CN111164221A - 数字化亲和连接试验 - Google Patents

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Abstract

提供检测样品中的分析物的方法。还提供了进行本文所述方法的试剂盒。

Description

数字化亲和连接试验
本申请要求2017年9月27日提交的美国临时申请62/564,029的权益，该申请通过引用整体并入本文。
背景技术
来自受试者的样品中生物分子的定量可为多种临床应用提供有用的信息。一种检测和定量生物分子例如蛋白质的方法是通过酶联免疫吸附实验(ELISA)。然而，用该实验定量的检测和精确性有限，不足以满足许多需求。替代技术例如免疫-PCR能够提高检测灵敏度，但实际上由于用作检测剂的抗原的非特异性结合而受到高背景信号的问题限制。
发明内容
本文描述了用于检测样品中的靶标的方法，组合物和试剂盒。
在一个实施方式中，检测样品中的靶标的方法包括：使样品接触与固相载体连接的第一亲和剂，其中第一亲和剂与靶标(如存在)特异性结合，从而形成与第一亲和剂结合的靶标；基于固相载体的存在与否，将与第一亲和剂结合的靶标与样品中未结合的物质分离，从而产生分离的样品，其包含与第一亲和剂结合的靶标；使分离的样品与包含第一标记物的第二亲和剂以及包含第二标记物的第三亲和剂接触，其中第二和第三亲和剂特异性与靶标结合，从而形成靶标-标记的亲和剂复合物；将靶标-标记的亲和剂复合物与未复合的第二和第三亲和剂基于固相载体的存在与否分离，从而形成分离的靶标-标记的亲和剂复合物；将至少分离的靶标-标记的亲和剂复合物分到多个分区内；和通过检测至少同一个分区内第一和第二标记物的存在检测靶标在样品中的存在。
在一些实施方式中，检测样品中靶标的方法包括：使样品接触与固相载体连接的第一亲和剂、包含第一标记物的第二亲和剂以及包含第二标记物的第三亲和剂，其中第一、第二和第三亲和剂与靶标(如存在)特异性结合，从而形成靶标-标记的亲和剂复合物；基于固相载体的存在与否，将靶标-标记的亲和剂复合物与样品中未复合的组分分离，从而形成分离的靶标-标记的亲和剂复合物；将至少分离的靶标-标记的亲和剂复合物分到多个分区内；和通过检测至少同一个分区内第一和第二标记物的存在检测靶标在样品中的存在。
在某些实施方式中，检测样品中靶标的方法包括：使样品接触包含第一标记物的第二亲和剂以及包含第二标记物的第三亲和剂，其中第二和第三亲和剂与靶标(如存在)特异性结合，从而形成包含靶标、第二亲和剂和第三亲和剂的第一复合物；使第一复合物和与固相载体连接的第一亲和剂接触，其中第一亲和剂与靶标特异性结合，从而形成包含靶标、第一亲和剂、第二亲和剂和第三亲和剂的靶标-标记的亲和剂复合物；基于固相载体的存在与否，将靶标-标记的亲和剂复合物与未复合的组分分离，从而形成分离的靶标-标记的亲和剂复合物；将至少分离的靶标-标记的亲和剂复合物分到多个分区内；和通过检测至少同一个分区内第一和第二标记物的存在检测靶标在样品中的存在。
在一些实施方式中，检测样品中靶标的方法包括：将多个固相载体与包含靶标(如存在)的样品中的多个蛋白偶联，从而形成多个固相载体偶联物，其中靶标包含至少多个蛋白之一；基于多个固相载体存在与否，将多个固相载体偶联物与样品中的未偶联物质分离，从而形成分离的多个固相载体偶联物；使分离的多个固相载体偶联物与包含第一标记物的第一亲和剂以及包含第二标记物的第二亲和剂接触，其中第一和第二亲和剂与靶标特异性结合，从而形成靶标-标记的亲和载体复合物；基于固相载体的存在与否，将靶标-标记的亲和剂复合物与未复合的第一和第二亲和剂分离，从而产生分离的靶标-标记的亲和剂复合物；将至少分离的靶标-标记的亲和剂复合物分到多个分区内；和通过检测至少同一个分区内第一和第二标记物的存在检测靶标在样品中的存在。在一些实施方式中，偶联包括交联。
在一些实施方式中，分区步骤前从固相载体上切下第一亲和剂，从而从固相载体上释放靶标-标记的亲和剂复合物。在一些实施方式中，用序列特异性蛋白酶切下连接第一亲和剂与固相载体的氨基酸标签。在某些实施方式中，蛋白酶是TEV、因子Xa或凝血酶。在一些实施方式中，固相表面和第一亲和剂之间的光可切割的接头通过暴露于光而切割。
在一些实施方式中，分离的靶标-标记的亲和剂复合物分到多个分区前，交联靶标-标记的亲和剂复合物。
在一些实施方式中，第一标记物是第一核酸标记物，第二标记物是第二核酸标记物。在某些实施方式中，在分区后扩增第一和第二核酸标记物。在一些实施方式中，第一和第二核酸标记物各自用DNA探针(例如TAQMANTM探针、SCORPIONTM探针、ECLIPSETM探针、分子信标探针、双链探针、双重杂交探针或双淬灭探针)检测。在某些实施方式中，第一和第二核酸标记物分别用嵌入染料(例如
Figure BDA0002427155130000021
染料)检测。在一些实施方式中，用同一DNA探针或嵌入染料的不同信号水平检测第一和第二核酸标记物。在一些实施方式中，第一标记物是第一荧光团，第二标记物是第二荧光团。在某些实施方式中，第一标记物是第一酶，第二标记物是第二酶，并且检测包括检测第一酶和第二酶产生的产物。在一些实施方式中，第一标记物产生第一信号，第二标记物产生第二信号，第一信号和第二信号可区分。
在一些实施方式中，在方法的第一步之前，第一标记物和第二标记物各自与链霉亲和素连接，第二和第三亲和剂生物素化，第二和第三亲和剂用链霉亲和素连接的第一和第二标记物分别标记，使得第一和第二标记的链霉亲和素与各自生物素化的第二和第三亲和剂结合(即通过链霉亲和素-生物素反应)。
在一些实施方式中，第一亲和剂生物素化，固相载体与链霉亲和素连接，在方法的第一步前，链霉亲和素连接的固相载体通过与生物素化的第一亲和剂结合(即通过链霉亲和素-生物素反应)与第一亲和剂连接。
在某些实施方式中，固相载体或多个固相载体是磁珠、非磁性珠、或反应容器表面。在一些实施方式中，非磁性珠是聚苯乙烯珠或硅基珠。在一些实施方式中，固相载体或多个固相载体是磁珠，靶标-标记的亲和剂复合物与样品中未复合的组分用磁铁通过吸引靶标-标记的亲和剂复合物中与第一亲和剂连接的磁珠而分离。在某些实施方式中，固相载体或多个固相载体是非磁性珠，靶标-标记的亲和剂复合物与样品中未复合的组分通过离心分离。在一些实施方式中，固相载体是反应表面，靶标-标记的亲和剂复合物与样品中的未复合组分通过抽吸分离。
在某些实施方式中，靶标包含蛋白质、蛋白质聚集物或蛋白质寡聚物。在一些实施方式，靶标是两种或多种相互作用蛋白的复合物，而第二和第三亲和剂各自与复合物中的相互作用蛋白之一结合。在一些实施方式中，其中所述靶标具有重复的相同表位，第一和第二亲和剂或第一和第三亲和剂识别相同表位。在一些实施方式中，第一、第二和第三亲和剂中的两个或以上识别靶标上的不同表位。在一些实施方式中，第一、第二和第三亲和剂各自识别靶标上的不同表位。
在一些实施方式中，第一、第二和第三亲和剂各自选自抗体、抗体片段和核酸适体。在一些实施方式中，抗体是单克隆和/或多克隆抗体。
在一些实施方式中(例如并行式实施方式中)，靶标是多个不同靶标，第一亲和剂是多种不同的亲和剂，第二亲和剂是多种不同的第二亲和剂，其含有多个第一标记物，且第三亲和剂是多种不同亲和剂，其含有多个第二标签，其中一组第一、第二和第三亲和剂特异性结合于多个不同靶标中的同一个。
在某些实施方式中，该方法还包括确定包含第一标记物和第二标记物的分区数，从而对靶标定量。在一些实施方式中，分区是液滴。
在一个实施方式中，检测样品中靶标的试剂盒包括：与固相载体连接的第一亲和剂；包含第一标记物的第二亲和剂；和包含第二标记物的第三亲和剂，其中第一、第二和第三亲和剂中各自特异性连接于靶标。在一些实施方式中，第二和第三亲和剂特异性结合于不同于第一亲和剂特异性结合的靶标上的表位。在一些实施方式中，检测样品中靶标的试剂盒包括：化学修饰的固相载体；第一标记物；和第二标记物，其中第一和第二标记物各自与链霉亲和素连接。
在一些第一标记物是第一寡核苷酸而第二标记物是第二寡核苷酸的实施方式中，试剂盒还包括DNA聚合酶、PCR引物、PCR探针、dNTP、缓冲液和/或PCR主混合物。在一些第一标记物是第一酶而第二标记物是第二酶的实施方式中，试剂盒还包括针对第一和第二酶的第一和第二种底物至少之一，和/或缓冲液。在某些实施方式中，试剂盒还包括进行检测样品中靶标的方法的说明书。
附图说明
图1是显示根据本发明实施方式的检测样品中靶标的方法的流程图。
图2描述了实施例的工作流程。涂覆了第一亲和剂的捕获珠与包含目标抗原的样品反应。进行洗涤，以除去未结合组分，然后靶标结合的珠与两种不同的DNA标记的亲和剂(“探针”)反应。一些探针与靶标结合的珠结合，未结合的探针被洗去。包含珠、目标抗原和标记的探针的复合物然后重悬浮于包含扩增混合物的溶液中，分到液滴中。进行ddPCR，测定液滴的荧光。根据双重阳性液滴的数量确定连接。
图3显示了如实施例1所述的实验的剂量反应曲线(用单克隆抗体对目标蛋白定量)。将两个独立免疫-PCR实验的结果(三角和方块标记，曲线为虚线)与使用同样的两种DNA-标记的单克隆抗体的亲和连接实验(圆圈标记，实心曲线)比较。垂直线标记了计算出的检测极限(LOD)值。
图4A-4C显示了实施例2所述实验的剂量反应曲线(用多克隆抗体对不同目标蛋白定量)。对于每种目标蛋白，将两个独立免疫-PCR实验的结果(三角和方块标记，曲线为虚线)与使用同样的两种DNA-标记的多克隆抗体的亲和连接实验(圆圈标记，实心曲线)比较。垂直线标记了独立免疫-PCR实验对数字化亲和连接实验的LOD计算值。
图5说明了对于不同标靶的多重蛋白质定量和数字化亲和连接实验的工作流程。
图6A-6C显示了实施例2和3所述的实验的剂量反应曲线的实验间比较，用单重或多重连接实验对不同的目标蛋白进行定量。对于每种目标蛋白，将来自单重实验的结果(方块标记，虚线曲线)与多重实验(圆圈标记，实心曲线)比较。垂直线标记了单重实验对多重实验的LOD计算值。
