤口渗出液、胸膜流体和腹膜透析流出物。
在一些优选实施方案中，所述样品包含来自腹膜腔的流体。来自腹膜腔的流体可以包括来自腹膜透析的流体或由于医学病况或疾病而存在于腹部中的流体(腹水)。
由于许多医学病况或疾病(包括肝硬化、癌症、心脏衰竭、肺结核、胰腺炎和肝静脉的阻塞)，腹膜腔中可能产生流体(腹水)。
当腹膜腔中存在流体时，存在腹膜炎的风险，并且感染的早期检测对于能够有效地治疗这种感染是至关重要的。
合适地，所述样品选自腹膜透析流出物和由于腹水而存在的从腹膜腔排出的流体。
在尤其优选的实施方案中，所述样品是腹膜透析流出物。这在本文中可以被称为PD流出物或PD流体。
所述指示剂化合物(a1)可以是当存在阈值浓度的白细胞时经历可观察到的变化的任何化合物。
可观察到的变化可以是光吸收、沉淀物形成、气泡形成、温度变化或其他可测量的量中的变化。
优选地，可观察到的变化是颜色变化。合适地，所述指示剂化合物在阈值浓度的白细胞存在的情况下的颜色与当不存在白细胞或存在低浓度的白细胞时的颜色不同。在指示剂化合物与样品接触之前，其合适地具有起始颜色。如果样品中存在阈值浓度的白细胞，则指示剂化合物优选经历颜色变化。指示剂化合物可以从无色的变为有色的、从有色的变为无色的或从第一颜色变为与第一颜色不同的第二颜色。
技术人员将理解，颜色变化合适地归因于指示剂化合物的影响发色团区域的结构的变化。
优选地，所述指示剂在阈值浓度的白细胞存在的情况下从无色的变为有色的。
提及白细胞检测剂的“激活”或“触发”是指白细胞检测剂中的变化，合适地是指示阈值浓度的白细胞的存在的阳性结果。
技术人员将理解，阈值浓度将取决于所述白细胞检测剂的具体成分及其量。在配制所述白细胞检测剂时，技术人员将考虑这一点。
通过阈值浓度，我们意指当达到其时期望提供警告的白细胞的水平，即该水平高于预期/期望水平的指标。阈值浓度可以根据样品的性质、提供样品的个体以及为何监测白细胞水平的原因而不同。
优选地，所述指示剂化合物是颜色变化指示剂。优选地，所述指示剂化合物是氧化还原指示剂。
优选地，当达到测试流体(即，在混合样品和白细胞检测剂后获得的混合物)中白细胞的阈值浓度时，指示剂化合物(a1)经历颜色变化。
优选地，白细胞的阈值浓度为105个白细胞/mL测试流体。
105个白细胞/mL透析流体的浓度是用于诊断PD患者中的感染的国际公认标准。
根据国际腹膜透析学会(International Society for Peritoneal Dialysis)(ISPD)；具有超过100/μL的白血细胞(WBC)的流出物细胞计数(在至少2小时的停留时间后)指示存在炎症，其中腹膜炎是最可能的原因(Li等人，2010. Peritoneal Dialysis-related Infections Recommendations: 2010 Update, Peritoneal Dialysis International, 30: 393-423)。
用于白细胞检测剂中的合适的指示剂化合物包括结晶紫、石炭酸品红(Carbolfuchsine)、番红(Safronin)、苯胺黑、墨汁(Indian ink)、碘、齐尼二氏染剂(Ziehl-Neelsen)、苏木精(Haemotoxylin)、伊红Y/伊红淡黄色(Eosin yellowish)、Papanicolaou、橙黄G、亮绿SF淡黄色(Light green SF yellowish)、俾斯麦棕Y、尼罗蓝/尼罗蓝A、尼罗红/尼罗蓝噁嗪酮、Mason三色、Romanowsky、瑞氏染剂、詹纳氏染剂、利氏曼染剂、吉姆萨染剂、银、苏丹III、苏丹IV、油红O、苏丹黑B、Conklin、孔雀石绿、四氧化锇/四氧化物(Tetraoxide)、罗丹明、吖啶橙、洋红、考马斯蓝、DAPI、伊红B、溴化乙锭、酸性品红(Acidfuchsine)、Hoechst、亚甲基绿、亚甲基蓝、中性红/二苯乙烯红(Toluylene red)和HDTMA/CTAB。
可以使用的另外的指示剂的实例包括刃天青(例如，阿尔玛蓝(Alamar blue))和10-乙酰基-3,7-二羟基吩噁嗪(Amplex Red)。优选的是，所述指示剂由所检测的白细胞内源的酶激活，且更优选的是，所述指示剂通过细胞还原酶(例如NAD(P)H还原酶)的作用激活。
优选地，所述指示剂化合物是氧化还原指示剂。合适地，所述指示剂化合物通过样品中的细胞的活性被还原。
优选地，所述白细胞检测剂中使用的指示剂化合物是四唑鎓化合物。
用于所述白细胞检测剂中的优选指示剂化合物可包括，例如，XTT(2,3-双-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-2H-四唑鎓-5-甲酰苯胺)，MTS(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑鎓)，MTT(溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓)，或水溶性四唑鎓盐(WST)，诸如WST-1、WST-3、WST-4、WST-5、WST-7、WST-8、WST-9、WST-10或WST-11。或者，可以使用其他四唑鎓盐，包括氯化碘硝基四唑鎓(indonitrotetrazolium chloride)(INT)，硝基蓝四唑鎓(Nitrobluetetrazolium)(NBT)，四硝基蓝四唑鎓(Tetranitro blue tetrazolium)(TNBT)，硫代氨基甲酰基硝基蓝四唑鎓(TCNBT)，四唑鎓红(TR)，四唑鎓紫(TV)，氯化新四唑鎓(NTC)或氯化5-氰基-2,3-二甲苯基四唑鎓(CTC)。
在一个优选的实施方案中，所述指示剂化合物(a1)是MTT(溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓)。
在另一个优选的实施方案中，所述指示剂化合物(a)是WST-9。
所述指示剂化合物(a1)(合适地四唑鎓化合物，例如MTT或WST-9)优选以一定量提供，以提供以下测试流体中的最终浓度：至少10μg/mL流体，优选至少50μg/mL流体，更优选至少100μg/mL流体，例如至少190μg/ mL流体。
所述指示剂化合物(a1)(合适地四唑鎓化合物，例如MTT或WST-9)可以以这样的量提供：最多达1000μg/mL测试流体，合适地最多达750μg/mL流体，优选最多达600μg/mL，合适地最多达550μg/mL，优选最多达500μg/mL流体。
优选地，所述白细胞检测剂进一步包含(b)缓冲剂。
优选地，选择所述缓冲剂以将测试流体中的pH维持在4和8之间，优选在5和7之间，更优选在6和6.5之间。
