CN111163792A - 用于治疗病毒感染的肽 - Google Patents

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Abstract

本发明公开多种用于治疗病毒病原体感染的肽、组合物、组合、试剂盒及方法。所述多种组合及试剂盒包括所述公开的肽以及一附加的抗病毒治疗剂。

Description

用于治疗病毒感染的肽
技术领域
本发明公开了用于治疗由病毒病原体引起的感染的多种方法、化合物、组合及其中的用途，所述病毒病原体包括正粘病毒科病毒，特别是A型及B型流感病毒，丝状病毒科或黄病毒科的病毒。当前公开的多种方法、化合物、组合及用途特别地采用特异性结合CD28的多种短肽，以及所述短肽与抗病毒剂的协同组合。
背景技术
在下文中列出了被认为与当前公开主题相关的参考文献：
[1]Osterholm，M.T.(2005年)N.Engl.J.Med.352，1839-1842
[2]Kobasa，D.等人(2004年)Nature 431，703-707
[3]Oxford，J.S.，Rev.Med.Virol.10，119-133(2000年)
[4]Cheung，C.Y.等人(2002年)Lancet 360，1831-1837
[5]Peiris，J.S.等人(2004年)Lancet 363，617-619
[6]WO 2004/087196
[7]US2017/0189529
[8]Ramachandran，G.等人(2015年)J.Infect.Dis.211，995-1003
[9]Arad，G.等人(2011年)PLoS Biol.第e1001149页
[10]Evans，E.J.等人(2005年)Nat.Immunol.6，271-279
[11]Tappe等人(2016年)Med.Microbiol.Immunol.205(3)：269-273
[12]Levy，R.等人(2016年)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 113，E6437-E6446
[13]Barnard，D.L.等人(2007年)Antivir.Chem.Chemother.18，125-132
[14]Nguyen，J.T.等人(2012年)PLoS One 7，e31006
[15]Sidwell等人(1992年)，Antimicrob.Agents Chemother.36，473-476)
[16]Sidwell等人，Antimicrob Agents Chemother 51：845-851(2007年)
本文中对以上参考文献的承认不应被解释为意味着这些参考文献与当前公开的主题的可专利性在任何方面都相关。
背景：
所述炎性细胞因子反应对于保护性免疫而言是不可或缺的，但是病毒感染通常会引起对宿主有害的夸大反应。急性病毒感染可导致细胞因子风暴，这是一种健康且剧烈的免疫系统的过度系统表达，导致多种炎症介质(细胞因子、氧自由基及凝血因子)的释放。血清中的促炎性细胞因子(例如：肿瘤坏死因子)及抗炎性细胞因子均升高，并且这些细胞因子的激烈且通常是致命的相互作用被称为“细胞因子风暴(cytokine storm)”。细胞因子风暴的主要贡献者包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(Interferon-γ)、IL-2(白介素)及IL-6。细胞因子风暴是由过度增殖及高度活化的T细胞或自然杀伤(NK)细胞引起的夸大的免疫反应。这些细胞被感染的巨噬细胞激活。细胞因子风暴必须得到治疗及抑制，以免造成致命的后果。
急性呼吸道病毒感染(尤其是来自A型流感病毒H5N1亚型)导致的细胞因子风暴[1]会影响肺部，并且可能致命。禽流感H5N1于1961年在南非首次从禽类中分离出来，具有极强的传染性，对家禽及人类都可能致命。自2003年1月以来，H5N1暴发已在世界上多个国家引起禽鸟及人类感染。人类感染与亚洲国家家禽养殖场的毁灭性流行同时发生，据报道死亡率接近100％。H5N1流感病毒在亚洲家禽中流行，不太可能被根除。
据信，在1918年的A型流感大流行中，细胞因子风暴造成了许多死亡，并且造成了不成比例的年轻人死亡，估计有4000万至5000万人。细胞因子风暴也被表明是造成2003年香港SARS流行期间许多人死亡的可能原因。人类死于禽流感病毒通常涉及细胞因子风暴。A型禽流感H5N1亚型(“禽流感”)的感染者死于细胞因子风暴引起的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，而不是直接死于病毒感染。死亡通常由多器官系统衰竭引起，而不仅仅是肺衰竭。
相较于最新的人类非致病性病毒，引起1918年大流行的A型流感病毒的血凝素可增强在小鼠中的致病性(pathogenicity)。1918年表现病毒血凝素的高毒性重组病毒可感染整个肺部，并诱导衍生自巨噬细胞的高水平的趋化因子及细胞因子，导致炎性细胞浸润及严重出血[2]，这是最初在大流行期间产生的疾病的标志[3]。
直到1997年左右，猪流感病毒株几乎完全是H1N1。在1997年至2002年之间，出现了三种不同亚型及五种不同基因型的新菌株，这些新菌株是猪中流感的诱因，H3N2是人、猪及禽病毒的重组型，H1N1及H3N2之间的重组型产生了H1N2，以及一种罕见的加拿大菌株H4N6从鸟类到猪跨越了物种屏障。2009年全球大流行的流感是一种A型H1N1流感病毒的新菌株(大流行H1N1/09)的爆发，这种病毒是五种已知的A型流感病毒的重组型，其中一种流行于人类，两种流行于鸟类，另一种流行于猪。重病患者可以使用抗病毒药物治疗，例如：奥司他韦
Figure BDA0002428985540000031
及扎那米韦
Figure BDA0002428985540000032
但并非总是没有副作用。H1N1大流行受到严厉措施的控制。2003年患有H5N1疾病的患者具有异常高的血清趋化因子浓度(例如：干扰素-γ诱导的蛋白10(IP-10)，也称为C-X-C基序趋化因子10(CXCL10)，由干扰素-γ诱导的趋化因子)。结合H5N1流感病毒在体外诱导巨噬细胞培养物中高水平的促炎细胞因子来进行观察[4]，这些发现表明，细胞因子风暴也有助于H5N1疾病的发病机理[5]。