具体实施方式
I.引言
本文描述了检测样品中靶标的方法。已开发了数字化亲和连接实验法，其中靶标的浓度在固相载体上确定，通过将样品分离到小的分区(例如液滴)中并进行两种不同DNA-标记的亲和剂(例如DNA-标记的抗体)的数字化PCR分析。从两种不同DNA标记物被扩增并在相同分区中共定位的分区比例计算连接信号。
如本文所述，出乎意料地发现使用与亲和剂连接的固相载体，以捕获靶标并洗去除了目标-亲和剂复合物外的组分，联合使用两种不同的检测亲和剂和随后来自两种不同标记的亲和剂共定位的连接信号来检测靶标，可显著减少亲和剂的非特异性结合产生的背景噪声。因此，本文所述的数字化亲和连接实验法减少DNA-标记的亲和剂非特异性结合的背景噪声，具有出乎意料的高检测灵敏度或低检测极限。本文所用的方法因此提供了以下优点，例如在样品中检测量显著比靶标单独检测试验中更少量的靶标，减少或消除在反应混合物中稀释亲和剂浓度的需求、从而避免了亲和剂稀释到检测浓度以下的问题。
II.定义
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常所理解的同样含义。参见例如Lackie，DICTIONARY OF CELLANDMOLECULAR BIOLOGY(《细胞和分子生物学词典》)，埃尔斯威尔出版社(Elsevier)(2007年第4版)；Green等，MOLECULARCLONING,ALABORATORY MANUAL(《分子克隆，实验室手册》)(第4版)，冷泉港实验室出版社(冷泉港，纽约2012)。
术语“一个”或“一种”意在表示“一个(种)或多个(种)”。当术语“包含”及其各种变体例如“包括”和“含有”位于叙述步骤或要素之前的时候，是用来表示添加其它的步骤或要素是任选的，并且是非排它性的。本发明的实践中可以使用与本文所述类似或等价的任何方法、装置和材料。本文提供的以下定义是用来帮助理解本文经常用到的某些术语，不对本发明的范围构成限制。
术语“靶标”指任何其存在和/或量要检测的物质。在一些实施方式中，靶标可以是几种靶标的混合物。在一些实施方式中，要确定不同靶标的存在或浓度情况。
靶标可以是任何生物和/或化学试剂(即分子、大分子、复合物或偶联物)。在一些实施方式中，靶标是有机或无机分子。在一些实施方式中，靶标是生物试剂。
在一个实施方式中，靶标是蛋白质，蛋白质寡聚物，多肽或肽。在一些实施方式中，蛋白质聚集物包含一种以上的蛋白质(例如多于一个靶标)。在一些实施方式中，蛋白质具有多于一个相同或不相同的亚基，其可以或可以不彼此共价结合。靶标可以是激素、抗体、氨基酸(例如谷氨酸、天冬氨酸)或其任何衍生物和/或组合。在一些实施方式中，靶标是毒素或药物。在一些实施方式中，样品中靶标量以微克计。在一些实施方式中，样品中靶标量在1毫克以下。在一些实施方式中，样品中靶标量以纳克计。在一些实施方式中，样品中靶标量在100ng-1ng之间。在一些实施方式中，样品中靶标量在1,000pg-1pg之间。在一些实施方式中，样品中靶标量在1pg-1fg之间。在一些实施方式中，样品中靶标量在1fg-1ag之间。
术语“亲和剂”指特异性结合靶标的分子。示例性亲和剂包括但不限于抗体、抗体片段、非抗体蛋白支架、抗体拟物或适体。
术语“抗体”指免疫球蛋白家族的多肽或包含能够非共价、可逆并以特定方式结合相应靶标(或抗原)的免疫球蛋白的片段的多肽。该术语包括但不限于：源自人或其它哺乳动物细胞的IgA、IgD、IgE、IgG和IgM同种型类的多克隆或单克隆抗体，包括天然形式或遗传修饰形式，如人源化、人、单链、嵌合、合成、重组、杂合、突变、移接和体外生成的抗体。该术语包括偶联物，包括但不限于含有免疫球蛋白部分的融合蛋白(如嵌合或双特异性抗体或单链Fv’s(scFv’s))以及片段(如Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb和其他组合物)。
示例性免疫球蛋白(抗体)的结构单元包含四聚体。各四聚体包含相同的两对多肽链，每对包含一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每条链的N末端确定约100至110个或更多个氨基酸构成的可变区，所述可变区主要负责抗原识别。术语轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)分别指这些轻链和重链。可变区含有抗体的抗原结合区(或其功能性等价物)并且对于结合的特异性和亲和力是至关重要的。参见Paul，Fundamental Immunology(《基础免疫学》)(2003)。
抗体可以完整的免疫球蛋白形式或任何包含特异性抗原结合活性的多种已充分表征片段的形式存在。这样的片段可以通过用多种肽酶消化来产生。胃蛋白酶在铰链区中的二硫键以下消化抗体，产生Fab的二聚体F(ab)'2，Fab本身是由二硫键接合到VH-CH1的轻链。可在温和条件下还原F(ab')2以打断铰链区中的二硫键，从而将F(ab')2二聚体转化为Fab'单体。Fab'单体实质上是具有铰链区部分的Fab。虽然根据对完整抗体的消化定义了多种抗体片段，但是本领域技术人员会理解，这类片段也可用化学方法或重组DNA方法从头合成。因此，本文中所用术语抗体，也包括通过修饰整个抗体而生成的抗体片段，或用重组DNA方法从头合成所产生(例如，scFv)，或使用噬菌体展示文库鉴定的那些抗体片段(参见如McCafferty等，Nature 348:552-554(1990))。制备抗体的方法是本领域已知的；参见例如Kohler和Milstein,Nature 256:495-497(1975)；Kozbor等，Immunology Today 4:72(1983)；Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(《单克隆抗体和癌症治疗》)，第77-96页，ARL公司(Alan R.Liss,Inc.)1985。
本文中，术语“Fv”指单价或双价可变区片段，并可仅包括可变区(如VL和/或VH)，以及较长的片段，如Fab、Fab’或F(ab’)2，其还可包含CL和/或CH1。除非另有说明，术语“Fc”指包含CH1和CH2区的重链单体或二聚体。
在亲和剂结合抗原时使用的术语“结合”通常指亲和剂(例如抗体)与纯群体中的大多数靶标结合(假定亲和剂与靶标的合适的摩尔比)。例如，结合给定抗原的亲和剂将结合溶液中至少2/3的抗原分子(例如75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)。本领域技术人员应理解，取决于测定结合的方法和/或阈值，可出现一些变化。
对亲和剂使用时，术语“特异性(地)结合”指亲和剂(例如抗体)与抗原的结合亲和力比非抗原分子高至少2倍，例如，亲和力高至少4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、25倍、50倍、100倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍、109倍、1010倍、1011倍、1012倍、1013倍、1014倍、或1015倍。例如，特异性结合特定抗原的亲和剂通常以与非抗原分子相比高至少2倍的亲和力结合抗原。
如本文所用，“核酸”意指包含核苷酸单体链的化合物。核酸可以是单链或双链(即，与另一核酸碱基配对)等。核酸链可以由任何合适数量的单体组成，如至少约10个或100个等。通常，核酸链的长度对应于其来源，合成核酸(例如，核酸试剂，例如引物和探针)通常较短，并且生物学产生的核酸(例如，核酸分析物)通常较长。
核酸可具有天然或人工结构，或其组合。有天然结构的核酸，即脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，具有交替的戊糖基团和磷酸基团的骨架。每个戊糖基团与核碱基(例如嘌呤(例如腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(T))或嘧啶(如胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)))连接。具有人工结构的核酸是天然核酸的类似物，并且可以，例如，通过改变天然主链的戊糖和/或磷酸基团和/或一个或多个核碱基产生。示例性人工核酸包括乙二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、苏糖核酸(TNA)等。类似地，具有人工结构的核酸是天然核酸分子的同类物，并且可以例如通过改变核碱基产生。示例性的人工或非天然存在的核碱基包括但不限于卤化核碱基(5-FU)、次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤核苷、7-甲基鸟苷、5,6-双氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、二氢尿苷和5-甲基胞苷。
核酸的序列由核碱基沿骨架排列的顺序定义(一般从5’到3’端读取)。该序列通常决定核酸通过氢键特异性结合伴侣链(或形成分子内双链体)的能力。具体地，腺嘌呤与胸腺嘧啶(或尿嘧啶)配对，鸟嘌呤与胞嘧啶配对。通过与另一种核酸形成连续的腺嘌呤-胸腺嘧啶和鸟嘌呤-胞嘧啶碱基对，可以以反平行方式与另一种核酸结合的核酸被称为“互补的”。