可以使用能够将pH维持在该范围内的任何合适的缓冲剂。合适的缓冲剂将是本领域技术人员已知的，且包括，例如2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、2,2-双(羟基甲基)-2,2',2''-次氮基三乙醇(BIS-TRIS)、N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸(ADA)、哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸)(PIPES)、N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸(ACES)、3-吗啉代-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、1,3-双(三(羟基甲基)甲基氨基)丙烷(BIS-TRIS丙烷)、N,N-双(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、3-吗啉代丙-1-磺酸(MOPS)、2-[(2-羟基-1,1-双(羟基甲基)乙基)氨基]乙磺酸(TES)、4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸)(HEPES)、3-(N,N-双[2-羟基乙基]氨基)-2-羟基丙磺酸(DIPSO)、2-羟基-3-[三(羟基甲基)甲基氨基]-1-丙磺酸(TAPSO)、2-氨基-2-(羟基甲基)-1,3-丙二醇(TRIZMA)、哌嗪-N,N'-双(2-羟基丙磺酸)/哌嗪-1,4-双(2-羟基丙磺酸)二水合物-水合物(POPSO)、4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪丙磺酸(HEPPS)、N-[三(羟基甲基)甲基]甘氨酸(TRICINE)、二甘氨酸(GLY-GLY)、N,N-双(2-羟基乙基)甘氨酸(BICINE)、N-(2-羟基乙基)哌嗪-N'-(4-丁磺酸)(HEPBS)、N-[三(羟基甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸(TAPS)和2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇(AMPD)。
用于本文中的一种尤其优选的缓冲剂是MES(2-(N-吗啉代)-乙磺酸)。
在一些实施方案中，当报道剂中包括将促进氧化还原酶系统的活性的电子介质时，优化指示剂化合物的激活(例如，就激活阈值和颜色强度而言)。
在一些实施方案中，所述白细胞检测剂可进一步包含(c1)电子介质。
电子介质的实例是本领域中众所周知的。例如，Fultz和Durst (AnalyticaChimica Acta 140(1992)1-18)列出的电子介质。
合适的电子介质包括紫精(viologens)、phenzonium、吩噻嗪、naphithanes、吩嗪、靛蓝、吲达胺、靛酚、蒽醌、萘醌、苯醌和苯扎明(benzamines)。
优选地，所述电子介质选自甲萘醌或吩嗪电子介质。
合适的吩嗪电子介质包括N-甲基吩嗪甲硫酸盐(mPMS)、吩嗪甲硫酸盐(PMS)、吩嗪乙硫酸盐(phenazine ethosulphate)(PES)、绿脓菌素、番红O、番红T、酚番红、苯并吩嗪(benzophenazine)和中性红。
优选的电子介质是甲萘醌、吩嗪甲硫酸盐及其(PMS)衍生物(例如，吩嗪乙硫酸盐)。包含在白细胞检测剂中的一种尤其优选的电子介质是1-甲氧基-5-甲基吩嗪甲硫酸盐(mPMS)。
所述电子介质存在的量使得其在测试流体中的最终浓度大于0.001mM。例如，其可以在0.001– 0.1mM的范围内且更优选0.005 – 0.05mM的范围内存在。
在一些优选实施方案中，所述白细胞检测剂不包含电子介质。
在一些优选实施方案中，所述白细胞检测剂的确包含电子介质。
本发明的第一方面的方法的步骤(ii)涉及检查所述白细胞检测剂。合适地检查所述白细胞检测剂以确定是否存在白细胞。
技术人员将理解，该检查将是当白细胞检测剂已与样品接触时获得的所得组合物的检查，这在本文中可称为“测试的流体”。
优选地，步骤(ii)涉及当存在阈值浓度的白细胞时，注意到存在由于所述指示剂化合物而发生的可观察到的变化。优选地，可观察到的变化是颜色变化。
在一些实施方案中，步骤(ii)可以在步骤(i)之后立即进行。然而，在优选实施方案中，步骤(ii)在孵育时段之后进行。在孵育时段期间，白细胞的活性引起指示剂的可见变化，优选氧化还原指示剂的颜色变化。
本发明涉及确定样品、合适地来自腹膜腔的流体样品、优选PD流出物的样品中的阈值浓度的白细胞的存在的方法。
样品中的白细胞的存在经常是由于感染、例如微生物感染。在一些实施方案中，本发明的方法可以进一步涉及确定样品中的微生物的存在。
在本发明的第一方面的一些实施方案中，提供了分析样品以确定阈值浓度的白细胞的存在以及微生物的存在的方法，所述方法包括以下步骤：
(i) 使所述样品与以下接触
(I)白细胞检测剂，其包含：
(a1) 指示剂化合物；和
任选地
(b) 缓冲剂；和
(II) 第一报道剂，其包含：
(a2) 指示剂化合物；和
(d1) 支持或促进微生物生长的培养基和/或营养物；和
(ii) 检查所述白细胞检测剂和所述报道剂。
优选地，本发明涉及检测取自透析患者的样品中的白细胞和微生物的方法。优选地，所述样品包含腹膜透析流出物。
在一些实施方案中，本发明涉及分析样品的微生物的存在。
在整个本说明书中提及“微生物”，且该术语应理解为涵盖肉眼不可见的所有生命形式。因此，术语“微生物”可包括例如细菌、真菌、病毒、原生动物和藻类。优选的是，本发明可用于鉴定检测和/或定量选自细菌、真菌、原生动物和藻类的一种或多种微生物。优选的是，本发明用于检测细菌，且特别是致病性细菌。
本发明可用于检测革兰氏阳性细菌和/或革兰氏阴性细菌的存在。基于染色特征，将细菌分类为革兰氏阳性和革兰氏阴性生物。
通过“革兰氏阳性细菌”，我们意指具有厚肽聚糖细胞壁且没有外膜的细菌，其因此用结晶紫染色。在腹膜透析中，由革兰氏阳性细菌引起的感染经常指示皮肤共栖体对透析导管的污染。
通过“革兰氏阴性细菌”，我们意指具有内膜和外膜以及薄肽聚糖层的细菌。因此，这些细菌不能保留结晶紫染色剂。
最优选的是，本发明用于确定腹膜透析流出物是否被选自以下的一种或多种微生物污染：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(且特别是多耐药性(multiresistant)金黄色葡萄球菌-MRSA)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、缓症链球菌(Streptococcus mitis)、血链球菌(Streptococcus sanguis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、大肠杆菌(Escherichia coli)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、白色假丝酵母(Candida albicans)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、奇异变形菌(Proteus mirabilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)或革兰氏阴性杆菌。
本发明可涉及使所述样品与第一报道剂接触。通过“报道剂”，我们意指发挥功能以报道样品中的微生物的存在(或不存在)的组合物或其组分。
提及报道剂的“激活”或“触发”是指报道剂中的变化，合适地指示微生物的存在的阳性结果。
所述第一报道剂包含(a2)指示剂化合物。
所述指示剂化合物可以是当存在微生物时经历可观察到的变化的任何化合物。
可观察到的变化可以是光吸收、沉淀物形成、气泡形成、温度变化或其他可测量的量中的变化。
优选地，所述指示剂化合物(a2)是颜色变化指示剂。优选地，其为氧化还原指示剂。
合适的指示剂的实例包括结晶紫、石炭酸品红、番红精、苯胺黑、墨汁、碘、齐尼二氏染剂(Ziehl-Neelsen)、苏木精、伊红Y/伊红淡黄色、Papanicolaou、橙黄G、亮绿SF淡黄色、俾斯麦棕Y、尼罗蓝/尼罗蓝A、尼罗红/尼罗蓝噁嗪酮、Mason三色、Romanowsky、瑞氏染剂、詹纳氏染剂、利氏曼染剂、吉姆萨染剂、银、苏丹III、苏丹IV、油红O、苏丹黑B、Conklin、孔雀石绿、四氧化锇/四氧化物、罗丹明、吖啶橙、洋红、考马斯蓝、DAPI、伊红B、溴化乙锭、酸性品红、Hoechst、亚甲基绿、亚甲基蓝、中性红/二苯乙烯红(Toluylene red)和HDTMA/CTAB。
