CN111171152A - Pcsk9抗体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种PCSK9抗体及其制备方法和应用，具体是提供用于人前蛋白转化酶枯草溶菌素9定量检测的配对单克隆抗体，该抗PCSK9单克隆抗体可特异性的与PCSK9反应，并可以应用于荧光免疫层析对人血清中PCSK9含量进行精确测定，其检测结果与总胆固醇有很好的相关性，R2＝0.9619，具有很高的灵敏度，其分析灵敏度约为52.15ng/ml。配对的单克隆抗体可以扩展应用至其他基于抗原抗体反应的免疫学检测技术，包括酶联免疫、胶体金、化学发光定量检测等，与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有稳定性好、易于标准化的优点，更适合用来建立商品化的标准检测方法。
Description
技术领域
本申请涉及生物检测以及抗体制备技术领域，具体涉及PCSK9抗体的制备和应用，尤其涉及一种用于PCSK9定量检测的配对抗体的制备方法、应用及其核苷酸序列。
背景技术
心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)是当今世界上危害人类健康最为严重的疾病之一，业内普遍认为，血液中的低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)水平升高会导致动脉粥样硬化，是心血管疾病主要的罪魁祸首。
人前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin kexin type9，PCSK9)是一种分泌性丝氨酸蛋白酶，被认为是LDL代谢的重要调节因子，是FH和CVD的潜在治疗靶点。PCSK9是前蛋白转化酶家族的一员，主要表达于肝、肠、肾和中枢神经系统。PCSK9由前体结构域、催化结构域和C端结构域组成，其中后者富含半胱氨酸和组氨酸。转录后，PCSK9 mRNA进入内质网并翻译表达一个分子量为74kD的前蛋白。前蛋白在高尔基体中裂解为分子量为20kD原结构域和63kD成熟结构域。前体结构域与催化结构域非共价连接，抑制PCSK9的自催化作用。
PCSK9通过下调肝细胞表面的低密度脂蛋白受体(LDL receptor，LDL-R)，对LDL-C的降解和脂质代谢的调节起着重要作用。PCSK9的催化结构域与LDL-R的表皮生长因子A结构域结合形成配体-受体复合物。复合物被包裹进入细胞质并转移到溶酶体中，在溶酶体中LDL-R被降解。结果，血液中的LDL清除率降低，血液LDL-C水平升高。
经过大量研究表明，高胆固醇血症患者的血清PCSK9水平显著升高，因此，血清PCSK9含量的检测是PCSK9抑制剂药物使用前必须检测的临床指标。同时，研究还发现血清PCSK9水平升高与年龄、TC、TG、LDL-C等动脉粥样硬化危险因素也有着十分密切的关系，因此血清PCSK9水平也是诊断冠心病的重要标准。
发明内容
鉴于现有技术中尚无针对PCSK9的定量检测方法的问题，本发明提供一种PCSK9抗体及其制备方法和应用，本发明建立了针对PCSK9的荧光免疫层析检测方法并以此成功建立了定量检测人PCSK9的荧光免疫层析检测方法，从而可以实现PCSK9快速定量检测，满足了市场的需要。
本发明的目的在于提供了用于PCSK9定量检测的配对抗体及其核苷酸序列。
本申请的一方面提供PCSK9抗体，所述PCSK9抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8。
在根据本发明的一个实施方案中，所述PCSK9抗体的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6。
在根据本发明的一个实施方案中，所述PCSK9抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2；
或者，所述PCSK9抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:8，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:6。
本发明还提供了一种编码PCSK9抗体的重链可变区的核苷酸序列，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7。
本发明进一步地提供了一种编码PCSK9抗体的轻链可变区的核苷酸序列，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5。
本发明还涉及一种表达载体，所述表达载体包含上述的核苷酸序列。
本发明还提供了一种用于pcsk9定量检测的配对抗体，其中，第一抗体包含氨基酸序列为SEQ ID NO:4的重链可变区和氨基酸序列为SEQ ID NO:2的轻链可变区；
第二抗体包含重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:8，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:6。
在根据本发明的一个实施方案中，第一抗体为捕获抗体，第二抗体为检测抗体。
本发明进一步涉及一种定量检测PCSK9的方法，包括：
利用上述的配对抗体建立双抗体夹心酶联免疫反应体系、胶体金层析检测体系或荧光免疫层板检测体系。
本发明还涉及一种用于检测PCSK9的试剂，所述试剂包含上述的PCSK9抗体的一种或多种。
本申请具有如下优点：
本发明建立了针对PCSK9的荧光免疫层析检测方法并以此成功建立了定量检测人PCSK9的荧光免疫层析检测方法，从而可以实现PCSK9快速定量检测，满足了市场的需要。
本发明的PCSK9抗体可特异性的与PCSK9反应，并可以应用于荧光免疫层析对人血清中PCSK9含量进行精确测定，其检测结果与总胆固醇有很好的相关性，R2＝0.9619，具有很高的灵敏度，其分析灵敏度约为52.15ng/ml。配对的单克隆抗体可以扩展应用至其他基于抗原抗体反应的免疫学检测技术，包括酶联免疫、胶体金、化学发光定量检测等，本发明的抗体具有稳定性好、易于标准化的优点，更适合用来建立商品化的标准检测方法。
附图说明
