CN111182913A - 用于通过多个生物屏障进行有效递送的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

提供了包含具有能够跨越血脑屏障的一种或多种肽的聚苹果酸基分子支架，一种或多种斑块结合肽和一种或多种附着在支架上的治疗剂的微型纳米药物。描述了治疗脑疾病或异常状况的方法，以及通过施用所述微型纳米药物在受试者中成像的方法。公开了用于减少受试者脑中淀粉样斑块形成的方法。

Description

用于通过多个生物屏障进行有效递送的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本发明要求2017年10月2日提交的美国临时申请No.62/566,813的优先权，该申请以全文援引的方式并入本文。
2018年10月2日创建的标题为“序列表”的以电子方式提交的序列表，其大小为2,890字节，其以全文援引的方式并入本文。
关于联邦赞助的研究或开发的声明
本发明是在国家卫生研究院授予的基金号CA188743和CA209921的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定权利。
技术领域
本发明内容一般涉及微型纳米药物，其包括能够跨越血脑屏障的肽、斑块结合肽和/或缀合至聚苹果酸基的支架的治疗剂。本发明还涉及通过施用本文所述的微型纳米药物治疗脑疾病包括神经病症、减少罹患阿尔茨海默病的患者的脑中淀粉样斑块的形成和/或使其成像的方法。
背景技术
穿过脑血屏障(BBB)的递送不足阻碍了许多临床前药物到达它们的预期靶标，并导致用于神经障碍的常规药物治疗的低效率(Dréan et al.(2016)和Abbot(2013)，两者均通过全文援引的方式并入本文，视为充分阐述。)药物穿过健康受试者的BBB的递送尤其具有挑战性，因为完整的BBB在很大程度上是药物不可跨越的。然而，神经疾病的早期治疗对于药物治疗的成功是极为重要的，因为大多数疾病一旦达到晚期就预后很差。此外，神经炎症和神经变性的早期药物治疗可一起预防BBB的恶化，并可维持其排除浸润细胞因子和毒素的保护能力(Alyautdin et al.(2014)，其通过全文援引的方式并入本文，视为充分阐述)。
通过用胞转(transcytosis)特异性肽靶向，将递送穿过BBB的尝试用于治疗脑肿瘤。递药的化疗药物是紫杉醇、PTX-生物素-CPP的直接缀合，或检查化学连接到PAMAM-G5树状聚体上的αvβ3整联蛋白，靶向紫杉醇-甲氧基聚(乙二醇)-共-聚(ε-己内酯)共聚物、聚合物囊泡的肽，或由聚(L-赖氨酸)-接枝的聚乙烯亚胺(PEI-PLL)的血管肽素-2-聚乙二醇(Angiopep-2-PEG)缀合的纳米颗粒包封的自杀基因的递送(Regina et al.(2008)、Li etal.(2016)、Yan et al.(2012)；Xin et al.(2012)；Lu et al.(2017)；和Morales-Zavlaaet al.(2017)，所有这些文献在此引入作为参考，如同完全阐述)。
描述了杆状纳米颗粒(秀丽隐杆线虫(C.elegans)阿尔茨海默病模型)、PTX(乳腺癌转移、PET和MRI)、电响应水凝胶纳米颗粒(抗癫痫苯妥英的递送)、神经降压素(伤害性传递的调节剂)向非肿瘤目标的脑递送(O'Sullivan et al.(2016)；Gao et al.(2016)；Wanget al.(2016)；和Demeule et al.(2014)，所有这些文献在此引入作为参考，如同完全阐述)。
靶向递送穿过BBB以治疗脑中肿瘤的实例不足以代表穿过健康脑的BBB的递送。在其它实施例中，递送的小化合物本身很容易渗透BBB。
通过显微镜观察，纳米器件跨越健康BBB还未明确地证实。
除了药物穿过BBB的递送之外，另一个问题是降低阿尔茨海默病中关键标志物如分泌酶和τ蛋白(Tau protein)的活性。
抑制Aβ产生的最先进的实例是通过静脉注射组合跨BBB的肽靶向递送和神经元中BACE1β-分泌酶的siRNA敲低(knockdown)(Zheng et al.(2017)，其以引用的方式并入本文，如同完全阐述一样)。然后，将被选自展示的特异性肽靶向的胶束纳米药物，用于与淀粉样肽结合，可能包括神经元细胞表面上的前体蛋白(APP)，在细胞内递送到神经元内体/溶酶体途径，并最终逃逸到细胞质中以阻断分泌酶mRNA(Zheng et al.(2017)，将其引入本文作为参考，如同完全阐述一样)。
Aβ1-42靶向D-肽已经使用镜像展示选择进行了筛选，并且具有亚微摩尔浓度的结合亲和力(Wiesehan et al.(2003)，其通过引用并入本文，如同完全阐述一样)。
针对人τ(tau)的反义寡核苷酸(ASO)TauASO-12的研究涉及使用PS19小鼠作为τ蛋白病小鼠模型，该模型过表达τ的突变形式(DeVos et al.(2017)，在此引入作为参考，如同完全阐述一样)。将含有ASO的流体用泵输注到右侧心室中。ASO应用不是靶向的，并且分布在脑中。在脑脊髓和脑脊液中τmRNA和蛋白质减少。延长小鼠存活，并且逆转病理性τ接种。尽管使用全身注射促进BACE1的siRNA敲低，τ的siRNA敲低处于初始阶段，并且根据情况使用直接应用和延长泵入脑中。
已经合成了许多小分子抑制剂、肽和合成化合物，但是没有一种通过临床试验。失败的原因可能是缺乏或损害的BBB渗透、从脑中快速清除和缺乏靶向患病神经细胞(VassarR.(2014)，其通过引用并入本文，如同完全阐述一样)。
另外，某些纳米颗粒通过包封递送药物，但它们具有不利的30-300nm范围内的流体动力学直径和有限的BBB渗透。这种颗粒也不是生物可降解的，并且会导致有毒的不溶性沉积物。此外，非特异性药物作用可能由于药物的自发释放、通过药物扩散或通过纳米颗粒溶解而产生(Elnegaard et al.(2017)，其通过引用并入，如同完全阐述)。
另一方面，某些基于抗体的药物跨越BBB，并在实验室以及神经障碍包括阿尔茨海默病的临床前治疗试验中提供了有希望的结果(Sevigny et al.(2016)，其引入如同完全阐述)。
然而，基于抗体的治疗剂，即使在人源化时，也可以触发全身性免疫应答，这使长期治疗前景复杂化(Borlak et al.(2016)，其通过引用并入，如同完全阐述一样)。
此外，抗体分子大且限制载货容量，因此限制多种药物运载物向受体细胞的递送。
发明内容
在一个方面，本发明涉及一种微型纳米药物，其包含聚苹果酸基的分子支架、至少一种能够跨越血脑屏障的肽、至少一种斑块结合肽和内体裂解配体。所述至少一种能够跨越血脑屏障的肽、所述至少一种斑块结合肽和所述内体裂解配体与所述聚苹果酸基的分子支架共价连接。所述的纳米小药膜的尺寸范围为1nm-10nm。
在一个方面，本发明涉及一种微型纳米药物，其包含聚苹果酸基的分子支架、至少一种能够跨越血脑屏障的肽、内体裂解配体和治疗剂。所述至少一种肽、内体裂解配体和治疗剂中的每一种都与聚苹果酸基的分子支架共价连接。所述的纳米小药膜的尺寸范围为1-10nm。
在一个方面，本发明涉及药学上可接受的组合物，其包含本文所述的任一种微型纳米药物和药学上可接受的载体或赋形剂。
在一个方面，本发明涉及用于治疗受试者的疾病或异常状况的方法。该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的任一种微型纳米药物或本文所述的任一种药学上可接受的组合物。
在一个方面，本发明涉及用于减少受试者脑中淀粉样蛋白斑形成的方法。该方法包括向有需要的受试者施用本文所述的任一种微型纳米药物，或本文所述的任一种组合物。
在一个方面，本发明涉及治疗受试者中增殖性疾病的方法。该方法包括向需要其的受试者施用治疗有效量的微型纳米药物，所述微型纳米药物包含聚苹果酸基的分子支架、至少一种能够跨越血脑屏障的肽、内体裂解配体和治疗剂。所述至少一种肽、内体裂解配体和治疗剂中的每一种都与聚苹果酸基的分子支架共价连接。所述的微型纳米药物的尺寸范围为1-10nm。
附图说明
当结合附图阅读时，将更好地理解优选实施例的以下详细描述。为了说明的目的，在附图中示出了目前优选的实施例。然而，应当理解，本发明不限于所示的精确安排和手段。在附图中：
图1是示出了用于递送本发明所述实施方案的微型纳米药物的分子途径的概况的示意图。
图2是说明通过多个生物屏障渗透到靶向肿瘤中的微型纳米药物的示意图。
图3A-3B是示意图，示出了微型纳米药物在跨越血脑屏障并进入脑实质中的优点。图3A是说明携带AP-2肽和三亮氨酸(内体逃逸单位)进入脑实质的微型纳米药物的示意图。图3B是比较携带肽的微型纳米药物和携带抗体的纳米药物跨越血脑屏障的效率的示意图。
图4说明了含有单个肽的微型纳米药物的实例。
图5说明了含有三种肽的微型纳米药物的实例。
图6A-6D说明PMLA/LLL/血管肽素-2/罗丹明(P/LLL/AP2)微型纳米药物的合成途径。图6A说明了生物合成的聚苹果酸(PMLA或P)的活化，通过使用DCC/NHS化学法来产生活化的聚苹果酸。图6B说明活化的PMLA与三亮氨酸(LLL)和2-巯基乙胺(MEA)的缀合。图6C说明PMLA/LLL与血管肽素-2(AP-2)和罗丹明染料的缀合。图6D说明了MEA部分用于通过马来酰亚胺-硫醇反应结合与PEG接头缀合的AP-2肽。罗丹明以相同方式附着。
图7A-7G说明了通过HPLC进行产物验证的实例。图7A说明了PMLA/LLL/血管肽素-2-PEG3400-MAL/罗丹明的验证。图7B说明了PMLA/LLL/“铁模拟肽(Fe mimetic peptide)”(SEQ ID NO：2)CRTIGPSVC(环状)-肽-PEG2000-Mal/罗丹明的验证。图7C说明了PMLA/LLL/迷你蜂毒明肽-4-PEG2000-Mal/cy5.5的验证。图7D示出了对照：PMLA/LLL/罗丹明。图7E-图7G示出了在220nm波长处测量的肽纳米缀合物的HPLC洗脱。图7E说明了用于靶向的PMLA/LLL/血管肽素2(2％)/“铁模拟肽”(2％)/罗丹明(1％)二肽。图7F说明了用于靶向的PMLA/LLL/血管肽-2(2％)/迷你蜂毒明肽-4(2％)/罗丹明(1％)二肽。图7G说明了用于靶向的PMLA/LLL/迷你蜂毒明肽-4(2％)/血管肽素-2(2％)/“铁模拟肽”(2％)/罗丹明(1％)三肽。术语“铁模拟肽”和“cTfRL”在本文中可互换使用
图8A-8C说明合成的P/LLL/AP2的特征。图8A说明了A200-A700nm的SEC-HPLC3D视图与P/LLL/AP2纳米缀合物成分的保留时间和吸光度的关系。图8B说明在220nm波长下记录的P/LLL/AP2的SEC-HPLC色谱图。图8C说明P/LLL/AP2纳米缀合物(虚线)、AP2游离肽(实线)和预缀合物(点划线)的FTIR(傅立叶变换红外)光谱。
图9说明P/AP-2(2％)/罗丹明(1％)结合物的PK，通过所连接的染料的荧光强度作为从IV注射到尾静脉直到采集血样的时间的函数来测量。
图10A-10C说明了合成的P/LLL/AP-2/ACI-89/罗丹明的特征。图10A说明了扫描A200-A700nm的SEC-HPLC顶视图对显示完整纳米缀合物的吸光度的保留时间。图10B说明了与图10A所示相同的缀合物在572nm波长处的扫描分布图，指示罗丹明组分。图10C说明了与图10A所示相同的缀合物在220nm波长下的扫描分布图，指示P/LLL/AP-2/ACI-89组分。
图11A-11C示出了P/LLL/AP-2/D1-肽/罗丹明在A200-A700nm处的SEC-HPLC色谱图与显示PMLA/LLL/AP-2/D-肽/罗丹明完全纳米缀合物的吸收的保留时间的关系。图11B是与图11A所示相同的纳米缀合物在572nm的扫描分布图，指示罗丹明成分。图11C是与图11A所示相同的纳米缀合物在220nm的扫描图谱，指示PMLA/LLL/AP-2/D1-肽组分。
图12A-12C说明合成的P/LLL/AP-2/D3-肽/罗丹明的特征。图12A说明扫描A200-A700nm的SEC-HPLC顶视图对显示P/LLL/AP-2/D3-肽/罗丹明完全纳米缀合物的保留时间和吸光度的关系。图12B是与图12A所示相同的纳米缀合物在572nm吸收罗丹明处的扫描分布图。图12C是图12A所示的纳米缀合物在220nm波长下记录的P/LLL/AP-2/D3-肽组分的扫描分布图。
图13是静脉内注射PBS缓冲液到小鼠尾静脉2小时后在荧光下检查的左海马CA1的照片
图14是示出包括上矢状窦(SSS)的主要血管的大脑的示意图，所述主要血管是沿着大脑的中线延伸的大血管。
图15A-15C说明了P/LLL/AP-2/罗丹明的浓度依赖性BBB渗透。图15A是一组照片，示出了在静脉注射P/LLL/AP-2/罗丹明后120min时获得的光学成像数据。在以下浓度下：照片1-29.5μmol/kg；照片2-59μmol/kg；照片3-118μmol/kg；和照片4-236μmol/kg。图15B是一个图表，说明了纳米缀合物的荧光强度对用三种不同浓度注射的小鼠脑实质中的“距血管的距离”尺寸的关系。图15C是一组图表：图1-皮质；图2-中脑和图3海马，说明了以四种不同药物浓度注射后测量的脑实质中的平均纳米缀合物荧光。术语“P/LLL/AP-2”和“P/LLL/AP-2/罗丹明”在此关于微型纳米药物可互换使用。
图16A-16D示出了不同脑区域中的血管直径、血管覆盖率和血管间距。图16A是一组照片，示出了皮质、中脑和海马CA1细胞层中的血管(轮廓)。图16B是示出血管直径的柱状图。图16C是示出血管覆盖率的柱状图。图16D示出了定义为两个相邻血管之间的最短(欧几里得)距离的血管间距，其针对每个图像中的所有血管综合采样。
图17A-17B说明纳米缀合物组合物确定BBB渗透的程度和位点。图17A是一组照片，示出了大脑皮质的纳米缀合物渗透：照片1-P/LLL/AP-2；恒定注射剂量(118μmol/kg)下的照片2-P/AP-2和照片3-P/LLL。图17B是一组柱状图，显示了大脑皮质(1)、中脑(2)和海马(2)中的平均纳米缀合物荧光，其作为纳米缀合物组成和浓度的函数：P/LLL/AP-2以黑色显示，P/AP-2以灰色显示，P/LLL以白色显示。图17A-17B中提及的所有纳米缀合物都含有罗丹明。
图18A-18B说明了缀合的LLL残基对纳米缀合物构象的影响。图18A是缀合物的化学结构。LLL在结构示意图中用黑色箭头表示。图18B是具有PEG(2链乙二醇-六聚体，通过马来酰亚胺与PMLA缀合)、封端的巯基(两个部分)和LLL(4个部分)的短PMLA(16个苹果酸残基)的三维图像。
图19A-19B示出了在不存在LLL的情况下的纳米缀合物构象。图19A示出了结构模型，并且与图18A所示的相似，但是缺少LLL。图19B是图19A所示结构的三维图像。
图20A-20E说明纳米缀合物肽部分筛选。图20A是一组照片，示出了配备有不同肽(1-P/LLL/AP-2；2-P/LLL/M4；和3-P/LLL/B6)的P/LLL纳米缀合物，以评估它们在以118μmol/kg的浓度(即，以恒定的注射剂量)注射到小鼠中之后在BBB渗透中的作用。图20B-20D是一组柱状图，显示了大脑皮质(图20B)、中脑(图20C)和海马(图20D)中的平均纳米缀合物荧光作为注射浓度的函数。图20E示出了纳米缀合物P/LLL/AP-2(2％)、P/LLL/AP-2/M4、P/LLL/AP-2(4％)和P/LLL/AP-7以59μmol/kg或118μmol/kg的浓度注射到小鼠中时在大脑皮质中的荧光测量(即，评估两个剂量)。图20A-20E中提及的所有纳米缀合物都含有罗丹明。
图21A-21D说明了纳米缀合物荧光在血清和脑组织中的药代动力学。图21A是说明对P/LLL/AP-2(黑色)和P/LLL(灰色)进行血清清除分析的图表，并且通过脑血管内容物的成像进行光学分析(黑色，三角形)。图21B是一组照片，说明了矢状窦及其周围的光学成像数据，显示了240min内的药物清除和实质累积。图21C说明了矢状窦的血管荧光强度图，如图21B的最左图中的白线所示。图21D是一个条形图，展示了脑组织中的纳米缀合物荧光强度对于P/LLL/AP-2(黑色)、P/LLL(灰色)以及P/AP-2(白色)的时间依赖性，这些与血清PK动力学不同。图21A-21D中提及的所有纳米缀合物都含有罗丹明。
图22A-22C显示了纳米缀合物(A1-A2)的不同灰色阴影的云状物所示的浓度，并且在静脉内注射P/LLL/AP-2至大脑皮质的实质后，在图22B和图22C中以μg/mL定量。图22A是一组照片，其说明显示来自注射了29.5μmol/kg(A1)和118μmol/kg(A2)的P/LLL/AP-2的小鼠的皮质组织和目的区域(点状)的光学成像数据，用于比较血管组织和实质中的荧光强度。图22B说明脉管系统/皮质脑实质中的荧光比率。图22C说明了作为注射剂量的函数的皮质脑实质中估计的P/LLL/AP-2浓度，其基于来自血管中PK测量值的已知浓度和血管与目的区域中荧光的测量强度比。图22A-22C中提及的所有纳米缀合物都含有罗丹明。
图23A-23C说明通过注射用罗丹明标记的纳米缀合物对斑块的肽依赖性标记。图23A是说明注射P/LLL/M4后的小鼠的光学成像数据的照片。图23B是说明注射P/LLL/M4/D1后小鼠的光学成像数据的照片。图23C是显示用罗丹明标记的纳米缀合物PMLA、P/cTfRL、P/M4、P/LLL/AP-2、P/LLL/M4、P/AP-2/ACI-89、P/LLL/AP-2/D3、P/LLL/AP-2/D1和P/LLL/M4/D1的Aβ结合的荧光强度的条形图。显示了斑块相对于背景的标记(信号噪声)。
具体实施方式
在以下描述中使用的某些术语仅为了方便而非限制。除非另有说明或从上下文暗示，以下术语和短语包括以下提供的含义。除非明确地另外说明，或从上下文中显而易见，否则以下术语和短语不排除术语或短语在其所属的领域中已获得的含义。提供定义是为了帮助描述特定实施例，而不是为了限制要求保护的发明，因为本发明的范围仅由权利要求书限制。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。
单数术语“一”、“一个”和“该”包括复数对象，除非上下文另有明确说明。类似地，除非上下文另外清楚地指示，否则词语“或”旨在包括“和”。
短语“至少一个”，后面跟着两个或更多个项目的列表，例如“A、B或C”，意指A、B或C中的任何单独的一个以及它们的任何组合。
词语“右”、“左”、“顶部”和“底部”表示所参考的附图中的方向。
尽管与本文所述的那些类似或等同的方法和材料可用于本发明的实践或测试，但下文描述了合适的方法和材料。
术语“肽”是指通过肽键连接的连续的且相对短的氨基酸序列。术语“肽”和“多肽”可互换使用。肽可以具有约2至10个氨基酸、8至20个氨基酸或6至25个氨基酸的长度。
术语“氨基酸”和“氨基酸残基”在本文中可互换使用。
“异常状况”是指患者体内细胞和组织的功能偏离体内正常功能。异常状况可以指疾病。异常状况可以包括脑障碍。脑障碍可以是但不限于阿尔茨海默病、多发性硬化、帕金森病、亨廷顿病、精神分裂症、焦虑、痴呆、智力低下和焦虑。异常状况可以包括增殖性疾病。术语“增殖性疾病”和“增殖性疾病”是指与异常细胞增殖相关的疾病。增殖性疾病可以是但不限于癌症、血管发生、银屑病和纤维化病症。
一个实施方案提供了一种微型纳米药物，其包含聚苹果酸基的分子支架、一种或多种能够跨越血脑屏障的肽、内体裂解配体和治疗剂。能够跨越血脑屏障的肽、内体裂解配体和治疗剂中的每一种均可以共价连接到聚苹果酸基的分子支架上。
如本文所用，术语“能够跨越血脑屏障的肽”是指能够结合负责维持脑-血屏障完整性和脑稳态的受体的任何肽。一种或多种能跨越血脑屏障的肽可以是LRP-1配体或转铁蛋白受体配体。一种或多种能够跨越血脑屏障的肽可以是可以结合低密度脂蛋白(LDL)受体相关蛋白(LPR)的肽，所述低密度脂蛋白(LDL)受体相关蛋白(LPR)具有介导配体穿过脑-血屏障的内皮细胞的转运的能力。一种或多种能够跨越血脑屏障的肽可以是血管肽素-2(Angiopep-2)，一种抑肽酶衍生肽，能够结合脂蛋白受体相关蛋白-1(LRP-1)并促进CNS中的药物递送(Demeule et al.，2008，其通过引用并入本文，如同完全阐述一样)。术语“血管肽素-2”和“AP-2”在此可互换使用。血管肽素-2可以是半胱氨酸修饰的血管肽素-2，半胱氨酸修饰的血管肽素-2肽可以是包含氨基酸序列TFFYGGSRGKRNNFKTEEYC(SEQ ID NO：1)的肽。血管肽素-2肽可以是血管肽素-2肽的变体。血管肽素-2肽的变体可以是包含与SEQ IDNO：1的序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％序列同一性的氨基酸的肽，血管肽素-2肽的变体可以是SEQ ID NO：1的序列的任何变体，其中在位置10和/或15处的赖氨酸残基保持不变。
一种或多种肽可以是能够结合LPR、跨越血脑屏障并促进所述微型纳米药物在CNS中递送的任何其它肽。
在一个实施方案中，一种或多种肽可以是增强本文所述的任何一种微型纳米药物通过转铁蛋白受体(TfR)途径跨越血脑屏障的肽。TfR途径将铁(与转铁蛋白Tf复合)导入脑中，并参与脑铁稳态。一种或多种能够跨越血脑屏障的肽可以是结合TfR的配体或结合运铁蛋白(Tf)的配体。转铁蛋白配体可以是铁模拟肽(Fe mimetic peptide)，本文也称为cTfRL。铁模拟肽可以是包含氨基酸序列CRTIGPSVC(SEQ ID NO：2)的肽。铁模拟肽的变体可以是包含与SEQ ID NO：2的序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％序列同一性的氨基酸的肽。铁模拟肽的变体可以是SEQ ID NO：2序列的任何变体，其能够结合其靶标并跨越血脑屏障。例如，结合固定化运铁蛋白(Tf)(其进一步结合运铁蛋白受体(TfR))的变体可通过表面等离子体共振(SPR)方法(Ding et al.(2016)，通过引用结合到本文中，如同完全阐述一样)。铁模拟肽或其变体可以是环状的，可以包含二硫键(-S-S-)，或可以包含本领域已知的任何其它修饰。当巯基形成二硫键(-SS-)-环状变体时，铁模拟肽或其变体可通过其末端-NH2基团的适当接头与PMLA连接，或者以线性形式在一个巯基如硫醚处与PMLA连接。
在一个实施方案中，运铁蛋白受体配体可以是B6肽。B6肽可以是包含氨基酸序列CGHKAKGPRK(SEQ ID NO：8)的肽。B6肽可以是包含与SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％序列同一性的氨基酸的肽。B6肽的变体可以是SEQ ID NO：8的氨基酸序列的任何变体，其能够结合其靶目标TfR并跨越血脑屏障。B6肽变体与运铁蛋白受体(TfR)的结合可通过例如表面等离子体共振(SPR)方法(Ding et al.(2016)，其在此引入作为参考，如同完全阐述一样)。
一种或多种能够跨越血脑屏障的肽可以是迷你蜂毒明肽-4(MiniAp-4)肽。迷你蜂毒明肽-4是一种从蜂毒中得到的肽，并且能够跨越血脑屏障(Oller-Sara et al.2010，其在此引入作为参考，如同完全阐述一样)。迷你蜂毒明肽-4肽可以是包含氨基酸序列KAPETALD(SEQ ID NO：3)的肽。迷你蜂毒明肽-4肽可包含与SEQ ID NO：3的序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的氨基酸序列。迷你蜂毒明肽-4肽的变体可以是SEQ ID NO：3序列的任何变体，其能够跨越血脑屏障(BBB)。用于测量BBB渗透活性的测定法是本领域已知的。例如，微型纳米药物的BBB渗透可以使用如本文实施例4中所述的荧光成像离体测定。