可以使用的另外的指示剂的实例包括刃天青(例如，阿尔玛蓝(Alamar blue))和10-乙酰基-3,7-二羟基吩噁嗪(Amplex Red)。优选的是，所述指示剂由所检测的微生物内源的酶激活，且更优选的是，所述指示剂通过细胞还原酶(例如NAD(P)H还原酶)的作用激活。
优选地，所述指示剂是氧化还原指示剂。
优选地，所述指示剂化合物是四唑鎓化合物。
合适的四唑鎓化合物包括MTT(溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓)；XTT(2,3-双-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-2H-四唑鎓-5-甲酰苯胺(carboxanilide))；MTS(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑鎓)；水溶性四唑鎓盐(WST)，诸如WST-1、WST-3、WST-4、WST-5、WST-7、WST-8、WST-9、WST-10或WST-11；氯化碘硝基四唑鎓(INT)；硝基蓝四唑鎓(NBT)；四硝基蓝四唑鎓(TNBT)；硫代氨基甲酰基硝基蓝四唑鎓(TCNBT)；四唑鎓红(TR)；四唑鎓紫(TV)和氯化新四唑鎓；和氯化5-氰基-2,3-二甲苯基四唑鎓(CTC)。
更优选地，所述指示剂化合物(a2)是水溶性四唑鎓盐。
合适地，所述水溶性四唑鎓盐(WST)选自WST-1、WST-3、WST-4、WST-5、WST-7、WST-8、WST-9、WST-10或WST-11。
最优选的是，所述指示剂化合物(a2)是WST-9或其衍生物。WST-9具有化学式：2-(4-硝基苯基)-5-苯基-3-[4-(4-磺基苯基偶氮)-2-磺基苯基] -2H-四唑鎓，一钠盐及化学结构：
Figure 246807DEST_PATH_IMAGE001
。
所述第一报道剂进一步包含(d1)支持或促进微生物生长的培养基和/或营养物。
所述报道剂中包括所述培养基和/或营养物以促进微生物生长或繁殖，使得所述报道剂可以通常通过指示剂化合物的颜色变化而被触发。
在开发工作期间，发明人发现许多因素可能潜在地导致指示剂化合物的降解或可能导致指示剂化合物的错误触发(即，在微生物不存在的情况下产生报道信号)。发明人发现，在根据本发明的装置的开发期间，支持或促进微生物生长的适当培养基和/或营养物的选择是显著的技术障碍。
优选地，选择所述培养基和/或营养物以：
(i) 在报道剂中维持活的微生物，并且在一些实施方案中支持或促进微生物生长和/或分裂；
(ii) 考虑是需要维持和检测窄谱还是广谱微生物；
(iii) 在阈值浓度的微生物不存在的情况下，不导致指示剂的错误触发；
(iv) 不降解或失活报道剂的任何组分。
报道剂中使用的培养基和/或营养物优选是培养基或液体培养基，当所述培养基或液体培养基与WST在37℃孵育过夜时，其不引起WST转化为甲䐶。或者，报道剂中使用的培养基和/或营养物优选是培养基或液体培养基，当所述培养基或液体培养基与WST在24℃孵育8至24小时时，其不引起WST转化为甲䐶。可以通过随着时间推移测量与WSTs混合的培养基溶液的光密度来测定WST向甲䐶的转化。
可根据本发明使用的培养基/营养物的实例包括Mueller Hinton、脑心浸液液体培养基(BHI)和Wilkins Chalgren培养基。优选地，所述培养基/营养物选自脑心浸液和Wilkins Chalgren培养基。最优选的是，Wilkins Chalgren培养基用于第一报道剂中。
在一些实施方案中，本发明的方法的步骤(i)可以进一步包括使样品与(III)第二报道剂接触，其中所述第二报道剂包含：
(a3) 指示剂化合物；
(d2) 支持或促进微生物生长的培养基和/或营养物；和
(e) 选择因子。
存在于第二报道剂中的指示剂化合物(a3)合适地选自关于第一报道剂定义的指示剂化合物。第二报道剂中使用的指示剂化合物可以与第一报道剂中使用的指示剂化合物相同，或者其可以是不同的。优选地，在第一报道剂和第二报道剂中使用相同的指示剂化合物。
优选地，第二报道剂中使用的指示剂化合物(a3)是氧化还原指示剂。优选地，所述指示剂化合物(a3)是水溶性四唑鎓盐。优选地，其选自WST-1、WST-3、WST-4、WST-5、WST-7、WST-8、WST-9、WST-10或WST-11。最优选地，存在于第二报道剂中的指示剂化合物(a3)是WST9。
第二报道剂(d2)中支持或促进微生物生长的培养基和/或营养物可以合适地选自关于第一报道剂定义的培养基和/或营养物。
第二报道剂中使用的培养基和/或营养物(d2)可以与第一报道剂中使用的那些相同或不同。
优选地，在第一报道剂和第二报道剂中使用相同的培养基和/或营养物。
第二报道剂中支持或促进微生物生长的培养基和/或营养物选自脑心浸液液体培养基和Wilkins Chalgren培养基。
所述第二报道剂进一步包含(e)选择因子。
通过“选择因子”，我们意指可以并入第二报道剂内的试剂，其将阻止某些微生物的复制、减少其生长或增加其死亡，并且将不影响其他微生物的生长或死亡速率。将理解的是，所述报道剂中应包括足够量的选择因子，其将防止对其敏感的微生物对装置的任何激活。
为了避免疑问，当我们提及第一和/或第二报道剂的激活时，我们意指所述指示剂化合物已经历可观察到的变化，合适地颜色变化。技术人员将理解，一旦达到微生物的阈值浓度，就将发生可观察到的变化。
技术人员将理解，阈值浓度将取决于所述报道剂的成分及其量。这些可以由技术人员适当时进行调整。
根据本发明的选择因子适合于允许当比较第一和第二报道剂的激活时区分不同类型的微生物。
在一个实施方案中，选择具有针对细菌的广谱活性、但相比于对其他类型的微生物对细菌具有选择性的选择因子。
在另一个实施方案中，所述选择因子可以是具有窄谱活性的试剂(例如仅具有针对有限数目的细菌物种的抗生素活性的试剂)。当在用户预期样品含有特定微生物的情况下设计装置时，此类窄谱选择因子作为选择因子是有用的。通过实例的方式，萘啶酮酸钠是用于针对假单胞菌属物种(Pseudomonas sp)的窄谱试剂。其可以用作经设计以鉴定是否存在假单胞菌属物种感染的装置中的第二通道中的选择因子(第一报道剂而不是第二报道剂的激活将指示这一点)。
在一个进一步实施方案中，所述选择因子阻止革兰氏阴性微生物的生长和/或代谢。根据该实施方案，第一和第二报道剂两者的激活将指示受试者感染革兰氏阳性微生物，因为第二通道中的选择因子未能阻止指示剂化合物的激活。如果仅第一报道剂(且不是第二报道剂)被激活，则用户将确定存在革兰氏阴性感染。多粘菌素B硫酸盐、庆大霉素或单环内酰胺化合物是主要用于革兰氏阴性感染的抗生素，并且其可以根据本发明的该实施方案使用。
革兰氏阳性微生物是腹膜炎发展中的常见问题。因此，根据本发明的一个优选实施方案，所述选择因子阻止革兰氏阳性微生物的生长和/或代谢。根据该实施方案，第一和第二报道剂两者的激活将指示受试者感染革兰氏阴性微生物，因为第二报道剂中的选择因子未能阻止指示剂化合物的可吸收变化。然而，如果仅第一报道剂(而不是第二报道剂)被激活，则用户将确定存在革兰氏阳性感染。
梭链孢酸(梭链孢酸(Fusidic acid))可用作确定是否存在革兰氏阳性感染的选择因子。其为主要针对革兰氏阳性细菌有效的抑菌抗生素。
抑制革兰氏阳性生物的生长的优选选择因子是万古霉素。