术语“标记物”、“可检测标记物”和“指示剂”指可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段检测的组合物。例如，可用的标记物包括荧光染料(荧光团)、荧光淬灭剂、发光剂、高电子密度试剂、酶(例如，ELISA中常用的酶)、生物素、地高辛、32P和其它放射性同位素、半抗原、蛋白质、核酸或可被检测的其他物质，例如通过将标记物整合至或连接至与目标分子特异性反应的寡核苷酸、肽或抗体。该术语包括单一标记试剂的组合，例如，提供独特可检测特征(例如，特定波长或波长组合下)的荧光团的组合。可检测标记物也可包括报告物和淬灭剂的组合。
“连接”至标记物的分子(例如本文所述经标记核酸)是共价(通过接头或化学键)或非共价(通过离子、范德华力、静电或氢键)地结合标记物的分子，从而可通过检测与该分子结合的标记物来检测是否存在该分子。
术语“报告物”是指物质或其部分，其能够显示可检测信号，该信号可被淬灭剂抑制。报告物的可检测信号是，例如，可检测范围内的荧光；因此，报告物也可以是标记物。
术语“淬灭剂”是指能够抑制、降低、阻遏(等)由报告物产生的可检测信号的物质。
本文所用术语“淬灭”是指一种过程，其中当报告物和淬灭剂紧密靠近并且报告物被能源激发时，激发状态的大部分能量非辐射地转移到淬灭剂，其中其非辐射地消散或者在与报告物不同的发射波长下发射(例如，通过荧光共振能量转移或FRET)。
报告物可选自用合适的连接基团修饰的荧光有机染料，该连接基团用于附着寡核苷酸，例如，附着至3'或5'末端。淬灭剂也可选自有机染料，其可以是或不是荧光的，取决于本发明的实施方式。一般而言，无论淬灭剂是荧光的或通过非辐射衰减简单释放来自报告物的转移的能量，淬灭剂的吸收带至少基本与报告物的荧光发射带重叠以优化淬灭。
非荧光淬灭剂或暗淬灭剂一般通过吸收来自激发的报告物的能量来发挥功能，但不辐射释放能量。
可以根据已知技术来选择特定探针的合适报告物-淬灭剂对。荧光和暗淬灭剂及其相关的光学性质(可从中选择示例性报告物-淬灭剂对)列示并描述于，例如，R.W.Sabnis，《荧光染料和探针手册》(HANDBOOK OF FLUORESCENT DYESAND PROBES)，约翰韦利森出版社(John Wiley and Sons)，新泽西州(New Jersey)，2015，其内容通过引用纳入本文。
报告物-淬灭剂对可选自包括荧光素和若丹明染料的氧杂蒽染料。这些化合物的许多合适形式可商购获得，在苯基上具有取代基，其可用作键合位点或用作附着寡核苷酸的键合官能团。用作报告物的另一组荧光化合物是萘胺，具有α或β位的氨基。这些萘氨基化合物包括1-二甲基氨基萘基-5-磺酸盐、1-苯胺基-8-萘磺酸盐和2-对甲苯氨基-6-萘磺酸盐。其他染料包括3-苯基-7-异氰酸酯香豆素；吖啶如9-异硫氰酸酯吖啶；N-(对-(2-苯并噁唑基)苯基)马来酰亚胺；苯并噁二唑；芪；芘等。
淬灭剂的合适示例可选自6-羧基-四甲基-若丹明、4-(4-二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABYL)、四甲基若丹明(TAMRA)、BHQ-OTM、BHQ-1TM、BHQ-2TM和BHQ-3TM，每个都可以从加利福尼亚州诺瓦托的生物研究技术公司(Biosearch Technologies,Inc.)获得，Qy7TMQSY-9TM、QSY-21TM和QSY-35TM，每个都可以从分子探针公司(Molecular Probes,Inc)获得，ZenTM和TAOTM双淬灭探针可从整合DNA技术公司(Integrated DNA Technologies)获得。
报告物的合适实例可选自染料，例如SYBR绿、5-羧基荧光素(5-FAMTm，购自加利福尼亚州福斯特城的应用生物系统公司(AppliedBiosystems))、6-羧基荧光素(6-FAM)、四氯-6-羧基荧光素(TET)、2,7-二甲氧基-4,5-二氯-6-羧基荧光素、六氯-6-羧基荧光素(HEX)、6-羧基-2',4,7,7'-四氯荧光素(6-TETTm，购自应用生物系统公司)、羧基-X-若丹明(ROX)、6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素(6-JOETM，购自应用生物系统公司)、购自分子探针公司(Molecular Probes,Inc.)的VICTM染料产品、购自应用生物系统公司的NEDTM染料产品、购自生物研究公司的Cal Fluor染料产品(例如，Cal Fluor Gold 540，Orange 560，Red 590，Red 610，Red 635)、购自生物研究公司的Quasar染料产品(例如，Quasar 570，670，705)等。
术语“划分”或“划分的”指将水性溶液样品分隔为多个部分或“分区(partitions)”，该水性溶液含有一种或多种样品和反应物。分区可以是固体或流体。在一些实施方式中，分区是固体分区，例如微通道、微管、或微孔。在一些实施方式中，分区是流体分区，例如液滴。在一些实施方式中，流体分区(如液滴)是不互溶的流体(如水和油)的混合物。在一些实施方式中，流体分区(如液滴)是水性液滴，其被不互溶的运载体流体(如油)包围。
III.检测方法
现在描述检测样品中靶标的方法100。一些步骤可以任意合适的顺序、任意合适的组合实施，并且可与本公开的任意其他合适的方面进行组合或改进。
在示例性步骤110中，样品与连接于固相载体的第一亲和剂(例如抗体或抗体片段)接触。第一亲和剂与靶标上(如存在)的第一表位特异性结合，从而形成结合于第一亲和剂的靶标。在一些实施方式中，将样品与第一亲和剂一起孵育，以留出第一亲和剂捕获或结合靶标的时间。在一些实施方式中，将样品与第一亲和剂一起孵育一小时或更长时间。在一些实施方式中，在使样品与连接至固相载体的第一亲和剂接触之前，用封闭剂处理固相载体以防止材料与载体的非特异性结合。示例性封闭剂包括但不限于蛋白质(例如脱脂牛奶或牛血清白蛋白)和去污剂(例如Tween20或Triton X-100)。
在一些实施方式中，所述样品是生物样品。生物样品可获自任何生物体，例如动物、植物、真菌、细菌或任何其他有机体。在一些实施方式中，该生物样品来自动物，例如哺乳动物(例如人或非人灵长类动物、奶牛、马、猪、绵羊、猫、狗、小鼠或大鼠)、鸟(例如鸡)、或鱼。生物样品可以是获自生物体的任何组织或体液，例如血液、血液成分或血液产品(例如血清、血浆、血小板、血红细胞等)、痰液或唾液、组织(例如肾、肺、肝、心、脑、神经组织、甲状腺、眼、骨骼肌、软骨或骨组织)；培养的细胞，例如原代培养物、外植体，转化的细胞、干细胞、细菌细胞、粪便或尿液。
在一些实施方式中，可制备样品以改善靶标的有效检测。例如，在一些实施方式中，可对样品进行片段化、分馏、匀化或超声。在一些实施方式中，可从样品(例如生物样品)提取或分离感兴趣的靶标或包含感兴趣靶标的子组分。在一些实施方式中，富集样品中存在的一种或多种靶标。在一些实施方式中，用亲和法(例如免疫亲和富集)富集样品中的靶标。在一些实施方式中，用尺寸筛选(例如除去非常小的片段或分子，或非常长的片段或分子)富集靶标。
示例性固相载体包括但不限于颗粒(例如磁珠、聚合物珠、或二氧化硅基珠)或固相表面(例如反应容器如试管或平板孔的表面)。在一些实施方式中，在附着第一亲和剂抗体(例如，基于疏水和其他相互作用，通过非共价吸附将抗体附着于基材)之前未对固相载体进行化学修饰。在某些实施方式中，在附着第一亲和剂之前对固相载体进行化学修饰。示例性的化学修饰的固相载体可以具有附连的羧基或胺基，并且这些基团可以用于共价结合第一亲和剂。在一些实施方式中，第一亲和剂通过碳二亚胺介导的化学作用与固相载体附连以形成酰胺键。在一些实施方式中，通过化学或光化学反应增强第一亲和剂与固相载体的附着。在一些实施方式中，第一亲和剂生物素化，通过亲和素-生物素或链霉亲和素-生物素作用附着于固相载体。在某些实施方式中，第一亲和剂通过化学或光化学反应永久附着于固相载体。在一些实施方式中，在将第一亲和剂附着于固相载体后使固相载体失活以防止其他试剂结合。例如，固相载体上的活性羧基可以用乙醇胺失活。
在示例性步骤120中，结合于第一亲和剂的靶标(例如用洗涤液洗涤固相载体)与样品中未结合的物质基于固相载体的存在与否分离，从而产生包含与第一亲和剂结合的靶标的分离样品。在一些实施方式中，用包含去污剂(如Tween20或Triton X-100)的缓冲液从固相载体上除去或分离未结合物质。在一些固相载体是磁珠的实施方式中，用吸引与第一亲和剂连接的磁珠的磁铁分离第一亲和剂结合的靶标和样品中未复合的组分。在固相载体是非磁性珠(例如聚苯乙烯或基于二氧化硅的珠)的一些实施方式中，通过离心从样品中未结合的组分分离结合于第一亲和剂的靶标。在固相载体是反应容器(例如试管或孔)的一些实施方式中，通过抽吸从样品中未结合的组分分离结合于第一亲和剂的靶标。
在示例性步骤130中，分离的样品与含有第一标志物的第二亲和剂以及含有第二标志物的第三亲和剂接触，其中第二和第三亲和剂与靶标特异性结合，从而形成靶标-标记的亲和剂复合物。在一些实施方式中，第二和第三亲和剂特异性结合于不同于第一亲和剂特异性结合的靶标上的表位。在一些实施方式中，靶标(例如，二聚体蛋白质、聚集体形成蛋白质或寡聚蛋白)具有重复的相同表位，使得第一和第二亲和剂或第一和第三亲和剂识别相同表位。在一些实施方式，靶标是两种或多种相互作用蛋白的复合物，而第二和第三亲和剂各自与复合物中的相互作用蛋白之一结合。在某些实施方式中，靶标是两种或多种相互作用的配体(例如两种蛋白质，一种蛋白质和一种非蛋白质分子，或都是非蛋白质分子)的复合物，该方法还包括计算相互作用的配体的结合亲和力(KD)。
在某些实施方式(例如多重化实施方式)中，样品包含多个不同靶标，对于样品中多个不同靶标中的每一个提供一组第一、第二和第三亲和剂，其中第一、第二和第三亲和剂中的每一种与靶标特异性结合。因此，第一亲和剂是多种不同的第一亲和剂(即不同的第一亲和剂中的每一种与样品中的不同靶标结合)，第二亲和剂是多种不同的含有多个第一标记物的第二亲和剂(即不同的第二亲和剂中的每一种与样品中不同的靶标结合)，且第三亲和剂是多种不同的包含多个第二标记物的第三亲和剂(即不同的第三亲和剂中每一种与样品中不同的靶标结合)。一组第一、第二和第三亲和剂与多个不同靶标中的同一个结合。