建立一种可靠的预防及/或治疗方法不仅对人类中零星爆发的H5N1、H1N1及其他流感病毒感染而言是很重要的，而且对于在出现大流行情况时的使用也很重要，但有效的疫苗是罕见的。例如，目前尚无有效的用于人类的抗H5N1疫苗。根据世界卫生组织(WHO)的资料，针对2003年H5N1病毒株开发的疫苗对于2004越南H5N1病毒株没有保护作用，所述越南H5N1病毒株已发生显着突变(由于抗原漂移(antigenic drift)导致的突变)。此外，使用当前可用的技术生产针对大流行禽流感毒株的疫苗将在大流行开始后花费至少六个月的时间，因此将不容易获得疫苗。此外，即使那样，供应量也可能仅足以为全球14％的人口接种疫苗[3]。通过疫苗接种预防大流行可能不是控制正粘病毒科病毒特别是A型流感病毒科的病毒的可靠方式，这在很大程度上是由于菌株检测与产品需求之间的时间间隔较短。希望以安全有效的抗病毒疗法的形式发展广谱手段(broad-spectrum means)，从而控制这种病毒感染，特别是A型流感感染，并且因此减轻及抑制由与病毒感染相关所引起的细胞因子风暴。目前，有两种可用于预防及治疗人类流感病毒感染的药物，M2离子通道阻滞剂及神经氨酸酶抑制剂。
金刚烷胺(Amantadine)及金刚乙胺(Rimantadine)通过阻断病毒蛋白的离子通道活性而发挥作用，这对于复制生命周期的早期阶段、病毒进入宿主细胞时是主要且必需的。两种治疗方式在治疗A型流感方面都是非常有效的，但是会对中枢神经系统、肝脏及肾脏产生明显的副作用。高达30％的患者中会产生抗M2抑制剂的流感病毒，这些病毒是致命性的及可传染的。神经氨酸酶抑制剂(例如：
Figure BDA0002428985540000041
Roche；
Figure BDA0002428985540000042
Biota/GlaxoSmithKline)用于防止新形成的病毒从感染细胞中释放并在宿主内传播。两种药物在临床研究中均有效抑制了非禽类流感病毒，但是在细胞培养以及患者中均观察到了神经氨酸酶抑制剂的选择性压力。奥司他韦(
Figure BDA0002428985540000043
Roche)、帕拉米韦
Figure BDA0002428985540000044
或扎那米韦
Figure BDA0002428985540000045
是化学相关药物，属于被提出用于治疗人类H5N1禽流感的主要治疗方法。针对A型流感病毒有活性的其他抗病毒药物包括：金刚烷胺及金刚乙胺(被称为金刚烷，作为M2质子通道阻滞剂)及法匹拉韦(聚合酶抑制剂)及兰尼米韦(laninamivir)。这些抗病毒药物不能解决与感染相关的致死性细胞因子风暴。奥司他韦及扎那米韦也可用于治疗猪流感感染的患者。
总体而言，当前许多抗病毒疗法都针对靶向病毒成分，因此易于产生补偿性病毒逃逸机制。例如，最近的一份报告表明，两名接受
Figure BDA0002428985540000051
治疗的越南籍患者对所述药物具有抗药性，并且死于禽流感。这再次表明需要替代疗法。
先前已证明基于免疫调节肽的方法及组合物可抑制T细胞共刺激途径(CD28/B7)的激活，从而预防细胞因子风暴[6]。在文献[7]中描述了针对流感病毒的抗体与靶向宿主细胞的治疗剂的组合，用于治疗及预防流感病毒的感染。
发明内容
根据本发明的第一方面，本文公开一种用于在需要治疗的一对象中治疗一病毒病原体感染的方法，所述方法包括步骤：向所述对象施用一治疗有效量的至少一种分离的肽，所述肽以特征为约0.1至30微摩尔的一KD值的一结合亲和力而特异性地结合至CD28的晶体同型二聚体界面；或施用一治疗有效量的具有相同的所述结合亲和力的所述肽的一功能性衍生物；或施用一治疗有效量的包括所述至少一种分离的肽或所述肽的功能性衍生物的一组合物，所述方法还选择性地包括步骤：向所述对象施用至少一种附加的抗病毒治疗剂。
在本发明的所有方面及实施例中，所述病毒感染的所述治疗用于控制及/或减弱及/或抑制由所述病毒病原体诱导的一细胞因子风暴。更具体地，所述治疗用于防止所述病毒感染的至少一种症状的恶化、中止及/或缓解所述病毒感染的至少一种症状，或防止对所述对象或所述对象的一器官或组织造成源自于所述病毒感染或与所述所述病毒感染相关的损害。由所述病毒感染引起或与所述病毒感染相关的所述症状或损害可以是但不限于：发烧(温度大于38℃)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、多器官功能障碍综合征(MODS)、全身性炎症反应综合征(SIRS)、低血压、心动过速、呼吸困难、缺血、组织灌注不足(尤其是涉及主要器官)、无法控制的出血、多系统器官衰竭(主要是由于缺氧或组织酸中毒引起)或严重的新陈代谢失调中的至少一种。发烧的一些非限制性的例子是寨卡热、西尼罗河热、登革热或黄热。在特定的实施例中，所述治疗用于防止所述对象死亡。
在本发明的所有方面及实施例中，所述病毒病原体可以是但不限于：正粘病毒科、丝状病毒科、黄病毒科、冠状病毒科或痘病毒科中任何一种的病毒。
因此，所述正粘病毒科中的一种病毒可以是但不限于：A型流感病毒、B型流感病毒或C型流感病毒或其任何亚型或重组型中的任何一种。在一些特定实施例中，A型流感病毒或其任何亚型或重组型可以具有H5、H7或H9亚型的血凝素成分，但不限于上述血凝素成分，并且具有亚型1或2的神经氨酸酶成分(NA)，但不限于所述神经氨酸酶成分。A型禽流感病毒的一个特定非限制性示例是H5N1亚型。一个特定非限制性示例是A型猪流感病毒H1N1亚型。
在其他实施例中，所述病毒病原体可以是所述丝状病毒科中的一种病毒，例如：马尔堡病毒(MARV)及埃博拉病毒(EBOV)，但不限于所述多种病毒。在其他实施例中，所述病毒病原体可以是所述黄病毒科中的一种病毒，例如：寨卡病毒(ZIKV)、西尼罗河病毒(WNV)、登革热病毒(DENV)及黄热病毒(YFV)，但不限于所述多种病毒。在另一实施例中，所述病毒病原体可以是所述冠状病毒科中的一种病毒，例如：严重急性呼吸系统综合症病毒(SARS-CoV)，但不限于严重急性呼吸系统综合症病毒。