可能有用的其他合适的抗生素包括其他糖肽，例如替拉万星(telavancin)和替考拉宁(teichoplanin)；或脂肽，例如达托霉素。
在本发明的方法的步骤(i)中，使样品与(I)白细胞检测剂、任选地(II)第一报道剂和任选地(III)第二报道剂接触。
选择所述第一和第二报道剂中的指示剂化合物、培养基和/或营养物和选择因子(适当时)的量，以提供在将报道剂与样品混合后获得的所得组合物中的适当的最终浓度。在将样品与报道剂混合后获得的这些混合物在本文中可称为“测试的流体”。
所述第一和第二报道剂中的指示剂化合物的量将取决于提供它的容器的大小和其设计用于保留以用于测试的样品的体积。优选地，在报道剂中包含足够量的指示剂化合物，使得所测试的流体中指示剂化合物(优选WST-9)的最终浓度大于0.01mM，且更优选大于0.075mM。优选地，所述指示剂化合物以一定量提供，以提供0.075-1.5mM且更优选0.1-12.0mM的范围内的所得组合物中的最终浓度。
例如，WST-9可以以一定量使用，以提供0.075-1.5mM的范围内且更优选在0.1-12.0mM的范围内的最终浓度。报道剂中指示剂化合物(优选WST-9)的最优选浓度在0.2mM-6.0mM的范围内，且特别是约0.6mM(例如，0.6±1.0mM)。在最优选的浓度(0.6mM)，这等于在测试的流体中包含0.38mg/mL的WST-9。在一个优选实施方案中，所述报道剂在经设计以接收约16mL流体的通道中提供。因此，此类通道含有约6.04mg的WST-9。
优选地，支持或促进微生物生长的培养基和/或营养物以一定量存在，以提供在所测试的流体中1-50g/L的范围内、优选在2-40g/L的范围内的最终浓度。在一个实施方案中，可以在流体中存在约33g/L Wilkins Chalgren培养基(推荐的培养基浓度)。然而，在优选的实施方案中，可以使用约2-18g/L作为流体中的最终浓度(例如，6.6g/L)。通过实例的方式，经设计以接收16mL流体的通道将理想地含有约100-500mg的Wilkins Chalgren培养基。
发明人已经发现，1ng/mL和1mg/mL流体之间的浓度是测试流体中选择因子的合适最终浓度，例如0.1至100μg/mL流体。所需的选择因子(优选抗生素)的量将取决于化合物的性质及其功效。在其中所述选择因子是万古霉素的一个优选实施方案中，所述浓度优选为5和40μg/mL之间，例如约16μg/mL。通过实例的方式，经设计以接收16mL流体的通道将理想地含有约256μg万古霉素。
所述第一和第二报道剂组合物可任选地包含一种或多种另外的组分。
在一些优选实施方案中，所述第一报道剂包含电子介质。在一些优选实施方案中，所述第二报道剂包含电子介质。
合适的电子介质如关于白细胞检测剂所定义。
优选的电子介质包括甲萘醌和吩嗪电子介质。
优选地，所述第一报道剂的电子介质(c2)是甲萘醌或mPMS。
优选地，所述第二报道剂的电子介质(c3)是甲萘醌或mPMS。
在所述第一和/或第二报道剂中优选包含电子介质(优选mPMS)，使得在测试的流体中的其最终浓度大于0.001mM。例如，所述电子介质(优选mPMS)可以在0.001-0.1mM的范围内，且更优选在0.005-0.05mM的范围内用于所述第一和/或第二报道剂中。在一个实施方案中，经设计以接收16mL流体的通道将理想地含有约100至300μg的mPMS。
在本发明的方法的步骤(i)中，使所述样品与以下接触：
(I) 白细胞检测剂，其包含：
(a1) 指示剂化合物；和任选地
(b) 缓冲剂；和任选地
(II) 第一报道剂，其包含：
(a2) 指示剂化合物；和
(d1) 支持或促进微生物生长的培养基和/或营养物；和
任选地
(III) 第二报道剂，其包含：
(a3) 指示剂化合物；
(d2) 支持或促进微生物生长的培养基和/或营养物；和
(e) 选择因子。
在一些实施方案中，本发明的第一方面的第一步骤(i)涉及使所述样品与所述白细胞检测剂(I)和所述第一报道剂(II)接触。
在一些实施方案中，本发明的第一方面的第一步骤(i)涉及使所述样品与所述白细胞检测剂(I)和所述第二报道剂(III)接触。
在优选实施方案中，步骤(i)涉及使所述样品与所述白细胞检测剂(I)、所述第一报道剂(II)和所述第二报道剂(III)接触。
在本发明的方法的步骤(i)中，使所述样品优选地与以下接触：
(I) 白细胞检测剂，其包含
(a1) 指示剂化合物；和任选地
(b) 缓冲剂；
(II) 第一报道剂，其包含：
(a2) 指示剂化合物；
(d1) 支持或促进微生物生长的培养基和/或营养物；和
(c2) 电子介质；
(III) 第二报道剂，其包含：
(a3) 指示剂化合物；
(d2) 支持或促进微生物生长的培养基和/或营养物；
(e) 选择因子；和
(c3) 电子介质。
在一些优选的实施方案中，本发明提供了分析样品、优选地取自透析患者的样品中存在阈值浓度的白细胞和微生物的方法，所述方法包括以下步骤：
(i) 使所述样品与以下接触：
(I) 白细胞检测剂，其包含：
(a1) 指示剂化合物；和
(b) 缓冲剂；
(II) 第一报道剂，其包含：
(a2) 指示剂化合物；
(d1) 支持或促进微生物生长的培养基和/或营养物；和
(c2) 电子介质；和
(III) 第二报道剂，其包含：
(a3) 指示剂化合物；
(d2) 支持或促进微生物生长的培养基和/或营养物；
(e) 选择因子；和
(c3) 电子介质；和
(ii) 检查所述白细胞检测剂和所述报道剂。
本发明的第一方面的方法进一步包括检查白细胞检测剂和(当存在时)报道剂的步骤(ii)。合适地，进行该步骤以确定是否存在白细胞或微生物。
技术人员将理解，该检查将是当白细胞检测剂和报道剂已与样品接触时获得的所得组合物的检查。这在本文中也可称为“测试的流体”。
在一些实施方案中，步骤(ii)包括检查第一报道剂和白细胞检测剂。
最优选地，步骤(ii)涉及检查白细胞检测剂、第一报道剂和第二报道剂。
所述白细胞检测剂(I)和(当存在时)第一和/或第二报道剂(II)和(III)应暴露于样品持续一段时间并且在这样的条件下，其适合于便于、促进或引起存在于样品中的任何微生物和白细胞进入报道剂和白细胞检测剂。已经成功进入报道剂的微生物可以在支持或促进微生物生长的培养基和/或营养物中维持或繁殖。在此时，可以使试剂(I)、(II)和(III)与样品保持接触，以允许报道剂完成向用户报道微生物的存在所必需的任何反应。或者，在与样品一起孵育一段时间后，样品可以与白细胞检测剂和(当存在时)第一和第二报道剂分离，并且在检查所述报道剂和白细胞检测剂之前再孵育一段时间。
将理解的是，孵育的长度将取决于所测试的PD流体的性质以及还有孵育发生的温度。优选地，所述组合物应孵育至少2小时，且优选至少4小时。这种组合物通常可以孵育4-24小时，优选4-18小时，且更优选4-12小时。优选的孵育时间为4小时、6小时、8小时、10小时或12小时。
一种或多种组合物可以在环境室温孵育。在本发明的一个实施方案中，一种或多种组合物可以在20℃、30℃或更优选37℃孵育。在一个优选实施方案中，一种或多种组合物可以置于培养箱中或培养箱上，该培养箱将使一种或多种组合物维持在期望的孵育温度(例如，37℃)。
孵育合适地在30至39℃，优选约37℃的温度进行，优选持续4至10小时，优选8至12小时的时段。在一些实施方案中，该装置可以加工成形以适合于培养箱内。
优选地，在孵育后冷却组合物，例如冷却至约4℃。该冷却抑制微生物活性，且因此减少孵育后组合物的进一步激活。
优选地，步骤(ii)涉及检查白细胞检测剂的颜色，和当存在时，第一报道剂和/或第二报道剂的颜色。