在一些实施方式中，第一、第二和第三亲和剂是抗体、抗体片段或核苷酸适体。在某些实施方式中，该抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
在示例性步骤140中，将靶标-标记的亲和剂复合物与未复合的第二和第三亲和剂根据固相载体的存在与否分离(例如再次洗涤固相载体)，从而产生分离的靶标-标记的亲和剂复合物。
在一些实施方式中，下一(分区)步骤前从固相载体上切下第一亲和剂，从而从固相载体上释放靶标-标记的亲和剂复合物。在一些实施方式中，用序列特异性蛋白酶(例如TEV、因子Xa或凝血酶)切下连接靶标-标记的亲和剂复合物与固相载体的氨基酸标签。在某些实施方式中，固相表面和第一亲和剂之间的光可切割的接头通过暴露于光而切割。在一些实施方式中，分离的靶标-标记的亲和剂复合物分到多个分区前，交联靶标-标记的亲和剂复合物。
在示例性步骤150中，从分离的靶标-标记的亲和剂形成多个分区，使得分区的一个亚组包含靶标-标记的亲和剂复合物。分区可包括多种类型的分区中的任一种，包括固体分区(如孔或管)和流体分区(如油相内的水相或液滴)。在一些实施方式中，分区是液滴。在一些实施方式中，分区是微通道或微孔。用于划分溶液的方法和组合物描述于，例如，公开的专利申请WO 2012/135259、WO 2014/117088、WO 2010/036352和US 9156010，其全部内容各自通过引用纳入本文。
在一些实施方式中，液滴包含乳液组合物，即不互溶的流体(如水和油)的混合物。在一些实施方式中，液滴是水性液滴，其被不互溶的运载体流体(如油)包围。在一些实施方式中，液滴是油性液滴，其被不互溶的运载体流体(如水性溶液)包围。在一些实施方式中，本文所述液滴是相对稳定的并在两个或更多个液滴之间具有最小聚结。在一些实施方式中，生成的液滴中少于0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％与其他液滴聚结。
在一个实施方式中，使油相流过水相，从而形成液滴。用于油相的油可经合成或天然存在。在一些实施方式中，所述油包括碳和/或硅。在一些实施方式中，所述油包括烃和/或氟碳。示例性的油包括但不限于硅油、矿物油、氟碳油、植物油或其组合。
该油相可包含氟化基础油，其可通过与氟化表面活性剂(如全氟聚醚)联用而进一步稳定。在一些实施方式中，该基础油包括以下一种或多种：HFE 7500、FC-40、FC-43、FC-70或其他常见氟化油。在一些实施方式中，该油相包含阴离子含氟表面活性剂。在一些实施方式中，该阴离子含氟表面活性剂是AmmoniumKrytox(Krytox-AS)、Krytox FSH的铵盐或Krytox FSH的吗啉代衍生物。Krytox-AS的浓度可以是约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％或4.0％(w/w)。在一些实施方式中，Krytox-AS的浓度是约1.8％。在一些实施方式中，Krytox-AS的浓度是约1.62％。KrytoxFSH的吗啉基衍生物的浓度可以是约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％或4.0％(w/w)。在一些实施方式中，Krytox FSH的吗啉代衍生物的浓度是约1.8％。在一些实施方式中，Krytox FSH的吗啉代衍生物的浓度是约1.62％。
在一些实施方式中，该油相还包含用于调节油性质(如蒸气压、粘度或表面张力)的添加剂。非限制性示例包括全氟辛醇和1H,1H,2H,2H-全氟癸醇。在一些实施方式中，1H,1H,2H,2H-全氟癸醇添加至约0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.25％、1.50％、1.75％、2.0％、2.25％、2.5％、2.75％或3.0％(w/w)的浓度。在一些实施方式中，1H,1H,2H,2H-全氟癸醇添加至约0.18％(w/w)的浓度。
在一些实施方式中，使油相流过包含DNA模板和用于检测样品中靶标存在与否的一种或多种组分(例如试剂)的水溶液相，从而形成液滴。在一些实施方式中，用于确定水性液滴中是否存在靶标的一种或多种组分可溶于和/或可混溶于水，包括但不限于，一种或多种盐、缓冲剂、试剂(例如，释放剂，如限制性内切酶或蛋白酶、PCR组分)、表面活性剂、和/或可用于在所形成的液滴内发生期望反应所需的任意其他组分。所有这种其他组分可经选择以与所需的反应或待进行的试验相容。
在一些实施方式中，可在分区内注入试验组分(例如DNA聚合酶、dNTP和/或PCR主混合物、酶底物)。试验组分可以任何顺序或同时注入分区。
向分区中注射流体的方法描述于，例如，WO2012/135259和US2012/0132288，其各自通过引用其全文纳入本文。
在一些实施方式中，形成了至少500个分区(如液滴)、至少1000个分区、至少2000个分区、至少3000个分区、至少4000个分区、至少5000个分区、至少6000个分区、至少7000个分区、至少8000个分区、至少10,000个分区、至少15,000个分区、至少20,000个分区、至少30,000个分区、至少40,000个分区、至少50,000个分区、至少60,000个分区、至少70,000个分区、至少80,000个分区、至少90,000个分区、至少100,000个分区、至少200,000个分区、至少300,000个分区、至少400,000个分区、至少500,000个分区、至少600,000个分区、至少700,000个分区、至少800,000个分区、至少900,000个分区、至少1,000,000个分区、至少2,000,000个分区、至少3,000,000个分区、至少4,000,000个分区、至少5,000,000个分区、至少10,000,000个分区、至少20,000,000个分区、至少30,000,000个分区、至少40,000,000个分区、至少50,000,000个分区、至少60,000,000个分区、至少70,000,000个分区、至少80,000,000个分区、至少90,000,000个分区、至少100,000,000个分区、至少150,000,000个分区或至少200,000,000个分区。
在一些实施方式中，生成的液滴在形状和/或尺寸方面基本均匀。例如，在一些实施方式中，这些液滴在平均直径方面基本均匀。术语“基本上”或“约”是指所列的数字以及所列数字10％范围内的任何值。在一些实施方式中，生成的液滴的平均直径为约0.001微米、约0.005微米、约0.01微米、约0.05微米、约0.1微米、约0.5微米、约1微米、约5微米、约10微米、约20微米、约30微米、约40微米、约50微米、约60微米、约70微米、约80微米、约90微米、约100微米、约150微米、约200微米、约300微米、约400微米、约500微米、约600微米、约700微米、约800微米、约900微米或约1000微米。在一些实施方式中，生成的液滴的平均直径为小于约1000微米、小于约900微米、小于约800微米、小于约700微米、小于约600微米、小于约500微米、小于约400微米、小于约300微米、小于约200微米、小于约100微米、小于约50微米，或小于约25微米。在一些实施方式中，生成的液滴在形状和/或尺寸方面是不均匀的。
在一些实施方式中，生成的液滴在体积上基本均匀。例如，在一些实施方式中，生成的液滴的平均体积为约0.001nL、约0.005nL、约0.01nL、约0.02nL、约0.03nL、约0.04nL、约0.05nL、约0.06nL、约0.07nL、约0.08nL、约0.09nL、约0.1nL、约0.2nL、约0.3nL、约0.4nL、约0.5nL、约0.6nL、约0.7nL、约0.8nL、约0.9nL、约1nL、约1.5nL、约2nL、约2.5nL、约3nL、约3.5nL、约4nL、约4.5nL、约5nL、约5.5nL、约6nL、约6.5nL、约7nL、约7.5nL、约8nL、约8.5nL、约9nL、约9.5nL、约10nL、约11nL、约12nL、约13nL、约14nL、约15nL、约16nL、约17nL、约18nL、约19nL、约20nL、约25nL、约30nL、约35nL、约40nL、约45nL、或约50nL。
在一些实施方式中，这些分区(例如液滴)是稳定的且能够长期储存。在一些实施方式中，这些分区在约－70℃、－20℃、0℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃或40℃下长时间储存(例如至少30天、至少60天、至少90天或更长)。
本文描述的分区能够含有一种或多种表面活性剂以减少移动过程中液滴的聚结。本文所用的“表面活性剂”是表面活性物质，能够减少含有该物质的液体的表面张力。表面活性剂，也可以或选择性地描述为洗涤剂和/或润湿剂，可引入亲水部分和疏水部分，它们可同时赋予表面活性剂双重亲水性-疏水性。表面活性剂在一些情况下可通过其亲水性与疏水性之比来表征。在一些实施方式中，水相纳入至少一种亲水性表面活性剂。水相可包括至少一种非离子表面活性剂和/或离子表面活性剂。在某些实施方式中，水相包括表面活性剂，该表面活性剂是聚环氧丙烷和聚环氧乙烷的嵌段共聚物。在一些实施方式中，表面活性剂是以商品名PLURONIC及TETRONIC(巴斯夫(BASF)公司)销售的聚环氧丙烷和聚环氧乙烷的嵌段共聚物。在一些实施方式中，表面活性剂是以商品名PLURONIC F-68销售的聚环氧丙烷和聚环氧乙烷的非离子嵌段共聚物。在一些实施方式中，水相的表面活性剂是水溶性和/或亲水性氟表面活性剂。水相的示例性氟表面活性剂以商品名ZONYL(杜邦(DuPont)公司)销售，例如ZONYL FSN氟表面活性剂。在一些情况下，表面活性剂可包括聚山梨醇酯20(美国ICI公司(ICI Americas,Inc.)以商品名TWEEN-20销售)。水相中的特定表面活性剂或总表面活性剂的浓度可经选择以在加热前使乳液液滴稳定。在一些实施方式中，水相的表面活性剂的浓度以重量计为0.01-10％，0.05-5％，0.1-1％或0.5％。