图1为重组人PCSK9蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳鉴定图；其中，泳道1为Marker，泳道2为重组人PCSK9蛋白；
图2为新制备的人PCSK9单克隆抗体2D10和6C6的SDS-PAGE凝胶电泳鉴定图；其中，泳道1为Marker，泳道2为2D10，泳道3为6C6；
图3为基于新制备的人PCSK9单克隆抗体建立的荧光免疫层析检测方法检测抗原的校准曲线；
图4为基于新制备的人PCSK9单克隆抗体建立的荧光免疫层析检测方法检测人血清中PCSK9含量与总胆固醇(TCH)的临床相关性。
具体实施方式
以下实施例用于说明本申请，但不用来限制本申请的范围。
下面将更详细地描述本申请的具体实施例。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。
如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
如无特别说明，本发明中所述室温是指“25℃”。
如无特别说明，本发明所使用的菌株与各种试剂的获得途径均如下所示：
Trizol试剂购自碧云天生物技术有限公司；
底物TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，英文全称
3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine，简称TMB)购自北京中山生物技术有限公司。
实施例1人PCSK9蛋白的制备
首先应用Trizol试剂(碧云天生物技术有限公司)从人肝癌细胞系HepG2(ATCC)中提取总RNA，逆转录获得cDNA。以cDNA为模板，采用聚合酶链反应(PCR)扩增PCSK9的cDNA序列。将PCR产物连接到一个修饰的哺乳动物表达载体pcDNA3.1-hIgG1 Fc(BioVector产品)中。对阳性克隆进行DNA测序(上海英骏生物技术有限公司)，以确定正确构建PCSK9真核表达载体pcDNA3.1-hIgG1 Fc-PCSK9。大量提取质粒后应用ExpiFectamineTM293Transfection Kit转染试剂盒(Gibco产品)将该表达载体转染到HEK293细胞(ATCC)中并培养。转染后8天收集细胞培养基上清液。应用Protein A琼脂糖层析柱(GE Healthcare)从细胞培养上清纯化重组蛋白。收集洗脱液，用酶TEV(上海生工)消化。消化产物用ProteinA琼脂糖层析柱(GE Healthcare)再次纯化。收集洗脱液，通过用SDS-PCSK9E和考马斯蓝染色验证重组蛋白的其分子量和纯度，结果如图1所示。应用小鼠抗人PCSK9单克隆抗体(R&DSystem)对重组蛋白进行免疫印迹检测以验证其免疫原性。经验证，本实施例成功制备了人PCSK9蛋白。
实施例2 PCSK9单克隆抗体的制备
(1)杂交瘤细胞的制备
将实施例1制备的人PCSK9蛋白抗原与等量的弗氏完全佐剂乳化，抗原乳化采用双注射器互推法。乳化完成后，以四肢皮下多点注射加腹腔注射途径对4只8周龄左右的Balb/c小鼠进行基础免疫(100μg/ml，每只小鼠200μl)。2周后，将人PCSK9蛋白抗原与等量的弗氏不完全佐剂乳化，以四肢皮下多点注射加腹腔注射途径对小鼠进行追加免疫(100μg/ml，每只小鼠200μl)；2周后，再采用同样方式追加免疫一次，7天后取小鼠尾静脉采血进行间接ELISA法检测抗血清效价，ELISA抗血清效价达到1：50000，说明免疫合格。选择效价最高的小鼠处死，取出小鼠脾脏进行融合筛选。
融合过程为将脾细胞与骨髓瘤细胞(Sp2/0)以8:1混合，以聚乙二醇(PEG4000，购自Sigma公司)为融合剂。融合细胞悬于含小牛血清的HAT培养液(购自Gibco公司)中，并置于6％CO2中在37℃培养。
用间接ELISA法进行筛选。筛选时，以人PCSK9蛋白为筛选原包被酶标版，封闭后加入各杂交瘤细胞培养上清，孵育后洗涤，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗小鼠IgG(购自北京中山生物技术有限公司)，孵育后洗涤，加入底物TMB(购自北京中山生物技术有限公司)显色。对检出的阳性克隆孔细胞采用有限稀释法进行细胞克隆化，并置于6％CO2中于37℃培养，直至所有细胞生长孔的培养液均呈阳性为止，即可进行杂交瘤细胞的扩大培养。
采用小鼠腹腔内诱生单克隆抗体的方法进行抗体生产。取成年雌性Balb/c小鼠，腹腔注射液体石蜡0.5mL。1周后，用生理盐水将杂交瘤细胞悬浮混匀，并将细胞数调至4×105个/mL，每只Balb/c小鼠腹腔注射0.5mL杂交瘤细胞。10～14天后收集腹水。
(2)PCSK9单克隆抗体的纯化
收集腹水后对其进行亲和纯化，具体方案简述如下：
配制抗体纯化所需缓冲液(所用试剂均为分析纯)：
结合缓冲液(A液)20mmol/L磷酸钠，0.8mol/L硫酸铵，pH 7.5；
洗脱缓冲液(B液)20mmol/L磷酸钠，pH 7.5；
再生缓冲液(C液)20mmol/L磷酸钠，pH 7.5，并按体积比30％加入异丙醇。
在含有单克隆抗体的腹水中加入硫酸铵，使其终浓度与A液中硫酸铵浓度一致，0.45μm滤膜过滤等待上样；选用HiTrap IgG Purification HP柱(购自GE Healthcare)接入AKTA prime蛋白纯化仪，先后A、B液和C液对柱子进行充分洗涤；用A液进行充分平衡后，将准备的样品从A管上样，上样后用A液平衡柱子，去除杂蛋白，再用B液洗脱纯化柱，收集洗脱峰；调节洗脱蛋白的pH至7.0-8.0，将抗体分装冷冻于-20℃保存；用RegenerationBuffer使填料进行再生，然后用Binding Buffer进行平衡。
(3)ELISA鉴定抗PCSK9单克隆抗体
将人PCSK9蛋白和相关对照抗原用包被稀释液稀释至5μg/mL，ELISA条板每孔加入100μl，4℃包被过夜。次日取出酶标板弃抗原，洗板。将待鉴定单克隆抗体稀释成1mg/ml，然后按1:10000，1:20000，1:40000，1:80000，1:160000......稀释至1：10240000，按100μl/孔加入对应条孔中，另作空白及阴阳对照孔。37℃孵育1h，洗板，加入HRP标记山羊抗小鼠IgG(酶标二抗，1:5000)，按100μl/孔加入对应条孔中，37℃孵育40min。弃液、洗板、拍干，加入底物液100μl/孔，避光显色3min，加入终止液50μl/孔。在450nm处测定吸光度值。