在一个实施方案中，一种或多种能够跨越血脑屏障的肽可以是两种或更多种肽。两种或多种肽可以是相似的肽。可以独立地选择两种或更多种肽。
所述微型纳米药物可以包括血管肽素-2、铁模拟肽、B6肽和迷你蜂毒明肽-4肽的任意组合。所述微型纳米药物可以包含能够跨越血脑屏障的任何其他肽。
在一个实施方案中，所述微型纳米药物可包含治疗剂。治疗剂可以是反义寡核苷酸、siRNA寡核苷酸、肽或低分子量药物。治疗剂可以是两种或更多种治疗剂的组合。治疗剂可以是反义寡核苷酸或siRNA。反义寡核苷酸可以是吗啉代(Morpholino)反义寡核苷酸。
在一个实施方案中，治疗剂可抑制β-分泌酶或γ-分泌酶的合成或淀粉样蛋白β(Aβ)产生的活性。反义寡核苷酸或siRNA可以包含与β-分泌酶或γ-分泌酶的mRNA转录物中含有的序列互补的序列。反义寡核苷酸可以包括与SEQ ID NO：4的序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的核酸序列。β-分泌酶和γ-分泌酶是蛋白水解酶，其在底物特异性氨基酸位点裂解淀粉样前体蛋白(APP)并产生淀粉样-β(Aβ)肽，其在脑组织中积累并引起阿尔茨海默病(AD)。抑制β-或γ-分泌酶活性在AD的治疗中可能具有治疗潜力。
在一个实施方案中，所述微型纳米药物可包含血管肽素-2、铁模拟肽、B6肽或迷你蜂毒明肽-4肽或其任何组合，并且所述反义寡核苷酸或siRNA包含与β-分泌酶或γ-分泌酶的mRNA转录物中所含序列互补的核酸序列。
在一个实施方案中，治疗剂可以是例如用于AD治疗的治疗肽。治疗性肽可以是靶向淀粉样蛋白斑并诱导微型纳米药物对阿尔茨海默病(AD)损伤的降解活性的肽。治疗肽可以是β-折叠破坏肽。如本文所用，术语“β-折叠破坏肽”是指通过抑制β折叠Aβ1-42的相互连接来破坏Aβ的β折叠元件和自我识别基序，从而防止Aβ的错误折叠和聚集的肽(Lin et al.(2014)，其通过引用并入本文，如同完全阐述一样)。
β-折叠破坏肽可以是H102肽。102肽可以是包含氨基酸序列HKQLPFFEED(SEQ IDNO：6)的肽。102肽可以是包含与SEQ ID NO：6的氨基酸序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％序列同一性的氨基酸的肽。H102肽的变体可以是SEQID NO：6序列的任何变体，其能够抑制β-折叠Aβ1-4的形成和通过Aβ的“错折叠”和聚集。因此，H102肽的变体可以是能够溶解斑块的任何变体。可以测量溶解斑块的能力。例如，治疗和参考动物中的斑块的数量和大小可以通过如本文实施例4中所述的光学成像离体测量。体内分析，例如，正电子发射断层摄影术(PET)、近红外光谱(NIR)或红外(IR)成像是本领域已知的，并且可以用于成像淀粉样斑块(Nordberg(2008)、Kung et al.(2012)和Cheng etal.(2018)，所有这些文献通过引用并入本文，如同完全阐述一样)。
在一个实施方案中，所述微型纳米药物可以包含一种或多种能够跨越血脑屏障的肽，和β-折叠破坏肽。所述微型纳米药物可以包括血管肽素-2、铁模拟肽、B6肽或迷你蜂毒明肽-4肽或其任意组合，以及H102肽。所述微型纳米药物还可以携带本文所述的任何反义寡核苷酸。
在一个实施方案中，用于AD治疗的治疗肽可以是斑块结合肽。如本文所用，术语“斑块结合肽”是指结合或标记由淀粉样肽β(Aβ)组成的神经斑的肽，Aβ是AD的特征病理标志。斑块结合肽可以是本文所述的β-折叠破坏肽。斑块结合肽可以是特异性结合淀粉样蛋白β1-42(Aβ42)的D-对映体肽。D-对映体肽可以结合或标记脑中含有Aβ42的斑块。
在一个实施方案中，所述D-对映体肽可以是D1-肽、D3-肽和ACI-89-肽中的一种或多种，或它们的变体。D-对映体肽可以是包含氨基酸序列QSHYRHISPAQVC(SEQ ID NO：9)的D1-肽。D1-肽可以是包含与SEQ ID NO：9的氨基酸序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％序列同一性的氨基酸的肽。D1-肽的变体可以是SEQ IDNO：9序列的任何变体，其能够结合或标记含有Aβ42的斑块。例如，离体测定斑块可包括试剂分子与淀粉样蛋白的结构单元(氨基酸结构域)的结合，以及测量试剂-淀粉样蛋白形成的荧光性质的变化，例如通过溶解在这些形态中的斑块物质。当β-淀粉样蛋白暴露于斑块中时，不同的D-肽可以识别β-淀粉样蛋白中的不同氨基酸序列。由于结合的功效，这些试剂可以使淀粉样蛋白相互作用不稳定，形成游离的淀粉样蛋白物质，这可以涉及进一步与试剂结合。试剂的总体功效可以取决于与斑块结构域的结合强度。在斑块溶解的情况下，可以使用形态测定分析来比较治疗的和参考的相似疾病阶段的小鼠。
D-对映体肽可以是包含氨基酸序列RPRTRLHTHRNRC(SEQ ID NO：10)的D3-肽。D3-肽可以是包含与SEQ ID NO：10的氨基酸序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％序列同一性的氨基酸的肽。
D3-肽的变体可以是SEQ ID NO：10的序列的任何变体，其能够结合或标记含有Aβ42的斑块。
所述D-对映体肽可以是包含氨基酸序列PSHYRHISPAQKC(SEQ ID NO：11)的ACI-89-肽。ACI-89肽可以是包含与SEQ ID NO：11的氨基酸序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％序列同一性的氨基酸的肽。ACI-89-肽的变体可以是SEQ ID NO：11序列的任何变体，其能够结合或标记含有Aβ42的斑块。
在一个实施方案中，所述微型纳米药物可以包含一种或多种能够跨越血脑屏障的肽，以及一种或多种斑块结合肽。所述微型纳米药物可以包括血管肽素-2、铁模拟肽、B6肽或迷你蜂毒明肽-4肽或其任意组合，以及D1-肽、D3-肽或ACI-89肽或其任意组合。所述微型纳米药物还可以包含β-折叠破坏肽。所述微型纳米药物还可以携带任何反义寡核苷酸。所述微型纳米药物可包含本文所述的肽和治疗剂的任意组合。
确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比可以包括比对和比较两个序列中相应位置的氨基酸残基或核苷酸。如果两个序列中的所有位置都被相同的氨基酸残基或核苷酸占据，则称该序列100％相同。同一性百分比通过Smith Waterman算法(SmithTF，Waterman MS1981，“Identification of Common Molecular Subsequences(普通分子子序列的鉴定)”，J Mol Biol147:195-197，其通过引用并入本文，如同完全阐述一样)。
如本文所用，“变体”或“变体肽”是指保留与原始序列相同或基本相似的生物活性的肽。变体可以具有与肽或其片段的原始序列相似但不相同的序列。变体可以包括一个或多个氨基酸残基的取代、缺失、插入或其任意组合。变体可以来自相同或不同的物种，或者可以是基于天然或先前序列(prior sequence)的合成序列。变体肽可以具有与肽的特定序列相同的长度，或者可以在肽的一个或两个末端具有额外的氨基酸残基。变体可以是肽的片段。原始序列的片段是原始序列的连续或邻接部分。例如，20个氨基酸长的原始肽的片段的长度可以在原始肽内的任何2至19个连续氨基酸中变化。
一个实施方案包括具有本发明所列任一氨基酸或其互补序列中所示序列的一部分的氨基酸序列、肽或多肽。这些氨基酸序列、肽或多肽可具有2至全长、4至6、6至8、8至10、10至12、12至14、14至16或7至13、或7、8、9、10、13、20或21个氨基酸范围内的长度。具有上述范围之一内的长度的氨基酸序列、肽或多肽可以具有在所列举的范围内的任何特定长度，包括端点。所述氨基酸长度可以在参考序列内的任何单个位置(即，本文的任何一个氨基酸)处开始，其中在所述单个位置之后有足够的氨基酸来适应所述长度。所述长度可以是参考序列的全长。
当本文所述的能够穿过BBB的任何一种肽的变体或片段保留了原肽的一些或全部活性时，该变体或片段具有生物活性，并且能够将其所连接的微型纳米药物转运穿过BBB。当本文所述的任一种斑块结合肽的变体或片段保留了原始肽的一些或全部活性时，所述变体或片段具有生物活性，并且能够结合或标记由淀粉样肽β(Aβ)组成的神经斑。
变体和片段的活性可以在测定中确定。该测定可包括测试变体结合受体或穿过BBB的能力。例如，该试验可以测试由淀粉样肽β(Aβ)组成的神经斑的结合或标记。原始肽的变体和片段与原始肽相比可以具有更高或更低的活性。片段的变体与原始肽相比可以具有较低的活性，只要它们能够实现期望的结果。
肽或其变体可以具有另外的组分或基团。例如，肽或其变体的序列可以在C末端与-NH2基团连接。肽或其变体的序列可以在N-末端与二氨基庚二酸(DAP)或羟基二氨基庚二酸(H-DAP)连接。肽或其变体可以含有键以增加肽的稳定性和折叠。例如，肽或其变体可包含形成环外结构的二硫键(-S-S-)，所述环外结构改善对肽酶切割的抗性。肽或其变体的序列可以与任何其它部分或基团连接。
所述肽的分子量没有限制，可以具有任何所需的分子量。在一个实施方案中，所述肽的分子量为约1,000kDa、约1,500kDa、约2,000kDa、约2,500kDa、约3,000kDa、约3,500kDa、约4,000kDa、约4,500kDa、约5,000kDa、约10,000kDa或约15,000kDa。在一个实施方案中，所述肽可具有约1kDa至约15kDa的分子量。在一个实施方案中，肽可以具有15kDa或更小的分子量。
在一个实施方式中，本文所述的每种肽可以通过接头缀合至聚苹果酸基的分子支架。如本文所用，术语“接头(linker)”是指连接化合物的两个部分的有机部分。
在一个实施方案中，接头可以包含聚乙二醇(PEG)。PEG可以是任何所需分子量的，没有限制。在一个实施方案中，PEG的分子量可以是约1,000Da、约1,500Da、约1,000Da、约2,500Da、约3,000Da、约3,500Da、约4,000Da、约4,500Da、约5,000Da、约10,000Da、约15,000Da、约20,000Da、约25,000Da或约30,000Da。在一个实施方案中，PEG可以具有约3,400Da的分子量。
在一个实施方案中，所述微型纳米药物可以包括内体裂解配体(endosomolyticligand)。内体裂解配体可以与聚苹果酸基的分子支架共价连接。如本文所用，术语“内体裂解配体”是指具有内体溶解性质的分子。内体裂解配体促进本发明的组合物或其组分从细胞区室，例如细胞内的内体、溶酶体、内质网(ER)、高尔基体、微管、过氧化物酶体或其它囊泡体溶解和/或转运至细胞的细胞质。内体裂解配体可以是，但不限于，咪唑，聚或寡咪唑，直链或支链的聚乙烯亚胺(PEIs)，直链或支链的聚胺，例如精胺，阳离子直链或支链的聚胺，聚羧酸酯，聚阳离子，掩蔽的寡或聚阳离子或阴离子，缩醛，聚缩醛，缩酮/聚缩酮，原酸酯，具有掩蔽或未掩蔽的阳离子或阴离子电荷的直链或支链的聚合物，具有掩蔽或未掩蔽的阳离子或阴离子电荷的树枝状聚合物，聚阴离子肽，聚阴离子肽模拟物，pH敏感肽，天然或合成的融合脂质，天然或合成的阳离子脂质。
在一个实施方案中，内体裂解配体可以包括多个亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、色氨酸或苯丙氨酸残基。该核内体裂解配体可以是色氨酸-色氨酸-色氨酸(Trp-Trp-Trp)(WWW)、苯丙氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸(Phe-Phe-Phe)(FFF)、亮氨酸-亮氨酸-亮氨酸(Leu-Leu-Leu)(LLL)或异亮氨酸-异亮氨酸-异亮氨酸(Ile-Ile-Ile)(I-I-I)。WWW、FFF、LLL或III可增强微型纳米药物跨越血脑屏障的能力。
在一个实施方式中，所述聚苹果酸基的分子支架可以是聚苹果酸。本文所用的术语“聚苹果酸(polymic acid)”是指聚合物，例如均聚物、共聚物或含有主链酯键的嵌段聚合物。聚苹果酸可以是可生物降解的和具有高分子柔韧性的、可溶于水(当离子化时)和有机溶剂(以其酸形式)的、无毒的、或无免疫原性的(Lee B et al.,Water-solublealiphatic polyesters:poly(malic acid)s(水溶性脂族聚酯：聚(苹果酸))，in：Biopolymers(生化聚合物)，vol.3A(Doi Y，Steinbuchel A eds，pp75-103，Wiley-VCH，NewYork2002，其在此引入作为参考，如同完全阐述)。
聚苹果酸的分子量没有限制，可以是任何长度和任何分子量。聚苹果酸的分子量为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200kDa。聚苹果酸的分子量为10、20、30、40、50或60kDa。
在一种实施方式中，聚苹果酸的分子量可以在以下分子量中的任意两个之间的范围内：10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、或200kDa。在一种实施方式中，聚苹果酸的分子量可以在以下质量中的任意两种之间的范围内：40、45、50、55或60kDa。
描述了适用于本文公开的成像纳米剂的示例性聚苹果酸基的分子支架，例如，在PCT申请中，2004年12月3日提交的PCT申请PCT/US04/40660、2009年4月10日提交的PCT/US09/40252和2010年12月10日提交的PCT/US 10/59919、2010年12月30日提交的PCT/US10/62515；以及2007年3月23日提交的美国专利申请10/580,999和2010年9月28日提交的美国专利申请12/935,110，其全部内容通过引用并入本文，如同完全阐述一样。
所述微型纳米药物可以与另外的治疗剂连接。所述另外的治疗剂可以是用于治疗AD的药物。用于治疗AD的其它示例性药物可以是但不限于胆碱酯酶抑制剂、毒蕈碱激动剂、抗氧化剂或抗炎药。可以使用加兰他敏(雷明基)、他克林(Cognex)、司来吉兰、多奈哌齐、(安理申(Aricept))、沙鲁唑、乙酰基-L-肉碱、艾地苯醌、ENA-713、迈瑞克(memric)、喹硫平或弗鲁贝切斯塔特(verubecestat)(3-亚氨基-1，2，4-噻二嗪1，1-二氧化物衍生物)。
所述另外的治疗剂可以是抗癌剂。其它适合于本发明的示例性抗癌剂可以是但不限于紫杉醇(泰素)；多西他赛；吉米替滨；阿利维A酸；氨磷汀；贝沙罗汀博来霉素；去氢甲睾酮；卡培他滨；铂酸盐；苯丁酸氮芥；阿糖胞苷；柔红霉素、柔红霉素；多西他赛；阿霉素；丙酸屈莫司琼；氟尿嘧啶(5-FU)；甲酰四氢叶酸；甲氨蝶呤；丝裂霉素C；米托蒽醌；帕米膦酸诺龙；光神霉素；卟吩姆钠；丙卡巴肼；奎纳克林；替莫唑胺；或托泊替康。
在一个实施方案中，所述微型纳米药物可以进一步包含成像剂。成像剂可以是任何荧光报告染料。多种荧光报告染料，例如荧光团，是本领域已知的。通常，荧光团是芳族或杂芳族化合物，并且可以是芘、蒽、萘、吖啶、茋、吲哚、苯并吲哚、噁唑、噻唑、苯并噻唑、花青、羰花青、水杨酸盐、邻氨基苯甲酸盐、香豆素、荧光素、罗丹明或其它类似化合物。合适的荧光报道分子可以包括呫吨染料，例如荧光素或罗丹明染料。荧光团可以是，但不限于，1,5IAEDANS；1,8-ANS；4-甲基伞形酮；5-羧基-2,7-二氯荧光素；5-羧基荧光素(5-FAM)；5-羧基萘荧光素(pH10)；5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA)；5-FAM(5-羧基荧光素)；5-羟色胺(HAT)；5-ROX(羧基-X-罗丹明)；5-TAMRA(5-羧基四甲基罗丹明)；6-羧基罗丹明6G；6-CR6G；6-JOE；7-氨基-4-甲基香豆素；7-氨基放线菌素D(7-AAD)；7-羟基-4-甲基香豆素；9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶；ABQ；酸性品红；ACMA(9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶)；吖啶橙；吖啶红；吖啶黄；吖啶黄素；吖啶黄素福尔根SITSA(Acriflavin Feulgen SITSA)；水母发光蛋白(发光蛋白)；荧光基团(Alexa Fluor)350TM；荧光基团430TM；荧光基团488TM；荧光基团532TM；荧光基团546TM；荧光基团568TM；荧光基团594TM；荧光基团633TM；荧光基团647TM；荧光基团660TM；荧光基团680TM；茜素氨羧络合剂；茜素红；别藻蓝蛋白(APC)；AMC，AMCA-S；AMCA(氨甲基香豆素)；AMCA-X；氨基放线菌素D；氨基香豆素；苯胺蓝；硬脂酸蒽酯；APC-Cy7；APTS；阿斯屈拉松亮红(Astrazon Brilliant Red)4G；阿斯屈拉松橙R；阿斯屈拉松红6B；阿斯屈拉松黄7GLL；阿特拉滨；ATTO-TAGTM CBQCA；ATTO-TAGTM FQ；金胺；磷化氢亚金(Aurophosphine)G；磷化氢亚金(Aurophosphine)；BAO9(双氨基苯基噁二唑)；BCECF(高pH)；BCECF(低pH)；硫酸小檗碱；β内酰胺酶；BFP蓝移GFP(Y66H)；BG-647；百明(Bimane)；双苯甲酰胺；布兰科福尔荧光增白剂(Blancophor)FFG；布兰科福尔荧光增白剂SV；BOBOTM-1；BOBOTM-3；氟硼二吡咯(氟硼二吡咯)492/515；氟硼二吡咯493/503；氟硼二吡咯500/510；氟硼二吡咯505/515；氟硼二吡咯530/550；氟硼二吡咯542/563；氟硼二吡咯558/568；氟硼二吡咯564/570；氟硼二吡咯576/589；氟硼二吡咯581/591；氟硼二吡咯630/650-X；氟硼二吡咯650/665-X；氟硼二吡咯665/676；氟硼二吡咯Fl；氟硼二吡咯FL ATP；氟硼二吡咯Fl-神经酰胺；氟硼二吡咯R6GSE；氟硼二吡咯TMR；氟硼二吡咯TMR-X缀合物；氟硼二吡咯TMR-X，SE；氟硼二吡咯TR；氟硼二吡咯TR ATP；氟硼二吡咯TR-X SE；BO-PROTM-1；BO-PROTM-3；亮硫黄素FF；钙黄绿素；钙黄绿素蓝；钙红(Calcium CrimsonTM)；钙绿；钙绿-1Ca2+染料；钙绿-2Ca2+；钙绿-5N Ca2+；钙绿-C18 Ca2+；钙橙；荧光增白剂(Calcofluor White)；羧基-X-罗丹明(5-ROX)；层叠蓝(CascadeBlueTM)；层叠黄；儿茶酚胺；CFDA；CFP-氰基荧光蛋白；叶绿素；色霉素A；色霉素A；CMFDA；腔肠素；腔肠素cp；腔肠素f；腔肠素fcp；腔肠素h；腔肠素HCP；腔肠素ip；腔肠素O；香豆素鬼笔环肽；CPM甲基香豆素；CTC；Cy2TM；Cy3.18；Cy3.5TM；Cy3TM；Cy5.18TM；Cy5.5TM；Cy5TM；Cy7TM；青色GFP；环腺苷酸荧光传感器(FiCRhR)；d2；DABCYL；丹磺酰；丹磺酰胺；丹磺酰尸胺；丹磺酰氯；丹磺酰基DHPE；丹磺酰氟；DAPI；二环氧；二环氧2；二环氧3；DCFDA；DCFH(二乙酸二氯二氢荧光素)；DDAO；DHR(二氢罗丹明123)；二-4-ANEPPS；二-8-ANEPPS(非比例)；DiA(4-Di-16-ASP)；DIDS；二氢异佛尔酮胺123(DHR)；DiO(DiOC18(3))；DiR；DiR(DiIC18(7))；多巴胺；DsRed；DTAF；DY-630-NHS；DY-635-NHS；EBFP；ECFP；EGFP；ELF97；曙红；赤藓红；赤藓红ITC；乙锭同型二聚体-1(EthD-1)；欧几里得溶素；氯化铕(III)；铕；EYFP；坚牢蓝；FDA；硫磺乐根(副玫瑰苯胺)；FITC；FL-645；鲜橙；氟-3；氟-4；荧光素二乙酸酯；氟-绿宝石；氟-金(羟基苯乙脒)；氟-红宝石；氟罗X；FM1-43 TM；FM4-46 TM；富拉红(Fura Red)TM(高pH)；富拉-2，高钙；富拉-2，低钙；结亚克力亮红(Genacryl Brilliant Red)B；结亚克力亮黄10GF；结亚克力粉3G；结亚克力黄5GF；GFP(S65T)；GFP红移(rsGFP)；GFP野生型，非UV激发(wtGFP)；GFP野生型，UV激发(wtGFP)；GFPuv；乙二酸；颗粒蓝；血丝卟啉；赫斯特(Hoechst)33258；赫斯特33342；赫斯特34580；HPTS；羟基香豆素；羟基苯乙脒(Fluorocolld)；羟色胺；吲多羰花菁(DiD)；吲哚三羰菁(DiR)；内白(Intrawhite)Cf；JC-1；JO-JO-1；JO-PRO-1；镭射先(LaserPro)；莱罗丹(Laurodan)；LDS751；雷可福(Leucophor)PAF；雷可福SF；雷可福WS；丽丝胺罗丹明；丽丝胺罗丹明B；LOLO-1；LO-PRO-1；荧光黄；麦格绿(Mag Green)；苏格达红(根皮苷B)；镁绿；镁橙；孔雀石绿；马里娜蓝；美西隆亮黄菌素10GFF；美西隆亮黄素8GFF；中花青素；甲氧基香豆素；米托示踪绿(Mitotracker Green)FM；米托示踪橙；米托示踪红；光辉霉素；单溴二胺(Monobromobimane)；单溴二胺(mBBr-GSH)；单氯二胺(Monochlorobimane)；MPS(甲基绿色派洛宁芪)；NBD；NBD胺；尼罗红；硝基苯并恶二唑；去甲肾上腺素；核坚牢红；核黄；尼龙山亮黄素(Nylosan Brilliant Iavin)E8G；俄勒冈绿(Oregon Green)；俄勒冈绿488-X；俄勒冈绿488；俄勒冈绿500；俄勒冈绿514；太平洋蓝；副玫瑰苯胺(Feulgen)；PE-Cy5；PE-Cy7；PerCP；PerCP-Cy5.5；PE-德州红(PE-TexasRed)(红色613)；根皮苷B(苏丹红)；磷碳铁AR；磷碳矿BKL；磷碳铁Rev；磷碳铁RPA；膦3R；光阻剂(PhotoResist)；藻红蛋白B[PE]；藻红蛋白R[PE]；PKH26；PKH67；PMIA；浮色蓝黑；POPO-1；POPO-3；PO-PRO-1；PO-PRO-3；报春灵；普罗西隆黄；碘化丙锭(PI)；PyMPO；芘；派洛宁；派洛宁B；皮左亮黄素(PyrozalBrilliant Flavin)7GF；QSY7；奎纳克林芥菜；试卤灵；RH414；Rhod-2；罗丹明；罗丹明110；罗丹明123；罗丹明5GLD；罗丹明6G；罗丹明B540；罗丹明B200；罗丹明B提取物(Rhodamine BExtra)；罗丹明BB；罗丹明BG；罗丹明绿；罗丹明Phallicidine；罗丹明鬼笔环肽(RhodaminePhallioidine)；罗丹明红；罗丹明WT；玫瑰红；R-藻红蛋白(PE)；红移GFP(rsGFP，S65T)；S65a；S65C；S65L；S65T；蓝宝石GFP；血清素；塞夫隆(Sevron)亮红2B；塞夫隆亮红4G；塞夫隆艳红B；塞夫隆橙；塞夫隆黄L；sgBFP；sgBFP(超辉(Super Glow)BFP)；sgGFP；sgGFP(超辉光GFP)；SITS；SITS(报春灵)；SITS(二苯乙烯异硫氰磺酸)；SPQ(6-甲氧基-N-(3-磺丙基)-喹啉鎓)；二苯乙烯；磺基罗丹明B可以是C；磺基罗丹明G提取物；四环素；四甲基罗丹明；德州红(Texas Red)；德州红-X共轭物；硫羰花青(DiSC3)；噻嗪红R；噻唑橙；硫磺素5；硫磺素S；硫磺素TCN；硫代硫酸盐；噻唑橙；廷诺坡尔(Tinopol)CBS(荧光增白剂)；TMR；TO-PRO-1；TO-PRO-3；TO-PRO-5；TOTO-1；TOTO-3；TriColor(PE-Cy5)；TRITC(四甲基罗丹明异硫代氰酸酯)；真蓝色(True Blue)；真红色；阿错赖特(Ultralite)；荧光素钠(Uranine)B；尤辉得(Uvitex)SFC；wt GFP；WW781；XL665；X-罗丹明；XRITC；二甲苯橙；Y66F；Y66H；Y66W；黄色GFP；YFP；YO-PRO-1；YO-PRO-3；YOYO-1；或YOYO-3。这些荧光化合物的许多合适形式是可获得的并且可以被使用。