在示例性步骤160中，通过检测在至少一个相同分区中第一和第二标志物的存在(即第一和第二标志物共同定位在同一分区中)检测样品中靶标的存在。
在一些实施方式中，检测样品中靶标的方法包括使样品接触与固相载体连接的第一亲和剂，包含第一标记物的第二亲和剂以及包含第二标记物的第三亲和剂。第一、第二和第三亲和剂与靶标(如存在)特异性结合，从而形成靶标-标记的亲和剂复合物。在一些实施方式中，第一、第二和第三亲和剂特异性结合于靶标上的不同表位。下一步包括将靶标-标记的亲和剂复合物与样品中未复合的组分基于固相载体的存在与否分离，从而形成分离的靶标-标记的亲和剂复合物。接着，将分离的靶标-标记的亲和剂复合物分到多个分区内。通过检测至少同一个分区内第一和第二标记物的存在检测靶标在样品中的存在。
在一些实施方式中，检测样品中靶标的方法包括使样品接触包含第一标记物的第二亲和剂以及包含第二标记物的第三亲和剂。第二和第三亲和剂与靶标(如存在)特异性结合，从而形成包含靶标、第二亲和剂和第三亲和剂的第一复合物。在一些实施方式中，第二和第三亲和剂特异性结合于靶标上的不同表位。该方法的下一步包括使第一复合物和与固相载体连接的第一亲和剂接触。第一亲和剂与靶标特异性结合，从而形成包含靶标、第一亲和剂、第二亲和剂和第三亲和剂的靶标-标记的亲和剂复合物。在一些实施方式中，第一亲和剂特异性结合于靶标上与第二和第三亲和剂的结合表位不同的表位。接着，将靶标-标记的亲和剂复合物与样品中未复合的组分基于固相载体的存在与否分离，从而形成分离的靶标-标记的亲和剂复合物。然后至少将分离的靶标-标记的亲和剂复合物分到多个分区内。通过检测至少同一个分区内第一和第二标记物的存在检测靶标在样品中的存在。
在一些实施方式中，检测样品中靶标的方法包括：将多个固相载体与包含靶标(如存在)的样品中的多个蛋白偶联，从而形成多个固相载体偶联物。在一些实施方式中，偶联步骤包括交联。交联方法和试剂是本领域已知的，包括但不限于使用碳二亚胺、吡啶基二硫化物、羰基化合物、酰肼、马来酰亚胺、卤代乙酰和双吖丙啶。下一步包括基于多个固相载体存在与否将多个固相载体偶联物与样品中的未偶联物质分离，从而形成分离的多个固相载体偶联物。接着，使分离的多个固相载体偶联物与包含第一标记物的第一亲和剂以及包含第二标记物的第二亲和剂接触。第一和第二亲和剂与靶标上不同表位特异性结合，从而形成靶标-标记的亲和载体复合物。在下一步中，将靶标-标记的亲和剂复合物与样品中未复合的组分基于固相载体的存在与否分离，从而形成分离的靶标-标记的亲和剂复合物。接着，至少将分离的靶标-标记的亲和剂复合物分到多个分区内。然后通过检测至少同一个分区内第一和第二标记物的存在检测靶标在样品中的存在。
在一些实施方式中，第一和第二标记物是核酸(例如DNA)标记物。合适的核酸标记物的示例包括但不限于：寡核苷酸序列、单链DNA、双链DNA、RNA(例如mRNA或miRNA)或DNA-RNA杂交体。在一些实施方式中，该核酸标记物的长度是约10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000个核苷酸。在核酸是寡核苷酸的实施方式中，可用本领域技术人员已知的方法合成寡核苷酸，且是市售的。在本文实施方式中用作第一和第二标记物的第一和第二寡核苷酸通常设计成第一寡核苷酸不和第二寡核苷酸杂交。本文所用的“杂交”指通过连接DNA或RNA的两条互补链形成双链核酸的过程。
在某些实施方式中，扩增核酸标记物。可通过例如以下扩增核酸标记物：PCR、LCR(连接酶链式反应)、SDA(链置换扩增)、3SR(自主维持合成反应)、TMA(转录介导的扩增)、滚环扩增(RCA)、或超支化RCA(HRCA)。
在一些实施方式中，通过使用标记物偶联引物或核苷酸直接将标记物(例如荧光团、放射性同位素或酶)掺入扩增的核酸来检测扩增的核酸标记物。在一些实施方式中，被插入双链DNA时的发荧光的染料用于检测扩增的核酸。示例性嵌入染料包括但不限于溴乙锭、碘丙锭、
Figure BDA0002427155130000151
染料和SYBRTM绿。在一些实施方式中，用在一端具有报告物另一端具有淬灭剂的核酸探针检测扩增的核酸。在一些实施方式中，探针包含报告物-淬灭剂组合，如在TAQMANTM探针、分子信标探针、SCORPIONTM探针、双重杂交探针、双链探针、ECLIPSETM探针、或双淬灭探针(例如来自IDT的ZENTM或TAOTM双淬灭探针)中所使用。在一些实施方式中，用同一DNA探针或嵌入染料的不同信号水平检测第一和第二核酸标记物。在使用DNA探针的实施方式中，对于每种寡聚标记物，以不同浓度加入DNA探针。在使用嵌入染料的实施方式中，用不同的扩增子长度或不同浓度的引物对每种寡聚标记物产生不同的信号强度。对于第一标记物阳性的液滴荧光有轻度增加，对于第二标记物阳性的液滴荧光有中等增加，双阳性(表示连接)液滴将具有最强的荧光信号。
在一些实施方式中，第一和第二标记物是不同的酶，通过检测酶各自产生的产物检测靶标。合适的酶的示例包括但不限于：脲酶、碱性磷酸酶、(辣根)氢过氧化物酶(HRP)、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、和酯酶。例如，辣根过氧化物酶检测系统可与荧光底物10-乙酰基-3,7-二羟基吩噁嗪(ADHP)联用，其在过氧化氢存在下产生在585nm处可检测的可溶产物试卤灵。碱性磷酸酶检测系统可与荧光底物二磷酸荧光素(FDP)联用，其产生在520nm处易测的可溶性产物。β-半乳糖苷酶检测系统可与荧光底物试卤灵-β-D-吡喃半乳糖苷(RBG)联用，其产生在585nm可测的可溶性产物。酯酶检测系统可与底物如二乙酸荧光素联用。在一些实施方式中，2、3、4、5或更多种用于检测目标分子的亲和试剂各自标记有酶(例如第一亲和试剂标记有第一酶，第二亲和试剂标记有第二酶等)，且标记有酶的各亲和试剂通过检测该酶生成的可分辨产物来测得。
在一些实施方式中，通过生物素-链霉亲和素相互作用将标记物与亲和剂连接。在一些实施方式中，第一和第二标记物各自与链霉亲和素连接，第二和第三亲和剂生物素化。在本文所述的任何方法的第一步之前通过使第一和第二标记的链霉亲和素结合于各生物素化第二和第三亲和剂来标记第二和第三亲和剂。
可用任何检测装置检测可检测的标记(例如本文所述的标记物)。检测方法的示例包括光学吸光度检测(例如荧光或化学发光)或放射性检测。作为非限制性示例，可使用配备生成激发光的模块(所述激发光可被荧光团吸收)以及检测由荧光团发射的光的模块的检测装置来检测荧光标记物。
在一些实施方式中，该检测器还包括对经划分的样品(例如液滴)的操作能力，通过单独划分的样品进入检测器，进行检测，然后退出检测器。在一些实施方式中，经划分的样品(例如液滴)在所述经划分的样品流动时连续检测。在一些实施方式中，经划分的样品(例如液滴)排列在表面，而检测器相对于所述表面运动，在含信号分区的各位置检测信号。检测器的示例如WO 2010/036352所示，其内容通过引用纳入本文。在一些实施方式中，经划分样品中的可检测标记物连续检测而无需使经划分的样品流动(例如使用室玻片)。
获取荧光检测数据后，可使用通用目的计算机系统(本文中称作“主机”)来储存和处理数据。可使用计算机可执行逻辑进行诸如扣减背景信号、对靶标和/或参考序列赋值、和定性和/或量化数据的功能。主机可用于显示、储存、检索或计算来自分子谱分析的结果；储存、检索或计算来自表达分析的原始数据；或者显示、储存、检索或计算用于本发明的方法中的任何样品或患者信息。
主机可配置许多不同的硬件组件并可以许多尺寸和形式制造(例如台式PC、笔记本、平板PC、手持式计算机、服务器、工作站、大型机)。可包含标准组件，如监视器、键盘、磁盘驱动器、CD和/或DVD驱动器等。当主机与网络相连时，可通过任何合适的传输介质(例如有线、光和/或无线介质)和任何合适的通信协议(例如TCP/IP)来提供连接；主机可包括合适的网络硬件(例如调制解调器、以太网卡、WiFi卡)。主机可使用多种操作系统中的任一种，包括UNIX、Linux、Microsoft Windows、MacOS或任何其他操作系统。
可以多种语言编写用于实施本发明的各方面的计算机代码，包括PERL、C、C++、Java、JavaScript、VBScript、AWK或任何其他的可在主机上执行或可经编译在主机上执行的脚本或编程语言。代码也可以低级语言编写或分配，例如汇编语言或机器语言。
主机系统有利地提供界面，用户可通过该界面控制工具的操作。在本文所述的实施例中，软件工具以脚本方式实施(例如使用PERL)，其执行可由用户从操作系统(如Linux或UNIX)的标准控制线界面起始。本领域技术人员应理解，需要时，可使命令适用于操作系统。在其他实施方式中，可提供图形化用户界面，使用户使用点击设备控制操作。因此，本发明不限于任何特定的用户界面。
可在用于储存和/或传输的多种计算机可读取介质上编码整合本发明的多种特征的脚本或程序。合适的介质的示例包括：磁盘或磁带、光学储存介质(如光盘(CD)或DVD(数字多功能光盘))、闪速存储器以及经由遵循各种协议的有线、光纤和/或无线网络(包括因特网)的适用于传输的载波信号。