(4)抗PCSK9单克隆抗体的免疫印迹鉴定
①将蛋白质分子量Marker3μl、人PCSK9蛋白20μl、相关对照抗原20μl行SDS-PAGE。
②电泳结束后，取下凝胶，置于转印缓冲液中平衡10min。
③将0.22μm PVDF膜先用无水甲醇处理20s，再用ddH2O洗涤5min。然后再浸入转印缓冲液超过5min。同时将滤纸浸入转印缓冲液中。
④转膜：从下至上依次排列：滤纸—PVDF膜—胶—滤纸，排出气泡，放入转膜仪，18V恒压电转移1.5h。
⑤转膜完成后，在膜上可见清晰蛋白marker，ddH2O清洗两遍，TBST洗5min。将转移膜置于封闭液中，室温封闭2h。
⑥弃去封闭液，用1×TBST漂洗膜3次，每次15min。
⑦加入以1:1000稀释的纯化抗体，4℃孵育过夜。1×TBST漂洗膜3次，每次15min。
⑧加入已稀释到1:10000的HRP-羊抗小鼠IgG抗体，37℃孵育3h。
⑨1×TBST洗涤3次，每次15min。
⑩用化学发光显色，显影定影后，观察分析结果并摄像。在PCSK9对应分子量处可见PCSK9-2D10和PCSK9-6C6结合清晰条带，说明这两株抗体具有很高的特异性。
实施例3荧光免疫层析检测
采用实施例2制备的人PCSK9单克隆抗体建立的荧光免疫层析检测方法
(1)缓冲溶液配制如下：
样品垫处理液50mM Tris，3.6mM EDTA-Na2,2％海藻糖，1％BSA，0.6％Tween-20，pH8.6；
结合垫处理缓冲液50mM Tris-HCl，3％海藻糖，1％BSA.0.5％酪蛋白和0.01％PEG-20000，pH9.0；
荧光微球封闭液50mM Tris-HCl，1％BSA，0.05％Tween-20，pH8.0；
荧光微球储存液50 mM Tris-HCl，0.5％BSA，3％海藻糖，0.05％Tween-20，pH8.0；
标记抗体稀释液50mM Tris-HCl，0.5％酪蛋白，3％海藻糖，pH8.0；
活化缓冲液50mM硼酸盐缓冲液，pH7.0)；
样品稀释缓冲液137mM NaCl，2mM KH2PO4,8mM Na2HPO4，2.6mM KCl，0.1％Tween-20，0.1％BSA，pH 7.4；
包被缓冲液137mM NaCl，2mM KH2PO4，8mM Na2HPO4，2.6mM KCl，3％海藻糖，5％甲醇，pH7.4。
(2)荧光微球与抗体偶联物的制备
为了制备抗体结合物，首先在含有50μL EDC(10mg/mL)的900μL活化缓冲液中活化100μL的荧光微球15分钟。然后，在4℃以14,000×g离心15分钟后弃去上清液。然后通过超声将活化的微球重悬于1mL活化缓冲液中。加入200微克抗体(PCSK9-2D10)。偶联反应进行2.5小时，同时轻轻混合。通过在4℃以14,000×g离心15分钟除去未偶联的抗体后，向混合物中加入1mL荧光微球封闭液，振荡1小时。随后，通过超声处理重悬浮结合物溶液。最后，将沉淀物溶于1mL荧光微球储存液中并在4℃下储存。
(3)测试条的制备
测试条由五个组成部分组成：样品垫，结合垫，NC膜，吸收垫和PVC板。将样品垫和结合垫分别在室温下浸入样品垫处理液和结合垫处理液中0.5小时，然后在37℃下干燥24小时。将抗体标记结合物用标记抗体稀释液稀释2倍，然后通过喷金划膜仪以4μL/mm的速度将混合物包被到预处理的结合物垫上，然后在37℃下干燥24小时。用包被缓冲液将PCSK9-6C6抗体和羊抗鼠IgG稀释至1mg/mL。将PCSK9-6C6抗体和羊抗鼠IgG分别通过喷金划膜仪包被到作为测试线(T)和对照线(C)的NC膜上，然后在37℃下干燥持续24小时。然后用切割机将PVC垫切成4mm宽的条带。将制备的测试条储存在干燥箱中。
(4)血清样本
在陆军医科大学新桥医院收集了40份血清样本，其中男性27名，女性13名(年龄0-82岁)，所有样品均在-20℃保存直至使用。
(5)样品检测和分析
采用荧光免疫层析技术原理。样中待测物首先与荧光标记的PCSK9耦合物结合，然后继续移动并与固定在硝酸纤维素膜检测线上的包被的另一株PCSK9抗体所捕获，形成双抗体夹心的免疫复合物，剩余未被捕获的游离的结合物层析至质控线位置被羊抗鼠IgG结合，其中待测物的浓度与T/C信号值呈正相关，通过干式荧光分析仪获得检测结果。
(6)抗原测试
将PCSK9抗原(2.67mg/mL)使用PBS稀释100倍(26.7ug/mL)，再倍比稀释9个浓度(26700ng/mL、13350ng/mL、6675ng/mL、3337.5ng/mL、1668.75ng/mL、834.38ng/mL、417.19ng/mL、208.59ng/mL、104.3ng/mL、52.15ng/mL)后加样测试，并且每个浓度重复测试三次，计算平均值。通过仪器测试分别记录T值和C值，并计算T/C比值，通过T/C值与抗原浓度进行回归分析，求出结尾回归方程，计划线性相关系数r，如下式所示：Y＝0.0001X+0.0227，可靠的相关系数(R2＝0.9984)。所测出的分析灵敏度约为52.15ng/mL。
(7)临床样本测试
测试40份总胆固醇(TCH)临床血清样本。PCSK9与总胆固醇(TCH)有高度的相关性。回归曲线的方程为y＝0.1587×-0.1283，其中x表示总胆固醇(TCH)的浓度，y表示通过PCSK9试纸条测试获得的信号值。因此，PCSK9与总胆固醇相关性R2＝0.9619。
实施例4两株抗体的核苷酸序列的确定方法
1)混合引物
将合成的引物用灭菌的双蒸水溶解至100mM(溶解前10000g离心2min)，将轻重链引物按照表1所示进行混合；
表1引物表
2)提取RNA，合成cDNA
用TRIZOL(sigma)试剂，按照说明书提取两个克隆细胞RNA，按照试剂盒说明书(promega)反转录合成cDNA；
3)扩增鼠抗体可变区轻重链基因
用vh和vk，vλ正反向混合引物分别扩增鼠抗体可变区基因，PCR扩增体系如下所示：
反应程序：98℃，30s，(98℃，10s，60℃，30s，72℃，30s)5个循环，(98℃，10s，65℃，30s，72℃，30s)25个循环，72℃，5min，4℃，5min。
程序完成后，2％电泳凝胶鉴定，回收目的条带。