在本发明的所有方面及实施例中，所述至少一种分离的肽可以是但不限于下述肽中的任何一种：由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列SPMLVAYD组成的肽，在本文中也称为p2TA核心序列；由SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列HVKGKHLCP组成的一种肽，在本文中也称为p1TA核心序列；由SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列HKGLDSAV组成的一种肽，在本文中也称为p3TA核心序列；由SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列YVNQTDIY组成的一种肽，在本文中也称为p4TA核心序列；由SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列SNGTIIHVK组成的一种肽，在本文中也称为p5TA核心序列；以及同样具有与所述CD28的结晶同二聚体界面的所述结合亲和力的所述肽的多种功能性衍生物；或所述肽的多种药学上可接受的盐类及酯类。
在本发明的多个实施例中，所述至少一种分离的肽可以是：
(a)与上文所定义的一种肽具有至少80％同源的一种肽；
(b)如权项14所述的一种肽，且所述肽通过存在于SEQ ID NO.1的所述氨基酸序列的相应相邻位置中的1至3个连续的氨基酸残基而延伸；
(c)如上文或在(a)或(b)中所定义的一种肽，且所述肽通过下述而在N末端及/或C末端延伸：
(i)通过在所述N端为一月桂基半胱氨酸，在所述C端为一半胱氨酸而延伸；或
(ii)通过一非天然存在或合成的氨基酸残基的一有机部分而延伸；或
(iii)通过相同的一个或多个疏水性氨基酸残基而延伸，所述疏水性氨基酸残基可以是天然存在的或合成的氨基酸残基；
(iv)通过一棕榈酰赖氨酸尾段而延伸，其中所述尾段在所述N末端处；或者
(d)上文所定义的一个肽的一个二聚体或多聚体，或由(a)、(b)或(c)中任一项得到的所述肽的一个二聚体或多聚体；
其中(a)、(b)、(c)或(d)中任一项的所述得到的所述肽维持有以一结合亲和力与所述人类CD28同型二聚体界面特异性结合的能力，所述结合亲和力的特征为低于30微摩尔的KD值，更特别地为约0.1至约30微摩尔的KD值；并且维持有在一病毒病原体感染的治疗中达到一治疗效果的能力。
在多个特定实施例中，如上文所述分离的肽利用D-丙氨酸在所述肽的N-末端及/或C-末端延伸。
在本文所定义的一种肽的一个特定示例中，所述至少一种分离的肽具有：如SEQID NO.2所示的所述氨基酸序列SPMLVAYD，在本文中也称为“p2TA核心序列”；或如SEQ IDNO.7所示的所述氨基酸序列(D-Ala)-SPMLVAYD-(D-Ala)，在本文中也称为(D-Ala)-p2TA-(D-Ala)。
在一第二方面，本发明提供一种用于在需要治疗的一对象中治疗一病毒病原体感染的方法，所述方法包括步骤：向所述对象施用一治疗有效量的至少一种分离的肽，所述肽以特征为约0.1至30微摩尔的一KD值的一结合亲和力而特异性地结合至CD28的晶体同型二聚体界面；或施用一治疗有效量的具有相同的所述结合亲和力的所述肽的一功能性衍生物；或施用一治疗有效量的包括所述至少一种分离的肽或所述肽的功能性衍生物的一组合物，所述方法还选择性地包括步骤：向所述对象施用至少一种附加的抗病毒治疗剂。
在所述治疗的所述第二方面的所有实施例中，由所述病毒感染引起的或与所述病毒感染相关的所述损害或症状、所述病毒病原体及所述分离的肽可以如上文具体的定义。
在本发明的多个实施例中，所述附加的抗病毒治疗剂不是针对所述病毒病原体的一抗体。
在本发明的多个方面及实施例中，所述至少一种附加的抗病毒治疗剂可以是一病毒神经氨酸酶抑制剂、一病毒聚合酶抑制剂或一M2离子通道封阻剂中的任何一种。所述神经氨酸酶抑制剂的非限制性示例是奥司他韦或扎那米韦。
在本发明的多个方面及实施例中，可以将所述至少一种附加的抗病毒治疗剂以一次优的剂量或以一治疗剂量施用于所述对象。
在本发明的多个方面及实施例中，所述至少一种分离的肽或包括所述至少一种分离的肽的所述组合物或所述至少一种附加的抗病毒剂的每一个均通过选自于由下述所组成的群组中的一途径来施用于所述对象，所述群组包含：静脉、肌肉或腹腔施用；鞘内或皮下注射；口服、直肠内、鼻内、眼及局部施用。
在本发明的多个方面及实施例中，所述分离的肽以所述对象的体重每公斤使用约0.05毫克至约0.5毫克的肽的一用量施用于所述人类对象。
在本发明的多个方面及实施例中，可以将所述至少一种分离的肽及所述至少一种附加的抗病毒治疗剂同时施用于所述对象。或者，在不同时间点、在多次施用之间的不同间隔、以不同的治疗期及/或以任何施用顺序，来将所述至少一种分离的肽及所述至少一种附加的抗病毒治疗剂施用于所述对象。所述分离的肽或包括所述分离的肽的组合物及所述附加的抗病毒治疗剂中的每一种可以以一个或多个相同或不同的治疗期进行一周或多周的施用，所述治疗期为每天一次、每三天一次、每五天一次或每周一次施用所述分离的肽及所述附加的抗病毒剂中的每一种，其中所述治疗期是连续的，或彼此间隔有1天或几天或1周或几周的多个非治疗间隔。所述至少一种分离的肽与所述至少一种附加的抗病毒治疗剂的施用之间的所述间隔可以是例如：约5分钟至约5小时。
在本发明的多个方面及实施例中，无论是在临床症状/损害出现之前或之后，所述分离的肽或包括所述分离的肽的所述组合物及所述附加的抗病毒剂的中的每一种，在暴露于所述病毒后立即施用，或在暴露后约30分钟至约10天内施用。
在本发明的多个方面及实施例中，所述组合物包括所述至少分离的肽或功能性衍生物或其中多种药学上可接受的盐类及酯类，包括药学上可接受的添加剂、载体、稀释剂及赋形剂中的至少一种。
本文还公开一种将至少一种分离的肽，或具有相同的结合亲和力的所述肽的一功能性衍生物，或包括所述至少一种分离的肽或所述肽的功能性衍生物的一组合物应用于在需要治疗的一对象中治疗一病毒病原体感染的一方法中的用途，其中所述肽以特征为约0.1至30微摩尔的一KD值的一结合亲合力而特异性地结合至所述CD28的晶体同型二聚体界面，所述方法还选择性地包括：向所述对象施用至少一种附加的抗病毒治疗剂。