在一些实施方式中，该方法还包括通过确定同时包含第一和第二标记物的分区数量和确定总分区数量来定量靶标(例如蛋白质、蛋白质聚集物或蛋白质寡聚物)。一旦确定各分区的二进制“是-否”结果，即可使用基于泊松统计的算法分析各分区的数据以定量样品中的靶标的量。在一些实施方式中，两个标记物之间的连接程度或数量与蛋白质聚集或蛋白质寡聚的程度或量成比例，用于定量聚集或寡聚的量。在例如前述的WO20100.36352中描述了确定靶标的浓度或量的示例性统计学方法。
IV.试剂盒
在另一个方面，提供了根据本文所述的方法检测样品中的一个或多个靶标的试剂盒。在一些实施方式中，试剂盒包括与固相载体连接的第一亲和剂、与第一标记物偶联的第二亲和剂、和与第二标记物偶联的第三亲和剂，其中第一、第二和第三亲和剂各自特异性连接于靶标。在靶标是多个靶标的实施方式中，对于样品中多个不同靶标中的每一个，提供了一组第一、第二和第三亲和剂，其中第一、第二和第三亲和剂各自特异性结合靶标。本文描述了亲和剂、与固相载体连接的亲和剂、以及偶联于标记物的亲和剂。
在一些实施方式中，第一标记物是第一寡核苷酸，第二标记物是第二寡核苷酸。在该实施方式中，试剂盒还可包含试验组分(例如DNA聚合酶、PCR引物、PCR探针、dNTP、缓冲液、PCR主混合物)。
在某些实施方式中，第一标记物是第一酶，第二标记物是第二酶。在该实施方式中，试剂盒还可包含第一和第二酶各自的酶底物。
在一些实施方式中，试剂盒包含化学修饰的固相载体、第一标记物和第二标记物，其中第一和第二标记物各自与链霉亲和素连接。固相载体与标记物如本文所述。在一些实施方式中，化学修饰的固相载体可与用户提供的第一亲和剂连接。在一些实施方式中，第一和第二标记的链霉亲和素可与用户提供的生物素化的第二和第三亲和剂分别连接。在一些实施方式中，试剂盒包含涂布有链霉亲和素的固相载体。涂覆有链霉亲和素的固相载体可与用户提供的生物素化的第一亲和剂连接。
在一些实施方式中，试剂盒还包括用来进行本文所述方法的说明。
附加披露和可诉主题
项目1.一种检测样品中靶标的方法，所述方法包括：
使样品接触与固相载体连接的第一亲和剂，其中第一亲和剂与靶标(如存在)特异性结合，从而形成与第一亲和剂结合的靶标；
基于固相载体的存在与否，将与第一亲和剂结合的靶标与样品中未结合的物质分离，从而产生分离的样品，其包含与第一亲和剂结合的靶标；
使分离的样品与包含第一标记物的第二亲和剂以及包含第二标记物的第三亲和剂接触，其中第二和第三亲和剂特异性结合于靶标，从而形成靶标-标记的亲和剂复合物；
基于固相载体的存在与否，将靶标-标记的亲和剂复合物与未复合的第二和第三亲和剂分离，从而形成分离的靶标-标记的亲和剂复合物；
将至少分离的靶标-标记的亲和剂复合物分到多个分区内；和
通过检测至少同一个分区内第一和第二标记物的存在检测靶标在样品中的存在。
项目2.一种检测样品中靶标的方法，所述方法包括：
使样品接触与固相载体连接的第一亲和剂、包含第一标记物的第二亲和剂、以及包含第二标记物的第三亲和剂，其中第一、第二和第三亲和剂与靶标(如存在)特异性结合，从而形成靶标-标记的亲和剂复合物；
基于固相载体的存在与否，将靶标-标记的亲和剂复合物与样品中未复合的组分分离，从而形成分离的靶标-标记的亲和剂复合物；
将至少分离的靶标-标记的亲和剂复合物分到多个分区内；和
通过检测至少同一个分区内第一和第二标记物的存在检测靶标在样品中的存在。
项目3.一种检测样品中靶标的方法，所述方法包括：
使分离的样品与包含第一标记物的第二亲和剂以及包含第二标记物的第三亲和剂接触，其中第二和第三亲和剂特异性结合于靶标(如存在)，从而形成包含靶标、第二亲和剂和第三亲和剂的第一复合物；
使第一复合物和与固相载体连接的第一亲和剂接触，从而形成包含靶标、第一亲和剂、第二亲和剂、和第三亲和剂的靶标-标记的亲和剂复合物，其中第一亲和剂与靶标特异性结合；
基于固相载体的存在与否，将靶标-标记的亲和剂复合物与未复合的组分分离，从而形成分离的靶标-标记的亲和剂复合物；
将至少分离的靶标-标记的亲和剂复合物分到多个分区内；和
通过检测至少同一个分区内第一和第二标记物的存在检测靶标在样品中的存在。
项目4.一种检测样品中靶标的方法，所述方法包括：
将多个固相载体与包含靶标(如存在)的样品中的多个蛋白偶联，从而形成多个固相载体偶联物，其中靶标包含至少多个蛋白之一；
基于多个固相载体存在与否，将多个固相载体偶联物与样品中的未偶联物质分离，从而形成分离的多个固相载体偶联物；
使分离的多个固相载体偶联物与包含第一标记物的第一亲和剂以及包含第二标记物的第二亲和剂接触，其中第一和第二亲和剂与靶标特异性结合，从而形成靶标-标记的亲和载体复合物；
基于固相载体的存在与否，将靶标-标记的亲和剂复合物与未复合的第一和第二亲和剂分离，从而产生分离的靶标-标记的亲和剂复合物；
将至少分离的靶标-标记的亲和剂复合物分到多个分区内；和
通过检测至少同一个分区内第一和第二标记物的存在检测靶标在样品中的存在。
项目5.如项目1-3任一所述的方法，其中分区步骤前从固相载体上切下第一亲和剂，从而从固相载体上释放靶标-标记的亲和剂复合物。
项目6.如项目1-5任一所述的方法，其中第一标记物是第一核酸标记物，第二标记物是第二核酸标记物。
项目7.如项目6的方法，其中在分区后扩增第一和第二核酸标记物。
项目8.如项目7的方法，其中第一和第二核酸标记物各自用嵌入染料或选自TAQMANTM探针、SCORPIONTM探针、ECLIPSETM探针、分子信标探针、双链探针、双重杂交探针或双淬灭探针的DNA探针检测。
项目9.如项目8的方法，其中用同一DNA探针或嵌入染料的不同信号水平检测第一和第二核酸标记物。
项目10.如项目1-5任一所述的方法，其中第一标记物是第一荧光团，第二标记物是第二荧光团。
项目11.如项目1-5任一的方法，其中第一标记物是第一酶，第二标记物是第二酶，检测包括检测第一酶和第二酶产生的产物。
项目12.如项目1-3任一的方法，其中第一标记物和第二标记物各自与链霉亲和素连接，第二和第三亲和剂生物素化，和其中在方法的第一步之前，第一和第二链霉亲和素连接的标记物与生物素化的第一和第二亲和剂各自通过链霉亲和素-生物素相互作用偶联。
项目13.如项目1-3任一的方法，其中第一亲和剂生物素化，固相载体与链霉亲和素连接，其中在方法的第一步前，链霉亲和素连接的固相载体通过链霉亲和素-生物素相互作用与生物素化的第一亲和剂连接。
项目14.如项目1-13任一的方法，其中第一标记物产生第一信号，第二标记物产生第二信号，第一信号和第二信号可分辨。
项目15.如项目1-14任一所述的方法，其中固相载体或多个固相载体选自磁珠、非磁性珠、或反应容器表面。
项目16.如项目15的方法，其中非磁性珠是聚苯乙烯珠或硅基珠。
项目17.如项目1-4任一的方法，其中固相载体或多个固相载体包括磁珠，靶标-标记的亲和剂复合物与样品中未复合的组分用磁铁通过吸引靶标-标记的亲和剂复合物中与第一亲和剂连接的磁珠而分离。
项目18.如项目1-4任一的方法，其中固相载体或多个固相载体包括非磁性珠，靶标-标记的亲和剂复合物与样品中未复合的组分通过离心分离。
项目19.如项目1-4任一的方法，其中固相载体是反应容器表面，靶标-标记的亲和剂复合物与样品中的未复合组分通过抽吸分离。
项目20.如项目5的方法，其中氨基酸标签将第一亲和剂和固相载体连接，其中序列特异性蛋白酶切割氨基酸标签。
项目21.如项目20的方法，其中蛋白酶选自TEV、因子Xa和凝血酶。
项目22.如项目5的方法，其中光可切割的接头连接固相表面和第一亲和剂，其中通过使接头暴露于光而切割。
项目23.任何前项目任一的方法，其中靶标选自蛋白质、蛋白质聚集物、和蛋白质寡聚物。
项目24.如项目1-22任一的方法，其中靶标是两种或多种相互作用蛋白的复合物，而第二和第三亲和剂各自与复合物中的相互作用蛋白之一结合。
项目25.如项目23所述的方法，其中所述靶标具有重复的相同表位，而第一和第二亲和剂或第一和第三亲和剂识别相同表位。
项目26.如项目1-22任一的方法，其中第一、第二和第三亲和剂中的每一种与靶标上的不同表位特异性结合。
项目27.如前项目任一的方法，其中第一、第二和第三亲和剂各自选自抗体、抗体片段和核酸适体。
项目28.如项目27的方法，其中抗体是单克隆抗体和/或多克隆抗体。
项目29.如前项目任一的方法，还包括确定同时包含第一标记物和第二标记物的分区数量，从而定量靶标。
项目30.如前项目任一的方法，其中所述分区是液滴。
项目31.在项目1-3任一的方法中，其中样品包含多个不同靶标，对于样品中多个不同靶标中的每一个提供一组第一、第二和第三亲和剂，其中第一、第二和第三亲和剂中的每一种与靶标特异性结合。
项目32.如项目1-4任一的方法中，其中分离的靶标-标记的亲和剂复合物分到多个分区前，交联靶标-标记的亲和剂复合物。
项目33.一种检测样品中靶标的试剂盒，所述试剂盒包括：
与固相载体连接的第一亲和剂；
包含第一标记物的第二亲和剂，和
包含第二标记物的第三亲和剂，
其中第一、第二和第三亲和剂各自特异性结合靶标。
项目34.一种检测样品中靶标的试剂盒，所述试剂盒包括：
一种固相载体，其中固相载体经化学修饰；
第一标记物；和
第二标记物；
其中第一和第二标记物各自与链霉亲和素连接。
项目35.项目33或34的试剂盒，其中第一标记物是第一寡核苷酸，第二标记物是第二寡核苷酸，试剂盒还包括至少一种选自DNA聚合酶、PCR引物、PCR探针、dNTP、缓冲液、PCR主混合物的组分，以及进行检测样品中靶标的方法的说明书。
项目36.项目33或34的试剂盒，其中第一标记物是第一酶，第二标记物是第二酶，试剂盒还包括至少一种选自以下的组分：第一和第二酶的第一和第二种底物至少之一，和/或缓冲液，和进行检测样品中靶标的方法的说明书。
项目37.如项目33或34的试剂盒，其中固相载体选自磁珠、非磁性珠、或反应容器表面。