将vh和vk或vλ的PCR产物混合作为第二轮连接vh和vL的模板，PCR扩增体系如下所示：
反应程序：98℃，30s，(98℃，10s，55℃，30s，72℃，30s)5个循环，(98℃，10s，65℃，30s，72℃，30s)25个循环，72℃，5min，4℃，5min。
PCR程序完成后取5ul，1.5％电泳凝胶鉴定，胶回收目的条带K-scFv，λ-scFv。
4)电转至感受态
用NEB的sifiI酶切scFv过夜，同时酶切pcomb3xxs载体，片段回收后用T4连接酶连接过夜，回收连接产物，电转至TG1感受态，结果得到初级库。
5)噬菌体展示筛选阳性克隆
按照标准噬菌体展示方法对免疫库筛选2轮，挑取单克隆，进行噬菌体ELISA，挑取阳性克隆进行测序
6)阳性克隆测序
编码抗体重链和轻链的基因序列如下所示：
SEQ ID NO:1 2D10-VL核酸序列
gacattgtgatgtcacagtctcctgcttccttagctgtatctctggggcagagggccaccatctcatacagggccagcaaaagtgtcagtacatctggctatagttatatgcactggaaccaacagaaaccaggacagccacccagactcctcatctatcttgtatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacattagagcttacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaa
SEQ ID NO:2 2D10-VL氨基酸序列
DIVMSQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRAYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO:3 2D10-VH核酸序列
gaggttcagctgcaacagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccatcacatgcaccgtctcagggttctcattaaccggctatggtgtaaactgggttcgccagcctccaggaaagggtctggagtggctgggaatgatatggggtgatggaagcacagactataattcagctctcaaatccagactgagcatcagcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccttgtactactgtgccagagataggtacggttggtttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctcg
SEQ ID NO:4 2D10-VH氨基酸序列
EVQLQQSGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTGYGVNWVRQPPGKGLEWLGMIWGDGSTDYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTALYYCARDRYGWFDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO:5 6C6-VL核酸序列
gacattgtgctcactcagtctccaggaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtcaccatatcctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatgtactggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaaccctggatttatcgcacatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagcatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtatcagagttacccgcacacgttcggaggggggaccaaactggaaatgaaa
SEQ ID NO:6 6C6-VL氨基酸序列
DIVLTQSPGIMSASPGEKVTISCSASSSVSYMYWYQQKPGSSPKPWIYRTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQYQSYPHTFGGGTKLEMK
SEQ ID NO:7 6C6-VH核酸序列
gaggtgctgctggtggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctctggattcactttcagtgcctatgccatgtcttgggttcgccagtctccagagaagaggctggagtgggtctcagaaattagtgatggtggttattacacctactatccagacactgtgacgggccgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctggaaatgaacagtctgaggtctgaggacacggccatgtattactgtgctcgcaggtacgacggagcctttacttactggggccaagggactctggtcaccgtctcctcg
SEQ ID NO:8 6C6-VH氨基酸序列
EVLLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSAYAMSWVRQSPEKRLEWVSEISDGGYYTYYPDTVTGRFTISRDNAKNTLYLEMNSLRSEDTAMYYCARRYDGAFTYWGQGTLVTVSS
本发明实施例以纯化真核重组表达的全长人PCSK9蛋白免疫Balb/c小鼠，应用杂交瘤技术进行细胞融合，利用间接ELISA法和细胞克隆化操作筛选出能稳定分泌人PCSK9特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔，收集腹水经HiTrap IgGPurification HP亲和层析柱纯化，对所得的单克隆抗体进行效价测定和亲和力测定。经筛选得到2株稳定分泌PCSK9特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株2D10和6C6，ELISA和免疫印迹鉴定结果表明2株单克隆抗体均具有较高的特异性。