适合用作成像剂的荧光蛋白的实例包括但不限于绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白(例如，DsRed)、黄色荧光蛋白、青色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白及它们的变体(参见例如美国专利6,403、374、6,800,733和7,157,566，其内容通过引用并入本文，如同完全阐述一样)。GFP变体的具体实例包括但不限于增强GFP(EGFP)、去稳定EGFP，Doan et al.，Mol.Microbiol,55:1767-1781(2005)中描述的GFP变体；Crameri et al.，Nat.Biotechnol.,14:315319(1996)中描述的GFP变体；Rizzo et al.，Nat.Biotechnol,22:445(2004)和Tsien,Annu.Rev.Biochem.,67:509(1998)中描述的天蓝荧光蛋白(cerulean fluorescent)；和Nagal et al,Nat.Biotechnol.,20:87-90(2002)所述的黄色荧光蛋白。DsRed变体描述于例如Shaner et al,Nat.Biotechnol.,22:1567-1572(2004)，并包括m草莓色(mStrawberry)、m樱桃色(mCherry)、m橙色(mOrange)、m香蕉色(mBanana)、m蜜色(mHoneydew)和m橘色(mTangerine)。其它DsRed变体描述于，例如Wang et al,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,101:16745-16749(2004)，包括m覆盆子色(mRaspberry)和m杨李色(mPlum)。DsRed变体的其它实例包括Fischer et al,FEBS Lett.,577:227-232(2004)中描述的mRFPmars和Fischer et al,FEBS Lett,580:2495-2502(2006)描述的mRFPruby。
成像剂可以是一种或多种花青染料。花青染料可以是但不限于吲哚菁绿(ICG)、Cy5、Cy5.5、Cy5.18、Cy7和Cy7.18、IR染料78、IR染料680、IR染料750、IR染料800亚磷酰胺、DY-681、DY-731和DY-781。
成像剂可以是适于近红外(NIR)荧光的荧光染料。NIR成像可以用于手术中对受试者中的细胞和组织的可视化和非侵入性成像。NIR荧光成像包括施用荧光造影剂(fluorescent contrast agent)，该荧光造影剂可以在780nm或更大的波长处被激发，并且具有在800nm或更大的波长处发射荧光的显著斯托克斯频移(Stoke’s shift)。
成像剂可以是适于通过磁共振(MRI)显像的试剂。成像剂可以包含顺磁性金属离子，例如锰(MnII)、铁(FeIII)或钆(Gd-III)。成像剂可以是DOTA-Gd (III)。
分子支架和与聚苹果酸基的分子支架共价连接的成分可以通过接头彼此连接。接头通常包含直接键或原子如氧或硫，如NR1、C(O)OC、C(O)NH、SO2NH、-SS-或原子链的单元，如取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、杂环基烷基、杂环基烯基、杂环基炔基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基(cycloalkenyl)、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基异芳醚、烷基异芳醚、烷基异芳醚、烷基异芳醚、烷基异芳醚、烷基异芳醚、烷基异芳醚、烷基异芳醚、烷基异环烷基、烷基异环烷基、烷基醚环烷基、烷基异环烷基、烷基异环烷基，其中，其中一个或多个亚甲基可以被O、S、S(O)、SO2、N(R1)2、C(O)、可裂解的连接基团、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环基中断或终止；其中R1是氢、酰基、脂族或取代的脂族。
在一个实施方案中，所述微型纳米药物还可以包含与聚苹果酸基的分子支架共价连接的PK调节配体。如本文所用，术语“PK调节配体(PK modulating ligand”和“PK调节剂(PK modulator)”是指能够调节成像纳米物质的药代动力学的分子。例如，PK调节剂可抑制或减少成像纳米剂被网状内皮系统(RES)再吸收和/或酶降解。
聚乙二醇化通常用于药物设计中以增加缀合蛋白的体内半衰期，延长循环时间，并增强到靶向实体瘤中的外渗(Arpicco et al.,2002 Bioconjugate Chem 13:757 andMaruyama et al,1997 FEBS Letters 413:1771，这两篇文献均通过引用并入本文，如同完全阐述一样)。因此，在一个实施方案中，该PK调节剂可以是PEG。PEG可以是任何所需分子量的，没有限制。在一个实施方案中，PEG的分子量可以是约1,000Da、约1,500Da、约1,000Da、约2,500Da、约3,000Da、约3,500Da、约4,000Da、约4,500Da、约5,000Da、约10,000Da、约15,000Da、约20,000Da、约25,000Da或约30,000Da。在一个实施方案中，该PK调节剂可以是约2,000Da的PEG。已知增加半衰期的其它分子也可用作PK调节剂。
所述微型纳米药物可以是任何期望的尺寸，没有限制。例如，所述微型纳米药物可以具有允许所述微型纳米药物经由靶向或经由胞转跨越血脑屏障的尺寸。在一个实施方案中，所述微型纳米药物的尺寸范围可以为约1nm至约10nm；从约1nm至约2nm；从约2nm至约3nm；从约3nm至约4nm；从约4nm至约5nm；从约5nm至约6nm；从约6nm至约7nm；从约7nm至约8nm；从约8nm至约9nm；从约9nm到约10nm。在一个实施方案中，所述微型纳米药物的尺寸可为约5nm至约10nm。在一个实施方案中，所述微型纳米药物的尺寸可以是10nm或更小。
本领域普通技术人员将理解，所述微型纳米药物可表现出在所指示的“尺寸”附近的尺寸分布。因此，除非另有说明，本文所用的术语“尺寸”是指微型纳米颗粒的尺寸分布的模式，即在尺寸分布中出现最频繁的值。测量大小的方法是本领域技术人员已知的，例如通过动态光散射(例如光关联光谱、激光衍射、低角度激光散射(LALLS)和中角度激光散射(MALLS))、光遮蔽方法(例如Coulter分析方法)或其它技术(例如流变学、以及光或电子显微镜)。
在一个实施方案中，提供了包含本文公开的任一种微型纳米药物和药学上可接受的载体或赋形剂的药学上可接受的组合物。
一个实施方案提供了一种用于治疗脑疾病或异常状况的方法。该方法可包括向有需要的受试者施用治疗有效量的包含本文所述的任一种微型纳米药物的组合物。
在一个实施方案中，用于治疗脑疾病或异常状况的方法可进一步包括向有需要的受试者提供包含本文所述的任一种微型纳米药物的组合物。所述脑疾病可以是阿尔茨海默病(AD)。AD是一种脑变性疾病，在1907年Alios Alzheimer对其患有认知能力急剧下降并患有全身性痴呆的患者之一进行检查后首次描述。AD与测量到的皮质、海马、下丘、海马回和扁桃体中直径高达200μm的神经炎斑块有关。神经炎性斑的主要成分之一是淀粉样蛋白。斑块由多肽原纤维组成，并且通常存在于血管周围，减少了对脑中的各种神经元的血液供应。
这些斑块主要由淀粉样β肽(Aβ；在文献中有时也称为β-淀粉样肽或β-肽)组成，其也是脑血管淀粉样沉积物中的主要蛋白质成分。在施用后，可以监测微型纳米药物的脑分布，例如通过本文所述的离体(ex vivo)和体内(in vivo)成像方法。可以将微型纳米药物的分布与通过本文公开的方法测定的它们抑制或减少淀粉样蛋白斑形成的功效进行比较。
AD治疗可以包括施用有效减少淀粉样蛋白斑形成的药物。
在一个实施方案中，用于治疗癌症的方法可包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的任一种微型纳米药物。
在一个实施方案中，用于治疗脑疾病或异常状况的方法可以包括向有需要的受试者共施用治疗有效量的抗癌剂和治疗有效量的微型纳米药物，其中所述微型纳米药物包含聚苹果酸基的分子支架和至少一种靶向配体以及共价缀合或连接至所述支架的至少一种抗癌剂。
在一个实施方案中，所述方法可以进一步包括分析受AD影响或患有AD的受试者中的斑块形成。分析步骤可以包括观察受试者中AD斑块形成的减少超过约50％、60％、70％、80％或约90％。分析步骤可以包括观察受试者中AD斑块的溶解。分析步骤可以包括观察受试者中AD斑块的稳定生长。
在一个实施方案中，所述方法可进一步包括分析肿瘤生长的抑制。分析步骤可包括观察受试者中超过约60％、70％、80％或约90％的肿瘤生长抑制。在一个实施方案中，分析步骤可以包括观察通过抑制Akt磷酸化而抑制HER2/neu受体信号传导。
术语“受试者”和“个体”在本文中可互换使用，并且是指人或动物。通常，动物是脊椎动物，例如灵长类、啮齿类、家畜或猎兽。灵长类包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴，例如恒河猴。啮齿动物包括小鼠、大鼠、土拨鼠、雪貂、兔和仓鼠。家畜和猎动物包括牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科动物如家猫、犬科动物如狗、狐狸、狼、鸟类如鸡、鸸鹋、鸵鸟和鱼如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼。患者或受试者包括前述的任何子集，例如，所有上述子集，但排除一个或多个组或物种，诸如人、灵长类或啮齿类。在一个实施方案中，受试者可以是哺乳动物，例如灵长类动物，例如人。术语“患者”和“受试者”在本文中可互换使用。术语“患者”和“受试者”在本文中可互换使用。
优选地，所述受试者是哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。非人类的哺乳动物可有利地用作代表阿尔茨海默病动物模型的受试者。作为非限制性实例，可以使用双重或三重转基因阿尔茨海默病小鼠。非人类的哺乳动物可以有利地用作代表癌症动物模型的受试者。此外，本文所述的方法可用于治疗家养动物和/或宠物。受试者可以是男性或女性。受试者可以是先前已被诊断或鉴定患有阿尔茨海默病，但不需要已经接受治疗的受试者。受试者可以是先前已诊断或鉴定为患有癌症，但不需要已经经历治疗的受试者。
在所述方法中的短语“治疗有效量(therapeutically-effective amount)”是指化合物、材料或组合物的量，其以适用于任何医学治疗的合理的效益/风险比，在动物的至少细胞亚群中有效产生一些期望的治疗效果。关于治疗癌症，“治疗有效量”是有效预防癌症或转化生长的进一步发展，甚至有效实现癌症或实体瘤消退的量。
治疗有效量的确定通常在本领域技术人员的能力范围内。通常，治疗有效量可随受试者的病史、年龄、状况、性别以及受试者的医学状况的严重性和类型而变化，并且施用其它药剂减轻待治疗的疾病或病症。
毒性和治疗效果可以通过标准药学方法在细胞培养物或实验动物中测定，例如测定LD50(50％群体致死的剂量)和ED50(50％群体治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，它可以表示为LD50/ED50比。优选显示治疗指数大的组合物。如本文所用，术语ED表示有效剂量，并且与动物模型结合使用。术语EC表示有效浓度，并且与体外模型结合使用。
从细胞培养试验和动物研究获得的数据可用于配制用于人的剂量范围。这些化合物的剂量优选在包括ED50的循环浓度范围内，而几乎没有或没有毒性。剂量可以在该范围内变化，这取决于所采用的剂型和所采用的给药途径。
治疗有效量最初可以从细胞培养物测定来评估。可以在动物模型中配制剂量以达到包括在细胞培养物中测定的IC50(即，达到症状的半数最大抑制的治疗剂浓度)的循环血浆浓度范围。血浆中的水平可以例如通过高效液相色谱法测量。任何特定剂量的效果可以通过合适的生物测定来监测。
剂量可以由医师确定，并且根据需要调整以适应观察到的治疗效果。通常，可以施用组合物，使得活性剂以1μg/kg至150mg/kg、1μg/kg至100mg/kg、1μg/kg至50mg/kg、1μg/kg至20mg/kg、1μg/kg至10mg/kg、1μg/kg至1mg/kg、100μg/kg至100mg/kg、100μg/kg至50mg/kg、100μg/kg至20mg/kg、100μg/kg至10mg/kg、100μg/kg至1mg/kg、1mg/kg至100mg/kg、1mg/kg至50mg/kg、1mg/kg至20mg/kg、1mg/kg至10mg/kg、10mg/kg至100mg/kg、10mg/kg至50mg/kg或10mg/kg至20mg/kg的剂量给予。应当理解，这里给出的范围包括所有中间范围，例如，1mg/kg至10mg/kg的范围包括1mg/kg至2mg/kg、1mg/kg至3mg/kg、1mg/kg至4mg/kg、1mg/kg至5mg/kg、1mg/kg至6mg/kg、1mg/kg至7mg/kg、1mg/kg至8mg/kg、1mg/kg至9mg/kg、2mg/kg至10mg/kg、3mg/kg至10mg/kg、4mg/kg至10mg/kg、5mg/kg至10mg/kg、6mg/kg至10mg/kg、7mg/kg至10mg/kg、8mg/kg至10mg/kg、9mg/kg至10mg/kg等。还应理解，上述中间范围也在本发明的范围内，例如，在1mg/kg至10mg/kg的范围内，剂量范围例如2mg/kg至8mg/kg、3mg/kg至7mg/kg、4mg/kg至6mg/kg等。
在一个实施方案中，可以以一定剂量施用组合物，使得活性剂的体内浓度在15min、30min、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时或更长的施用时间后小于500nM、小于400nM、小于300nM、小于250nM、小于200nM、小于150nM、小于100nM、小于50nM、小于25nM、小于20nM、小于10nM、小于5nM、小于1nM、小于0.5nM、小于0.1nM、小于0.05、小于0.01、nM、小于0.005nM、小于0.001nM。
关于治疗的持续时间和频率，熟练的临床医生通常监测受试者以确定治疗何时提供治疗有益，并确定是否增加或减少剂量、增加或减少施用频率、中止治疗、恢复治疗或对治疗方案进行其它改变。给药方案可以从一周一次到每天一次变化，这取决于许多临床因素，例如受试者对肽的敏感性。所需剂量可以每天或每三、四、五或六天施用。所需剂量可以一次给药或分成子剂量，例如2-4个子剂量并在一段时间内给药，例如以适当的间隔通过一天或其它适当的时间表给药。这样的亚剂量可以作为单位剂型施用。在一个实施方案中，施用可以是长期的，例如，在数周或数月的时间段内每天一次或多次剂量。给药方案的实例可以包括在1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月或更长的时间内每天给药、每天给药两次、每天给药三次或每天给药四次或更多次。
如本文所用，术语“施用(administer)”是指通过导致组合物至少部分定位在所需部位以产生所需效果的方法或途径将组合物放置到受试者中。本文所述的化合物或组合物可以通过本领域已知的任何合适途径施用，包括但不限于口服或肠胃外途径，包括静脉内、肌内、皮下、透皮、气道(气雾剂)、肺、鼻、直肠或局部(包括颊和舌下)施用。
示例性的给药模式包括但不限于注射、输注、滴注、吸入或摄入。“注射(injection)”包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、脑脊柱内和胸骨内注射和输注。在一个实施方案中，组合物可以通过静脉内输注或注射施用。
对于向受试者施用，可以以药学上可接受的组合物提供所述微型纳米药物。因此，一个实施方案还提供了包含如本文所公开的微型纳米药物的药物组合物。这些药学上可接受的组合物可包含治疗有效量的一种或多种微型纳米药物，其与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂一起配制。药物组合物可以特别地配制用于以固体或液体形式施用，包括适于以下的那些：(1)口服给药，例如，灌服剂(水性或非水性溶液或悬浮液)、锭剂、糖衣丸、胶囊、丸剂、片剂(例如，靶向于口腔、舌下和全身吸收的那些)、大丸剂、粉末、颗粒、用于施用于舌的糊剂；(2)肠胃外给药，例如通过皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射，例如作为无菌溶液或悬浮液或缓释制剂；(3)局部施用，例如作为施用于皮肤的乳膏、软膏或控释贴剂或喷雾剂；(4)阴道内或直肠内，例如，作为阴道栓剂、乳膏剂或泡沫；(5)舌下给药；(6)眼睛；(7)透皮给药；(8)透粘膜；或(9)经鼻给药。另外，微型纳米药物可植入患者体内或使用药物递送系统注射。
多种已知的控释或缓释剂型、制剂和装置可以适用于本公开的微型纳米药物和组合物。实例包括但不限于美国专利号：3,845,770；3,916,899；3,536,809；3,598,123；4,008,719；5674,533；5,059,595；5,591,767；5,120,548；5,073,543；5,639,476；5,354,556；5,733,566；6,365,185B1，所有这些文献在此引入作为参考，如同完全阐述一样。这些剂型可用于提供一种或多种活性成分的缓释或控释，使用例如羟丙基甲基纤维素、其它聚合物基质、凝胶、渗透膜、渗透系统(如美国加利福尼亚州山景市Alza公司)或其组合，以提供不同比例的所需释放曲线。
在一个实施方案中，药学上可接受的组合物可以配制成剂量单位形式以便于施用和保持剂量一致性。本文所用的表述“剂量单位形式(dosage unit form)”是指适于待治疗的受试者的活性剂的物理离散单位。
本文所用的术语“药学上可接受的(pharmaceutically acceptable)”是指在合理的医学判断范围内，适用于与人和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
本文所用的术语“药学上可接受的载体(pharmaceutically acceptablecarrier)”是指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如润滑剂、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌、或硬脂酸)或溶剂包封材料，其涉及将主题化合物从一个器官或身体的一部分携带或转运至另一个器官或身体的另一部分。每种载体必须是“可接受的”，即与制剂的其它成分相容并且对患者无害。可以用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和醋酸纤维素；(4)粉末状黄芪胶(powdered tragacanth)；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，如硬脂酸镁、月桂基硫酸钠和滑石；(8)赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；(9)油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇(PEG)；(12)酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；(22)填充剂，例如多肽和氨基酸(23)血清组分，例如血清白蛋白、HDL和LDL；(22)C2-C12醇，如乙醇；和(23)用于药物制剂的其它无毒相容物质。润湿剂、着色剂、脱模剂、涂层剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于制剂中。术语如“赋形剂(excipient)”、“载体(carrier)”、“药学上可接受的载体(pharmaceutically acceptablecarrier)”等在本文中可互换使用。
以下列表包括本发明的特定实施例。但是，该列举不是限制性的，并且不排除替代实施方案或本文另外描述的实施方案。在以下实施方案列表中描述的同一性百分比是指所引用序列沿参考序列的整个长度的同一性。
实施例
1.一种微型纳米药物，其包含聚苹果酸基的分子支架，
至少一种能够跨越血脑屏障的肽、至少一种斑块结合肽和内体裂解配体，其中，所述至少一种能够跨越血脑屏障的肽、所述至少一种斑块结合肽和所述内体裂解配体中的每一种均与所述聚苹果酸基的分子支架共价连接，并且所述微型纳米药物的尺寸范围为1nm-10nm。
2.根据实施方案1所述的微型纳米药物，其中，所述至少一种能够跨越血脑屏障的肽是LRP-1配体或转铁蛋白受体配体。
3.实施方案1和2中的一项或两项所述的微型纳米药物，其中，所述至少一种能够跨越血脑屏障的肽是选自由血管肽素-2、铁模拟肽、B6肽和迷你蜂毒明肽-4肽，或它们的变体所组成的组中的肽。
4.实施方案1-3中任一项或多项所述的微型纳米药物，其中，所述至少一种能够跨越血脑屏障的肽是包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的血管肽素-2或其变体。
5.实施方案1-4中任一项或多项所述的微型纳米药物，其中，所述至少一种能够跨越血脑屏障的肽是包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的铁模拟肽或其变体。
6.实施方案1-5中任一项或多项所述的微型纳米药物，其中，所述至少一种跨越血脑屏障的肽是包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的B6肽或其变体。
7.实施方案1-6中任一项或多项所述的微型纳米药物，其中，所述至少一种能够跨越血脑屏障的肽是包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的迷你蜂毒明肽-4肽或其变体。
8.实施方案1-7中任一项或多项所述的微型纳米药物，其中，所述至少一种能够跨越血脑屏障的肽包含至少两种肽。
9.根据实施方案8所述的微型纳米药物，其中，所述至少两种肽中的每一种被独立地选择。
10.根据实施方案8所述的微型纳米药物，其中，所述至少两种肽是相似的肽。