项目38.如项目34的试剂盒，其中固相载体包括结合于其上的羧基或胺基。
项目39.如项目33的试剂盒，其中靶标是多个靶标，其中对于样品中多个不同靶标中的每一个，提供了一组第一、第二和第三亲和剂，其中第一、第二和第三亲和剂各自特异性结合靶标。
实施例
提供以下实施例仅为说明而非限定。本领域技术人员不难发现有多项非关键参数可变或可修饰并得出基本相同或相似的结果。
实施例1：用单克隆抗体通过数字化亲和连接试验定量靶标
在该实施例中，将两种独立的免疫PCR试验与本文所述的数字化亲和连接试验比较。纯化的人核心蛋白聚糖用作目标蛋白，使用三种不同的单克隆核心蛋白聚糖抗体：一种抗体用于捕获，另两种抗体用于检测。
用生物素化单克隆核心蛋白聚糖抗体(R&D Systems)与链霉亲和素包裹的1μm酪醇活化的磁珠(DynabeadsTM MyOneTM链霉亲和素T1，Thermo Fisher Scientific)结合来制备捕获珠。首先用Dulbecco磷酸缓冲盐水pH7.4(PBS，Biological Industries,Israel)洗涤珠三次。接着，将珠与生物素化核心蛋白聚糖抗体以40μg抗体/2×106个珠的比例在280μl体积的PBS缓冲液中混合，室温孵育2小时。在补充有0.1％胎牛血清(BSA，Merck)的PBS中洗涤珠5次使其洗脱残余抗体。
从与胺修饰的100个碱基长的DNA寡核苷酸(IDT，Innova Biosciences,UK)直接偶联的两个不同克隆的核心蛋白聚糖单克隆抗体(R&D systems)制备检测抗体。从未结合的寡核苷酸中纯化偶联物。
对于每个样品，将3×107个捕获珠用补充有0.01％tween-20(PBS-T，Merck)和0.1％BSA的200μl PBS孵育15分钟。在磁化珠后，通过抽吸除去封闭溶液。将珠重悬浮于25μl的补充有25μg/ml HeLa细胞裂解物(Ipracell，Belgium)的PBS-T中，其中还加入了系列浓度的人重组核心蛋白聚糖(R&D systems)，其浓度范围为100ng/ml-10fg/ml。珠和样品在室温在旋转器上孵育1.5小时。为了测量背景水平，制备了4个非蛋白对照(NPC)，其中核心蛋白聚糖中未加入Hela细胞裂解物。结合反应后，用200μl PBS-T洗涤珠三次。
然后将珠孵育在50μl的两种检测探针的混合物中，其浓度各为2nM，溶于补充有0.1％BSA和100ng/μl聚腺苷酸(Merck)的PBS-T中。使探针与珠在室温下一边旋转一边结合1.5小时。孵育后，用PBS-T洗涤未结合的检测探针5次，将珠重悬浮于100μl TE溶液，pH8.0(Merck)中。1μl的各样品进一步稀释于99μl TE溶液，使珠浓度达到3,000个珠/μl。
最后，制备了含有PCR引物、Taqman探针、dNTP和DNA聚合酶的扩增混合物，并与样品混合。液滴在QX200TM液滴发生机(Bio-Rad)中产生。
扩增混合物含有(每个样品)：12μl探针的ddPCR超混合物(Bio-Rad)，1.2μl的10μM扩增引物(每个标记物的正向和反向引物)，用于第一标记物的0.5μl的10μM FAM水解探针，用于第二标记物的0.5μl的10μM HEX水解探针(全部寡核苷酸购自IDT)和6.5μl稀释样品。
用20μl扩增混合物产生液滴，置于ddPCR平板(BioRad)中，用Microseal‘F’PCR平板密封剂(Bio-Rad)密封，置于C1000热循环仪(Bio-Rad)中扩增。对于每个样品准备4个PCR反应，分析大约80,000个珠。
PCR循环：95℃维持10分钟，94℃循环30秒，56℃一分钟，进行40轮，98℃维持10分钟。用QX200TM液滴读数仪(Bio-Rad)测量液滴荧光，记录每个样品对于每个标记物阳性和阴性液滴的数目。用QuantaSoftTM根据泊松分布计算标记物浓度。用软件在“连接”输出中通过计算观察到的双阳性液滴在随机分布的预期数以上的数目自动计算试验结果。
用GraphPad Prism7.02版(GraphPad软件公司，美国加利福尼亚州)将数据与4参数对数(4PL)模型拟合。
两个免疫PCR试验和数字化亲和连接试验的结果总结于图3。结果显示免疫PCR试验中使用的各标记抗体较高的检测极限(LOD)(虚线曲线上的三角形和方块记号)。然而，当重新将相同的数据用于计算连接信号(圆圈记号，实线)，显著减少噪声水平，使得能检测低得多的靶标浓度并将动态范围扩展三个数量级。这些结果提示当独立免疫PCR试验与亲和连接试验进行比较时，信噪比中有出乎意料的100到100倍的改善。
实施例2：用多克隆抗体通过数字化亲和免疫试验定量靶标
在该实施例中，将两种独立的免疫PCR试验与根据本发明的三种不同目标蛋白的数字化亲和连接试验比较。用纯化的人抗原(PSA、EGF或IL-10)作为目标蛋白，对于每种靶标使用一种单克隆抗体(靶向Psa、EGF或IL-10)捕获和检测。
用生物素化多克隆抗体(R&D Systems)与链霉亲和素涂覆的1μm酪醇活化的磁珠(DynabeadsTM MyOneTM链霉亲和素T1，Thermo Fisher Scientific)与每种靶标结合来制备捕获珠。将200μl储藏浓度为7-10×109个珠/ml的珠转移到Eppendorf管中，通过磁化珠并抽吸上清液除去缓冲液。将珠重悬于200μl补充有50nM生物素化多克隆抗体(R&D systems)的Dulbecco磷酸缓冲盐(pH 7.4，PBS，Biological Industries，Israel)中。接着，珠在室温下旋转孵育1小时。用补充有0.05％Tween-20的PBS洗涤珠两次，除去剩余抗体。最后，将珠重悬浮于补充有0.1％胎牛血清白蛋白(BSA，Merck)的200μl PBS中，4℃储藏。
事先如下制备与寡核苷酸标签偶联的链霉亲和素。设计两条长70-80个碱基的5’氨基修饰的寡核苷酸，从IDT订购。寡核苷酸设计成彼此或与其他天然序列没有显著同源性。用Protein-Oligo偶联试剂盒(TriLink BioTechnologies)根据厂商说明书使它们分别与PierceTM链霉亲和素(Thermo Fisher Scientific)共价偶联。通过紫外吸光度测定得到的偶联物中的蛋白质浓度和核苷酸浓度。
在每次试验前，在两根独立试管中制备用两种寡核苷酸标签之一标记的检测抗体。2μl的1μM生物素化多克隆抗体与2μl的1μM(蛋白质浓度)链霉亲和素-寡核苷酸偶联物以及36μl补充有0.1％BSA(Merck)的PBS混合。在室温下孵育抗体和偶联物一小时，4℃储藏。
对于每个样品，从储藏缓冲液中取出约1×106个捕获珠，重悬浮在由PBS pH 7.4(Biological Industries,Israel)，1mM D-生物素(Thermo Fisher Scientific)，1mg/mLBSA(Merck)，0.05％Tween-20(Merck)，100nM山羊IgG(Merck)，0.1mg/mL鲑鱼精子单链DNA(Thermo Fisher Scientific)和5mM乙二胺四乙酸二钠盐二水合物(EDTA，Merck)的5μl封闭溶液中。在珠的每个样品中加入补充有25μg/ml的Hela细胞裂解物(Ipracell，Belgium)且加入系列浓度的人重组PSA/EGF/IL-10(R&D systems)(浓度范围为100ng/ml-10fg/ml)的45μl封闭溶液。珠和样品在室温1200rpm振荡孵育1.5小时。为了测量背景水平，制备了4个非蛋白对照(NPC)，其中抗原未被加入Hela细胞裂解物。结合反应后，通过磁化珠，用150μl的PBS-T(具有0.05％Tween-20的PBS)洗涤珠两次，除去上清液并将珠重悬浮在新鲜溶液中。
然后珠在浓度分别为62.5nM的两种检测探针和封闭溶液的50μl混合物中孵育。使探针与珠在室温下一边振荡一边结合1.5小时。孵育后，用PBS-T洗涤未结合的检探针三次，将珠重悬浮于120μl TE溶液(pH8.0，Merck)中，最终浓度为8,333个珠/μl。
最后，制备了含有PCR引物、Taqman探针、dNTP和DNA聚合酶的扩增混合物，与样品混合。液滴在QX200TM液滴发生机(Bio-Rad)中产生。
扩增混合物含有(每个样品)：12μl探针的ddPCR超混合物(Bio-Rad)，1.2μl的10μM扩增引物(每个标记物的正向和反向引物)，用于第一标记物的0.5μl的10μM FAM水解探针，用于第二标记物的0.5μl的10μM HEX水解探针(全部寡核苷酸购自IDT)和4.2μl稀释样品和2μl珠。
用20μl扩增混合物产生液滴，置于ddPCR平板(BioRad)中，用Microseal‘F’PCR平板密封剂(Bio-Rad)密封，置于C1000热循环仪(Bio-Rad)中扩增。对于每个样品准备2个PCR反应，分析大约33,000个珠。
PCR循环：95℃维持10分钟，94℃循环30秒，56℃一分钟，进行40轮，98℃维持10分钟。用QX200TM液滴读数仪(Bio-Rad)测量液滴荧光，记录每个样品对于每个标记物阳性和阴性液滴的数目。用QuantaSoftTM根据泊松分布计算标记物浓度。用软件在“连接”输出中通过计算观察到的双阳性液滴在随机分布的预期数以上的数目自动计算试验结果。用GraphPadPrism7.02版(GraphPad软件公司，美国加利福尼亚州)将数据与4参数对数(4PL)模型拟合。
三组免疫试验的结果总结于图4A-4C以及下页的表1。
表1
用多克隆抗体制备使用两个相同探针的独立免疫PCR试验对数字化亲和连接试验的检测值极限
Figure BDA0002427155130000251
结果显示当比较独立免疫PCR的结果(三角和圆圈记号，虚线)和连接结果(圆圈标记，实线)时，三个靶标中每一个的LOD值都有进步。来自NPC的背景噪声水平在免疫PCR和连接试验之间下降了100-1000倍，得到改进的LOD。