本发明建立了针对PCSK9的荧光免疫层析检测方法：以PCSK9特异性抗体2D10标记物为包被抗体，6C6为检测抗体，建立荧光免疫层析检测体系，能够准确检测标本中的PCSK9，并以此成功建立了定量检测人PCSK9的荧光免疫层析检测方法。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本申请作了详尽的描述，但在本申请基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本申请精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本申请要求保护的范围。
序列表
<110> 吉林医药学院
重庆探生科技有限公司
<120> PCSK9抗体及其制备方法和应用
<160> 45
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gacattgtga tgtcacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60
atctcataca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggaac 120
caacagaaac caggacagcc acccagactc ctcatctatc ttgtatccaa cctagaatct 180
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acattagagc ttacacgttc 300
ggagggggga ccaagctgga aataaaa 327
<210> 2
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg
85 90 95
Ala Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaggttcagc tgcaacagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatc 60
acatgcaccg tctcagggtt ctcattaacc ggctatggtg taaactgggt tcgccagcct 120
ccaggaaagg gtctggagtg gctgggaatg atatggggtg atggaagcac agactataat 180
tcagctctca aatccagact gagcatcagc aaggacaact ccaagagcca agttttctta 240
aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccttgtact actgtgccag agataggtac 300
ggttggtttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctcg 348
<210> 4
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Arg Tyr Gly Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gacattgtgc tcactcagtc tccaggaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60
atatcctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgtact ggtaccagca gaagccagga 120
tcctccccca aaccctggat ttatcgcaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240
gatgctgcca cttattactg ccagcagtat cagagttacc cgcacacgtt cggagggggg 300
accaaactgg aaatgaaa 318
<210> 6
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gln Ser Tyr Pro His Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys
100 105
<210> 7
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaggtgctgc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt gcctatgcca tgtcttgggt tcgccagtct 120
ccagagaaga ggctggagtg ggtctcagaa attagtgatg gtggttatta cacctactat 180
ccagacactg tgacgggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240
ctggaaatga acagtctgag gtctgaggac acggccatgt attactgtgc tcgcaggtac 300
gacggagcct ttacttactg gggccaaggg actctggtca ccgtctcctc g 351
<210> 8
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Glu Val Leu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Glu Ile Ser Asp Gly Gly Tyr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Tyr Asp Gly Ala Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctacagcagg cccagccggc catggcggac tacaaag 37