在本发明的第三个方面中，本发明公开一种组合，特别是一治疗组合，所述组合包括：所述至少一种分离的肽或具有相同的结合亲和力的所述肽的一功能性衍生物及至少一种附加的抗病毒治疗剂，所述肽以特征为约0.1至30微摩尔的一KD值的一结合亲合力而特异性地结合至所述CD28的晶体同型二聚体界面。
同样在本发明及其实施例的这个方面，所述分离的肽可以为上文描述的任何方面及实施例中所定义的分离的肽。在特定实施例中，所述分离的肽具有：如SEQ ID NO.2所示的所述氨基酸序列SPMLVAYD，在本文中也称为p2TA核心序列；或由SEQ ID NO.7所示的所述氨基酸序列(D-Ala)-SPMLVAYD-(D-Ala)，在本文中也称为(D-Ala)-p2TA-(D-Ala)，或其中多种药学上可接受的盐类及酯类，例如：其中的钠盐。
在一些实施例中，包含在所述组合中的所述附加的抗病毒治疗剂是一病毒神经氨酸酶抑制剂、一病毒聚合酶抑制剂或一M2离子通道封阻剂。神经氨酸酶抑制剂的多个非限制性示例是奥司他韦或扎那米韦。在一些实施例中，包含在所述组合中的所述至少一种附加的抗病毒治疗剂不是针对所述病毒病原体的一抗体。
所述组合可用于治疗需要治疗的一对象的一病毒病原体感染，其中“治疗(treatment)”如上所定义。
在本发明的另一个第四方面，本发明提供一种用于在需要治疗的一对象中治疗一病毒病原体感染及/或其至少一种症状的试剂盒，所述试剂盒包括：
(a)至少一种分离的肽，所述分离的肽以特征为约0.1至30微摩尔的一KD值的一结合亲合力而特异性地结合至所述CD28的晶体同型二聚体界面，并且所述分离的肽选择性地包含在一组合物中，所述组合物还包括一药学上可接受的载体或稀释剂，选择性地为一第一剂量单位形式；
(b)一附加的抗病毒治疗剂，选择性地包含在一组合物中，所述组合物还包括一药学上可接受的载体或稀释剂，选择性地为一第二剂量单位形式；
(c)多个容器装置，用于共同或分别容纳所述第一剂量单位形式及所述第二剂量单位形式；
(d)多个使用说明；以及选择性地包含：
(e)多个装置，用以向所述对象施用所述至少一种分离的肽及所述至少一种附加的抗病毒治疗剂。
在所述公开的试剂盒中，所述分离的肽为上文所定义的肽。在具体的实施例中，所述分离的肽具有：如SEQ ID NO.2所示的所述氨基酸序列SPMLVAYD，在本文中也称为p2TA核心序列；或由SEQ ID NO.7所示的所述氨基酸序列(D-Ala)-SPMLVAYD-(D-Ala)，在本文中也称为(D-Ala)-p2TA-(D-Ala)，或其中多种药学上可接受的盐类及酯类，例如：其中的钠盐。
在所述公开的试剂盒中，所述附加的抗病毒治疗剂是一病毒神经氨酸酶抑制剂、一病毒聚合酶抑制剂或一M2离子通道阻滞剂。多种特定的所述神经氨酸酶抑制剂可以是但不限于奥司他韦或扎那米韦。在所述公开的试剂盒的其他实施例中，所述附加的抗病毒治疗剂不是针对所述病毒病原体的一抗体。
所述公开的试剂盒可以设计成用于在需要治疗的一对象中治疗一病毒病原体感染。
图示说明
图1A至图1B：所述p2TA肽保护小鼠免受致命的禽流感感染。
Balb/c小鼠(n＝10/组)分别经由口服及腹腔内施用(腹腔注射)感染了以1：400稀释的A型H5N1鸭/MN/1525/81流感病毒(LD约为1×105)。利用p2TA肽(也用SEQ ID NO:7表示)进行治疗，腹腔内施用(腹腔注射)p2TA肽、奥司他韦(口服)或利巴韦林(腹腔注射)，每天两次且连续5天，间隔8小时，直到如图所示的总剂量。PSS组别，未经处理的。在长达21天(仅显示前14天)的期间监测存活情况(图1A)，并在第13天后保持恒定，除了利巴韦林组以外(其中一只小鼠在第16天死亡)。在第4至8天测量了血氧饱和度(图1B)。从第0天开始测量体重；在第6天及第21天对每组中的其他动物进行组织学检查(未显示)。缩写：Pep，肽。
图2A至图2D：所述p2TA肽保护小鼠免受致命的H1N1及H5N1流感病毒感染，并与奥司他韦(Oseltamivir)协同作用。
在感染的BALB/c小鼠中监测存活情况。感染后5天内，每天进行两次剂量为每日剂量一半的治疗。利用腹腔注射p2TA，注射的剂量为每只小鼠每日的指示剂量(微克)。对照组为未注射肽的组别。奥司他韦(Osel)以每日指示剂量(毫克/公斤)进行口服施用。利巴韦林作为阳性对照组。图中显示了各个组别的Kaplan-Meier生存曲线。进行对数秩(Mantel-Cox)测试以比较各组别之间的存活状况。*p＜0.05、***p＜0.001、****p＜0.0001。
图2A：存活曲线显示了p2TA对致死性大流行的H1N1/A/California/04/09流感感染的一剂量依赖性保护。鼻内施用H1N1病毒(3LD50)。
图2B：存活曲线显示p2TA及奥司他韦在保护小鼠免于致命的H1N1/A/California/04/09流感感染中具有协同作用。
图2C：存活曲线显示p2TA对致命H5N1/鸭子/MN/1525/81流感病毒感染的剂量依赖性保护。鼻内施用以1：400稀释的H5N1病毒(LD100～1×105)。
图2D：存活曲线显示p2TA对致命的H5N1/鸭子/MN/1525/81流感病毒感染的剂量依赖性保护作用。p2TA及奥司他韦协同保护小鼠免受致命的H5N1流感病毒感染。
图3A至图3B：受到所述p2TA肽保护而免受致命的H1N1/A/California/04/09流感大流行感染的小鼠的体重恢复。
图3A：显示参与图2A所描述的实验中的小鼠的每天测量的重量(平均值±标准差)的图表。所述p2TA肽以每只小鼠每日的指示剂量(微克)进行腹腔内施用。利巴韦林作为阳性对照组，进行腹腔内施用(75毫克/公斤)。图3B：显示参与图2A所描述的实验中的小鼠的每天测量的重量(平均值±标准误差，n＞4)。每只小鼠以每天10微克的剂量施用p2TA。利巴韦林作为阳性对照组。
图4A至图4D：所述p2TA肽改善了受到H5N1流感病毒致命感染的小鼠的动脉血氧饱和度，并减弱了肺中炎性细胞因子的表达。
图4A：在图2C的实验中，在第7天针对感染了H5N1流感病毒的小鼠进行动脉血氧饱和度的确定。