11.实施方案1-10中任一项或多项所述的微型纳米药物，其中，所述至少一种肽通过接头缀合至聚苹果酸基的分子支架。
12.根据实施方案11所述的微型纳米药物，其中，所述接头包含聚乙二醇(PEG)。
13.实施方案1至12中任一项或多项所述的微型纳米药物，其中，所述内体裂解配体包含多个亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、色氨酸或苯丙氨酸残基。
14.实施方案1-13中任一项或多项的微型纳米药物，其中，所述内体裂解配体包含色氨酸-色氨酸-色氨酸(WWW)、苯丙氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸(FFF)、亮氨酸-亮氨酸-亮氨酸(LLL)或异亮氨酸-异亮氨酸-异亮氨酸(I-I-I)。
15.实施方案1至14中任一项或多项所述的微型纳米药物，其中，所述微型纳米药物还包含治疗剂。
16.实施方案1至15中任一项或多项所述的微型纳米药物，其中，所述治疗剂选自由反义寡核苷酸、siRNA寡核苷酸、肽和低分子量药物所组成的组中。
17.实施方案1-16中任一项或多项所述的微型纳米药物，其中，所述治疗剂是与β-分泌酶mRNA序列或γ-分泌酶mRNA序列互补的反义寡核苷酸。
18.实施方案16-17中任一项或多项所述的微型纳米药物，其中，所述反义寡核苷酸包含与SEQ ID NO：4具有至少90％同一性的核酸序列。
19.实施方案1-18中任一项或多项所述的微型纳米药物，其中，所述治疗剂包含β-折叠破坏肽。
20.实施方案19所述的微型纳米药物，其中，所述β-折叠破坏肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列或其变体。
21.实施方案1至20中任一项或多项所述的微型纳米药物，其中，所述斑块结合肽是D-对映体肽。
22.实施方案1至21中任一项或多项所述的微型纳米药物，其中，所述D-对映体肽选自由D1-肽、D3-肽和ACI-89-肽，或它们的变体所组成的组中。
23.实施方案1-18中任一项或多项所述的微型纳米药物，其中，所述D-对映体肽是包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的D1-肽或其变体。
24.实施方案1-23中任一项或多项所述的微型纳米药物，其中，所述D-对映体肽是包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的D3-肽或其变体。
25.实施方案1-24中任一项或多项所述的微型纳米药物，其中，所述D-对映体肽是包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的ACI-89-肽或其变体。
26.实施方案1至25中任一项或多项所述的微型纳米药物，其中，所述纳米药物还包含与聚苹果酸基的分子支架共价连接的成像剂。
27.根据实施方案26所述的微型纳米药物，其中，所述成像剂包含荧光部分、放射性同位素部分或磁共振成像部分。
28.实施方案1至27中任一项或多项所述的微型纳米药物，其中，所述聚苹果酸基的分子支架包含聚(β-L-苹果酸)。
29.一种微型纳米药物，其包含聚苹果酸基的分子支架，
至少一种能够跨越血脑屏障的肽、内体裂解配体和治疗剂，其中，所述至少一种能够跨越血脑屏障的肽、所述内体裂解配体和所述治疗剂中的每一种都与聚苹果酸基的分子支架共价连接，并且所述纳米药物的尺寸范围为1nm-10nm。
30.实施方案29的微型纳米药物，其中，所述至少一种能够跨越血脑屏障的肽是选自由血管肽素-2、铁模拟肽、B6肽和迷你蜂毒明肽-4肽，或它们的变体所组成的组中的肽。
31.实施方案29和30中任一项或两者的微型纳米药物，其中，所述至少一种能够跨越血脑屏障的肽是包含SEQ ID NO：1的序列的血管肽素-2或其变体。
32.实施方案29-31中任一项或多项所述的微型纳米药物，其中，所述至少一种能够跨越血脑屏障的肽是包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的铁模拟肽或其变体。
33.实施方案29-32中任一项或多项所述的微型纳米药物，其中，所述至少一种能够跨越血脑屏障的肽是包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的B6肽或其变体。
34.实施方案29-33中任一项或多项所述的微型纳米药物，其中，所述至少一种能够跨越血脑屏障的肽是包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的迷你蜂毒明肽-4肽或其变体。
35.实施方案29-34中任一项或多项所述的微型纳米药物，其中，所述至少一种能够跨越血脑屏障的肽包含至少两种肽，其中，所述至少两种肽中的每一种是独立选择的肽或类似的肽。
36.实施方案29-35中任一项或多项所述的微型纳米药物，其中，所述至少一种能够跨越血脑屏障的肽通过接头与聚苹果酸基的分子支架缀合。
37.实施方案29-36中任一项或多项的微型纳米药物，其中，所述内体裂解配体包含色氨酸-色氨酸-色氨酸(WWW)、苯丙氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸(FFF)、亮氨酸-亮氨酸-亮氨酸(LLL)或异亮氨酸-异亮氨酸-异亮氨酸(I-I-I)。
38.实施方案29-37中任一项或多项所述的微型纳米药物，其中，所述治疗剂选自由反义寡核苷酸、siRNA寡核苷酸、肽和低分子量药物所组成的组中。
39.实施方案29-38中任一项或多项所述的微型纳米药物，其中，所述治疗剂包含与β-分泌酶mRNA序列或γ-分泌酶mRNA序列互补的反义寡核苷酸。
40.如实施方案39所述的微型纳米药物，其中，所述反义寡核苷酸包含与SEQ ID NO：4具有至少90％同一性的核酸序列。
41.实施方案29-40中任一项或多项所述的微型纳米药物，其中，所述治疗剂包含β-折叠破坏肽。
42.实施方案41所述的微型纳米药物，其中，所述β-折叠破坏肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列或其变体。
43.实施方案29至42中任一项或多项所述的微型纳米药物，其中，所述微型纳米药物还包含斑块结合肽。
44.实施方案43的微型纳米药物，其中，所述斑块结合肽选自由Dl-肽，D3-肽和ACI-89-肽，或它们的变体所组成的组中的D-对映体肽。
45.实施方案43至44中任一项或两项的微型纳米药物，其中，所述斑块结合肽包含两种或更多种斑块结合肽，所述斑块结合肽独立地选自由D1-肽、D3-肽和ACI-89-肽，或它们的变体所组成的组中。
46.实施方案43至45中任一项或多项所述的微型纳米药物，其中，所述斑块结合肽包含两种或更多种斑块结合肽，所述斑块结合肽选自D1-肽、D3-肽和ACI-89-肽，或它们的变体所组成的组中，并且所选择的肽是相似的。
47.实施方案43至46中任一项或多项所述的微型纳米药物，其中，所述D-对映体肽是包含SEQ ID NO：9、10或11的氨基酸序列的肽。
48.实施方案29-47中任一项或多项所述的微型纳米药物，其中，所述微型纳米药物还包含与聚苹果酸基的分子支架共价连接的成像剂。
49.根据实施方案48所述的微型纳米药物，其中，所述成像剂包含荧光部分、放射性同位素部分或磁共振成像部分。
50.实施方案29-38中任一项或多项所述的微型纳米药物，其中，所述治疗剂包含抗癌剂。
51.实施方案29-50中任一项或多项所述的微型纳米药物，其中，所述聚苹果酸基的分子支架包含聚(β-L-苹果酸)。
52.实施方案28或51所述的微型纳米药物，其中，所述聚(β-L-苹果酸)具有40kDa至60kDa的分子量。
53.实施方案1-52中任一项或多项所述的微型纳米药物，其中，所述微型纳米药物的分子量在75kDa和500kDa之间。
54.一种药学上可接受的组合物，其包含实施方案1至53中任一项或多项所述的微型纳米药物和药学上可接受的载体或赋形剂。
55.一种用于治疗受试者的脑疾病或异常状况的方法，所述方法包括：向有需要的受试者施用治疗有效量的实施方案1至53中任一项或多项所述的微型纳米药物或实施方案54所述的药学上可接受的组合物。
56.实施方案55所述的方法，其中，所述脑疾病或异常状况选自由阿尔茨海默病、多发性硬化、帕金森病、亨廷顿病、精神分裂症、焦虑、痴呆、智力低下和焦虑所组成的组中。
57.实施方案55-56中任一个或两个的方法，其中，所述脑疾病是阿尔茨海默病。
58.实施方案55-57中任一项或多项所述的方法，其中，在施用所述微型纳米药物一段时间后，阿尔茨海默病被治疗、预防或改善。
59.根据实施方案58所述的方法，其中，所述一段时间为至少一个月。
60.实施方案55-59中任一项或多项所述的方法，其中，施用至少一个月的时间段，每周至少一次、每天至少一次或每天至少两次。
61.一种用于减少受试者脑中淀粉样斑块形成的方法，包括向有需要的受试者施用实施方案1至53中任一项或多项所述的微型纳米药物或实施方案54所述的组合物。
62.一种用于检测受试者的脑中的淀粉样斑块的方法，其包括施用实施方案1-25、28-47和50-53中任一项或多项所述的微型纳米药物，其中，所述微型纳米药物还包含成像剂，所述成像剂包含荧光部分、放射性同位素部分或磁共振成像部分；将所述微型纳米药物可视化。
63.根据实施例62的方法，其中，所述可视化包括对所述对象的大脑中的组织进行成像。
64.一种用于治疗受试者的增殖性疾病的方法，包括：向有需要的受试者施用治疗有效量的实施方案29-38中任一项或多项所述的微型纳米药物或包含实施方案29-38中任一项的微型纳米药物和药学上可接受的载体或赋形剂的组合物。
65.实施方案64所述的方法，其中，所述增殖性疾病是癌症。
66.实施方案65所述的方法，其中，所述癌症选自由胶质瘤、胶质母细胞瘤、转移至脑的乳腺癌和转移至脑的肺癌所组成的组中。
67.实施方案64-66中任一项或多项所述的方法，其中治疗剂是抗癌剂。
68.实施方案55-67中任一项或多项所述的方法，其中，所述受试者是哺乳动物。
69.实施方案68的方法，其中，所述哺乳动物选自由啮齿动物、犬、灵长类动物、马、实验性的带有人乳瘤的裸鼠和人所组成的组中。
本文的另外的实施方案可通过用来自本文的任何一个或多个其它实施方案的一个或多个元件补充实施方案，和/或用来自本文的一个或多个其它实施方案的一个或多个元件替代来自一个实施方案的一个或多个元件来形成。
实施例
提供以下非限制性实施例以说明特定实施方案。全文中的实施例可以用来自以下一个或多个示例的一个或多个细节来补充，和/或来自实施例的一个或多个元素可以用来自以下一个或多个示例的一个或多个细节来替换。
实施例1-设计有效跨越血脑屏障的微型纳米药物
神经系统疾病治疗面临的主要问题之一是治疗剂和常规药物向脑内的不良递送。作为这些药物设计的替代，围绕天然存在的聚合物支架，聚苹果酸，在此也称为PMLA或P，开发了多功能和可生物降解的纳米缀合物药物递送系统。例如，可以使用β-聚(L-苹果酸)。已经开发了这种纳米缀合物药物递送系统，其能够穿过血脑屏障(BBB)以进入受神经疾病影响的脑组织。
纳米缀合物药物递送系统在本文中也被称为微型纳米药物。所设计的微型纳米药物的特征在于流体动力学直径5-8nm、细长形状以及药物和操作基团(例如受体靶向)化学附着于聚合物平台的能力。与相同质量的球形纳米药物相比，细长形状使得微型纳米药物能够快速扩散，且能够穿过窄直径的孔。平台还为设计用于内体破坏、MRI和荧光成像或保护的各种模块提供化学锚定。可以使用可裂解的接头，其能够响应靶向区室中的化学反应而激活药物。在所设计的微型纳米药物上，几个靶向分子可以通过多个附件连接到平台上，因此，纳米药物可以设计用于通过多个生物屏障进行程序化的传递。所述微型纳米药物具有高的内部自由度，这是由于围绕来自酯键的碳和碳-氧原子的无限旋转而引起的。旋转自由度允许支架连接的基团避免不利的分子拥挤。
使用这种设计，可以通过用HER2-亲和肽代替靶向抗体来开发微型纳米药物用于临床前HER2-阳性人乳腺癌的高效治疗。所述微型纳米药物可被设计成将反义寡核苷酸或多西他赛的多个拷贝递送至细胞质并阻止肿瘤生长。当分别连接时用靶向不同递送途径的肽，或同时连接时用靶向不同的递送途径的的组合的肽，可以实现成像剂穿过血脑屏障(BBB)的递送。另一种设计可以是携带NIR荧光染料ICG的靶向微型纳米药物，其闪亮地照亮小鼠中的成胶质细胞瘤以用于成像引导的肿瘤切除。在所有设计中，微型纳米药物被清除，半衰期为一小时，在肿瘤或其它目标区域内停留时间为数小时。
本文描述了治疗阿尔茨海默病的微型纳米药物的设计。尽管多次尝试持续治疗阿尔茨海默病，但是仍无法令人满意地预防毒性Aβ的产生。本文描述了用纳米尺寸的多药物递送平台进行的治疗，其设计用于有效靶向的多倾向抑制可溶性Aβ产生。在应用纳米载体级联靶向通过胞转途径的多个BBB和脑中的试剂/细胞时，治疗超过了现有尝试在功效、无副作用和改善的图像引导控制方面的结果。
使用PMLA作为生物可降解平台的微型纳米药物的设计：
因此，焦点集中在开发一种能与健康小鼠的BBB交叉的微型纳米药物。
选择PMLA(聚苹果酸或P)作为微型纳米药物开发的平台，因为PMLA可完全生物降解为二氧化碳和水，生物惰性，无毒和非免疫原性。PMLA还携带丰富的羧基，其可以与多个靶向和治疗部分缀合，最终构成可以携带任何数目和类型的功能部分的微型纳米药物平台。(Ljubimova et al.(2014年)，其在此引入作为参考，如同完全阐述一样)。
某些分子通过高选择性内源转运机制转运跨越BBB。例如，低密度脂蛋白受体通路(LRP-1)能使低密度脂蛋白双向运动穿过BBB(Georgieva et al.(2014)；和Dehouck etal.(1997)，两者均引入本文作为参考，如同完全阐述一样)。
当合适的配体结合到血管内皮中的LRP-1上并被其内化时，发生LRP-1介导的血-脑转运。内化后，LRP-1结合的配体被胞转到脑实质中。合成的LRP-1肽配体血管肽素-2(AP-2；TFFYGGSRGKRNNFKTEEY(SEQ ID NO：1))由Demeule et al.(2008)鉴定(Demeule et al.(2008)，其通过引用并入本文，如同完全列出一样)。据报道，AP-2的转运在高浓度下饱和，并被其它LRP-1配体抑制，证实AP-2的转胞吞作用。选择AP-2用于初始筛选。
另一类肽通过运铁蛋白受体(TfR)途径增强BBB药物渗透。TfR途径将铁导入脑中，并且关键地参与维持脑铁稳态。TfR在脑毛细血管的内皮细胞上选择性表达，从而提供选择性药物递送到脑中的导管(Johnsen et al.(2017)，其通过引用并入本文，如同完全阐述一样)。通过噬菌体展示分离用于TfR介导的药物递送的铁模拟肽配体cTfRL(本文也称为Fe模拟肽)((SEQ ID NO：2)，CRTIGPSVC-NH2，环状，S-S键合)，且已显示其将载物递送到脑肿瘤中(Staquicini et al.(2011)，其以引用的方式并入本文中，如同完全阐述一样)。还选择铁模拟肽或cTfRL进行设计。
已经描述了另一种TfR配体B6(CGHKAKGPRK(SEQ ID NO：9))，并选择其用于设计微型纳米药物(Yin et al.(2015)，将其引入本文作为参考，如同对其进行了充分阐述一样)。
另一种选择的肽是迷你蜂毒明肽-4(在此也称为M4；H-[dap]KAPETAL D-NH2(SEQID NO：3)，一种来源于蜂毒的环肽，据报道这种肽能够使蛋白质和纳米颗粒穿过基于人细胞的BBB模型转移，(Oller-sara et al.(2016)，在此引入作为参考，如同完全阐述一样)。
上述BBB跨越肽都没有固有的治疗价值，并且它们没有被设计成携带自身可逆结合的载物。这些肽被选为载物递送分子的组分，并被检查以确定与其它肽或非肽部分的缀合如何影响它们的BBB渗透能力。
基于PMLA主链与合成肽缀合的能够跨越BBB的微型纳米药物另外设计为携带三亮氨酸(LLL)。LLL表现出pH-响应的亲脂性，一旦被内化并成为内体途径的一部分，则促进PMLA结合剂的内体逃逸。细胞内药物治疗中描述了细胞质药物递送的内体逃逸(Ding etal.(2011)，其通过引用并入本文，如同完全阐述一样)。
还将微型纳米药物与罗丹明缀合以便在脑组织中显现化合物。
微型纳米药物最初被设计成中性的，以测试它们跨越BBB并分布在可能潜在地受神经障碍影响的所有脑区域的能力。
另外，设计了微型纳米药物用于反义寡核苷酸(AON)和化学治疗剂穿过血脑屏障(BBB)的多靶向全身递送以沉默Aβ的产生。
微型纳米药物可以与β折叠破坏肽缀合。除了阻断分泌酶和tau的合成外，β-折叠破坏肽设计成特异性干扰Aβ内的β-折叠，防止Aβ的错误折叠和沉积，并降低毒性，例如H102(HKQLPFFEED；SEQ ID NO：7)肽(Zhang et al.(2014)，在此引入作为参考，如同完全阐述一样)。这些和其它功能肽被包括在(微型纳米药物)内用于溶解聚集体和斑块。
微型纳米药物被设计成携带多个肽，用于靶向穿过BBB并提供快速和大量递送至脑中的通量。图1是示出微型纳米药物的分子途径的概况的示意图。参考该图，将微型纳米药物静脉内注射入受试者。通过沿着这种微型纳米药物途径结合靶向特定屏障(例如内体膜、细胞膜、细胞内基质、外渗)的不同附着肽来维持大量通量(通量1)。靶向不同途径到达相同屏障的多种肽将增加药物递送通过屏障的总体通量。在处理位点(细胞质细胞器)，共价连接的药物通过酶反应或与仅包含在靶向处理位点的反应物(即氢离子(pH)，或用于药物与载体的二硫化物接头的还原裂解的谷胱甘肽-SH)的自发反应而从纳米载体裂解。另一个通量(通量2)针对肾清除。
设计微型纳米药物以携带肽，并特异性靶向过量产生Aβ前体肽(APP)的神经元细胞。设计微型纳米药物以携带反义寡核苷酸(AON)以沉默mRNA，从而沉默产生Aβ的β-分泌酶和/或γ-分泌酶的生物合成。图2是示意图，其示出了携带跨越多个生物屏障进入靶向神经元的肽、趋化因子(chemo)、AON和靶向APP和Aβ的肽的微型纳米药物。一种AON是抑制β-分泌酶合成的AON，另一种AON是抑制γ-分泌酶早老素1(酶活性)亚单位合成的AON。所述的微型纳米药物进一步携带抑制分泌酶活性的药物(图2中标记为“趋化因子(chemo)”)。所述微型纳米药物还携带三亮氨酸，用于释放递送系统跨越内体膜进入细胞质。所述微型纳米药物进一步任选地携带Cy5.5(NIR荧光)、鬼笔环肽(红色荧光)或DOTAGd(III)用于荧光成像或通过磁共振(MRI)成像。
参考图2，在静脉注射后，所述微型纳米药物透过BBB，并通过阻断β-和γ-分泌酶蛋白质合成和酶活性(包含在细胞质和/或细胞器中)而解开对Aβ的抑制。肽(血管肽-2、环状MiniAp-4、环状CRTIGPSVC(SEQ ID NO：2)-肽)以平行的胞转途径靶向穿过BBB的递送。高通量胞转成功地与血管清除竞争。淀粉样蛋白靶向肽将所述微型纳米药物特异性地粘附至过量产生Aβ的神经元表面上的淀粉样蛋白前体肽(APP)。APP和粘附的微型纳米药物被内化到内体系统中，以被β-分泌酶切割并释放AON和分泌酶抑制药。释放到细胞质中的AON特异性地抑制β-分泌酶和γ-分泌酶的生物合成。膜渗透性药物抑制APP的分泌酶裂解和Aβ释放到细胞外空间。生产Aβ的缺乏停止了Aβ聚集、原纤维形成和毒性反应。随时间发生现有斑块的溶解，或者可以通过用聚集体破坏剂(例如肽和合成物)处理来加速。
由可降解的非免疫原性系统静脉可注射纳米试剂组成的微型纳米药物适用于成像和治疗阿尔茨海默病。该微型纳米药物可用于治疗其它神经疾病，如通过使用合适的肽、化疗药物和反义寡核苷酸。由于PMLA载体上具有多个附着位点，因此，所述的微型纳米药物可以配备多种化疗药物和DNA-反义药物，用于阻断阿尔茨海默病特异性标记。当对局部pH或谷胱甘肽反应时，化疗剂和寡核苷酸与微型纳米药物的连接是可逆的，并且适合靶细胞内的药物激活。试剂携带用于NIR或IR图像引导的空间和时间分辨分析的染料。
图3A-3B是示意图，示出了微型纳米药物在穿过血脑屏障并进入脑实质中的优点。图3A是示意图，说明携带AP-2肽和三亮氨酸(内体逃逸单位)进入脑实质内的微型纳米药物。用于快速递送和深跨越的微型纳米药物被设计为6-10nm尺寸并具有细长的结构。这是通过将低分子靶向肽而不是抗体连接到PMLA上实现的。图3B是比较携带肽的微型纳米药物和携带抗体的纳米药物穿过血脑屏障的效率的示意图。
聚苹果酸(PMLA)是一种无支链的聚合物和大分子，具有多个侧基羧基，用于连接多种药物功能模块。结构高度柔性的聚苹果酸的线性组织使得通过间隙空间的扩散增强，并且具有多个肽与相互作用位点的最佳可接近性。较低纳米尺度上的小分子尺寸和分子柔性提供了在脑中的最佳渗透。
通过连接同时参与多个位点结合和不同特异性的BBB交叉途径的几种不同亲和肽，获得了从循环脉管系统到脑的有利的高通量。在脑内，第二肽靶向阿尔茨海默病或其它神经变性疾病的特异性标志物。此外，附着NIR荧光染料用于成像，附着化学治疗药物和反义寡核苷酸用于治疗。肽具有低免疫原性，对变性具有强抵抗性(robust against)，并且在环外形式中较少被酶裂解所破坏。肽具有较低的亲和力，因此在受体结合后具有有利的释放动力学。靶向肽与聚苹果酸携带的多个连接位点的缀合增加了用于内部靶向、成像和治疗的官能团的通量。所列举的有利性质使该递送系统令人惊讶地适用于有效和通用的跨BBB递送，提供了优于其它递送装置的独特优点。微型纳米药物可用于解决跨BBB的递送途径的可用性差以及它们在管理大型纳米颗粒、不稳定和长循环时间方面的效率低的问题，容易导致载物损失和诱导系统性副作用。微型纳米药物可用于解决其它问题，例如生产(抗体)昂贵、保存期有限、难以在溶液中管理运输、以及需要大量用于患者应用。微型纳米药物能够用于解决分泌酶抑制不完全，缺乏靶向性生产细胞导致的副作用程度高，以及需要成像来控制治疗的进程的问题。
纳米载体的结构被设计用于快速扩散和易于屏障跨越，优异的相互作用位点的进入，以及光学(荧光)和磁成像(MRI)的试剂的附着。通过简化生产、储存、运输和患者应用程序来管理成本。
Aβ肽过量生产细胞是肽靶向的。靶向也被认为是沉默蛋白和肽的过度产生。沉默以多管齐下的主动方式使用反义寡核苷酸，并且包括通过化疗进行抑制。
实施例2-基于聚苹果酸(PMLA)的纳米缀合物的合成
描述代表性反应的主方案(master chemes)在图4和5中说明。图4显示了具有单个肽的微型纳米药物的合成。所述微型纳米药物具有将特定的级联靶标延伸至跨越BBB以达到脑细胞的能力。合成流程从左上角开始，NHS激活聚苹果酸(PMLA)。活化后，用消耗40％侧链活化羧化物的三亮氨酸(LLL)进行酰胺形成取代，然后用2-巯基乙胺(MEA)(可用羧基的10％或消耗任选量的活化羧化物)进行酰胺形成取代，以获得称为“预缀合物(preconjugate)”的中间产物。PMLA支架上的巯基与马来酰亚胺标记的肽和成像基团反应，形成相应的硫醚缀合物。肽与马来酰亚胺反应性基团的缀合使用了可商购的双功能PEG2000/3400-接头，其与肽(和染料，如果需要的话)上的反应性基团连接(参见该方案右上角的方案)。吗啉代寡核苷酸(AON)通过用3-吡啶基二硫代丙酰基-3'-酰氨基-AON对预缀合物-SH进行二硫键交换而被加载(Ljumbiova et al.(2014年)，其通过引用并入本文，如同被完全阐述一样)。
过量的剩余巯基通过与3-吡啶基二硫代丙酸酯(PDP)的交换反应而封闭。
图5说明了具有三种肽的纳米缀合物的实例。