在一些实施方案中，可以将白细胞检测剂和(当存在时)第一和/或第二报道剂的颜色与比色图表进行比较。当在一个或多个装置内提供第一和/或第二报道剂和/或白细胞检测剂时，比色图表可以形成所述一个或多个装置的一部分。
在优选的实施方案中，所述第二报道剂中的选择因子阻止革兰氏阳性微生物的生长，并允许该装置的用户区分革兰氏阳性和革兰氏阴性感染。第一和第二报道剂都不激活通知用户不存在样品(例如PD流出物)的微生物污染或样品(例如PD流出物)中微生物的滴度低于临床显著水平。此类水平将取决于特定的微生物，但对于PD流出物中通常发现的那些微生物，临床显著水平通常为104 cfu/mL、105 cfu/mL或以上。
所述第一报道剂的激活通知用户样品(例如PD流出物)被微生物污染。第一报道剂而不是第二报道剂的激活指示微生物污染是革兰氏阳性的，而第一和第二报道剂两者的激活指示微生物污染包括除了革兰氏阳性细菌以外的微生物(是否也存在革兰氏阳性微生物)。
所述白细胞检测剂的激活指示白细胞以高于阈值浓度的浓度存在，这指示感染。
在一些实施方案中，所述白细胞检测剂可包含阻止细菌的生长、代谢和/或增殖的抗细菌剂。可以使用在白细胞存在的情况下选择性抑制细菌的任何试剂。这可以帮助确保白细胞检测剂中存在的任何细菌不触发这些剂。
合适的抗细菌剂将是本领域技术人员已知的，且包括例如广谱抗生素。
合适的抗细菌剂的实例包括青霉素和青霉素组合，美洛培南，氯霉素，第二代和第三代头孢菌素，红霉素，第一代头孢菌素(即，头孢氨苄达托霉素糖肽，例如万古霉素)，环丙沙星和氨基糖苷类，例如庆大霉素。
在一个实施方案中，所述白细胞检测剂包含抗细菌剂美罗培南、环丙沙星和万古霉素。
这些将合适地以提供0.01-1 mg/mL的量包含。
在一些实施方案中，所述第一报道剂和/或第二报道剂可进一步包含白细胞抑制剂，其阻止白细胞的生长和/或增殖。可以使用在细菌存在的情况下选择性抑制白细胞的任何试剂。这可以帮助确保存在于第一或第二报道剂中的任何白细胞不触发这些剂。合适的白细胞抑制剂包括皂苷和表面活性剂。
合适的皂苷包括毛地黄皂苷。
合适的表面活性剂包括阴离子型、非离子型和两性表面活性剂。
合适的阴离子型表面活性剂包括烷基硫酸盐、烷基醚硫酸盐、脂肪酸盐、羧酸盐、烷基或芳基磺酸盐、羟乙基磺酸盐、烷基磷酸盐、磺基琥珀酸盐、牛磺酸盐、肌氨酸盐、磺基乙酸盐、乳酸盐、酰基氨基酸盐和膦酸盐。
合适的非离子型表面活性剂包括脂肪族醇、烷氧基化醇、烷氧基化酚、烷基胺氧化物、烷基膦氧化物、烷基亚砜、脱水山梨糖醇和蔗糖酯、烷基多葡糖苷和烷氧基化烷基多葡糖苷。
合适的两性表面活性剂包括烷基甜菜碱、烷基磺基甜菜碱和两性基乙酸盐(amphoacetates)。
优选的表面活性剂是阴离子型表面活性剂，尤其是硫酸盐化合物。
一种优选的白细胞抑制剂是十二烷基硫酸钠(或SDS)。
基于测试的流体的量，阴离子型表面活性剂可以合适地以0.001至5wt%、优选0.01至1wt%的量提供。
在一些优选的实施方案中，本发明提供了分析样品、优选地取自透析患者的PD流出物样品中存在阈值浓度的白细胞和微生物的方法，所述方法包括以下步骤：
(i) 使所述样品与以下接触：
(I) 白细胞检测剂，其包含：
(a1) 指示剂化合物；
(b) 缓冲剂；
(c1) 电子介质；和
(f) 抗细菌剂；
(II) 第一报道剂，其包含：
(a2)(a2) 指示剂化合物；
(d1) 支持或促进微生物生长的培养基和/或营养物；
(c2) 电子介质；
(g1) 白细胞抑制剂；和
(III) 第二报道剂，其包含：
(a3) 指示剂化合物；
(d2) 支持或促进微生物生长的培养基和/或营养物；
(e) 选择因子；
(c3) 电子介质；和
(g2) 白细胞抑制剂；和
(ii) 检查所述白细胞检测剂和所述报道剂。
当在该方法中使用时，组合物(I)和(II)和/或(III)可以在各个容器中分别提供。
当存在时，组合物(I)和(II)和/或(III)可以分别提供或者可以作为相同装置的一部分提供。
根据本发明的第二方面，提供了用于检测样品中的阈值浓度的白细胞的装置，所述装置包括经布置以接收所述样品的通道，其中所述通道含有包含(a1)指示剂化合物的白细胞检测剂。
合适地，可以使用第二方面的装置来进行第一方面的方法。
第二方面的优选特征如关于第一方面所定义。现在将描述第一和第二方面的进一步优选的特征。
在一些实施方案中，第二方面的装置包括另外的通道，其包含可以检测和/或鉴定样品中的微生物的报道剂，所述报道剂包含(a2)指示剂化合物；和(d1)支持或促进微生物生长的培养基和/或营养物。
将理解的是，根据本发明的装置可用于检测或鉴定各种不同流体中的白细胞和微生物。优选的是，该装置用于测试生物流体(例如，支气管灌洗液、血清、脑脊液、尿液等)，并且最优选的是，该装置用于检测或鉴定PD流出物中的微生物。
在一些实施方案中，第二方面的装置可用于确定样品中的阈值浓度的白细胞的存在和用于检测和/或鉴定所述样品中的微生物，所述装置包括三个经布置以接收所述样品的通道，且其中：
第一通道含有第一报道剂，所述第一报道剂包含：
(a2) 指示剂化合物；和
(d1) 支持或促进微生物生长的培养基和/或营养物；和
第二通道含有第二报道剂，所述第二报道剂包含：
(a3) 指示剂化合物；
(d2) 支持或促进微生物生长的培养基和/或营养物；和
(e) 选择性抑制微生物的生长的选择因子；且
第三通道含有白细胞检测剂，所述白细胞检测剂包含：
(a1) 指示剂化合物；和
(b) 缓冲剂。
优选地，存在于第一通道中的第一报道剂如关于第一方面所定义。优选地，所述指示剂化合物是水溶性四唑鎓盐。
优选地，所述第一报道剂进一步包含(c2)电子介质。
优选地，存在于第二通道中的第二报道剂组合物如关于第一方面所定义。优选地，所述指示剂化合物是水溶性四唑鎓盐。
优选地，所述第二报道剂进一步包含(c3)电子介质。
优选地，在第三通道中提供的白细胞检测剂如关于第一方面所定义。
优选地，所述白细胞检测剂进一步包含(b)缓冲剂。
在一些实施方案中，所述白细胞检测剂可以进一步包含(c1)电子介质。
在一些实施方案中，所述第一报道剂可以进一步包含白细胞抑制剂。
在一些实施方案中，第二报道剂可以进一步包含白细胞抑制剂。
在一些实施方案中，所述白细胞检测剂可以进一步包含抗细菌剂。
第二方面的其他优选特征如关于第一方面所定义。
现在将定义第一和第二方面的进一步优选的特征。
优选地，本发明的第一方面提供了分析取自透析患者的样品中存在阈值浓度的白细胞和(在一个优选实施方案中)微生物的方法，且所述方法包括以下步骤：
(a) 使由本发明的第二方面提供的装置与待分析的样品接触；和
(b) 检查报道剂。
所述装置的通道可以是任何合适的容器，其可以保留报道剂的组分并且可以将样品流体引入其中。还应当设计该装置，使得装置的用户可以容易地观察通道的内容物。
在一个优选实施方案中，每个通道都是含有报道剂的袋，并且其中每个袋都具有与其连接的用于接收流体的管。此类袋可以由本领域众所周知的许多材料形成，并且在一个优选实施方案中，此类袋由PVC形成。
优选的是，通过将两片PVC与在密封之前放置在两片之间的报道剂的组分一起密封来形成所述袋。至少一个片应当是透明的(用于观察内容物)，并且优选的是，一片是透明的而另一片是不透明的并且优选是白色的。
图2举例说明本发明的一个实施方案，其中所述通道包括袋，且实施例描述了可以如何形成此类袋。
将理解的是，所述通道，特别是当它们是连接至管道的袋时(如图2中所举例说明)，理想地包含在合适的壳体(casting)内。
在一些优选实施方案中，所述壳体装有比色图表，所述比色图表使得用户能够比较白细胞检测剂和(当存在时)第一和/或第二报道剂的颜色与图表上提供的颜色。图表上的颜色将举例说明在白细胞和/或微生物存在/不存在的情况下预期的颜色。