图4B：在图2D的实验中，在第6天确定小鼠的动脉血氧饱和度。平均值+标准误差；n＝5。每只小鼠以指定的每日剂量(微克)接受p2TA、以1毫克/公斤接收奥司他韦(Osel)或以这两种剂量接受(p2TA/Osel)。利巴韦林作为阳性对照组。使用双尾未配对的学生t检验(two-tailed unpaired Student's t-test)比较单种药物治疗及联合治疗；*p＜0.05、**p＜0.05、****p＜0.0001。
图4C：图2D中显示感染了H5N1流感病毒的小鼠的肺中细胞因子及趋化因子的水平，在感染后第6天牺牲。为了允许在共同的y轴上显示，将IFN-γ的测定值除以6，将IL-6的测定值除以5，将MCP-1的测定值除以20，然后将IL-10的测定值乘以4(平均值+标准误差，n＝5)。使用单向方差分析(one-way analysis of variance)及Dunnett的多重比较检验(Dunnett’s multiple comparisons test)来对治疗进行比较；*p＜0.05、**p＜0.005、***p＜0.001、****p＜0.0001。
图4D：柱状图，显示p2TA选择性地减弱感染了H5N1/鸭子/MN/1525/81流感病毒的小鼠肺中炎性介质的表达。显示H5N1流感病毒感染的小鼠肺中的细胞因子及趋化因子水平，所述小鼠在感染后第6天牺牲。针对图4C中的数据，绘制了通过p2TA而减少的倍数。
具体实施方式
如上文所述，细胞因子风暴(高细胞因子症)是一种健康且剧烈的免疫系统的系统表达，可导致150多种炎症介质(细胞因子、氧自由基及凝血因子)的释放。经历细胞因子风暴的患者血清中的Th1促炎性细胞因子及Th2抗炎性细胞因子均升高。细胞因子风暴可能会损坏人体组织及器官、可能导致死亡，并可能发生在包括禽流感及猪流感在内的许多传染病中。
根据建议，所述治疗旨在操纵宿主免疫系统以干扰由病毒病原体激活宿主促炎性Th1细胞及单核细胞引发的细胞因子风暴，并且所述治疗具有控制、减弱、抑制及预防与细胞因子风暴相关的症状，而不会对病毒本身施加选择性压力以使所述病毒以补偿方式进行突变。
本发明人先前已经描述了多种人类CD28模拟肽，所述人类CD28模拟肽的特征为以低于30微摩尔的KD值(更具体的KD值介于约0.1至30微摩尔之间)的一结合亲和力而结合至CD28[8]，并表现出免疫调节活性。
在以下实施例中给出的结果表明，这些特异性结合CD28的晶体同二聚体界面的肽(也称为“本文定义的短肽”或“本文定义的肽”或“本发明的肽”)可以有效地用于治疗病毒病原体的感染，并控制、减弱及/或抑制由感染的病毒病原体引起/导致的细胞因子风暴。所述结果还显示了用本文定义的肽与其他附加的治疗性抗病毒剂联合治疗的协同作用。
根据本发明的第一方面，本文公开了一种在需要治疗的一对象中治疗病毒病原体感染的方法。本发明公开的第一方面的方法包括步骤：向一对象施用一治疗有效量的至少一种分离的肽或如本文定义的肽，或包含所述至少一种分离的肽的一组合物。这种治疗导致控制及抑制所述病毒病原体感染引起的细胞因子风暴，并防止或延迟了受病毒感染的动物的死亡。
换句话说，本发明提供了一种用于在需要治疗的一对象中治疗病毒病原体感染的方法，所述方法包括向所述对象施用一治疗有效量的至少一种分离的肽，所述肽以特征为约0.1至30微摩尔的一KD值的一结合亲和力而特异性地结合至CD28的晶体同型二聚体界面；或施用一治疗有效量的具有相同的所述结合亲和力的所述肽的一功能性衍生物；或施用一治疗有效量的包括所述至少一种分离的肽或所述肽的功能性衍生物的一组合物。
根据第二方面，本发明公开了一种用于在需要治疗的一对象中治疗病毒病原体感染的方法，所述方法包括向所述对象施用如本文定义的一治疗有效量的至少一种分离的肽；或施用一治疗有效量的包括所述至少一种分离的肽的一组合物及其他附加的抗病毒治疗剂。如以下示例所示，利用本文定义的一种肽及一种抗病毒药进行的治疗在控制及抑制病毒病原体感染产生的细胞因子风暴方面显示出一协同作用，并且保护被感染的动物免于死亡。
因此，本发明进一步提供了一种在需要治疗的一对象中治疗病毒病原体感染的方法，所述方法包括步骤：向所述对象施用一治疗有效量的至少一种分离的肽，所述肽以特征为约0.1至30微摩尔的一KD值的一结合亲和力而特异性地结合至CD28的晶体同型二聚体界面；或施用一治疗有效量的具有相同的所述结合亲和力的所述肽的一功能性衍生物；或施用一治疗有效量的包括所述至少一种分离的肽或所述肽的功能性衍生物的一组合物，所述方法还选包括步骤：向所述对象施用至少一种附加的抗病毒治疗剂。
本文所用的术语“附加的抗病毒治疗剂”(或“药物”)是指附加的抗病毒治疗剂/药物(其本身表现出抗病毒活性)，所述附加的抗病毒治疗剂/药物不同于本文所定义的肽。
在上文及其他实施例中，本文定义的治疗控制及/或减弱及/或抑制由所述病毒病原体诱导的一细胞因子风暴。
如本文所定义的治疗方法防止了所述病毒感染的进展并最终防止了所述对象的死亡。
在本发明的这些第一方面及第二方面的方法的实施例中，所述治疗用于防止所述病毒感染的至少一种症状的恶化、中止及/或缓解所述病毒感染的至少一种症状，或防止对所述对象或所述对象的一器官或组织造成源自于所述病毒感染或与所述所述病毒感染相关的损害。所述病毒感染的症状或所述损害可以是发烧(温度大于38℃)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、多器官功能障碍综合征(MODS)、全身性炎症反应综合征(SIRS)、低血压、心动过速、呼吸困难、缺血、组织灌注不足(尤其是涉及主要器官)、无法控制的出血、多系统器官衰竭(主要是由于缺氧或组织酸中毒引起)或严重的新陈代谢失调中的至少一种。
在特定的实施例中，本文所定义的治疗防止所述对象死亡。
如上文详细描述的内容，本发明提供一种在需要治疗的一对象中治疗病毒病原体感染的方法，所述方法包括步骤：向所述对象施用一治疗有效量的至少一种分离的肽，所述肽以特征为约0.1至30微摩尔的一KD值的一结合亲和力而特异性地结合至CD28的晶体同型二聚体界面；或施用一治疗有效量的具有相同的所述结合亲和力的所述肽的一功能性衍生物。