材料：如前所述，从多头绒泡菌(Physarum polycephalum)的培养液中制备高纯度聚(β-L-苹果酸；50kDa)(Ljumbiova et al.(2014)，在此引入作为参考，如同完全阐述一样)。血管肽素-2-cys肽(含有额外的C-末端半胱氨酸基团；TFFYGGSRGKRNNFKTEEYCNH2(SEQID NO：1))、血管肽素-7-cys(TFFYGGSRGRRNNFRTEEYCNH2(SEQ ID NO：7))、B6(CGHKAKGPRK(SEQ ID NO：9))、M4(H-[dap]KAPETAL D-NH2(SEQ ID NO：3))和cTfRL，本文也称为铁模拟肽，(CRTIGPSVC-NH2(SEQ ID NO：2)，S-S结合)由AnaSpec(Fremont，CA，USA)定制合成。罗丹明-马来酰亚胺购自ThermoFisher Scientific(Canoga Park，CA，USA)。Mal-PEG3400-Mal或Mal-PEG2000-Mal购自Creative PEGWorks(Durham，NC，USA)。三亮氨酸从Bachem(Torrance，CA，USA)订购，而试剂DCC、NHS、TFA、MEA和DTT从Sigma(St Louis，MO，USA)获得。
详细的合成如下所示
产物肽贮存于-20℃或冻干。
合成PMLA/MEA(10％)(不含三聚亮氨酸的PMLA预缀合物)：将PMLA19 mg(116g/mol单体，0.164μmol)置于带有磁力搅拌器的玻璃小瓶(环境温度)中，并溶于300μL丙酮中。将N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，115g/mol，9.6mg，0.083μmol，50mol％的PMLA COOH)和N，N'-二环己基碳二亚胺(DCC，206g/mol，17.7mg，0.086μmol，50mol％的PMLA COOH)溶解在500μL的DMF中，并滴加到反应混合物中，然后加入15mg二硫苏糖醇(DTT，154.25g/mol，0.097μmol)的38μL DMF溶液，然后加入半胱胺(MEA，113.61g/mol，1.9mg，0.017μmol，7.8μL DMF溶液)和Et3N(2.3μL，1eq加入MEA)。使用TLC(n-BuOH：H2O：AcOH5:1，使用茚三酮浸液观察)监测反应。反应终止后，加入0.8mL磷酸钠缓冲液(150nM，pH6.8)，再搅拌反应两小时。离心分离混合物与沉淀物，液相经PD-10柱纯化。SEC-HPLC分析表明保留时间为7.0min(HPLC泵：Hitachi L-2130；检测器，Hitachi L-2455；软件，EZchrome；柱，Polysep4000；流速：1ml/min；缓冲液，PBS)。将最终产物冻干，将所得白色纤维固体储存在-20℃。
合成PMLA/LLL(40％)/MEA(10％)(PMLA预缀合物)：
在下文中，LLL或其它取代基的百分负载量是相对于聚合物中苹果酸残基的总含量而言的。在环境温度下，将PMLA(40mg的116g/mol单体，0.345μmol)溶解在400μL丙酮中。滴加溶解在400μL DMF中的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，115g/mol，40mg，0.345μmol)和N，N'-二环己基碳二亚胺(DCC，206g/mol，74mg，0.36μmol)的混合物。2小时后，加入三亮氨酸(LLL，357.4g/mol，49.3mg，0.138μmol)和三氟乙酸(TFA，114g/mol，d＝1.489g/mL，12.7μL)在200μL DMF中的混合物(以10min间隔分20、25、30、35、40、45和50μL部分)。每次加入后加入溶于DMF的Et3N(101.2g/mol，d＝0.73g/mL，26.65μL，溶于200μL DMF，作为15、20、25、30、35、40和45μL的部分)。使用TLC(n-BuOH：H2O：AcOH5:1)和茚三酮反应监测反应程度。反应终止后，加入二硫苏糖醇(DTT，7mg，154.25g/mol，0.045μmol)的50μL DMF溶液，随后加入半胱胺(MEA，113.61g/mol，3.92mg，0.035μmol，10.8μL DMF溶液)和Et3N(4.8μL，1eq的MEA溶液)用于NH-CH2-CH2-SH2的缀合。使用TLC和茚三酮反应监测反应。反应终止后，加入1.2mL(与反应体积相同)磷酸钠缓冲液(150nM，pH6.8)，将混合物再搅拌两小时，最后离心以与沉淀分离。产物在PD-10柱上纯化，并通过HPLC(7.2min保留时间，220nm波长，HPLC泵：Hitachi L-2130；检测器：Hitachi L-2455；EZchrome软件；Polysep4000柱；流速1ml/min；PBS)表征。冻干后，将产物作为白色纤维材料储存。
Mal-接头-肽的合成：
血管肽素-2-PEG3400-Mal的合成：在环境温度下，将Mal-PEG3400-Mal(3400g/mol，7.4mg，2.2μmol，1.05eq)溶解在500μL pH6.3的100nM(含有2mM EDTA)的磷酸盐缓冲液中，滴加溶解在500μL pH6.3的磷酸盐缓冲液中的半胱氨酸修饰的血管肽素-2(SEQ ID NO：1)2403.7g/mol，5mg，2.08μmol，1当量(1eq)。在一小时后完成通过HPLC监测的反应。将冻干产物(10mg/mL，在pH6.3的磷酸盐缓冲液中)用于与PMLA预缀合物的反应(SEC-HPLC分析：在220nm波长下的保留时间8.2min)。以相同的方式合成血管肽素-7-PEG3400-Mal(SEC-HPLC在220nm保留8.25min)和B6-PEG-Mal(SEC-HPLC在220nm保留7.92min)。
SEC-HPLC分析：在220nm波长下保留8.2min。
HPLC泵：日立L-2130；检测器，日立L-2455；软件，EZChrome；柱，Polysep4000；流量：1ml/min；缓冲液，PBS。
“铁模拟肽”或cTfRL(SEQ ID NO：2)(环状)-肽-PEG2000-Mal的合成：在装有磁力搅拌器的玻璃小瓶(环境温度)中，将Mal-PEG-SCM2000(2000g/mol，11.2mg，5.6μmol，1.05eq)溶解在500μL DMF中。“铁模拟肽”(SEQ ID NO：2)：CRTIGPSVC(环状)-肽(932g/mol，5mg，5.36μmol，1eq)溶于500μL DMF中，随后加入0.89μL Et3N(101.2g/mol，d＝0.73g/mL，6.45μmol，1.48eq，或8.9μL 10倍稀释于DMF中的Et3N溶液)。用HPLC监测反应，如果反应没有进行，加入0.1μL Et3N。搅拌过夜后反应结束，用PD-10柱纯化，用HPLC分析，然后冻干。将10mg/mL产物在磷酸盐缓冲液6.3中的溶液用于与PMLA预缀合物的反应。
SEC-HPLC分析条件如上：在220nm波长下保留8.3min。
在Mw2817的质谱与预期产物一致。
Miniap-4-PEG2000-Mal的合成：在装有磁力搅拌器的玻璃小瓶(环境温度)中，将Mal-PEG-SCM2000(2000g/mol，5.5mg，2.76μmol，1.2eq)溶解在200μL DMF中。加入溶解于200μL DMF的Miniap-4(SEQ ID NO：3)(911.1g/mol，2.1mg，1eq)，随后加入0.45μL Et3N(101.2g/mol，d＝0.73g/mL，3.25μmol，1.48eq，或4.5μL 10倍稀释于DMF中的Et3N溶液)。
使用HPLC(与上述相同的条件)监测反应，在反应没有进行的情况下加入0.3eqMal-PEG2000-SCM(1.32mg在DMF中)和0.1μL Et3N。避免了大大过量的Mal-PEG2000-SCM和过夜反应，以保持与赖氨酸的副反应最小。将反应物用PD-10柱纯化，用HPLC分析并冻干。将10mg/mL产物在磷酸盐缓冲液6.3中的溶液用于与PMLA预缀合物的反应。
SEC-HPLC分析条件如上：在220nm波长下保留8.1min。
肽-PEG2000-Mal的合成：在环境温度下，将Mal-PEG2000-SCM(2000g/mol，3.5mg，1.75μmol，1.05eq)溶解在250μL DMF中。加入溶于250μL DMF的TfR配体(932g/mol，1.5mg，1eq，1.6μmol)，随后加入0.34μL Et3N(101.2g/mol，d＝0.73g/mL，2.4μmol，1.5eq)。用HPLC(通常过夜)监测反应，如果反应没有进行，加入0.1μL Et3N。将反应物用PD-10柱纯化，用HPLC分析，并冻干。以相同的方式合成Miniap-4-PEG2000-Mal，使用N-末端和琥珀酰亚胺基羧甲基酯反应进行连接。
从不含三亮氨酸的PMLA预缀合物合成PMLA/肽(2％)/染料结合物：将2mg PMLA/MEA(10％)(127.36g/mol单体，15.7μmol)溶解在300μL pH6.3的磷酸盐缓冲液中，并在室温下置于带有磁力搅拌器的玻璃小瓶中。将溶解于pH6.3的磷酸盐缓冲液中的2％(0.314μmol)的肽-PEG-MAL加入至10mg/mL的任选的肽-接头-MAL：任选地，1.82mg血管肽素-2-PEG3400-MAL(5802.7g/mol)或0.88mg“铁模拟肽”(SEQ ID NO：2)：CRTIGPSVC(环状)-肽-PEG2000-Mal(2817g/mol)或0.88mg Miniap-4-PEG2000-Mal(2796g/mol)，或不含肽的缓冲液(对照)。通过HPLC在220nm处监测反应混合物(通常反应1小时)，一旦完成，通过用PMLA平台-SH形成硫醚将罗丹明C2物质加载(对于1％负载量，为0.107mg，680.79g/mol，0.153μmol，52.2μL2 mg/mL的DMF溶液)。使用HPLC监测避光下的反应。记录吸收光谱以检测PMLA缀合物洗脱峰中的染料吸收。在将反应混合物再搅拌1-2小时后，加入15μL 3-(2-吡啶基二硫代丙酸)或PDP(10mg/mL的DMF溶液)以封闭游离SH基。将反应物再搅拌一小时，并经PD-10柱纯化，通过HPLC分析，冻干并储存于-20℃。分次)，任选地，NIR染料Cy5,5也用于荧光标记。
合成PMLA/肽(2％)/染料缀合物：以与PMLA/LLL/肽(2％)/染料相同的方式进行反应，使用PMLA/MEA(10％)缀合物(2mg，127.36g/mol单体，0.0157mmol)和1.82mg，3.14μmol，5802.7g/mol AP2-PEG-MAL或0.88mg cTfRL-PEG-MAL，2817g/mol，或0.88mg M4-PEG-MAL，2796g/mol；使用0.107mg，680.79g/mol，0.153μmol罗丹明-马来酰亚胺(1％负载量)。
PMLA/LLL(40％)/肽(2％)/染料的合成：将4mg PMLA/LLL(40％)/MEA(10％)(260.7g/mol单体，15μmol)溶解在350μL pH6.3的磷酸盐缓冲液中，并在室温下置于带有磁力搅拌器的玻璃小瓶中。对于2％负载量，加入(0.314μmol)溶解于pH6.3的磷酸盐缓冲液中的肽-PEG-MAL至10mg/mL浓度：任选地，1.78mg血管肽素-2-PEG3400-MAL(5802.7g/mol)或0.86mg“铁模拟肽”(SEQ ID NO：2)：CRTIGPSVC(环状)-肽-PEG2000-Mal(2817g/mol)或0.88mg Miniap-4-PEG2000-Mal(2796g/mol)，或不含肽的缓冲液(对照)。在S7下继续反应，除了加入Cy5,5(对于0.5％负载量，0.033mg，741g/mol，0.0765μmol，33μL1 mg/mL的DMF溶液)代替罗丹明C2。如上所述继续反应，产物纯化、分析、冻干并在-20℃下储存。
PMLA/LLL(40％)/肽(2％)/染料(1％)的合成：将4mg PMLA/LLL(40％)/MEA(10％)(260.7g/mol，15μmol预缀合物)溶解在350μL pH6.3的磷酸盐缓冲液中，并在室温下置于带有磁力搅拌器的玻璃小瓶中。为了达到2％的负载量，将1.78mg血管肽素-2-PEG3400-Mal(5802.7g/mol)，或2.07mg血管肽素-7-PEG3400-Mal(5858.8g/mol)，或0.87mg cTfRL-PEG-Mal(2817g/mol)，或0.86mg Miniap-4-PEG2000-Mal(2796g/mol)或1.33mg B6-PEG2000-Mal(4480g/mol)全部溶解在pH6.3至10mg/mL浓度的磷酸盐缓冲液中并逐滴加入。1小时后，使用SEC-HPLC(220nm)监测的反应完成。然后将罗丹明-马来酰亚胺(对于1％负载量，0.104mg，680.79g/mol，0.149μmol，52μL2 mg/mL的DMF溶液)负载到缀合物上，在侧MEA-SH处与PMLA平台形成硫醚。反应在黑暗中进行，并使用HPLC监测。结合的成功通过在PMLA结合物洗脱峰中的罗丹明吸光度来指示。在将反应混合物进一步搅拌1-2小时后，加入15μL 3-(2-吡啶基二硫代)丙酸(10mg/mL的DMF溶液)以封盖游离SH基团。再搅拌混合物一小时后，产物经PD-10柱纯化，分析，冻干并在-20℃下储存。
PMLA/LLL(40％)/肽(2％)/染料(1％)的合成：将1mg PMLA/LLL(40％)/MEA(10％)(260.7g/mol单体，3.84μmol)溶解在300μL pH6.3的磷酸盐缓冲液中，并在室温下置于带有磁力搅拌器的玻璃小瓶中。对于2％的负载量，加入(0.077μmol)溶解于pH6.3的磷酸盐缓冲液中的肽-PEG-MAL至10mg/mL浓度：任选地，21.5μL“铁模拟肽”(SEQ ID NO：2)：CRTIGPSVC(环状)-肽-PEG2000-Mal(2817g/mol)或0.215mg(21.5μL)Miniap-4-PEG2000-Mal(2796g/mol)。使用HPLC监测反应。反应终止后，加入第二个肽：任选地，0.445mg血管肽素-2-PEG-MAL3400(5802.7g/mol)或0.215mg“铁模拟肽”(SEQ ID NO：2)：CRTIGPSVC(环状)-肽-PEG2000-Mal(2817g/mol，在Miniap-4的情况下是第一种肽)。使用HPLC在220nm处监测反应混合物(通常1小时反应)，一旦完成，加入罗丹明C2(对于1％负载量为0.026mg，680.79g/mol，0.38μmol，13.05μL的2mg/mL的DMF溶液)，并使用HPLC监测避光下的反应。记录染料吸收度与PMLA吸收度的差值，并搅拌反应1小时。然后，加入05μL 3-(2-吡啶基二硫代)丙酸或PDP(10mg/mL的DMF溶液)以封盖游离SH基团。在用PD-10柱纯化、HPLC分析、冷冻干燥和在-20℃下储存之前，将反应物再搅拌一小时。
PMLA/LLL(40％)/肽(2％)/染料(1％)的合成：将1mg PMLA/LLL(40％)/MEA(10％)(260.7g/mol单体，3.75μmol)溶解在300μL脱气磷酸盐缓冲液(pH6.3)中，并在室温下置于带有磁力搅拌器的玻璃小瓶中。对于2％负载量，任选地(0.077μmol)或0.512mg血管肽素-2-PEG3400-MAL(5802.7g/mol)肽-PEG-MAL溶解于pH6.3至10mg/mL浓度的磷酸盐缓冲液中加入。使用HPLC在220nm和染料吸光度下监测反应，并且通常在1小时后完成。然后，加入第二肽：任选地，21.5μL的“铁模拟肽”(SEQ ID NO：2)：CRTIGPSVC(环状)-肽-PEG2000-Mal(2817g/mol)或0.215mg(21.5μL)Miniap-4-PEG2000-Mal(2796g/mol)。在加入第三个肽并完成反应后，缀合物制备的剩余部分遵循S9的描述。在将反应混合物进一步搅拌1-2小时后，加入15μL 3-(2-吡啶基二硫代)丙酸(10mg/mL的DMF溶液)以封盖游离SH基团。再搅拌混合物一小时后，产物经PD-10柱纯化，分析，冻干并在-20℃下储存。
PMLA/LLL/AP2/M4/罗丹明的合成：将1mg PMLA/LLL(40％)/MEA(10％)(260.7g/mol，0.00375mmol)溶解在300μL脱气磷酸盐缓冲液(pH6.3)中，并在室温下置于带有磁力搅拌器的玻璃小瓶中。然后，加入2.3％(0.0862μmol)或0.512mg血管肽素-2-PEG3400-MAL(5803g/mol)肽-PEG-MAL，以10mg/mL的浓度溶解在pH6.3的磷酸盐缓冲液中。使用HPLC监测反应，通常持续1小时。然后，加入0.215mg(21.5μL)Miniap-4-PEG2000-Mal(2796g/mol)。使用HPLC(通常1小时反应时间)监测反应混合物，一旦完成，用铝箔覆盖玻璃小瓶，并加入罗丹明C2(对于1％负载量为0.026mg，680.79g/mol，0.153μmol，13.05μL的2mg/mL DMF溶液)，并搅拌1小时。然后，加入15μL 3-(2-吡啶基二硫代)丙酸(PDP：10mg/mL的DMF溶液)以封盖游离SH基团，反应物再搅拌一小时，然后使用PD-10柱(H2O作为溶剂)纯化，HPLC分析和冻干。
纳米缀合物的合成和表征
如表1所示，合成了十二种基于PMLA的纳米缀合物作为用于反式BBB药物递送的候选物。
表1、纳米缀合物的命名、功能组分、ζ电势和分子量
Figure BDA0002439098430000551
肽序列：aTFFYGGSRGKRNNFKTEEY(SEQ ID NO：1)；b TFFYGGSRGRRNNFRTEEYCNH2(SEQID NO：7)；c H-[dap]KAPETAL D-NH2(SEQ ID NO：3)，环状；d CRTIGPSVC-NH2(SEQ ID NO：2)，环状，S-S键合；e CGHKAKGPRK(SEQ ID NO：9)。
除非另有说明，所有PMLA缀合物在100％的PMLA羧基侧基中含有1％的罗丹明。在八个纳米缀合物中，通过DDC/NHS化学作用，将三亮氨酸(LLL)与PMLA主链的40％的侧接羧化物缀合，如图6A-6D所示。
图6A-6D说明了PMLA/LLL/血管肽素-2/罗丹明(P/LLL/AP2)纳米缀合物的合成途径。图6A显示了使用DCC/NHS化学法对生物合成的PMLA进行活化，以产生活化的PMLA。图6B说明活化的PMLA与LLL和MEA的缀合。图6C说明PMLA/LLL与血管肽素-2(AP2)和罗丹明染料的缀合。图6D说明了部分MEA被用于通过马来酰亚胺-硫醇反应结合与PEG接头缀合的AP2肽。罗丹明以相同方式附着。
由AP-2、AP-7、M4、cTfRL和B6组成的肽部分，通过马来酰亚胺-硫醇键缀合到聚合物，每个肽部分的化学计量为总侧链羧化物的2％，并且使用PEG3400或PEG2000接头以允许肽与生物靶标灵活相互作用。M4和cTfRL肽通过其N-末端与PEG接头连接，因为这些小环肽不含末端半胱氨酸(与AP-2、AP-7和B6不同)。对于一种缀合物，将4％负载量的AP2加入到PMLA主链中(表1)。
为了合成所有的缀合物，通过DCC/NHS方法将PMLA侧链羧化物活化，以连接LLL和2-巯基乙胺(MEA)(Ding et al.(2010)；和Patil et al.(2015)，将两者都通过引用并入本文，如同完全阐述一样)。然后使用MEA与肽-PEG-马来酰亚胺和罗丹明-马来酰亚胺形成硫醚。通过表1所示的计算分子量、苹果酸含量、FTIR分析、SEC-HPLC洗脱曲线和ζ电势表征缀合物。
如表2所示，使用动态光散射(DLS)通过流体动力学直径也表征了没有连接罗丹明的缀合物。
表2、通过DLS测量的所选纳米缀合物的流体动力学直径和PDI。
Figure BDA0002439098430000561
Figure BDA0002439098430000571
通过HPLC进行产物验证的实例在图7A-7G中说明。图7A显示了对PMLA/LLL/血管肽素-2-PEG3400-MAL/罗丹明的验证。图7B显示了PMLA/LLL/“铁模拟肽”CRTIGPSVC(SEQ IDNO：2)(环状)-肽-PEG2000-Mal/罗丹明的验证。图7C说明了PMLA/LLL/Miniap-4-PEG2000-Mal/cy5.5的验证。图7D示出了对照：PMLA/LLL/罗丹明。图7E说明了用于靶向的PMLA/LLL/血管肽素-2(2％)/“铁模拟肽”(2％)/罗丹明(1％)二肽。图7F说明了用于靶向的PMLA/LLL/血管肽-2(2％)/miniap-4(2％)/罗丹明(1％)二肽。图7G说明了用于靶向的PMLA/LLL/miniaap-4(2％)/Angiopep-2(2％)/“铁模拟肽”(2％)/罗丹明(1％)三肽。
图8A-8C说明合成的P/LLL/AP2的特征。图8A说明了A200-A700 nm的SEC-HPLC3D视图与P/LLL/AP2纳米缀合物成分的保留时间和吸光度的关系。图8B说明在220nm波长下记录的P/LLL/AP2的SEC-HPLC色谱图。图8C说明P/LLL/AP2纳米缀合物(虚线)、AP2游离肽(实线)和预缀合物(点划线)的FTIR光谱。图8C中的箭头指示与AP2肽和预缀合物相比，P/LLL/AP2缀合物中的峰移位。
参考图8C，P/LLL/AP2的FTIR光谱含有几个独特的峰，其可归因于预缀合物和原始AP2肽，而一些峰的强度发生了移动或降低。从预缀合物谱中的3050cm-1到P/LLL/AP2谱中的3057cm-1，以及1040、1104和950cm-1的较低频率处的峰的其它变化，可以看到显著的峰位移。图8A和图8B中所示的分析数据，特别是在sec-HPLC洗脱液中在577nm波长处的材料吸收，表明罗丹明(图8A)和AP2-PEG-Mal与聚合物平台的缀合是成功的。参考图8A-8B，这些数据、HPLC洗脱曲线(图8B)和在577nm波长处存在的吸收表明罗丹明的激发波长(图8A)，证明罗丹明染料和AP2-PEG-Mal与聚合物平台的缀合是成功的。此外，P/LLL/AP2中苹果酸的含量与合成的PMLA缀合物报道的苹果酸产率的85％一致(Ding et al.(2011)，其通过引用并入本文，如同完全阐述一样)。
为了确保不同的缀合部分对罗丹明信号没有影响，即通过电化学和静电力，在溶液中测量纳米缀合物P/LLL/AP2、P/LLL/cTfRL和P/LLL/AP7的荧光发射。与P/AP2相比，对于含LLL的纳米缀合物观察到高20-30％的荧光强度。据推测，这种效应反映了LLL侧链的疏水性，但排除了这种效应对脑组织中荧光测量的结果的影响。
SEC-HPLC分析数据(LLL存在)：
PMLA/LLL(40％)/AP2(2％)/罗丹明(1％)或P/LLL/AP2：保留时间(RT)＝7.215；PMLA/LLL(40％)/罗丹明(1％)或P/LLL：rt＝7.1；PMLA/LLL(40％)/AP7(2％)/罗丹明(1％)或P/LLL/AP7：rt＝7.27；PMLA/LLL(40％)/Miniap-4(2％)/罗丹明(1％)或P/LLL/M4：rt＝7.2；PMLA/LLL(40％)/cTfRL(2％)/罗丹明(1％)或P/LLL/cTfRL：rt＝7.22；PMLA/LLL(40％)/AP-2(2％)/罗丹明(1％)或P/LLL/AP2/M4：rt＝7.05；PMLA/LLL(40％)/B6(2％)/罗丹明(1％)或P/LLL/B6：rt＝7.5。这些缀合物中的每一种的ζ-电位和计算分子量列于表1中。