图1举例说明可用于保留通道的壳体/容器的种类。所述容器在顶部表面上具有三个观察窗口，所述三个观察窗口在通道中的报道剂和白细胞检测剂上方对准，以允许用户观察通道中的流体是否被微生物感染。在一个优选的实施方案中，所述报道剂和白细胞检测剂的组分包含在胶囊内。当将流体引入通道中时，这些胶囊溶解以将其内容物释放至流体中。当指示剂化合物是WST化合物时，如果流体未被感染/污染，则装置的用户将观察到透明或稻草色(straw-coloured)的流体，而如果微生物感染流体，则第一和/或第二通道中的流体将变成深色/紫色(WST被还原为甲䐶)。当MTT是所用的指示剂化合物时，如果存在指示感染的白细胞，则白细胞通道将变为蓝色。
后面在实施例中描述具有最优选壳体的装置的组装，其呈具有特卫强(Tyvek)盖的热成型泡罩盘的形式。
可以以许多方式将流体应用至装置的每个通道。例如，在本发明的通道是附接有管的袋的实施方案中，可以使用无菌注射器吸上流体样品，并通过将注射器附接至管而将流体插入通道中。然后，通道中的流体将允许报道剂的组分混合，并且在合适的孵育时段之后，流体中的任何微生物将引起指示剂经历例如颜色变化。或者，可以将流体泵入装置中或者甚至通过重力进入(即，流体排放至低于流体容器放置的装置中)。
所述报道剂和白细胞检测剂的组分(例如指示剂化合物、支持或促进微生物生长的培养基和/或营养物等)可构成直接插入通道内的粉末。例如，所述通道可包括袋，报道剂或白细胞检测剂的每种组分被注射入所述袋中。
然而，优选的是，每个通道/袋含有装载至某种媒介物上或其中的白细胞检测或报道剂或其个别组分。此类媒介物对于设计制造根据本发明的装置的最佳方法是有用的，并且当该装置或至少报道剂和/或白细胞检测剂的组分需要灭菌时，可以特别有用。
可以使用许多媒介物。例如，所述报道剂或白细胞检测剂的组分可以制成浓缩溶液，其应用于滤盘。然后将滤盘干燥，使得它们保留相关组分，且然后将滤盘放置在通道内。根据一个实施方案，选择因子(例如，万古霉素)可以应用于滤盘。通过实例的方式，6mmWhatman或Oxoid滤盘可以用20μl浓缩的报道剂或白细胞检测剂组分(例如，指示剂化合物、选择因子或电子介质)的储备物浸渗。然后应当将这些盘干燥(例如，在37℃持续18小时或直到完全干燥为止)。然后可将干燥的盘插入相关通道中。或者，可以将所述盘浸在浓缩的储备溶液中。在一些实施方案中，可以使用市售的浸渗滤盘。
或者，所述报道剂或白细胞检测剂的组分可以与合适的粘合剂和赋形剂组合以形成片剂，并将片剂置于通道内。
优选的是，用于报道剂、白细胞检测剂或其组分的媒介物是一个或多个胶囊。在一个实施方案中，一个通道的所有组分都保留在一个胶囊内。在另一个实施方案中，通道可以含有多于一个胶囊，其中所述报道剂或白细胞检测剂的组分包含在不同的胶囊内。
根据本发明使用的胶囊当与所测试的流体接触时应当溶解，并且理想地也是无色的或至少是不影响报道剂的可视化的颜色。胶囊是本领域众所周知的，并且技术人员将能够容易地选择适应它们将需要插入其中的特定通道的胶囊。优选的胶囊可以由羟丙基甲基纤维素(HPMC)或明胶形成。
所使用的胶囊的大小将取决于报道剂或白细胞检测剂(或需要引入通道中的其组分)的量；而这进而将取决于通道的大小和设计其以保留的流体量。通过实例的方式，发明人已发现5号Capsugel Vcap胶囊可合适地用于经设计以接收约16mL测试流体的通道。
在一个实施方案中，所述第一或第二报道剂的所有组分都保留在单个胶囊内。例如，胶囊可含有WST-9、Wilkins Chalgren培养基、mPMS和任选万古霉素。
在一个实施方案中，所述白细胞检测剂保留在胶囊内，用于经设计以接收约16mL测试流体的通道中。
在一些实施方案中，所述第一和/或第二报道剂和/或白细胞检测剂的组分与赋形剂混合，且然后用于填充胶囊。优选的赋形剂是聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或其衍生物。PVP是优选的，因为其不引起错误触发或掩盖颜色变化。实际上，令他们惊讶的是，发明人发现PVP似乎改善并强化当WST-9被还原成甲䐶时发生的颜色变化。
在一些优选的实施方案中，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)用作赋形剂。这可以是例如在报道剂的组分需要与赋形剂混合的情况下(例如，当片剂或形成时或帮助填充胶囊时)。
在一些实施方案中，所述第一报道剂包含聚乙烯吡咯烷酮。
在一些实施方案中，所述第二报道剂包含聚乙烯吡咯烷酮。
在一些实施方案中，所述白细胞检测剂包含聚乙烯吡咯烷酮。
测试的流体中的PVP的最终浓度优选大于0.25%(w/v)PVP，且更优选应当为至少0.8% (w/v)PVP。根据本发明的一个实施方案，PVP的最终浓度应当为约1.25%(w/v)。在本发明的另一个实施方案中，PVP的最终浓度可为最多达约3.0%(w/v)。技术人员将理解，可以调节用作胶囊等中的赋形剂的PVP的量，以便使PVP的最终浓度在这些优选范围内。
在一些优选实施方案中，所述第一通道包含第一报道剂，其包含Wilkin Chalgren培养基、WST-9、mPMS和PVP；所述第二通道包含第二报道剂，其包含Wilkins Chalgren培养基、WST-9、mPMS、万古霉素和PVP；且所述第三通道包含白细胞检测剂，其包含MTT和MES缓冲剂。
在一些优选实施方案中，所述第一通道包含第一报道剂，其包含Wilkin Chalgren培养基、WST-9、mPMS、PVP和毛地黄皂苷；所述第二通道包含第二报道剂，其包含WilkinsChalgren培养基、WST-9、mPMS、万古霉素、PVP和毛地黄皂苷；且所述第三通道包含白细胞检测剂，其包含WST-9、mPMS、PVP、MES缓冲剂、美罗培南、环丙沙星和万古霉素。
每个通道的组分都可以以任何合适的形式提供。它们可以作为粉末、片剂、凝胶、溶液或糊剂提供。
优选地，每种组分以在胶囊内的粉末形式提供。每个胶囊可包含个别组分中的一种或多种。
所述第一通道可包含一个或多个胶囊。
所述第二通道可包含一个或多个胶囊。
所述第三通道可包含一个或多个胶囊。
在一些优选实施方案中，所述第一报道剂的所有组分都提供在单个胶囊中。
在一些优选实施方案中，所述第二报道剂的所有组分都提供在单个胶囊中。
在一些优选实施方案中，所述白细胞检测剂的所有组分都提供在单个胶囊中。
在一些实施方案中，每个通道包括单个胶囊。
在本发明的一个实施方案中，所述第一通道含有第一报道剂，其包含：
(1) 含有Wilkins Chalgren培养基的胶囊；
(2) 含有WST-9和PVP的混合物的胶囊；和
(3) 含有mPMS和PVP的混合物的胶囊；且
所述第二通道含有第二报道剂，其包含：
(1) 含有Wilkins Chalgren培养基的胶囊；
(2) 含有WST-9和PVP的混合物的胶囊；
(3) 含有mPMS和PVP的混合物的胶囊；和
(4) 浸渗有万古霉素的滤纸；且
所述第三通道含有白细胞检测剂，其包含：
(1) 含有MTT的胶囊；和
(2) 含有MES缓冲剂的胶囊。
根据本发明的第二方面的装置可用于在早期阶段简单地检测感染。这意味着可以更快速地开始治疗，且因此可以更容易地控制感染。
当样品是临床样品时，如所优选，微生物的早期检测允许对受试者进行更早治疗，且这进而降低与感染(例如，腹膜炎)相关的发病率和死亡率。早期治疗也有益于健康服务，因为早期治疗减少住院治疗的需要，且由此节省费用。此外，当测试PD流出物时，腹膜炎的控制和/或预防允许患者维持PD。
根据本发明的第二方面的装置还有利地提供关于流体中微生物类型的额外信息。当临床医生希望选择最佳治疗时(例如，当装置用于测试临床样品诸如PD流出物时)，该信息是重要的。