在所有方面及实施例中，本发明的肽也称为“如本文定义的肽”或“如本文定义的短肽”，所述肽应理解为是指具有约6至约10个氨基酸残基的一分离的肽，所述分离的肽特异性地结合至CD28的晶体同型二聚体界面(由SEQ ID NO.1定义)，其中所述结合亲和力的特征为低于30微摩尔的一KD值，更特别地，所述KD值为约0.1至30微摩尔。
可以通过本领域已知的任何方法来确定针对所述晶体同型二聚体界面的结合亲和力，例如通过[9]中所述的表面等离子体共振光谱法。所述术语“晶体同型二聚体界面”及“同型二聚体界面”在本文中可以互换使用。
所述术语“如本文定义的肽”或“如本文定义的短肽”在本文中与“本发明的肽”或“本发明的分离的肽”互换使用。所述术语“如本文定义的肽”或“如本文定义的短肽”或“本发明的肽”还涵盖所述肽的功能片段及衍生物，以及其药学上可接受的盐类及酯类。
如本文所用，所述术语“氨基酸”是指天然存在的及合成的氨基酸残基，以及氨基酸类似物及氨基酸模拟物，所述氨基酸类似物及氨基酸模拟物以类似于天然存在的氨基酸的方式而起作用。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及后来被修饰的那些氨基酸，例如：羟脯氨酸，γ-羧基谷氨酸及O-磷酸丝氨酸。所述术语氨基酸还包括D-氨基酸，D-氨基酸是L-氨基酸的镜像，其中碳α处的手性已被反转。
所述术语“氨基酸序列”或“肽序列”还涉及位于肽及蛋白质的链中氨基酸残基的顺序，所述氨基酸残基通过肽键连接。通常从含有游离氨基的N末端到含有游离羧基的C末端报道所述序列。
所述术语“肽”是指氨基酸残基的分子链，如果需要，所述分子链可以在每个氨基酸残基上被修饰，例如通过甘露糖基化、糖基化、酰胺化(例如：C端酰胺)、羧化或磷酸化。所述肽可以通过基因工程方法，在宿主细胞中表达或通过任何其他合适的方式合成获得。产生肽的方法是本领域众所周知的。
所述术语“分离的”是指从其天然环境中移除、分离或分开的分子，例如：氨基酸序列或肽。
所述术语“分离的肽”是指分离的肽，即具有一定长度或一定数目的连续氨基酸残基的肽，所述肽不是较长氨基酸序列的一部分。
如本文所用，所述术语“盐类”是指本发明的肽或其功能衍生物的药学上可接受的盐类，例如：在制药工业中通常使用的无毒的碱金属、碱土金属及铵盐都是通过本领域众所周知的方法制备的，包括：钠、钾、锂、钙、镁、钡、铵及鱼精蛋白锌盐(protamine zincsalts)；所述术语还包括无毒的酸加盐(acid addition salts)，所述酸加盐通常是通过将本文使用的活性化合物与一合适的有机酸或无机酸反应而制备的。
本文所用的所述术语“酯类”是指药学上可接受的酯类，例如：在酯键水解后保留羧酸或醇的生物学有效性及性质的酯类，并且在生物学或其他方面上都不是非期望的酯类。通常，可以通过常规合成技术完成所述酯类的合成。
本文所定义的肽通常衍生自人类CD28的氨基酸序列(SEQ ID NO.1)中的区域，所述区域具有形成同型二聚体接触(homodimeric contacts)的残基中的至少一个氨基酸残基[9、10]。形成同型二聚体接触的多个残基为(在序列SEQ ID NO.1中的方括号的位置)：人类CD28(SEQ ID NO.1)的氨基酸序列中的Pro(9)、Met(10)、Leu(41)、Val(86)、Thr(89)、Ile(91)、Asn(111)、Gly(112)、Ile(114)及His(116)，并定义了人类CD28的晶体同型二聚体界面。从人类CD28氨基酸序列中衍生出用于本发明的肽的区域为例如：SEQ ID NO.1的氨基酸10至15及116至121，例如：p2TA核心序列(SEQ ID NO.2)及p1TA核心序列(SEQ ID NO.3)，但是还公开了不是特异性衍生自这些区域的肽，所述肽包括一个或多个氨基酸残基，这些胺基酸残基形成同源二聚体接触，例如：p3TA核心序列(SEQ ID NO.4)、p4TA核心序列(SEQ IDNO.5)或p5TA核心序列(SEQ ID NO.6)。
如上文所述，本发明还涵盖如本文所定义的分离的肽的功能衍生物。所述术语“功能性衍生物”是指包括功能性肽片段及变体，所述功能性肽片段及变体与如本文所定义的分离的肽在整个序列中的一个或多个氨基酸不同，即具有缺失、插入、取代(例如：通过保守性取代，至少一个氨基酸被另一个氨基酸置换)、倒位或添加。这个术语还包括用其各自的D氨基酸残基替换整个序列中的至少一个氨基酸残基。此外，所述术语还涵盖本发明的肽的二聚体或多聚体。应当理解，这些肽片段或衍生物不会显着影响原始肽的生物学活性。所述术语“功能性的”或“相较于未修饰的肽，不显着影响修饰的肽的生物学特性”应理解为意指修饰的肽(衍生物)保留与未修饰的肽相似的定性生物学活性。
当涉及本文公开及使用的分离的肽时，所述术语“生物活性特征”包括抑制一发炎反应的多种肽，所述发炎反应由炎症细胞因子IL2、干扰素-γ(IFN-γ)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及/或降低环氧合酶2(cox-2)中的至少一种而确定，以及通过本文所述及本领域已知的任何其他合适参数来确定的生物活性特征。
如本文所定义的肽的特定功能性衍生物可以是以下任一种：
(a)与上文所定义的一种肽具有至少80％同源的一种肽；
(b)如本文所定义的一种肽，且所述肽通过存在于SEQ ID NO.1的所述氨基酸序列的相应相邻位置中的1至3个连续的氨基酸残基而延伸；
(c)如上文或在(a)或(b)中所定义的一种肽，且所述肽通过下述而在N末端及/或C末端延伸：
(i)通过在所述N端为一月桂基半胱氨酸，在所述C端为一半胱氨酸而延伸；或
(ii)通过一非天然存在或合成的氨基酸残基的一有机部分而延伸；或
(iii)通过相同的一个或多个疏水性氨基酸残基而延伸，所述疏水性氨基酸残基可以是天然存在的或合成的氨基酸残基；
(iv)通过一棕榈酰赖氨酸尾段而延伸，其中所述尾段在所述N末端处；或者
(d)上文所定义的一个肽的一个二聚体或多聚体，或由(a)、(b)或(c)中任一项得到的所述肽的一个二聚体或多聚体；
其中(a)、(b)、(c)或(d)中任一项的所述得到的所述肽维持有以一结合亲和力与所述人类CD28同型二聚体界面特异性结合的能力，所述结合亲和力的特征为低于30微摩尔的KD值，更特别地为约0.1至约30微摩尔的KD值；并且维持有在一病毒病原体感染的治疗中达到一治疗效果的能力。