SEC-HPLC分析数据(LLL不存在)：PMLA/罗丹明(1％)或P/Rh：rt＝7.23；PMLA/AP2(2％)/罗丹明(1％)或P/AP2：rt＝7.18；PMLA/Miniap-4(2％)/罗丹明(1％)或P/M4：rt＝7.1；PMLA/cTfRL(2％)/罗丹明(1％)或P/cTfRL：rt＝7.05。这些缀合物中的每一种的ζ-电位和计算分子量列于表1中。使用Hitachi L-2130泵和Hitachi L-2455检测器和EZChrome软件进行上述所有缀合物的SEC-HPLC分析。所用的柱是Polysep4000，流速为1ml/min；缓冲液为PBS(pH7.4)。
合成用于靶向淀粉样肽和斑块跨越BBB的PMLA/LLL/AP2/d-肽/罗丹明缀合物，BBB 参与阿尔茨海默病：合成包括下列肽(D-氨基酸序列)：
D1-肽(QSHYRHISPAQVC(SEQ ID NO：10))，所有D-氨基酸；
D3-肽(RPR TRL HTH RNRC(SEQ ID NO：11))，所有D-氨基酸；和ACI-89(PSHYRHISPAQKC(SEQ ID NO：12))，所有D-氨基酸。
这些肽在van Groen et al.(2009)和Funke et al.(2012)中有描述，其通过引用并入本文，如同完全阐述一样。对于所有肽，方案都是相同的，这里描述的合成包括D-1肽：
D1-肽与Mal-PEG-Mal3400的偶联：
在装有磁力搅拌器的玻璃小瓶(环境温度)中，将Mal-PEG-Mal3400(3400g/mol，9.36mg，2.75*10-3mmol，1.05eq)溶解在936μL磷酸盐缓冲液6.3中。滴加溶解于400μL磷酸盐缓冲液6.3中的D1肽(1525.8g/mol，4mg，1eq，2.62*10-3mmol)。
使用HPLC监测反应，一旦反应完成，就将其置于-20℃。在磷酸盐缓冲液6.3中计算10mg/mL产物的溶液，用于下一步反应。
PMLA/LLL/Angiopep-2/D1-PEG-Mal/罗丹明的制备：
将3mg PMLA/LLL(40％)/MEA(10％)(260.7g/mol单体，0.0115mmol)溶解在700μLpH6.3的磷酸盐缓冲液中，并在室温下置于带有磁力搅拌器的玻璃小瓶中。加入D1-peg-Mal(4924.8g/mol，1.13mg/2％，2.3*10-3mmol，10mg/mL的磷酸盐缓冲液6.3溶液)。使用HPLC监测反应，通常为1小时。然后，加入1.0eq的2％(2.3*10-4mmol)或1.33mg血管肽素-2-PEG-MAL3400(5802.7g/mol)肽-PEG-MAL，以10mg/mL的浓度溶解在pH6.3的磷酸盐缓冲液中。用HPLC监测反应，一旦完成(通常1小时)，用铝箔覆盖玻璃小瓶并加入罗丹明C2(对于1％负载量为0.0786mg，680.79g/mol，1.15*10-4mmol，39.3μL的2mg/mL的DMF溶液)。混合观察需要观察PMLA峰中的染料吸收。通常，反应应搅拌1小时。然后，加入15μL 3-(2-吡啶基二硫代)丙酸(PDP，10mg/mL的DMF溶液)或N-乙基马来酰亚胺(10mg，125g/mol，0.08mmol的50μL DMF溶液)以封端游离SH基团。在用PD-10柱(用水洗脱)、HPLC分析和冻干纯化之前，将反应再搅拌一小时。
PMLA/LLL/Miniap-4/D1-PEG-Mal/罗丹明的制备：
将2mg PMLA/LLL(40％)/MEA(10％)(260.7g/mol单体，0.0077mmol)溶解在800μLpH6.3的磷酸盐缓冲液中，并在室温下置于带有磁力搅拌器的玻璃小瓶中。加入1.15eq的2％或0.867mg的D1-PEG-MAL3400(4924.8g/mol)，溶解在pH6.3的磷酸盐缓冲液中至10mg/mL浓度。使用HPLC监测反应，通常为1小时。然后，加入Miniap-PEG-Mal(2796g/mol，0.43mg2％，10mg/mL的磷酸盐缓冲液6.3溶液)。用HPLC监测反应。一旦完成，用铝箔覆盖玻璃小瓶并加入罗丹明C2(对于1％负载量为0.0516mg，680.79g/mol，25.8μL2 mg/mL的DMF溶液)并再次使用HPLC监测反应。混合观察需要观察PMLA峰中的染料吸收。通常，反应应搅拌1小时。然后，加入15μL 3-(2-吡啶基二硫代)丙酸或PDP(10mg/mL的DMF溶液)以封盖游离SH基团。在用PD-10柱纯化、HPLC分析和冷冻干燥之前，将反应物再搅拌一小时。
所有的缀合物和预缀合物都保持在-20℃，D-肽和AP2负载量用HPLC定量。D肽的平均负载量为1.5％。
图10A-10C说明了合成的P/LLL/AP-2/ACI-89/罗丹明的表征。图10A说明了扫描A200-A700 nm的SEC-HPLC顶视图对显示完整纳米缀合物的吸光度的保留时间。图10B说明了与图10A所示相同的结合物在572nm波长的扫描分布图，表明罗丹明是物理实体的一部分。图10C说明了与图10A所示相同的缀合物在220nm波长的扫描分布图，表明P/LLL/AP-2/ACI-89是物理实体的一部分。
图11A-11C示出了P/LLL/AP-2/D1-肽/罗丹明在A200-A700 nm处的SEC-HPLC色谱图与显示PMLA/LLL/AP-2/D1-肽/罗丹明完全纳米缀合物的吸收的保留时间的关系。图11B是与图11A所示相同的纳米缀合物在572nm的扫描分布图，指示罗丹明成分。图11C是与图11A所示相同的纳米缀合物在220nm的扫描图谱，指示PMLA/LLL/AP-2/D1-肽组分。
包括D1、D3或ACI-89肽的纳米缀合物的IV应用遵循与携带肽P/LLL/AP2/Rh或类似物的纳米缀合物相同的方案。
ζ电势测量：使用Zetasizer Nano ZS90(Malvern Instruments，Malvern，UK)表征合成的缀合物的ζ点位。将10μL纳米缀合物样品的等分试样稀释在0.99mL PBS中，并且施加的电压为150mV。数据表示三次测量的平均值±它们的标准偏差。
动态光散射：使用Zetasizer Nano ZS90(Malvern Instruments，Malvern，UK)表征合成的缀合物。将10μL纳米缀合物样品的等分试样稀释在0.99mL PBS中，并使用透明比色皿测量3次。数据表示三次测量的平均值和多分散指数。
化学表征：在100℃下，在含有2M HCl的密封安瓿中水解裂解共聚物12小时，通过基于酶反应的比色法，使用苹果酸脱氢酶(Rozemaet al.(2003)Bioconjugate Chemistry，14，51-57，其在此引入作为参考，如同完全阐述一样)定量水解产物中的苹果酸。
FTIR测量：将测试材料的干燥样品加入KBr粉末中，并使用具有DRIFT模块(Bruker，Billerica，Ma，USA)的Brukerα仪器扫描。KBr单独用于背景扫描。
3D图像和能量计算：计算遵循Chem3D Pro11.0(CambridgeSoft，Wellesley，MA，USA)。
实施例3-血清和脑中纳米缀合物的药代动力学(PK)分析
动物给药：从Charles River Laboratories(Wilmington，MA，USA)获得8至9周龄BALB/C小鼠。小鼠维持和实验程序遵循由Cedars Sinai Institution Aminal Care andUseCommittee(IACUC协议#7416)制定的指导方针。每种性别的三至四只小鼠用于每个实验。总共110只小鼠用于产生本文所述的数据。
在每个实验前，将纳米缀合物新鲜溶解在PBS(pH7.4)中，并静脉内注射到侧尾静脉中。预先用异氟烷麻醉小鼠，并将它们的尾部短暂温热以允许进入尾静脉。所有缀合物作为单剂量施用。如每个实验所示，以29.5至236μmol总纳米缀合物/Kg体重的终浓度注射缀合物。药物注射体积保持恒定在150μL。每次注射后，将小鼠迅速放回到它们的笼子中。
眶下血收集和组织收集：在多个时间点从眼眶后窦抽取血液以测量血清中的药物浓度。时间点范围为30至480min，并且对于每个实验分别标明。用微血细胞比容毛细管(内径1.1mm；Chase Scientific Glass，Rockwood，TN，USA)收集血液，将150μl血液收集到BDMicrotainer SST中，室温下储存45min，然后以6000rpm离心5min。然后将血清转移到新鲜试管中并在-80℃下储存直到后续使用。
在血液收集后立即在预定时间点处死小鼠。通过深度麻醉的动物的脊柱脱位进行安乐死；迅速取出脑、脾、肝、心、肺和肾，快速冷冻，并放入-80℃贮藏。用于显微镜分析的所有组织都包埋在最佳切割温度的化合物(OCT；Sakura，Torrance，CA，USA)中，并置于干冰上冷冻。
使用血清测量PK：使用具有已知浓度(以μmol/mL计)的荧光标记的纳米缀合物来获得标准荧光校准曲线，其用于将收集的血清中的原始荧光测量结果转换为本文所示的μmol/mL单位。将含有注射的缀合物的20μL处理过的血清置于96孔白色不透明平板中，并使用荧光计以570/600nm激发/发射测量荧光，590nm临界(Flexstation，Molecular Devices，Sunnyvale，CA，USA)。使用校准曲线将结果转化为μg/mL，并作为时间的函数作图。PK半衰期t1/2值使用Prism(Graphpad，LaJolla，CA，USA)计算。
光学药物清除率测量(例如，图21A、21C)是从30至480min的多个时间点处死的小鼠的矢状窦血管的光学成像数据获得的。血管荧光定义为在垂直穿过血管绘制的线性分布中的荧光峰和肩峰之间的差异(参见图21C)。然后通过用已知浓度的荧光标准品计算，将荧光的连续减少转化为μmol/mL，并在图21A中与血清测量一起绘制。
组织处理和染色：在每个实验中对脑脉管系统进行染色以区分血管和脑实质。在大多数实验中(图15A-15C、16A-16B、17A-17B、20A-20E、22A-22C)，在安乐死前15min，将DyLight488番茄凝集素(DL-1174；Vector Laboratories，Burlingame，CA)在盐水中以1:2的稀释度以150μl的大药丸(bolus)注入。这导致广泛和最佳的脉管系统染色。对图21A-21D所示的组织进行脉管系统的免疫组织化学染色。这在8-14μm厚的冷冻切片中完成，将其在室温下风干，用1％多聚甲醛固定5min，然后用PBS冲洗。然后将切片在潮湿的小室中与封闭缓冲液(5％正常BSA和0.1％Triton X-100的PBS溶液)一起温育1小时。切片用与AlexaFluor488(Thermo-Fisher Scientific，Canoga Park，CA，USA)缀合的抗血管性血友病因子(anti-von Willebrand Factor)(vWF，Abcam，Cambridge，UK)染色。洗涤后，如上所述安装切片。
实施例4-图像获取和光学分析
用Lecia DM6000B落射荧光显微镜(Leica Microsystems，Wetzlar，Germany)进行成像。用534-558nm激发和560-640nm发射滤光器组观察罗丹明标记的纳米缀合物，用20XLeica HC Plan apo0.70 N.A.和40X Leica HCX Plan apo0.85 N.A.透镜观察，并用LeicaDFC360 FX相机记录。用Leica LAS X软件控制照相机，并且对于20X镜头用4.5秒+2.0增益曝光并且对于40X镜头用3.5秒+2.0增益曝光来获取图像。这些参数在整个成像实验中保持恒定，以使得能够在试验和实验之间进行精确的图像与图像比较。使用互补标准滤光片组观察其它荧光团(DAPI，番茄凝集素，抗体)，并且它们的成像参数在实验试验中也保持一致。
光学数据分析：光学成像数据的分析在ImageJ FIJI中进行(Schindelin et al.(2012)Nature Methods，9,676-82，其通过引用并入本文，如同完全阐述一样)。
为了确定纳米缀合物是否进入脑实质，在不含脉管系统的区域中进行图像强度分析(即，参见图15A照片1中的白框)。在该分析中，20×10μm2大小的感兴趣区域(ROI)随机覆盖在显示脉管系统的图像上，明确避开血管。然后在将每个ROI单独覆盖在显示纳米缀合物荧光的图像上之后，获得每个ROI的强度测量和位置。因此，荧光测量基于脑血管的解剖学，而不是脑实质的整个切片或提取物的纳米缀合物标记，并且因此是无偏差的并且有意地避免了脑血管系统中的纳米缀合物的负载。纳米缀合物标记的总体描述以来自海马、皮质或中脑三个单独图像(每个缀合物和脑区用4只小鼠)的20个测量的组合平均值和标准误差呈现。为了确定纳米缀合物相关的荧光如何与脉管系统的解剖结构相关，手动测量每个分析的ROI距最近的血管壁的距离(使用FIJI的线工具)。然后将强度值相对于血管壁的位置作图并总结在散点图中(例如，图15B)。
脑实质中的所有纳米缀合物荧光测量(例如，图15B-15C(1-3)；17B(1-3)；20B-20E和21C-21D)以相对荧光强度表示。通过从每个纳米缀合物荧光测量中减去在注射PBS的小鼠(总共6只小鼠；每个脑区域28个图像)的相应脑区域中成像的自身荧光的平均强度，获得相对荧光测量值。因此，相对荧光测量值代表总荧光减去代表性自身荧光。在Prism中进行数据图和统计分析。除非另有说明，荧光测量值通过单因素方差分析结合单个数据点的成对事后比较进行比较；每个结果都分别显示了精确的参数和测试。
实施例5-体内数据分析
PMLA/血管肽素-2(2％)/罗丹明(1％)缀合物的药代动力学是单肽缀合物的PKs的代表。
图9表示PMLA/血管肽素-2(2％)/罗丹明(1％)缀合物的PK，通过所连接的染料的荧光强度作为从IV注射到尾静脉直到采集血样的时间的函数进行测量。基于标准曲线，将样品荧光强度转化为mg注射的纳米缀合物，所述标准曲线通过用已知mg量的缀合物掺加血液样品并将荧光强度作为mg纳米缀合物的函数来获得。计算图9中绘制的曲线，用于获得的与实验点的最佳拟合。基于该曲线计算下表3中所示的参数。
表3、计算参数
Figure BDA0002439098430000651
Figure BDA0002439098430000661
在观察到的两相中，考虑第二相，其半衰期为1.31小时。注射4小时后纳米缀合物的残留量小于6％。
将PMLA/LLL(40％)/血管肽素-2(2％)/罗丹明(1％)纳米缀合物静脉(尾)注射到健康的裸鼠中。在注射后0.5小时、1小时、2小时和4小时检测离体脑切片。观察到纳米缀合物在血管周围两小时可见，并且在注射纳米缀合物后4小时几乎消失。
经观察，不携带Aβ结合肽的纳米缀合物在阿尔茨海默病小鼠的AD斑块处不显示沉积。还观察到，在特征荧光波长下，染料荧光的沉积与染料的类型无关。
图13是将缓冲液(IV)注射到健康小鼠尾静脉后12小时的左海马CA的图像。观察到荧光点的位置靠近细胞核，在绿色和红色波长区域具有可激发的荧光，并且据报道代表被称为脂褐素的废弃亲脂性物质。这些不同于纳米缀合物，纳米缀合物表现为红色“薄雾(haze)”，并且仅在红光范围内可激发。在应用过滤器之后，云状物被转换成白色和灰色阴影的云。
实施例6-肽缀合物随时间和与血管的空间关系的分布
图14是示出包括上矢状窦(SSS)的主要血管的大脑的示意图，所述主要血管是沿着大脑的中线延伸的大血管。注射后60min和120min时检查SSS中纳米缀合物(也称为微型纳米药物)的位置。如图21B-21C所示的该位置的检查提供了关于药物从脉管系统转移到脑实质中以及在2-4小时后药物消失的信息。这是定性观察(图21B)，但是发现当比较在IV注射后60min和110min时SSS周围的面积时是令人信服的。在60min时，在容器附近有更多的小颗粒“薄雾”形式的药物。120min后，雾度几乎完全清除。可以以图21C的轮廓图中所示的荧光强度对与SSS的距离的形式进行定性分析。肽纳米缀合物以分子形式通过BBB的外观被看作“薄雾”或“云状物”，表明这些试剂以溶质渗透BBB。形态测定分析证实，在减去由脂褐素引起的荧光背景后，肽缀合物的荧光产生“薄雾”，如图13所示。
对于本文所述的所有肽纳米缀合物(或微型纳米药物)已经获得了类似的结果。
实施例7-脑实质中纳米缀合物荧光的表征
通过对由它们的罗丹明部分发射的荧光进行光学成像，研究了纳米缀合物的BBB渗透和脑分布。所有成像在固定冷冻切片中进行，所述固定冷冻切片在全身静脉内注射后的不同时间从小鼠获得。观察到两种不同的荧光模式，然而仅一种模式可归因于纳米缀合物。一种类型的荧光归因于脂褐素的存在，脂褐素是细胞内代谢物和神经元中的废物沉积物(Di Guardo(2015)，其通过引用并入，如同完全阐述一样)。假设纳米缀合物荧光可以有助于脂褐素信号(即，通过细胞内细胞器中罗丹明的降解和累积)，但这种类型的荧光被排除在光谱分析之外。尽管一些研究已经显示脂褐素样颗粒染色模式，但是还没有报道扩散的纳米缀合物荧光与脂褐素之间的区别。
这种区别是获得纳米缀合物荧光的精确和可靠的光学测量的前提。
实施例8-浓度依赖性BBB渗透P/LLL/AP-2
表1列出了12种纳米缀合物，对它们跨越BBB并分布在脑实质中的能力进行了检验。结果表明P/LLL/AP2具有最好的BBB渗透能力。
图15A-15C说明了P/LLL/AP-2/罗丹明的浓度依赖性BBB渗透。图15A是一组照片，示出了在静脉内注射下述浓度的P/LLL/AP-2/罗丹明后120min时获得的光学成像数据：照片1-29.5μmol/kg；照片2-59μmol/kg；照片3-118μmol/kg；和照片4-236μmol/kg。列出了关于系统注射的总纳米缀合物含量的药物浓度。参考该图，脉管系统以浅灰色显示，并且纳米缀合物为白色扩散的云状物。图15B是一个图表，说明了纳米缀合物的荧光强度相对于用三种不同浓度注射的小鼠脑实质中的“距血管的距离”的测量值。参考图15B，从随机覆盖在无脉管系统的区域上的10μm2大小的感兴趣区域(ROI)获得荧光测量结果，如图15A的照片1上的白色正方形所示。然后获得每个ROI的强度测量和位置，并相对于最近血管壁的位置绘图。图15C是一组图表：图1-皮质；图2-中脑和图3海马，说明了以四种不同药物浓度注射后测量的脑实质中的平均纳米缀合物荧光。在该图中，荧光以相对荧光显示，其是减去使用类似的采集设置从注射PBS的动物成像的自身荧光后测量的纳米缀合物荧光。其中所有统计学测试均针对29.5μmol/kg的P/LLL/AP-2/罗丹明进行；个体测试结果用星号指示，其中，*＝p<0.01，**＝p<0.001，***＝p<0.0001。
参考图15A，显示了用不同浓度的P/LLL/AP-2/罗丹明静脉注射尾部并在注射后120min处死的小鼠的光学成像数据。药物浓度以每种注射的纳米缀合物的总浓度列出，其中，缀合物含有40％LLL、2％肽和1％罗丹明，除非另有说明。图15A中所示的组织用番茄凝集素复染以显示脉管系统(浅灰色)，而纳米缀合物显示灰色。
观察到以增加的药物浓度注射P/LLL/AP-2/罗丹明产生了明显更多的荧光，如图15A中用29.5μmol/kg(照片1)、59μmol/kg(照片2)、118μmol/kg(照片3)和236μmol/kg(照片4)注射的小鼠所示。参照图15A的照片4，还观察到有更多的药物呈“薄雾”的形式。纳米缀合物的脑组织渗透不均匀，并且大多数纳米缀合物荧光集中在血管周围空间，距血管壁5-20μm。参考图15A，这在照片4中可见，在血管附近为强纳米缀合物荧光(灰色“薄雾”)，但在远离血管处荧光减弱。图15B在所有测量的图中探索了这种关系(对于每种条件：4只小鼠，3-4个切片，每个切片有20个随机测量)。所有荧光强度测量均在置于番茄凝集素染色的血管(ROI如图15A的照片1中)外部的10μm2大小的目的区域进行；然后，相对于最近血管壁的位置测量这些ROI的位置，以产生图15B中的散点图。将数据拟合成线性回归，表明236μmol/kg药物注射条件的荧光强度降低(斜率)为-0.72±0.15，118μmol/kg药物注射条件的荧光强度降低为-0.272±0.07。这证实了纳米缀合物组织渗透是不均匀的，并且药物浓度随着与脉管系统的距离而降低。然而，基于显着不同的y-截距，在较高药物浓度下注射后，P/LLL/AP-2/罗丹明的BBB渗透显著被证实。因此，236μmol/kg药物注射条件下的y截距为34.07±2.3；对于118μmol/kg药物注射，为17.49±0.8，对于以29.5μmol/kg注射的药物，为6.342±0.34。
参考图15C，上述结果适用于大脑皮质(表1)、中脑(表2)和海马(表3)。图15C的图表1-3中所示的数据是平均纳米缀合物荧光强度值和它们的标准误差：这些是从随机取样的ROI获得的，而不管它们的位置和距脉管系统的距离(在每种条件下4只小鼠)。值得注意的是，图15C的图表3显示海马区中的荧光测量结果始终低于皮质或中脑中的荧光测量结果。海马与记忆的形成和维持有关，受神经变性疾病影响，因此是潜在纳米缀合物疗法的关键重要靶标(Zeidman和Maguire(2016)；其通过引用如同完全阐述一样并入)。例如，图13显示了海马区域中的背景荧光归因于脂褐素，其是预先存在的自发荧光并且不依赖于缓冲液或肽纳米缀合物的注射。从图15C所示的荧光强度中减去背景荧光。
假设海马区中较低的纳米缀合物荧光是由于该脑区的血管灌注的相对小的量。
图16A-16D示出了不同脑区域中的血管直径、血管覆盖率和血管间距。图16A是一组照片，示出了皮层、中脑和海马CA1细胞层中的血管(概述)。用番茄凝集素(在此显示为白色片段)染色血管，用DAPI复染细胞核(灰色圆点)。图16B是示出血管直径的柱状图。参照图16B，血管直径被测量为血管壁之间的最短距离，并且在每个脑区域中平均是4-5μm。该直径的血管在脑微血管的范围内。图16C示出了脉管覆盖的柱状图。参考图16C，血管覆盖定义为番茄凝集素染色的血管所占据的面积除以每个分析图像的总面积。在皮层和中脑中血管覆盖相似，但在海马CA1细胞层中小得多(ANOVA：F＝22.03；p＝0.0003)。图16D示出了定义为两个相邻血管之间的最短(欧几里得)距离的血管间距离，其是针对每个图像中的所有血管综合采样的。参照图16D，观察到该距离在海马区中最大(ANOVA：F＝36.05；p＜0.0001)，这证实了在该区域中存在最少的血管。对来自海马的形态学测量进行个体统计学比较，并表示为**＝p<0.001和***＝p<0.0001。
参考图16B-16C，在皮层、中脑和海马中观察到相似大小的血管(图16B)，但是海马中这些血管覆盖的区域比皮层或中脑中的小(图16C)。参考图16D，这些导致海马中59μm的血管间距离，其几乎是皮质(32μm)和中脑(30μm)的两倍。通过考虑P/LLL/AP-2/罗丹明优先分布在距微脉管系统～30μm内(即图15B)，可以认为海马中血管通路减少可能是其药物灌注减少的原因。这个问题可以通过以较高浓度注射药物而部分解决，如在图15C，小图3(海马)中海马纳米缀合物荧光的显著剂量依赖性增加所观察到的。
实施例9-BBB渗透取决于纳米缀合物组成
接着注意到单个纳米缀合物部分对BBB渗透(LLL和AP-2)的影响，其中剩余的LLL(40％)、AP-2(2％)和罗丹明(1％)的浓度保持恒定。除去LLL部分，得到P/AP-2(具有0％LLL)。