本发明的优选用途是用于测试临床流体样品，且特别是在诊所、在患者家中和作为“护理点(point of care)”的其他地方。
本发明的最优选用途是用于测试PD流出物以评估患者是否正在发展或已经发展腹膜炎。可以收集PD流出物，且然后在病房进行测试，或甚至送出用于在实验室中进行测试。然而，优选的是，装置被整合至患者在取出已经在其腹中停留所需时间量的PD流出物时所遵循的常规程序中。
优选的是，将根据本发明的装置调整，使得它们可以与持续性非卧床腹膜透析(CAPD)所遵循的程序一起使用或甚至与其整合。CAPD使用重力将流体排放出腹膜腔并将其用新鲜流体替换。每次交换耗费约30分钟，且大多数患者每天需要进行4次交换。
最优选的是，将根据本发明的装置调整，使得它们可以与自动腹膜透析(APD)中使用的装置一起使用或甚至与其整合。APD通常在晚上使用机器进行，该机器在患者睡着时将流体移入和移出腹部，通常在8-9小时时段内。所述机器小到足以摆放在床头桌的顶部上。优选地设计根据本发明的装置，使得它们可以适合于来自此类机器的流出物管线，并且因此可以在将流出物泵送到废物之前测试流出物的微生物污染。
在优选实施方案中，本发明的装置的通道提供在壳体内。合适地，所述壳体具有一个或多个观察窗口，其允许观察通道的内容物。
在其中所述装置具有三个通道的一些优选实施方案中，提供三个观察窗口，每个通道一个。
在一些优选实施方案中，所述壳体包括比色图表，其允许用户将每个通道中可见的颜色与图表上的颜色进行比较。这合适地提供了微生物和/或白细胞是否存在于通道中的指示。
合适地，可以在与观察窗口相邻的区域中提供比色图表，使得比色图表和通道是并排的。
在一个优选实施方案中，本发明基本上如说明书和附图中所述。
详述
现在将参考以下附图详细描述本发明，所述附图显示：
图1：代表从可以根据本发明使用的装置的顶部和两侧的透视图。
图2：代表图1的装置内的通道的透视图。
图3显示在孵育之前和孵育10小时之后包含白细胞检测剂的通道。
图4：是含有报道剂且无微生物(对照)或104-106 CFU/mL金黄色葡萄球菌(SA)或铜绿假单胞菌(PA)的管的照片。上排管不含任何选择因子，而下排含有万古霉素。
图5：顶排照片显示未感染的流出物袋的外观以及与来自流出物袋的PD流出物孵育0和8小时后的通道1和2(第一和第二报道剂)的图像；并且底排照片显示临床医生怀疑感染的流出物袋的外观以及与来自可疑流出物袋的PD流出物孵育0和8小时后的通道(从装置壳体取出的)图像。
图6是显示每个通道的可能结果以及在感染方面这指示什么的示意图。
图1是从根据本发明的装置1的顶部和两侧的透视图。该装置包括不透明的塑料壳体2，其在顶面具有透明的观察窗口3，4，5。第一观察窗口3在包括在壳体内的第一通道30上方对准，第二观察窗口4在包括在壳体内的第二通道40上方对准，并且第三观察窗口5在包括在壳体内的第三通道50上方对准。观察窗口3，4，5这样布置，使得可以由装置的用户观察通道的内容物。在使用中，流体通过入口6引入并通过管道(图1中未显示)流入含有报道剂的通道(图1中也未显示)。
图2是包括在图1中所示的壳体2内的通道30，40，50的透视图。管道将流体传输到第一通道30、第二通道40和第三通道50，在该实施方案中，所述第一通道30、第二通道40和第三通道50是具有透明上部面的袋。管道包括单向阀31，41，51，61，其防止流体和报道剂向管道上方回流。第一通道30内的报道剂包括一个或多个含有WST-9、mPMS WilkinsChalgren培养基和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)填料的胶囊。第二通道40内的报道剂包括一个或多个含有WST-9、mPMS、Wilkins Chalgren培养基、PVP填料的胶囊，且也提供浸渗在滤盘上的万古霉素。当流体被引入通道时，每个胶囊都溶解。当流体被引入通道时，报道剂的组分有效地组合。如果流体中存在微生物，则第一通道中的WST-9被还原为深色甲䐶，且如果流体中存在对万古霉素具有抗性的微生物，则第二通道中的WST-9被还原为深色甲䐶。
白细胞检测剂50在一个或多个胶囊中包含MTT和MES缓冲剂。
实施例
发明人意识到，没有市售的小而简单的可用于检测流体、特别是PD流出物的高水平的白细胞和微生物污染的产品。
进行了最初的原理验证实验，以确定是否可以产生这样的装置，其可以在微生物之间进行区分/选择，并且还可以对于何者控制用于触发所述白细胞检测剂和报道剂的阈值。
1. 报道剂的组分的制备
在8种不同细菌物种存在的情况下测试包含WST-9、mPMS和PVP的报道剂。确定105 CFU/mL的所有细菌都能够在37℃在8或10小时内还原四唑鎓以提供颜色变化。
胶囊填充
将空胶囊称重作为空白。通过称量活性组分的量并将其添加至5号胶囊中，确定具有PVP赋形剂的每种活性组分(即，WST-9、mPMS和万古霉素)的振实密度(tapped density)。添加PVP赋形剂并将其压缩到胶囊中直到充满为止。将胶囊再次称重以确定对于每种活性组分填充5号胶囊所需的赋形剂的质量。将这重复5次，以得到对于每种活性组分和赋形剂的胶囊的平均重量。
制备100倍质量的每种活性组分和赋形剂并将其充分混合以产生均匀的粉末混合物，其中活性组分均匀地分布在整个赋形剂中。这用于使用Feton Fastlock试剂盒填充100个胶囊。
万古霉素滤盘的制备
通过浸在万古霉素在水中的储备物中来制备6mm Whatman滤盘。将这些在37℃作为单片干燥18小时或直到完全干燥为止。每个盘上抗生素的最终浓度为256μg。
2. 根据本发明的装置的组装
用于检测来自自动腹膜透析(APD)机器(Baxter)的PD流出物的微生物污染的装置通过下述生产：
3. 制作通道并用报道剂加载它们
1. 白色PVC材料用透明PVC覆盖，两者均切割至93mm x 70mm。
2. 将最长的边缘熔接，并通过熔接袋的中间产生两个通道。
3. 在顶部边缘处插入两个管(直径3.0mm，长度25mm)，向每个通道插入一个，其通过围绕管密封固定。
4. 将胶囊插入将形成第一通道的PVC片之间，并密封底部边缘。
5. 将胶囊和万古霉素滤盘(filter disk)插入将形成第二通道的PVC片之间，并密封底部边缘。
6. 在之间插入胶囊。
7. 将白色PVC单向止回阀插入每个管中
8. 将两个柔性PVC管固定至每个阀。两个管由PVC Y形连接管连接，从该连接管附接单个长度为1米的管。
4. 装置的组装
9. 将袋/通道组件插入包括热成型泡罩盘的壳体中，并通过将阀按压到泡罩盘中的预成型凹槽中将组件固定就位。
10. 管通过泡罩盘右侧的孔装入。
11. 在管的末端附接阀，随后是公Luer锁紧接口，该公Luer锁紧接口与腹膜透析消耗品相容，流出物从所述腹膜透析消耗品取样。
12. Luer锁紧接口由帽保护。
13. 泡罩包装用不透明的特卫强盖密封，该盖具有两个透明窗口，袋通道可通过该窗口可视化。
14. 将泡罩盘和管道密封至PET/PE/特卫强撕裂袋(peel pouch)中并包装成箱。
5. 测试用于根据本发明的装置中的通道
通过用透析物填充其腹膜最少两小时来从腹膜透析患者获得透析流出物样品。在该停留时间之后，从腹膜排放出流体，并通过以每通道16mL填充装置的通道来测试样品。然后将通道在37℃孵育8小时，其后读取结果。
还制备了根据本发明的白细胞检测通道。这含有用MES缓冲至pH 6.5的MTT。使用该通道测试PD流出物样品。来自健康患者的透明流体且独立证实具有低于阈值浓度的白细胞的第一样品与独立证实含有高浓度的白细胞的不适患者的混浊样品一起进行测试。图3在顶排显示最初和孵育8和10小时后健康患者的样品。在底排，显示来自不适患者的样品。