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atggcggact acaaagacaw tgttctcacc cagtc 35
<210> 11
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atggcggact acaaagacat ccagatgaca cagwc 35
<210> 12
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atggcggact acaaagatrt tgtgatgacc cagwc 35
<210> 13
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atggcggact acaaagacat tstgmtgacc cagtc 35
<210> 14
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atggcggact acaaagatgt tgtgvtgacc caaac 35
<210> 15
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
atggcggact acaaagacac aactgtgacc cagtc 35
<210> 16
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
atggcggact acaaagayat tktgctcact cagtc 35
<210> 17
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
atggcggact acaaagatat tgtgatracc caggm 35
<210> 18
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
atggcggact acaaagacat tgtaatgacc caatc 35
<210> 19
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
atggcggact acaaagacat tgtgatgwca cagtc 35
<210> 20
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
atggcggact acaaagatrt ccagatgamc cagtc 35
<210> 21
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
atggcggact acaaagatgg agaaacaaca caggc 35
<210> 22
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
atggcggact acaaagacgc tgttgtgact cagga 35
<210> 23
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
atggcggact acaaagaccy tgtgctcact cagtc 35
<210> 24
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ggagccgccg ccgccagaac caccaccacc gcgtttbatt tccagcttgg 50
<210> 25
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ggagccgccg ccgccagaac caccaccacc gcgttttatt tccaattttg 50
<210> 26
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ggagccgccg ccgccagaac caccaccacc gcctaggaca gtcamcytgg 50
<210> 27
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ggcggcggcg gctccggtgg tggtggatcc gaggttcdsc tgcaacagty 50
<210> 28
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ggcggcggcg gctccggtgg tggtggatcc gaggtgcaam tgmagsagtc 50
<210> 29
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ggcggcggcg gctccggtgg tggtggatcc gavgtgmwgc tggtggagtc 50
<210> 30
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ggcggcggcg gctccggtgg tggtggatcc caggttaytc tgcagsagtc 50
<210> 31
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ggcggcggcg gctccggtgg tggtggatcc gakgtgcagc ttcagsagtc 50
<210> 32
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ggcggcggcg gctccggtgg tggtggatcc cagatccagt tsgygcagtc 50
<210> 33