图17A-17B说明纳米缀合物组合物确定BBB渗透的程度和位点。图17A是一组照片，示出了大脑皮质的纳米缀合物渗透：照片1-P/LLL/AP2；照片2-P/AP-2和照片3-P/LLL。参考该图，显示大脑皮质的纳米缀合物渗透的光学成像数据：纳米缀合物荧光是灰色“薄雾”，脉管系统由白色延伸部分指示。如照片1所示，对于P/LLL/AP-2观察到最强的”薄雾”荧光。图17B是一组柱状图，显示了大脑皮质(1)、中脑(2)和海马(2)中的平均纳米缀合物荧光，其作为纳米缀合物组成和浓度的函数：P/LLL/AP-2以黑色显示，P/AP-2以灰色显示，P/LLL以白色显示。平均纳米缀合物荧光测量值从在脑脉管系统外部明确随机采样的20个目的区域获得(4只小鼠，每个测量具有4个图像)。在不同浓度的纳米缀合物类型(例如，黑色对灰色)之间进行统计学测试。结果用d星号指示，其中，*＝p<0.01，**＝p<0.001，并且***＝p<0.0001；虚线显示了P/LLL/AP-2的浓度，对其进行了每次比较。
参考图17A，照片1相对于和照片2所示的数据显示P/LLL/AP-2比P/AP2更好地跨越脑实质。这在血管周围空间中尤其明显，其中在P/LLL/AP-2条件下而不是在P/AP-2条件下可以看到许多漫射灰色纳米缀合物荧光”薄雾”。来自皮层的相应荧光测量值总结在图17B的图表1中(黑色相对于灰色数据)，并且以29.5μmol/kg(Tukey：P＜0.0001)、59μmol/kg(Tukey：P＜0.0001)和118μmol/kg(Tukey：P＜0.0001)注射的P/LLL/AP-2相对于P/AP-2的荧光测量显著更大。实际上，与P/AP2相关的荧光总是在所有成像的皮层组织中较低。在中脑(图17B，图2)和海马(图17B，图3)中进行了基本上相同的观察，并且得出结论，P/AP-2几乎没有BBB渗透的潜力。
检查AP-2部分的去除是否影响纳米缀合物的BBB渗透。在所有测试浓度下，P/LLL(含0％AP-2)在脑实质中产生的荧光比P/LLL/AP2(图17A，照片1相对于照片3)少(图17B，图表1；黑色相对于白色数据)。然而，来自注射P/LLL的小鼠的脑组织比来自注射P/AP-2的小鼠的组织的荧光显着增强(图17B中的灰色相对于白色，图1)：在29.5μmol/kg(Tukey：P＜0.01)、59μmol/kg(Tukey：P＜0.0001)和118μmol/kg(Tukey：P＜0.0001)时，与P/AP-2相比，P/LLL具有更多的皮层荧光。这种观察也在中脑(图17B，图2)和海马(图17B，图3)中进行。因此，即使没有肽部分，P/LLL也能跨越BBB。AP-2肽的加入显著增加BBB渗透，并且与LLL组合，产生最佳的纳米缀合物式P/LLL/AP2。
本发明的结果令人惊奇地表明，LLL部分与PMLA结合，也有助于PMLA的BBB渗透，而不需要BBB跨越肽。这种机制可能涉及PMLA和LLL部分的协同作用，以引入特定的疏水/亲水两亲缀合物，其破坏血脑屏障。
此外，能量计算表明分子内LLL-LLL缔合对纳米缀合物的构象有影响，即，其可能有利于AP-2或其他肽非依赖性BBB渗透。图18A-18B说明了缀合的LLL残基对纳米缀合物构象的影响。图18A是含有LLL和部分缀合肽接头(PEG)的代表性缀合物的化学结构的示意图。LLL在结构示意图中用黑色箭头表示。图18B是图18A中所示的短的代表性PMLA结构(16个苹果酸残基)的三维图像，其中具有PEG(2条乙二醇-六聚体链通过马来酰亚胺与PMLA缀合)、封端的巯基(两个部分)和LLL(4个部分)。相邻LLL部分之间的范德华相互作用用白色箭头表示。图18B所示的结构是真空计算的总能量最小化的结果，对于LLL类似物(Chem3DPro11.0)表示为226kcal/mol。
图19A-19B示出了在不存在LLL的情况下的纳米缀合物构象。图19A示出了结构模型，并且与图18A所示的相似。因为该结构缺乏LLL，所以与图18B中的缀合物相比，该缀合物的三维构象似乎是延伸的。图19B是在能量最小值计算之后获得的图19A中所示的结构的三维图像。根据真空计算的能量最小化(Chem3D Pro11.0)，总能量为1194kcal/mol。已知PMLA是带负电荷的(表1：P/Rh的ζ电势为-22.9mV)，因此是亲水的；这可以增加其接近的距离并排除与带负电荷的内皮细胞膜的初始相互作用。LLL的加入减少了负电荷并增加了PMLA的疏水性，这可以促进与细胞膜的相互作用。第二，LLL的加入可以阻碍带正电荷的AP-2肽残基和带负电荷的PMLA主链之间静电接触的形成。在没有LLL的情况下，缀合物中的肽-接头部分可以折叠并附着到PMLA主链，最终使得它们较少用于生物学相互作用。LLL在空间上阻止这种相互作用，从而AP-2肽通过与LRP-1(或其它受体分子)相互作用而变得有生物学活性。动态光散射(DLS，溶液中的流体动力学直径)和多分散指数测量(PDI，分子大小分布)的结果与该想法一致，并且显示具有不同程度的聚合物卷曲和卷曲大小的纳米缀合物的多样性(表2)。
如图18A-18B和19A-19B所示的能量计算表明LLL可以通过LLL-LLL相互作用诱导纳米缀合物的折叠，这最终降低游离聚合物的构象，并因此减少构象变体的数目和直径。因此，单独的PMLA的测定流体动力学直径为3.68nm，高PDI为0.89(表2)。在形成P/LLL缀合物之后，平均直径减少到2.68nm，而变体分散度减少到0.50。P/AP-2的测量直径为5.93nm，PDI为0.79，暗示了通过肽与聚合物的不规则连接推断的多样性增加。缀合LLL的作用(即P/LLL/AP-2)将大小降低至4.45nm，PDI降低至0.39，这再次通过形成内部缀合物LLL-LLL接触来解释，即使缀合物携带更大的负荷和分子量。进一步地，通过能量计算(在无溶剂的情况下)获得的图18A-18B和19A-19B所示的结构和三维模型显示了短PMLA类似物的三维结构，其模拟具有和不具有LLL(16个苹果酸残基，通过马来酰亚胺和两个巯基部分缀合的两个六甘醇低聚物(282g/mol))和缀合的LLL(图18A；4个部分，黑色箭头)和没有缀合的LLL(图19A)的短PMLA缀合物。因此，结构模型显示LLL部分可以缔合以形成分子内结构域，并且LLL-LLL相互作用通过增加刚性和减小直径来减少PMLA缀合物的可能构象的数目。总之，与LLL的缀合有利于BBB渗透，其通过(i)优化靶向肽与特定转胞吞作用途径的受体的相互作用，(ii)减小渗透纳米缀合物的直径，和(iii)增加纳米缀合物的刚性。
实施例10-筛选BBB-跨越肽部分
将四种BBB-跨越肽，即AP-2、M4、B6和cTfRL缀合至P/LLL，并筛选其允许或增强纳米缀合物的BBB-跨越的能力(Demeule et al.(2008)；Staquicini et al.(2011)；Yin etal.(2015)；Liu et al.(2013)；和Oller-Sara et al.(2016)，将其全部引入作为参考，如同完全阐述一样。
图20A-20E说明纳米缀合物肽部分筛选。图20A是一组照片，说明了P/LLL配备了不同的肽(1-P/LLL/AP-2；2-P/LLL/M4；和3-P/LLL/B6)以评价它们在BBB渗透中的作用。参考该图，罗丹明标记的肽结合物的光学成像数据显示通过与AP-2(1)、M4(2)和B6(3)结合的P/LLL对大脑皮质的渗透。纳米缀合物荧光是灰色的，脉管系统是白色的。图20B-20D是一组柱状图，显示了以29.5μmol/kg或118μmol/kg的浓度注射的大脑皮质(图20B)、中脑(图20C)和海马(图20D)中的平均纳米缀合物荧光。图20E示出了以59μmol/kg或118μmol/kg的浓度注射的肽组合P/LLL/AP-7(浅灰色条)、P/LLL/AP-2(4％)(白色条)、P/LLL/AP-2/M4(深灰色条)和P/LLL/AP-2(2％)(黑色条)的大脑皮质中的纳米缀合物荧光测量。针对每个直方图中P/LLL/AP2的不同浓度中的每一个进行统计测试，并且用星号指示，其中，*＝p<0.01，**＝p<0.001，***＝p<0.0001；红线表示P/LLL/AP2的浓度，每次对其进行比较。
具有高BBB渗透的纳米缀合物具有式P/LLL/AP-2/罗丹明。参考图20A，用M4代替AP-2(照片1和2；P/LLL/M4)在注射了29.5μmol/kg缀合物的小鼠皮层中产生相似水平的纳米缀合物荧光(图20B中黑色相对于深灰色；Sidak：P＝0.5749)。然而，以118μmol/kg注射的缀合物P/LLL/M4在皮层中产生的荧光显著低于P/LLL/AP-2(图20B；Sidak：P＜0.0001)。然而，在中脑和海马中都测量到基本相同水平的P/LLL/M4和P/LLL/AP-2荧光，而不管注射的药物浓度(图20C和20D中的黑色相对于深灰色)。因此，P/LLL/M4和P/LLL/AP-2似乎以相似的功效渗透到脑组织中，但是P/LLL/M4表现出局部选择性和较差的大脑皮质渗透。
由TfR配体注射得到的荧光测量通常小于由P/LLL/AP-2注射得到的荧光测量。当与在相同的脑区域中注射P/LLL/AP2相比时，P/LLL/B6几乎总是较少(图20B-20D中的黑色相对于白色)。唯一的例外是中脑中P/LLL/B6相关荧光，其类似于以118μmol/kg注射的P/LLL/AP-2所测量的(比较图20C中的黑色相对于白色；Sidak：p s＝0.2499)。中脑含有最高密度的脑微血管(例如图16A-16B)，这可能促进药物进入脑组织。这也可以解释为什么如果以足够高的浓度(118μmol/kg)注射，P/LLL/AP-2、P/LLL/M4和P/LLL/B6在中脑中显示基本上相同水平的纳米缀合物荧光。含有29.5μmol/kg Tf配体cTfRL(P/LLL/cTfRL)的纳米缀合物在中脑和海马中产生与B6相当的荧光强度测量(图20C和20D)，并且在皮质中产生低强度(图20B)。因为P/LLL/cTfRL的结果对于P/LLL/B6是冗余的，所以该纳米缀合物从进一步的实验中被去除。作为图17A-17B所示实验的另一对照，合成P/AP-2/罗丹明(即，省略LLL的不同的肽)。该肽的BBB渗透性差。类似地，P/M4和P/cTfRL进入脑实质的渗透性都较差，并且产生极低的荧光测量值。这些结果证实了LLL是BBB渗透所需要的，而不管缀合物携带哪种肽。
在另一组实验中，评价了具有肽组合和修饰的肽负载的纳米缀合物是否更有效地穿过BBB(图20E)。携带AP-2和M4(P/LLL/AP-2/M4)组合的纳米缀合物(每种都是其自身有希望的)比含有单一肽的纳米缀合物略微更多地渗透皮层。这在图20E中显示，其中以59μmol/kg注射的P/LLL/AP-2/M4产生的荧光比相同浓度的P/LLL/AP-2产生的荧光稍多，但不显著多(黑色相对于为深灰色；Sidak：p＝0.0617)。因此，P/LLL/AP-2/M4不能表现出每种肽的显著的效果总和。此外，P/LLL/AP-2/M4由于聚合物平台的较高占有率而具有降低的载物容量，并因此减少了游离配体附着位点的数量。
在评估中，如果纳米缀合物上增加相同肽载量，是否可以导致BBB渗透的增强。迄今为止，所有缀合物携带2％总肽含量。在图20E中，证明肽负荷加倍，P/LLL/AP-2(4％)实际上导致BBB渗透降低(黑色相对于白色；Sidak：p＜0.0154)。根据这些结果，得出结论，2％肽是纳米缀合物递送系统的最佳负载。
测定注射的P/LLL/AP-7的结果作为对照。AP-7与AP-2的不同之处在于，用精氨酸残基取代了10位和15位的两个赖氨酸残基(TFFYGGSRGRRNNFRTEEYCNH2(SEQ ID NO：7))，据报道这削弱了肽与内皮LRP-1受体的相互作用(Demeule et al.(2008)，将其引入本文作为参考，如同将其完全阐述一样)。
P/LLL/AP7渗透皮质脑组织，但产生的荧光显著低于P/LLL/AP-2，两者均以118μmol/kg注射(图20E中黑色对灰色；Sidak：P＜0.0001)。该结果证实了真正的AP-2能够起到使纳米缀合物进行跨BBB移动的实质作用。连同本文所述的其他发现，证明了通过BBB的纳米缀合物转运取决于肽同一性、肽负载和与其他纳米缀合物部分的相互作用(即LLL)。
结果适用于健康小鼠的脑。在BBB受损或跨BBB受体表达改变的病理条件下，某些肽的表现可能会有所不同，这是有启发意义的。例如，TfR途径可有效将药物递送至脑肿瘤。神经胶质瘤在其血管内皮中过表达TfR，并且这可以通过增强TfR转运来帮助药物-肿瘤渗透和递送(Meng et al.(2017)，其通过引用并入本文，如同完全阐述一样)。相反，LRP-1途径与活性较低的淀粉样β蛋白清除有关，并影响阿尔茨海默氏病中的稳态(Grimmer et al.(2014)，其通过引用结合到本文中，如同完全阐述一样)。
实施例11-纳米缀合物在血液和脑中的药代动力学
通过静脉内注射给予荧光纳米缀合物，并在注射后15-480min时抽取血液以测量血液清除和血清中P/LLL/AP-2/罗丹明和P/LLL/罗丹明的药代动力学。图21A-21D说明了纳米缀合物荧光在血清和脑组织中的药代动力学。图21A是说明对P/LLL/AP-2(黑色)和P/LLL(灰色)进行血清清除分析的图表，并通过脑血管含量的成像进行光学分析(黑色三角形)。图21B是一组说明显示240min中药物清除血管和实质积累的光学成像数据的照片。这些图像显示纳米缀合物P/LLL/AP-2为发白的“薄雾”，脉管系统为灰色。图21C说明了矢状窦的血管荧光强度曲线，如图21B中的白线所示。在该图的右上角指示了时间点。图21D是一个条形图，展示了脑组织中纳米缀合物的荧光强度对P/LLL/AP2(黑色)、P/LLL(灰色)和P/AP2(白色)的时间依赖性与血清PK动力学不同。荧光开始快并且在120min内保持准稳定。清除时间为240-480min。所有显示的数据来自大脑皮质，并且是从注射PBS的小鼠的代表性组织的背景图像强度中减去的相对荧光值。
如图21A所示，从校准曲线计算纳米缀合物的血清浓度，所述校准曲线预先来源于具有已知浓度的纳米缀合物的荧光测量。缀合物P/LLL/AP-2和P/LLL的血清半衰期分别为76.7min和119min。通过用单指数衰减函数拟合血清荧光测量来确定半衰期：与P/LLL/AP-2相关的荧光衰减在r2＝0.9361时是良好拟合，而P/LLL衰减在r2＝0.715时是良好拟合。衰减函数显著不同(额外的平方和F-检验：F＝8.281；p＝0.0002)，因此证实P/LLL/AP-2和P/LLL的血清清除率不同。
在确定了纳米缀合物在血清中的药代动力学之后，接下来的问题是这些测量是否可以用脑切片的光学成像数据复制。为此，直接光学测量脑组织中血管P/LLL/AP-2/罗丹明荧光。图21B显示了静脉注射后30-240min来自大的中心血管即矢状窦的成像数据。图像显示了微型纳米药物(发白的“薄雾”)和窦脉管系统(灰色)。图21C显示了该血管和邻近脑组织的荧光强度分布图，如图21B中的白线所示。荧光纳米缀合物在静脉注射后30min时在脉管系统中明显浓缩，而随后的时间点显示血管荧光的逐渐丧失(图21C)。通过测量荧光峰和周围实质中荧光强度之间的差异(参见图21C中的虚线)来计算“光学血管荧光(opticalvascular fluorescence)”，然后在图21A中将血管荧光在多个时间点上与实际血清测量值并排作图(黑色三角形)。通过归一化到血清P/LLL/AP-2的一个时间点(120min)，将光学血管荧光测量结果转化为μmol/mL单位；然后使用相同的比例(对于29.5μmol/kg注射，在120min时，0.115μmol/mL血清浓度)转换剩余的时间点。值得注意的是，对于光学测量的P/LLL/AP-2的血清清除率，获得了几乎完全相同的半衰期(光学半衰期＝73.2min)，并且在光学和血清拟合函数之间没有检测到差异(额外的平方和F-检验：F＝0.3327；p＝0.8017)。该结果证实了光学成像数据理解脑中纳米缀合物药代动力学的有效性。
纳米缀合物相关的荧光在皮质实质中的衰减总结于图21D。参考该图，在注射P/LLL/AP-2/罗丹明后，在不同时间(30min-细实线，60min-虚线，120min-点划线，240min-粗实线和480min-点线)穿过矢状窦(血管)和邻近实质的荧光强度。在静脉注射后30min时，缀合物荧光最大，并且只有轻微的降低，直到120min(图21D；ANOVA：F＝531.6；p＜0.0001)，尽管血清药物显著降低(图21A)。在静脉注射后240min，纳米缀合物的荧光不能与脑实质的背景荧光区分开来，表明P/LLL/AP-2/罗丹明在给药后四小时内从脑中被消除(图21D)。在中脑和海马中进行相同的观察。在30至480min的时间段内，皮质中的P/LLL相关荧光低于P/LLL/AP-2的荧光(ANOVA：F＝268.5；p<0.0001)，但是总荧光累积和清除遵循与用P/LLL/AP-2所见的相同模式(图21D；黑色)。还观察到P/AP-2相关荧光低于其它纳米缀合物的荧光，但再次遵循类似的荧光衰减轨迹(图21D；白色)。当血管中的水平降低时，由于荧光缀合物随时间透过BBB，实质中的水平升高。在延长时间(240min和480min)之后，强度降低，这是由于纳米缀合物反向渗透和累积回血管(具有比之前低得多的纳米药物含量，因此诱导反向扩散)。
本文数据的分析显示，在静脉内注射后4小时开始，P/LLL/AP-2相关荧光从血清和脑组织中消失。药代动力学测量获得自从注射了29.5μmol/kg纳米缀合物浓度的小鼠组织。没有研究较高浓度注射的药物的清除，但可能延长时间；这是可能的，因为在施用高药物浓度后在实质组织中观察到更多的药物积累(参见图15A-15C)。
实施例12-基于光学比率测量估计脑实质中的微型纳米药物浓度
在该分析中，成像结果是为了估计在药物注射后120min皮质脑实质中P/LLL/AP-2缀合物的实际浓度。这是通过首先测量脑血管系统中的P/LLL/AP-2/罗丹明荧光，然后测量具有相同感兴趣区域的周围实质荧光，接着计算血管/实质荧光比率来实现的
图22A-22C说明对静脉注射P/LLL/AP-2至大脑皮质实质中的纳米缀合物浓度的估计，单位为μg/mL。(A1-A2)。图22A是一组说明光学成像数据的照片，显示了来自注射了29.5μmol/kg(A1)和118μmol/kg(A2)的P/LLL/AP-2/罗丹明的小鼠的皮层组织。顶部图像显示细胞核(灰色)、脉管系统(浅灰色延伸)和P/LLL/AP-2缀合物(灰色)。下图仅显示P/LLL/AP-2缀合物相关的荧光。在与血管的指定距离处选择的白色相邻的感兴趣区域(虚线，ROI)用于计算脉管系统/实质荧光比。所选择的ROI是接近的，但不是最终最高纳米缀合物染色的区域。图22B说明脉管系统/皮质脑实质中的荧光比率。星号表示在29.5μmol/kg药物注射条件下进行的Tukey试验中的统计学显著性，其中，**＝p<0.001，***＝p<0.0001。图22C说明了皮质脑实质中估计的P/LLL/AP-2浓度。星号表示在针对29.5μmol/kg药物注射条件进行的Tukey测试中的统计学显著性，其中，**＝p<0.001，***＝p<0.0001。参考图22A，总结了4只小鼠的数据，4个切片，每个条件进行10次测量。图22A中的图像(A1和A2，下图)表明了分别注射了29.5μmol/kg和118μmol/kg P/LLL/AP-2缀合物的小鼠的两个样品中的这一过程。测量得到的荧光比率总结在图22B中。对于118μmol/kg(ANOVA：F＝11.36；p<0.0001；Tukey：p<0.0001)和236μmol/kg(Tukey：P＝0.0018)的P/LLL/AP-2/罗丹明注射，观察到脉管系统/脑实质荧光比率的显著降低；两种浓度都相当于29.5μmol/kg。结果表明在高浓度P/LLL/AP-2时，血液到脑的转运稍微降低，这可能是由于血液中的高纳米缀合物浓度导致的LRP-1途径饱和的结果。
使用这些数据，通过将每个脉管系统/实质比测量值乘以注射后120min时的已知血清药物浓度(对于29.5μmol/kg注射，为0.115μmol/mL，如图21A所示)，估计脑实质中的实际P/LLL/AP-2浓度。得到的药物实质组织浓度在图22C中作图。在整个皮质实质中观察到药物浓度的强烈显著的总体增加(ANOVA：F＝166.3；p<0.0001)。对于29.5μmol/kg注射，最低P/LLL/AP-2实质组织浓度估计为0.049±0.001μmol/ml；对于236μmol/kg注射，最高实质组织浓度为0.32±0.01μmol/mL。基于这些估计，得出结论：P/LLL/AP-2有效地穿过BBB，静脉内给药后120min内，在脑中可检测到血管组织中40％或更高百分比的游离血清药物(％取决于与血管组织的距离)。
在此基础上，试验性地假定血管和近端实质浓度相似(作为参考，40％和更高的血管浓度)。相似的浓度可表明，对于P/LLL/AP-2，血脑屏障不能起到非常有效的屏障的作用，至少在本文研究的浓度范围内。对实质浓度的了解可用于预测肽缀合物与脑中意欲靶向的受体分子的复合物形成，并因此用于级联靶向的设计。
实施例13-靶向淀粉样蛋白斑的微型纳米药物
设计了将载体靶向脑内细胞或结构的肽纳米药物。为了这个目的，使用包括靶向淀粉样蛋白和淀粉样蛋白斑的D-对映体多肽的纳米缀合物。评价了淀粉样蛋白靶向肽D1、D3、ACI-89的效力。图23A-23C显示了斑块的肽依赖性标记。图23A是说明注射P/LLL/M4后的小鼠的光学成像数据的照片。图23B是说明在小鼠注射P/LLL/M4/D1/罗丹明后的光学成像数据的照片。参考图23A-23B，观察到用缀合物染色的噬斑在照片的中心为“发白的灰色云状物”。观察到P/LLL/M4/罗丹明染色(图23A)不如P/LLL/M4/D1-肽/罗丹明染色强烈，这是通过光学测量揭示的。参考这些图，将携带肽的纳米药物以236μmol/kg P/LLL/M4/罗丹明或P/LLL/M4/D1的剂量静脉内注射到小鼠尾中。使用三重转基因阿尔茨海默病小鼠(株名：B6；129-sen1tm1MpmTg(APPSwe，tauP301L)1Lfa/Mmjax，短名：3xTg)。8小时后，如所描述的，将小鼠安乐死，脑切除并植入纳米药物，不进行脑内靶向。将脑切片并对细胞核染色。图23C是显示PMPLA(P)、P/cTfRL、P/M4、P/LLL/AP-2、P/LLL/M4、P/LLL/AP-2/ACI-89、P/LLL/AP-2/D3、P/LLL/AP-2/D1和P/LLL/M4/D1微型纳米药物的Aβ斑块相对于背景标记(信号噪声)的柱状图。图23C所示的所有微型纳米药物都含有荧光罗丹明。基本上如图23A-23B所述进行实验。所有斑块都可以用荧光硫黄素、淀粉辉光(Amyloglow)、荧光标记的抗β-淀粉样蛋白的mAb来标记，或者用它们的自发荧光来识别。斑块具有独特的结构外观，如大小为约3μm或更大的毛状星。固定后，试剂也可在体外应用于固定的载玻片，在斑块试剂中孵育20-30min，然后彻底洗涤。
与体内获得的标记一致，对于P/LLL/M4/D1微型纳米药物获得了最高水平的斑块标记，对于微型纳米药物P/LLL/AP-2/D1获得了第二高水平的斑块标记。对于缺乏D1、D3、ACI-89肽的纳米药物观察到背景靶向。
结果表明，在跨越BBB后，除了用于跨越BBB的其它肽AP-2、M4或B6之一以外，D1-肽纳米药物还含有D1-肽，确实靶向淀粉样蛋白斑。
参见图23A-23B，该图显示与IV注射P/LLL/M4/罗丹明(图23A；在图中被称为P/LLL/M4/D1-肽)后的染色相比，IV注射P/LLL/M4/D1-肽/罗丹明微型纳米药物后斑块被更强烈地染色(图23B；在图中被称为P/LLL/M4/D1-肽)。结果显示纳米药物，如P/LLL/M4/罗丹明，通过携带额外的肽，如D1，可用于进一步靶向脑内。图23C的条图定量显示了，与不存在D1时的染色相比，在缀合D1时染色斑块增加的效果。