图5显示对来自诊所的PD流出物袋进行的两个示例性测试的第一和第二通道的照片，在所述诊所中患者正在经历自动腹膜透析(APD)。
顶排照片显示来自从似乎健康的患者收集的PD流出物的通道的外观。在37℃孵育0和8小时后拍摄通道的照片，且可以看出在8小时孵育后通道内的报道剂尚未被激活。还拍摄了流出物袋的照片，且可以看出流体相对透明。这些结果提示患者未患腹膜炎，且临床医生随后证实患者保持健康。
底排照片显示来自从开始感觉不适的患者收集的PD流出物的通道的外观。在37℃孵育0和8小时后，还拍摄了通道的照片。还对流出物袋拍摄照片，且可以看出流体的确看起来是混浊的。该图显示第一和第二通道两者内的报道剂都已被激活。这提示患者患有腹膜炎，并且其可能由革兰氏阴性生物引起(第二通道中的万古霉素未能抑制报道剂激活)。两天后，临床医生在收到来自医院测试实验室的证实时，证实该患者具有革兰氏阴性感染。将理解的是，该装置准确且快速(比常规实验室测试快2天)鉴定了感染以及还有感染类型。这具有下列巨大好处：临床医生可以使用该装置来做出关于腹膜炎治疗的知情和早期决定。这进而改善了患者的结果，节省了健康服务费，且还具有下列优点：可以在早期阶段鉴定和治疗感染的患者具有更好的维持PD的机会(而不是需要转到HD)。
6 在临床背景中使用根据本发明的装置。
对于当使用根据本发明的装置以结合自动腹膜透析(APD)机器(Baxter)监控PD流出物的微生物污染时，确立并遵循方案。
该装置的用户被指示：
1. 彻底洗涤并干燥双手，并使用无菌技术以降低污染取样装置的风险
2. 打开装置包装
3. 确保关闭流出物样品管线上的夹子
4. 从样品管线除去帽
5. 从装置除去红色帽。保存所述帽。
6. 以扭转动作将装置连接到样品管线，直到锁定为止
7. 将装置放在排液袋的位置处的地板上
8. 当您开始您的治疗时，遵循Baxter机器上的说明书
9. 在‘最初排放(Initial drain)’的点，等待40秒
10. 打开样品管线上的夹子，并允许流出物充满装置。这应当耗费不多于2分钟。
11. 当装置充满时，关闭样品管线上的夹子。
12. 把装置与样品管线分开，并给连接管重新盖上帽
13. 确保培养箱在插头处开启
14. 将取样装置拿到培养箱并放入其中。
15. 关上门，并按开始
16. 该装置将加热至37℃并在该温度保持孵育10小时，其后其将冷却至4℃(冰箱温度)。
17. 您可以在最少10小时后观察装置。
18. 如果您没有准备好立即观察装置，将装置保持在门关闭的培养箱中，这将保持结果固定。如果您取出装置，则其必须在1小时内读取。
7 如何读取装置的举例说明
图6提供了当使用根据本发明的三通道装置时可以获得的可能结果的示意图，其中该装置包括：
通道1(第一报道剂)：
WST-9
mPMS
PVP
通道2(第二报道剂)：
WST-9
mPMS
PVP
万古霉素
通道3(白细胞检测剂)：
MTT
MES
8. 本发明的另外的实例装置
制备本发明的另外的实例，其包含提供指定浓度的量的以下组分，假定向每个通道提供16 mL的PD流出物。
Figure 23002DEST_PATH_IMAGE002
图7显示当暴露于各种临床样品时上述装置(实施例8)的通道的照片。在该图中，当我们说存在或不存在细菌或白细胞时，我们意指它们以高于阈值浓度存在或不以高于阈值浓度存在。

Claims (20)

1.确定样品中的阈值浓度的白细胞的存在的方法，所述方法包括(i)使所述样品与包含(a1)指示剂化合物的白细胞检测剂接触；和(ii)检查所述白细胞检测剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品选自腹膜透析流出物和由于腹水而存在的从腹膜腔排出的流体。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述样品是腹膜透析流出物。
4.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述指示剂化合物(a1)是四唑鎓化合物。
5.根据任一前述权利要求所述的方法，其进一步涉及分析所述样品的微生物的存在，其中步骤(i)进一步包括使所述样品与以下接触：
(II) 第一报道剂，其包含：
(a2) 指示剂化合物；和
(d1) 支持或促进微生物生长的培养基和/或营养物。
6.根据任一前述权利要求1或权利要求2所述的方法，其中步骤(i)进一步包括使所述样品与(III)第二报道剂接触，其中所述第二报道剂包含：
(a3)指示剂化合物；
(d2)支持或促进微生物生长的培养基和/或营养物；和
(e) 选择因子。
7.根据权利要求5或6中任一项所述的方法，其中所述第一和/或第二报道剂中的指示剂化合物(a2)和/或(a3)是水溶性四唑鎓盐，优选WST-9。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其中所述第一和/或第二报道剂中的支持或促进微生物生长的培养基和/或营养物(d1)和/或(d2)是Wilkins Chalgren培养基。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的方法，其中所述第一和/或第二报道剂进一步包含电子介质。
10.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述白细胞检测剂进一步包含电子介质。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述电子介质是1-甲氧基-5-甲基吩嗪甲硫酸盐(mPMS)。
12.根据权利要求6至11中任一项所述的方法，其中所述选择因子抑制革兰氏阳性微生物的生长。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述选择因子是万古霉素。
14.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述白细胞检测剂进一步包含一种或多种抗细菌剂。
15.根据权利要求5至13中任一项所述的方法，其中所述第一报道剂和/或第二报道剂进一步包含白细胞抑制剂，优选皂苷。
16.根据任一前述权利要求所述的方法，其中步骤(ii)涉及检查白细胞检测剂、所述第一报道剂和所述第二报道剂。
17.用于检测样品中的阈值浓度的白细胞的装置，所述装置包括经布置以接收所述样品的通道，其中所述样品包含(a1)指示剂化合物和任选地缓冲剂。
18.根据权利要求17所述的装置，其也可用于检测和/或鉴定可存在于所述样品中的微生物，所述装置包含三个经布置以接收流体的通道，且其中：
第一通道含有第一报道剂，所述第一报道剂包含：
(a2) 指示剂化合物；和
(d1) 支持或促进微生物生长的培养基和/或营养物；和
第二通道含有第二报道剂，所述第二报道剂包含：
(a3) 指示剂化合物；
(d2) 支持或促进微生物生长的培养基和/或营养物；和
(e) 选择性抑制微生物的生长的选择因子；且
第三通道含有白细胞检测剂，所述白细胞检测剂包含：
(a1) 指示剂化合物；和
(b) 缓冲剂。
19.根据权利要求17或权利要求18所述的装置，其中所述第一和第二通道各自进一步包含电子介质，且所述第三通道进一步包含缓冲剂。
20.根据权利要求17、18或19所述的装置，其中所述通道被保留在壳体中，且所述壳体具有用于观察所述通道的内容物的观察窗口。
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