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ggcggcggcg gctccggtgg tggtggatcc cagrtccaac tgcagcagyc 50
<210> 34
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ggcggcggcg gctccggtgg tggtggatcc gaggtgmagc tasttcagwc 50
<210> 35
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ggcggcggcg gctccggtgg tggtggatcc gaagtgaagm ttgaggagtc 50
<210> 36
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ggcggcggcg gctccggtgg tggtggatcc gatgtgaacc tggaagtgtc 50
<210> 37
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
ggcggcggcg gctccggtgg tggtggatcc cagatkcagc ttmaggagtc 50
<210> 38
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ggcggcggcg gctccggtgg tggtggatcc caggcttatc tgcagcagtc 50
<210> 39
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
ggcggcggcg gctccggtgg tggtggatcc caggttctcc tacaacagtc 50
<210> 40
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
ggcggcggcg gctccggtgg tggtggatcc caggtgcagc ttctagagac 50
<210> 41
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
ggcggcggcg gctccggtgg tggtggatcc gargtgmagc tgktggagac 50
<210> 42
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
cggagtcagg cccccgag 18
<210> 43
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
cggagtcagg cccccgaggc cgaggagacg gtgacmgtgg 40
<210> 44
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
cggagtcagg cccccgaggc cgcagagaca gtgaccagag 40
<210> 45
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
cggagtcagg cccccgaggc cgaggagact gtgagastgg 40
Claims (10)
1.一种PCSK9抗体，其特征在于，所述PCSK9抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:8。
2.一种PCSK9抗体，其特征在于，所述PCSK9抗体的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:6。
3.如权利要求1或2所述的PCSK9抗体，其特征在于，所述PCSK9抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2；
或者，所述PCSK9抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:8，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:6。
4.一种编码PCSK9抗体的重链可变区的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7。
5.一种编码PCSK9抗体的轻链可变区的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5。
6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含如权利要求4或5所述的核苷酸序列。
7.一种用于pcsk9定量检测的配对抗体，其特征在于，第一抗体包含氨基酸序列为SEQID NO:4的重链可变区和氨基酸序列为SEQ ID NO:2的轻链可变区；
第二抗体包含重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:8，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:6。
8.如权利要求6所述的配对抗体，其特征在于，所述第一抗体为捕获抗体，第二抗体为检测抗体。
9.一种定量检测PCSK9的方法，其特征在于，包括：
利用如权利要求6或7所述的配对抗体建立双抗体夹心酶联免疫反应体系、胶体金层析检测体系、化学发光定量检测体系或荧光免疫层板检测体系。
10.一种用于检测PCSK9的试剂，其特征在于，所述试剂包含如权利要求1-3中任一项所述的PCSK9抗体的一种或多种。
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2020
- 2020-01-15 CN CN202010043385.5A patent/CN111171152B/zh active Active
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| GR01 | Patent grant | ||
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