如本文所用，所述术语“同源(homologous)”是指两个肽之间的序列相似性。同源可以通过比较每个序列中的位置来确定，所述位置可以被对齐以用于比对。当比较的序列中的一个位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则所述分子在所述位置是同源的。序列之间的同源程度是序列共享的匹配或同源位置数目的函数。
在本发明的多种方法、组合物、组合及/或试剂盒中使用的肽的特定衍生物是在其N-末端及/或C-末端利用D-丙氨酸延伸的那些肽。
在一些实施例中，所述至少一种分离的肽是下述肽中的任何一种：由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列SPMLVAYD组成的肽，在本文中也称为p2TA核心序列；由SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列HVKGKHLCP组成的一种肽，在本文中也称为p1TA核心序列；由SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列HKGLDSAV组成的一种肽，在本文中也称为p3TA核心序列；由SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列YVNQTDIY组成的一种肽，在本文中也称为p4TA核心序列；由SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列SNGTIIHVK组成的一种肽，在本文中也称为p5TA核心序列；以及同样具有与所述CD28的结晶同二聚体界面的所述结合亲和力的所述肽的多种功能性衍生物；或所述肽的多种药学上可接受的盐类及酯类。
在本发明的多个方面的各种实施例中，在公开的多种方法、组合物、组合及/或试剂盒中使用的所述肽是具有如上文所述的核心序列的任何一种肽，所述肽在两端都具有D-丙氨酸，特别是如SEQ ID NO.7所示的所述氨基酸序列(D-Ala)-SPMLVAYD-(D-Ala)，在本文中也称为(D-Ala)-p2TA-(D-Ala)；如SEQ ID NO.8所示的所述氨基酸序列(DAla)-HVKGKHLCP-(DAla)，在本文中也称为(D-A)-p1TA-(D-A)；如SEQ ID NO.9所示的所述氨基酸序列(DAla)-HKGLDSAV-(DAla)，在本文中也称为(D-A)-p3TA-(D-A)；如SEQ ID NO.10所示的所述氨基酸序列(DAla)-YVNQTDIY-(DAla)，在本文中也称为(D-A)-p4TA-(D-A)；或如SEQID NO.11所示的所述氨基酸序列(DAla)-SNGTIIHVK-(DAla)，在本文中也称为(D-A)-p5TA-(D-A)。
下表1显示了人类CD28的晶体同型二聚体界面的氨基酸序列及本文公开的特定肽及所述肽的氨基酸序列。
表1
Figure BDA0002428985540000211
Figure BDA0002428985540000221
在本发明的所有方面的多个特定实施例中，在所述公开的方法、组合物、组合及/或试剂盒中使用的所述肽是命名为p2TA核心序列的肽，所述肽具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列SPMLVAYD或其任何功能性片段、衍生物、盐类及酯类。一种特定的衍生物是利用D-丙氨酸在N末端及C末端延伸的所述p2TA的肽，在本文中称为(DA)-p2TA-(DA)，具有如SEQID NO.7所示的氨基酸序列(DA)-SPMLVAYD-(DA)。所述名称p2TA(以及所有其他任意肽的名称)有时在本文中可以用来代表所述核心序列(SEQ ID NO.2)或其D-Ala邻接衍生物(SEQID NO.7)。所述肽p2TA也称为AB103，所述肽的INN是瑞替莫德(Reltecimod)，瑞替莫德是(D-A)-p2TA-(D-A)(SEQ ID NO.7)的钠盐。这种肽(即SEQ ID NO.7)在以下多个示例中以举例的方式进行说明。
因此，在一些实施例中，所述至少一种分离的肽具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列SPMLVAYD，在本文中也称为p2TA，或如SEQ ID NO.7所示的所述氨基酸序列(D-Ala)-SPMLVAYD-(D-Ala)，在本文中也称为(D-Ala)-p2TA-(D-Ala)。
在本发明的所有方面的其他具体实施例中，本发明的方法所使用的肽称为p1TA核心序列，并具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列HVKGKHLCP或其任何功能性片段、衍生物、盐类及酯类。
其他特异性肽是由如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的一种肽，所述肽被命名为p3TA；由SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列组成的一种肽，所述肽被命名为p4TA；以及由SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列组成的一种肽，所述肽被命名为p5TA。这些肽表现出与p2TA相似的生物活性[9]。
所述多种D-Ala衍生物(肽核心序列利用D-丙氨酸残基在C及N末端延伸的)及棕榈酰赖氨酸衍生物肽(核心序列利用棕榈酰赖氨酸尾段在所述肽的N末端延伸)也包括在内。
如上文所述，本发明提供了一种在需要治疗的一对象中治疗病毒病原体感染的方法。在以下示例中，如本文所定义的肽在治疗由A型禽流感病毒H5N1亚型及A型禽流感病毒H1N1亚型引起的病毒感染中显示出有益的作用。
通常，“病毒”一词的使用范围最广，包括：黄病毒、出血热病毒(例如：西尼罗河病毒及寨卡病毒)、冠状病毒、腺病毒、乳头状病毒、疱疹病毒(例如：单纯疱疹、水痘带状疱疹或EB病毒)、巨细胞病毒(CMV)、痘病毒(例如：天花或牛痘)；A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、鼻病毒、风疹病毒、虫媒病毒、正粘病毒科病毒(例如：A型及B型流感病毒)；麻疹病毒、腮腺炎病毒、丝状病毒科的病毒(例如：埃博拉病毒及马尔堡病毒)、病毒以及其他病毒，如下文更详细描述。