实施例14-用于经BBB(Trans-BBB)传递的微型纳米药物的优点
合成生物可降解的无毒β-聚(L-苹果酸)(PMLA或P)作为支架，以化学结合穿过BBB的肽血管肽素-2(AP2)、Miniap-4(M4)和转铁蛋白受体定向配体cTfRL和B6。另外，在PMLA主链上连接了一个三亮氨酸内体逃逸单元(LLL)和一个荧光标记(罗丹明)。通过光学成像在不同脑区和多个时间点检测微型纳米药物的药代动力学、BBB渗透和分布。单次静脉注射后30min，含有P/LLL/AP-2的微型纳米药物在皮质、中脑和海马的实质中产生显著的荧光；四小时后观察到已清除。缺乏AP-2的微型纳米药物变体P/LLL，或缺乏LLL的变体P/AP-2，显示出BBB渗透明显更少。LLL部分似乎稳定纳米缀合物，而AP-2增强BBB渗透。含有肽cTfRL的微型纳米药物表现出相当少和/或不一致的脑实质浸润，可能是由于跨BBB转运降低。现在可以用脑内靶向和药物治疗部分将P/LLL/AP-2或其它肽功能化，所述脑内靶向和药物治疗部分针对神经障碍中涉及的分子途径。
提供了用于跨BBB药物递送的纳米药物平台。该策略建立在以前公开的肽上，以便跨BBB穿梭基于PMLA的药物平台。令人惊奇的是，观察到PMLA/LLL/肽相互作用以确定BBB通道，并进行了详细研究以确定微型纳米药物是如何分布在脑中的。此外，观察到固有疏水结构的部分，例如LLL，影响和增强脑递送，尤其是在具有高血管密度的区域，例如中脑中。这种效果可能是由于固有的药物性质。结果表明，对于纳米药物(P/LLL/AP-2、P/LLL/M4或P/LLL/B6-缀合物)和在应用条件下，BBB可能不构成有效的屏障，并且其可以开放以递送用于药物治疗的大量共价结合的药物。
神经障碍对脑区域的影响不同，并且几乎每种疾病都可归因于脑区域中的特定功能障碍。因此，不同脑区域中的纳米药物行为的详细知识可用于药物开发，并且在此提供这样的信息。用P/LLL/AP-2，仅50％的羧酸被官能化，留下具有额外位点的构建体以进一步使纳米药物配备有靶向和药物处理部分。
系统的优点：(1)肽缀合物与聚苹果酸的新组合的合成容易且成本低。(2)提供了证明纳米器件渗透穿过健康和阿尔茨海默BBB的微观证据。(3)从血管快速离开进入靶向组织，在组织中具有长期滞留(PK和与实质组织中纳米器件的微观流行率的比较)。(4)因此，用受体亲和特异性肽取代BBB胞转靶向抗体，提供了调谐的亲和力和受体-肽结合/解离的速率。(5)纳米平台具有多个药物位点和靶向基团。(6)药物的受控位点响应性释放(pH、酶、二硫化物交换)。(7)药物和靶向分子可自由接近以立即起作用(纳米载体平台上的配体的线性排列，不存在拥挤抗体的包藏)。(8)小于10nm尺寸和细长形状(高轴比)的微型纳米载体，即不存在用于快速扩散通过屏障和深层组织渗透的大体积蛋白质(抗体)(Ding et al.(2016)Nanomecine13,631-659，其通过引用并入本文，如同完全阐述一样)。(9)大分子纳米载体(全是共价键)，以确保可调的高化学和物理稳定性。(10)具有环外结构的抗切割肽，并且缺乏不存在酶切割的底物特性。(11)纳米器件的快速系统清除以将降解片段的干扰保持在最小。(12)生物可降解性、不存在不受控制的全身毒性和抗原性(例如通过抗体)。(13)制成粉末。在施用时和施用位点通过输注施用可溶性微型纳米药物。
靶向和功能性肽的序列和构象提供了对体内降解的高抗性(环外或D-构象)。具有微摩尔或更低的离解常数值。除了tau，用于靶向恶性疾病标记蛋白β-分泌酶1(BACE1)，早老素1的基因/氨基酸序列的核酸序列可用于靶向和设计反义寡核苷酸。
另外，微型纳米药物在受体治疗期间提供足够的对抗体内平衡失衡的活性。微型纳米药物不会过度供给受体有机体药物和递送载体以及它们的构成成分。微型药物的原理是在最大有效药物剂量下携带接近最小的供给，以最有效的物理补充进行深层组织渗透。所述微型纳米药是具有最小表面、伸长形式和适度强的结合亲和力的受体靶向构建体，以便使受体释放动力学和快速生物屏障跨越最大化，使抗原含量最小化以使免疫反应最小化，并且是生物可降解性的以避免长期持续的体内沉积。
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本申请中引用的参考文献出于所有显而易见的目的并入本文，并且在参考文献本身中如同每个参考文献被完全阐述一样。为了说明起见，这些参考文献中的特定参考文献在本文的特定位置处引用。在特定位置处引用参考文献表明了引入参考文献教导的方式。然而，在特定位置处引用参考文献不限制其中出于所有目的并入所引用参考文献的所有教示的方式。
因此，应当理解，本发明不限于所公开的特定实施例，而是旨在覆盖落入由所附权利要求限定的本发明的精神和范围内的所有修改；以上描述；和/或在附图中示出。
SEQUENCE LISTING
<110> 西奈医疗中心
<120> 用于通过多个生物屏障进行有效递送的方法和组合物
<130> P61808VOL
<150> 62/566,813
<151> 2017-10-02
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct, Angiopep-2-C
<400> 1
Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Ser Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys Thr
1 5 10 15
Glu Glu Tyr Cys
20
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct, Fe mimetic peptide
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Cys Arg Thr Ile Gly Pro Ser Val Cys
1 5
<210> 3
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<212> PRT
<213> Apis mellifera
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(8)
<223> Miniap-4 peptide
<400> 3
Lys Ala Pro Glu Thr Ala Leu Asp
1 5
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct, AON_antisense_B-secretase mRNA
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uccaccaucu ccacaaagct t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct, control sequence
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acgugacacg uucggagaat t 21
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct, H102 peptide
<400> 6
His Lys Gln Leu Pro Phe Phe Glu Glu Asp
1 5 10
<210> 7
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct, Angiopep-7C peptide
<400> 7
Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Ser Arg Gly Arg Arg Asn Asn Phe Arg Thr
1 5 10 15
Glu Glu Tyr Cys
20
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct, B6 peptide
<400> 8
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1 5 10
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Syntehtic construct, D1 peptide
<400> 9
Gln Ser His Tyr Arg His Ile Ser Pro Ala Gln Val Cys
1 5 10
<210> 10
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct, D3 peptide
<400> 10
Arg Pro Arg Thr Arg Leu His Thr His Arg Asn Arg Cys
1 5 10
<210> 11
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct, ACI-89 peptide
<400> 11
Pro Ser His Tyr Arg His Ile Ser Pro Ala Gln Lys Cys
1 5 10

Claims (66)

1.一种微型纳米药物，其包含：
聚苹果酸基的分子支架；
至少一种能够跨越血脑屏障的肽；
至少一种斑块结合肽；和
内体裂解配体；其中，
所述至少一种能够跨越血脑屏障的肽，所述至少一种斑块结合肽和所述内体裂解配体中的每一种均与所述聚苹果酸基的分子支架共价连接，和
所述微型纳米药物的尺寸范围为1nm-10nm。
2.根据权利要求1所述的微型纳米药物，其中，所述至少一种能够跨越血脑屏障的肽是LRP-1配体或转铁蛋白受体配体。
3.根据权利要求1所述的微型纳米药物，其中，所述至少一种能够跨越血脑屏障的肽是选自由血管肽素-2、铁模拟肽、B6肽和迷你蜂毒明肽-4肽，或它们的变体所组成的组中的肽。
4.根据权利要求3所述的微型纳米药物，其中，所述至少一种能够跨越血脑屏障的肽是包含SEQ ID NO：1的序列的血管肽素-2或其变体。
5.根据权利要求3所述的微型纳米药物，其中，所述至少一种能够跨越血脑屏障的肽是包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的铁模拟肽或其变体。
6.根据权利要求3所述的微型纳米药物，其中，所述至少一种跨越血脑屏障的肽是包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的B6肽或其变体。
7.根据权利要求3所述的微型纳米药物，其中，所述至少一种跨越血脑屏障的肽是包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的迷你蜂毒明肽-4肽或其变体。
8.根据权利要求1所述的微型纳米药物，其中，所述至少一种能够跨越血脑屏障的肽包含至少两种能够跨越血脑屏障的肽。
9.根据权利要求8所述的微型纳米药物，其中，所述至少两种能够跨越血脑屏障的肽各自被独立地选择。
10.根据权利要求1所述的微型纳米药物，其中，所述至少一种能够跨越血脑屏障的肽和所述斑块结合肽中的每一种均通过接头与所述聚苹果酸基的分子支架缀合。
11.根据权利要求10所述的微型纳米药物，其中，所述接头包含聚乙二醇(PEG)。
12.根据权利要求1所述的微型纳米药物，其中，所述内体裂解配体包含色氨酸-色氨酸-色氨酸(WWW)、苯丙氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸(FFF)、亮氨酸-亮氨酸-亮氨酸(LLL)或异亮氨酸-异亮氨酸-异亮氨酸(I-I-I)。
13.根据权利要求1所述的微型纳米药物，其中，所述微型纳米药物还包含治疗剂。
14.根据权利要求13所述的微型纳米药物，其中，所述治疗剂选自由反义寡核苷酸、siRNA寡核苷酸、肽和低分子量药物所组成的组中。
15.根据权利要求14所述的微型纳米药物，其中，所述治疗剂是与β-分泌酶mRNA序列或γ-分泌酶mRNA序列互补的反义寡核苷酸。
16.根据权利要求15所述的微型纳米药物，其中，所述反义寡核苷酸包含与SEQ ID NO：4具有至少90％同一性的核酸序列。
17.根据权利要求14所述的微型纳米药物，其中，所述治疗剂是肽。
18.根据权利要求17所述的微型纳米药物，其中，所述肽是包含SEQ ID NO：6的序列的β-折叠破坏肽或其变体。
19.根据权利要求1所述的微型纳米药物，其中，所述斑块结合肽是D-对映体肽。
20.根据权利要求19所述的微型纳米药物，其中，所述D-对映体肽选自由Dl-肽、D3-肽和ACI-89-肽，或它们的变体所组成的组中。
21.根据权利要求20所述的微型纳米药物，其中，所述D-对映体肽是包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的Dl-肽或其变体。
22.根据权利要求20所述的微型纳米药物，其中，所述D-对映体肽是包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的D3-肽或其变体。
23.根据权利要求20所述的微型纳米药物，其中，所述D-对映肽是包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的ACI-89-肽或其变体。
24.根据权利要求1所述的微型纳米药物，其中，所述斑块结合肽包含至少两种斑块结合肽。
25.根据权利要求1所述的微型纳米药物，其中，所述至少一种能够跨越血脑屏障的肽选自由血管肽素-2、铁模拟肽、B6肽、迷你蜂毒明肽-4肽，及它们的变体所组成的组中，所述至少一种斑块结合肽选自由Dl-肽、D3-肽和ACI-89-肽，或它们的变体所组成的组中，所述内体裂解配体包含色氨酸-色氨酸-色氨酸(WWW)、苯丙氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸(FFF)、亮氨酸-亮氨酸-亮氨酸(LLL)或异亮氨酸-异亮氨酸-异亮氨酸(I-I-I)。
26.根据权利要求1所述的微型纳米药物，其中，所述纳米药物还包含与所述聚苹果酸基的分子支架共价连接的成像剂。
27.根据权利要求26所述的微型纳米药物，其中，所述成像剂包含荧光部分、放射性同位素部分或磁共振成像部分。
28.根据权利要求26所述的微型纳米药物，其包含选自由以下所组成的组中的所述至少一种能够跨越血脑屏障的肽：血管肽素-2、铁模拟肽、B6肽、迷你蜂毒明肽-4肽，及它们的变体，选自由以下所组成的组中的所述斑块结合肽：D1-肽、D3-肽和ACI-89-肽，或它们的变体，包含色氨酸-色氨酸-色氨酸(WWW)、苯丙氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸(FFF)、亮氨酸-亮氨酸-亮氨酸(LLL)或异亮氨酸-异亮氨酸-异亮氨酸(I-I-I)的所述内体裂解配体，以及包含荧光部分、放射性同位素部分或磁共振成像部分的成像剂。
29.根据权利要求1所述的微型纳米药物，其中，所述聚苹果酸基的分子支架包括聚(β-L-苹果酸)。
30.一种微型纳米药物，其包含：
聚苹果酸基的分子支架；
至少一种能够跨越血脑屏障的肽；
内体裂解配体；和
治疗剂，其中，
所述至少一种能够跨越血脑屏障的肽，所述内体裂解配体和所述治疗剂中的每一种均与所述聚苹果酸基的分子支架共价连接，和
所述微型纳米药物的尺寸范围为1nm-10nm。
31.根据权利要求30所述的微型纳米药物，其中，所述至少一种能够跨越血脑屏障的肽是选自由血管肽素-2、铁模拟肽、B6肽和迷你蜂毒明肽-4肽，或他们的变体所组成的组中的肽。
32.根据权利要求31所述的微型纳米药物，其中，所述至少一种能够跨越血脑屏障的肽是包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的血管肽素-2或其变体。
33.根据权利要求31所述的微型纳米药物，其中，所述至少一种能够跨越血脑屏障的肽是包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的铁模拟肽或其变体。
34.根据权利要求31所述的微型纳米药物，其中，所述至少一种跨越血脑屏障的肽是包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的B6肽或其变体。
35.根据权利要求31所述的微型纳米药物，其中，所述至少一种跨越血脑屏障的肽是包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的迷你蜂毒明肽-4肽或其变体。
36.根据权利要求31所述的微型纳米药物，其中，所述至少一种能够跨越血脑屏障的肽包含至少两种能够跨越血脑屏障的肽。
37.根据权利要求36所述的微型纳米药物，其中，所述至少两种肽各自被独立地选择。
38.根据权利要求30所述的微型纳米药物，其中，所述至少一种能够跨越血脑屏障的肽中的每一种均通过接头与所述聚苹果酸基的分子支架缀合。
39.根据权利要求30所述的微型纳米药物，其中，所述内体裂解配体包含色氨酸-色氨酸-色氨酸(WWW)、苯丙氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸(FFF)、亮氨酸-亮氨酸-亮氨酸(LLL)或异亮氨酸-异亮氨酸-异亮氨酸(I-I-I)。
40.根据权利要求30所述的微型纳米药物，其中，所述治疗剂选自由反义寡核苷酸、siRNA寡核苷酸、肽和低分子量药物所组成的组中。
41.根据权利要求40所述的微型纳米药物，其中，所述治疗剂包含与β-分泌酶mRNA序列或γ-分泌酶mRNA序列互补的反义寡核苷酸。
42.根据权利要求41所述的微型纳米药物，其中，所述反义寡核苷酸包含与SEQ ID NO：4具有至少90％同一性的核酸序列。
43.根据权利要求30所述的微型纳米药物，其中，所述至少一种能够跨越血脑屏障的肽为选自由血管肽素-2、铁模拟肽、B6肽、以及迷你蜂毒明肽-4肽，或它们的变体所组成的组中的肽，所述治疗剂包含与β-分泌酶mRNA序列或γ-分泌酶mRNA序列互补的反义寡核苷酸，所述内体裂解配体包含色氨酸-色氨酸-色氨酸(WWW)、苯丙氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸(FFF)、亮氨酸-亮氨酸-亮氨酸(LLL)或异亮氨酸-异亮氨酸-异亮氨酸(I-I-I)。
44.根据权利要求40所述的微型纳米药物，其中，所述治疗剂是包含β-折叠破坏肽的肽。
45.根据权利要求44所述的微型纳米药物，其中，所述β-折叠破坏肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列或其变体。
46.根据权利要求30所述的微型纳米药物，其中，所述至少一种能够跨越血脑屏障的肽为选自由血管肽素-2、铁模拟肽、B6肽、以及迷你蜂毒明肽-4肽，或它们的变体所组成的组中的肽，所述治疗剂包含β-折叠破坏肽，所述内体裂解配体包含色氨酸-色氨酸-色氨酸(WWW)、苯丙氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸(FFF)、亮氨酸-亮氨酸-亮氨酸(LLL)或异亮氨酸-异亮氨酸-异亮氨酸(I-I-I)。
47.根据权利要求30所述的微型纳米药物，其中，所述微型纳米药物还包含斑块结合肽。
48.根据权利要求47所述的微型纳米药物，其中，所述斑块结合肽选自由Dl-肽，D3-肽和ACI-89-肽，或它们的变体所组成的组中的D-对映体肽。
49.根据权利要求47所述的微型纳米药物，其中，所述D-对映体肽是包含SEQ ID NO：9、10或11的氨基酸序列或它们的变体的肽。
50.根据权利要求30所述的微型纳米药物，其中，所述微型纳米药物还包含与所述聚苹果酸基的分子支架共价连接的成像剂。
51.根据权利要求50所述的微型纳米药物，其中，所述成像剂包含荧光部分、放射性同位素部分或磁共振成像部分。
52.根据权利要求50所述的微型纳米药物，其中，所述至少一种能够跨越血脑屏障的肽为选自由以下所组成的组中的肽：血管肽素-2、铁模拟肽、B6肽、迷你蜂毒明肽-4肽，或及它们的变体，所述治疗剂包含与β-分泌酶mRNA序列或γ-分泌酶mRNA序列互补的反义寡核苷酸，所述内体裂解配体包含色氨酸-色氨酸-色氨酸(WWW)、苯丙氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸(FFF)、亮氨酸-亮氨酸-亮氨酸(LLL)或异亮氨酸-异亮氨酸-异亮氨酸(I-I-I)，所述成像剂包含荧光部分、放射性同位素部分或磁共振成像部分。
53.根据权利要求30所述的微型纳米药物，其中，所述至少一种能够跨越血脑屏障的肽是选自由血管肽素-2、铁模拟肽、B6肽和迷你蜂毒明肽-4肽，或它们的变体所组成的组中的肽，所述治疗剂包含β-折叠破坏肽，所述内体裂解配体包含色氨酸-色氨酸-色氨酸(WWW)、苯丙氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸(FFF)、亮氨酸-亮氨酸-亮氨酸(LLL)或异亮氨酸-异亮氨酸-异亮氨酸(I-I-I)，所述成像剂包含荧光部分、放射性同位素部分或磁共振成像部分。
54.一种药学上可接受的组合物，包含权利要求1-53中任一项所述的微型纳米药物和药学上可接受的载体或赋形剂。
55.一种治疗受试者脑疾病或异常状况的方法，包括：向有需要的受试者施用治疗有效量的权利要求1-53中任一项所述的微型纳米药物或权利要求54所述的药学上可接受的组合物。
56.根据权利要求55所述的方法，其中，脑疾病或异常状况选自由阿尔茨海默病、多发性硬化、帕金森病、亨廷顿病、精神分裂症、焦虑、痴呆、精神阻滞和焦虑所组成的组中。
57.根据权利要求56所述的方法，其中，所述脑疾病是阿尔茨海默病。
58.根据权利要求57所述的方法，其中，在施用所述微型纳米药物后，所述阿尔茨海默病被治疗、预防或改善。
59.根据权利要求55所述的方法，其中，进行至少一个月的施用，每周至少一次、每天至少一次或每天至少两次。
60.根据权利要求55所述的方法，其中，所述受试者是哺乳动物。
61.根据权利要求60所述的方法，其中，所述哺乳动物选自由啮齿动物、犬、灵长类动物、马、实验性的带有人乳瘤的裸鼠和人所组成的组中。
62.一种用于减少受试者脑中淀粉样斑块形成的方法，包括向有需要的受试者施用权利要求1-53中任一项所述的微型纳米药物或权利要求54所述的组合物。
63.一种用于治疗受试者中的增殖性疾病的方法，包括：
向有需要的受试者施用治疗有效量的微型纳米药物，所述微型纳米药物包含聚苹果酸基的分子支架、至少一种能够跨越血脑屏障的肽、内体裂解配体和治疗剂，
其中，所述至少一种肽、所述内体裂解配体和所述治疗剂中的每一种均共价连接到所述聚苹果酸基的分子支架上，并且所述微型纳米药物的尺寸范围为1nm至10nm。
64.根据权利要求63所述的方法，其中，所述增殖性疾病是癌症。
65.根据权利要求64所述的方法，其中，所述癌症选自由胶质瘤、胶质母细胞瘤、转移至脑的乳腺癌和转移至脑的肺癌所组成的组中。
66.根据权利要求63所述的方法，其中，所述治疗剂是选自由反义寡核苷酸、siRNA寡核苷酸、肽和低分子量药物所组成的组中的抗癌剂。
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