实施例3：用多克隆抗体通过数字化亲和免疫试验多重定量数个靶标
在该实施例中，根据本发明在一个反应中进行了对三种不同蛋白的三个免疫试验。用纯化的人抗原(PSA、EGF和IL-10)作为目标蛋白，用三种多克隆抗体(靶向PSA、EGF和IL-10)捕获和检测。
用生物素化多克隆抗体(R&D Systems)与链霉亲和素涂覆的1μm酪醇活化的磁珠(DynabeadsTM MyOneTM链霉亲和素T1，Thermo Fisher Scientific)结合，对于每种靶标分别制备捕获珠。将200μl储藏浓度为7-10×109个珠/ml的珠转移到Eppendorf管中，通过磁化珠并抽吸上清液除去缓冲液。将珠重悬于200μl补充有50nM生物素化多克隆抗体(R&Dsystems)的Dulbecco磷酸缓冲盐(pH 7.4，PBS,Biological Industries，Israel)中。接着，珠在室温下旋转孵育1小时。用补充有0.05％Tween-20的PBS洗涤珠两次，除去剩余抗体。最后，将珠重悬浮于补充有0.1％胎牛血清白蛋白(BSA，Merck)的66.6μl PBS中，4℃储藏。
事先如下制备与寡核苷酸标签偶联的链霉亲和素。对于每种分析的靶标，设计两条5’氨基修饰的长70-80个碱基的寡核苷酸，从IDT订购。寡核苷酸设计成彼此或与其他天然序列没有显著同源性。用Protein-Oligo偶联试剂盒(TriLink BioTechnologies)根据厂商说明书使它们分别与PierceTM链霉亲和素(Thermo Fisher Scientific)共价偶联。用PierceTM BCA蛋白质试验(ThermoFisher Scientific)和UV吸收测定得到的偶联物中蛋白质浓度和核苷酸浓度。
实验前，用两条独特的寡核苷酸标签在两根分开的试管中标记每个靶标的检测抗体。2μl的1μM生物素化多克隆抗体与2μl的1μM(蛋白质浓度)链霉亲和素-寡核苷酸偶联物以及36μl补充有0.1％BSA(Merck)的PBS混合。在室温下孵育抗体和偶联物一小时，4℃储藏。
对于每个样品，从储藏缓冲液中对于每种靶标取出1-2×106个捕获珠(总共3-6×106个珠)，重悬浮在由PBS pH 7.4(Biological Industries，Israel)，1mM D-生物素(Thermo Fisher Scientific)，1mg/mL BSA(Merck)，0.05％Tween-20(Merck)，100nM山羊IgG(Merck)，0.1mg/mL鲑鱼精单链DNA(Thermo Fisher Scientific)和5mM乙二胺四乙酸二钠盐二水合物(EDTA，Merck)组成的5μl封闭溶液中。在珠的每个样品中加入补充有25μg/ml的Hela细胞裂解物(Ipracell，Belgium)且加入系列浓度的人重组PSA、EGF、IL-10(R&Dsystems)(浓度范围为100ng/ml-10fg/ml)的45μl封闭溶液。珠和样品在室温1200rpm振荡孵育1.5小时。为了测量背景水平，制备了4个非蛋白对照(NPC)，其中抗原未被加入Hela细胞裂解物。结合反应后，通过磁化珠，用150μl的PBS-T(具有0.05％Tween-20的PBS)洗涤珠两次，除去上清液并将珠重悬浮在新鲜溶液中。
然后将珠与50μl六种检测探针的混合物(对于每种抗原两种检测探针)一起孵育，封闭溶液中每种探针的浓度为62.5nM。使探针与珠在室温下一边振荡一边结合1.5小时。孵育后，用PBS-T洗涤未结合的检测探针三次，将珠重悬浮于120μl TE溶液(pH8.0，Merck)中，最终浓度为25,000个珠/μl。
对于每种靶标的检测，分别制备含有PCR引物、TaqMan探针、dNTP和DNA聚合酶的扩增混合物。
扩增混合物含有(每个样品每个靶标)：12μl探针的ddPCR超混合物(Bio-Rad)，1.2μl的10μM扩增引物(两个标记物中每一个的正向和反向引物)，用于第一标记物的0.5μl的10μM FAM水解探针，用于第二标记物的0.5μl的10μM HEX水解探针(全部寡核苷酸购自IDT)和4.2μl双蒸水。然后将2μl的珠-结合的免疫复合物加到3种不同的扩增混合物中，在QX200TM液滴发生器(Bio-Rad)中产生液滴。
用20μl扩增混合物产生液滴，置于ddPCR平板(BioRad)中，用Microseal‘F’PCR平板密封剂(Bio-Rad)密封，置于C1000热循环仪(Bio-Rad)中扩增。对于每个样品和每个靶标，准备2个PCR反应，分析大约33,000-66,000个珠。
PCR循环：95℃维持10分钟，94℃循环30秒，56℃一分钟，进行40轮，98℃维持10分钟。用QX200TM液滴读数仪(Bio-Rad)测量液滴荧光，记录每个样品对于每个标记物阳性和阴性液滴的数目。用QuantaSoftTM根据泊松分布计算标记物浓度。用软件在“连接”输出中通过对于每种靶标分别计算观察到的双阳性液滴在随机分布的预期数以上的数目自动计算试验结果。用GraphPad Prism7.02版(GraphPad软件公司，美国加利福尼亚州)将数据与4参数对数(4PL)模型拟合。
图5说明了对于不同靶标的多重蛋白质定量和数字化亲和连接实验的工作流程。
对于相同靶标比较三个靶标的多重连接亲和试验与三个单重连接亲和试验的结果总结于图6A-6C和表2。
表2
用三次独立单重连接试验对一次多重连接试验在试验之间比较三个靶标的LOD值。
Figure BDA0002427155130000271
结果显示多重试验不降低灵敏度，当与单重试验比较时，对于三种靶标中的每一种都得到了可比较的LOD值。
本说明书中引用的所有专利、专利申请和其它公开的参考材料都通过引用全文结合入本文中。

Claims (20)

1.检测样品中分析物的方法，所述方法包括：
使样品接触与固相载体连接的第一亲和剂，其中第一亲和剂与靶标(如存在)特异性结合，从而形成与第一亲和剂结合的靶标；
基于固相载体的存在与否，将与第一亲和剂结合的靶标与样品中未结合的物质分离，从而产生分离的样品，其包含与第一亲和剂结合的靶标；
使分离的样品与包含第一标记物的第二亲和剂以及包含第二标记物的第三亲和剂接触，其中第二和第三亲和剂特异性结合于靶标，从而形成靶标-标记的亲和剂复合物；
基于固相载体的存在与否，将靶标-标记的亲和剂复合物与未复合的第二和第三亲和剂分离，从而形成分离的靶标-标记的亲和剂复合物；
将至少分离的靶标-标记的亲和剂复合物分到多个分区内；和
通过检测至少同一个分区内第一和第二标记物的存在检测靶标在样品中的存在。
2.如权利要求1所述的方法，其中第一标记物是第一核酸标记物，第二标记物是第二核酸标记物。
3.如权利要求2所述的方法，其中在分区后扩增第一和第二核酸标记物。
4.如权利要求3所述方法，其中第一和第二核酸标记物各自用嵌入染料或选自TAQMANTM探针、SCORPIONTM探针、ECLIPSETM探针、分子信标探针、双链探针、双重杂交探针或双淬灭探针的DNA探针检测。
5.如权利要求4所述的方法，其中用同一DNA探针或嵌入染料的不同信号水平检测第一和第二核酸标记物。
6.如权利要求1所述的方法，其中第一标记物和第二标记物各自与链霉亲和素连接，第二和第三亲和剂生物素化，和其中在方法的第一步之前，第一和第二链霉亲和素连接的标记物与生物素化的第一和第二亲和剂各自通过链霉亲和素-生物素相互作用偶联。
7.如权利要求1所述的方法，其中第一亲和剂生物素化，固相载体与链霉亲和素连接，其中在方法的第一步前，链霉亲和素连接的固相载体通过链霉亲和素-生物素相互作用与生物素化的第一亲和剂连接。
8.如权利要求1-7任一所述的方法，其中第一标记物产生第一信号，第二标记物产生第二信号，第一信号和第二信号可分辨。
9.如权利要求1-8任一所述的方法，其中固相载体或多个固相载体选自磁珠、非磁性珠、或反应容器表面。
10.如权利要求1所述的方法，其中固相载体或多个固相载体包括磁珠，靶标-标记的亲和剂复合物与样品中未复合的组分用磁铁通过吸引靶标-标记的亲和剂复合物中与第一亲和剂连接的磁珠而分离。
11.任何前述权利要求任一所述的方法，其中靶标选自蛋白质、蛋白质聚集物、和蛋白质寡聚物。
12.如权利要求1-10任一所述的方法，其中靶标是两种或多种相互作用蛋白的复合物，而第二和第三亲和剂各自与复合物中的相互作用蛋白之一结合，该方法还包括计算相互作用伴侣的结合亲和力(KD)。
13.如先前权利要求任一所述的方法，其中第一、第二和第三亲和剂中的每一种与靶标上的不同表位特异性结合。
14.如前权利要求任一所述的方法，其中第一、第二和第三亲和剂各自选自抗体、抗体片段和核酸适体。
15.如权利要求14所述的方法，其中抗体是单克隆抗体和/或多克隆抗体。
16.如前权利要求任一所述的方法，还包括确定同时包含第一和第二标记物的分区数量，从而定量靶标。
17.如前权利要求任一所述的方法，其中，所述分区是液滴。
18.在权利要求1所述的方法中，其中样品包含多个不同靶标，对于样品中多个不同靶标中的每一个提供一组第一、第二和第三亲和剂，其中第一、第二和第三亲和剂中的每一种与靶标特异性结合。
19.一种检测样品中靶标的试剂盒，所述试剂盒包括：
与固相载体连接的第一亲和剂；
包含第一标记物的第二亲和剂，和
包含第二标记物的第三亲和剂，
其中第一、第二和第三亲和剂各自特异性结合于靶标。
20.如权利要求19所述的试剂盒，其中靶标是多个靶标，其中对于样品中多个不同靶标中的每一个，提供了一组第一、第二和第三亲和剂，其中第一、第二和第三亲和剂各自特异性结合靶标。
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