在本发明的多个方面的一些实施例中，所述病毒病原体是正粘病毒科、丝状病毒科、黄病毒科、冠状病毒科或痘病毒科及其亚家族中的任一种的病毒。
病毒病原体的感染可以由医生诊断。
本领域已知的正粘病毒科是RNA病毒家族，包括：A型、B型、C型及D型流感病毒、流感病毒、托高土病毒(Thogotovirus)及夸兰菲尔病毒(Quaranjavirus)。前三个属包括在脊椎动物中引起流行性感冒的病毒，所述脊椎动物包括：鸟类、人类及其他哺乳动物。
在本发明的多个方面的多个特定实施例中，所述病毒病原体是正粘病毒科的病毒，例如但不限于：A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒(也称为A流感病毒、B流感病毒或C流感病毒)或其任何亚型或重组型。
根据本发明的方法、组合物、组合及试剂盒提供了用于治疗由大量病毒引起的病毒感染的方法。这些病毒包括但不限于以下详细描述的特定病毒。
A型及B型流感病毒颗粒包含负义基因组(genome of negative sense)，单链RNA分为8个线性片段。单个宿主与两种不同的流感病毒的共同感染可导致产生重组型的后代病毒，所述重组型的后代病毒具有衍生自每种亲本病毒的基因组片段的新组合。根据病毒表面的两种蛋白质，血凝素(HA)及神经氨酸酶(NA)，A型流感病毒被分为多种亚型。A型流感病毒具有15种不同的HA亚型及9种不同的NA亚型。A型流感病毒的亚型根据其HA及NA表面蛋白来命名。例如，“H7N2病毒”表示具有HA 7蛋白及NA 2蛋白等的一种A型流感亚型。在禽类中可以找到A病毒的所有已知亚型。人类感染禽类病毒的症状的范围从典型的流感样症状(发烧、咳嗽、喉咙痛及肌肉疼痛)到眼部感染、肺炎、严重呼吸道疾病(例如：急性呼吸窘迫)以及其他严重威胁生命的疾病并发症。禽流感的症状可能取决于引起感染的病毒。理论上，每种A型H5、H7及H9禽流感病毒都可以与9种神经氨酸酶表面蛋白中的任何一种结合；因此，每种亚型(例如：H5N1至H5N9)可能有九种不同形式。H5感染已在人类中记录，有时会导致严重的疾病及死亡。人类感染H7则很少见，但可能在直接与受感染鸟类接触的人类中发生。据信，大多数人感染禽流感的情况是由于接触受感染的家禽或受污染的表面而造成的。对于大多数人来说，禽流感的风险通常较低，因为这种病毒主要发生在鸟类中，通常不会感染人类。然而，当前在亚洲及欧洲的禽类中爆发的A型禽流感(H5N1)就是禽流感暴发的一个例子，并且已引起人类感染及死亡。
在本发明的所有方面的特定实施例中，所述病毒病原体是禽流感病毒A型病毒或其任何亚型及重组型。在本发明的所有方面的其他特定实施例中，所述病毒病原体是具有H5、H7或H9亚型的血凝素成分的A型禽流感病毒。
在许多不同的动物中都发现了A型流感病毒的重组型及新的流感亚型的形成，包括：鸭、鸡、猪、鲸鱼、马及海豹。然而，除了是所有A型流感亚型宿主的鸟类以外，某些A型流感病毒亚型特定于某些物种。通常在一个物种中见过的A型流感病毒可能会跨越宿主并在另一物种中引起疾病。例如，H5N1禽流感是造成最近人类禽流感爆发的原因，而H7N7、H9N2及H7N2亚型也与物种跨越宿主传播及人类感染有关。H1N1与2009年猪流感病毒大流行有关。
因此，在本发明的所有方面的一些特定实施方式中，所述病毒病原体是猪A型流感病毒H1N1亚型。在本发明的所有方面的其他具体实施例中，所述病毒病原体是禽流感A型病毒H5N1亚型。
禽流感病毒可以通过两种主要方式传播给人类；(a)直接来自受感染的鸟类或受禽流感病毒污染的材料，(b)通过中间宿主，例如：猪。
流感病毒具有八个独立的基因片段。如果来自两个不同物种的病毒感染同一个人或动物，则分段的基因组可使不同物种的病毒混合并产生新的A型流感病毒。例如，如果一只猪同时感染人类流感病毒及禽流感病毒，则这些病毒可能会重新组合并产生一种新病毒，所述新病毒具有来自人类病毒的大部分基因，但具有来自禽病毒的血凝素及/或神经氨酸酶。然后，所述产生的新病毒可能能够感染人类并在人与人之间传播，但是所述新病毒具有的表面蛋白(血凝素及/或神经氨酸酶)在以前没有在感染人类的流感病毒中发现。所述A型流感病毒的这种主要变化称为抗原转移(antigenic shift)。当新的A流感亚型感染大多数几乎没有免疫保护或没有免疫保护的人类时，就会导致抗原转移。如果这种新病毒在人类中引起疾病并且可以在人与人之间轻易传播，则可能会导致流感大流行。
重组过程也可能发生在感染了禽流感及人类流感株的人类中。病毒重组可能会产生一种新的病毒，其中所述禽流感病毒的血凝素及人类病毒的其他基因会共同产生。理论上，带有血凝素的A型流感病毒(人类对其免疫能力很低或没有免疫能力)与人类流感病毒重组后，更有可能导致人与人之间的持续传播及大流行性流感。
如上所述，人类中的A型流感病毒感染通常由包含H1、H2及H3血凝素亚型的亚型引起，所述亚型与N1或N2神经氨酸酶亚型中的一种结合。在具有血凝素亚型H5、H7及H9的A型流感病毒中，已经观察到了A型流感病毒，所述A型流感病毒衍生自禽类并且主要是对禽类具有传染性，但是已经越过物种障碍而导致人类感染。这些菌株，例如：H5N1、H7N2、H7N3及H9N2，包括禽类H及N亚型。所述A型H1N1猪流感病毒是5种禽类、猪及人源毒株的重组型。在同时感染了A型禽流感病毒及人类A型流感病毒的宿主中的病毒的重组可能导致一种病毒，其中来自人类适应性A型流感病毒的H或N成分会与禽流感病毒重组。
因此，本发明公开的多种方法、肽、用途、组合物的组合及试剂盒可有效抵抗由抗原性漂移及抗原性转移(antigenic shift)引起的禽流感变体，并对新的A型流感病毒株具有疗效，不管病毒基因组发生了什么样的抗原转移突变。
因此，本发明的所有方面及实例、肽、方法、用途、组合、组合物及试剂盒，扩展到治疗由人类流感病毒与禽流感病毒自然重组以形成新的流感病毒变体而产生的流感亚型感染，并且用于治疗由人类、猪及禽流感病毒的自然重组形成新的流感病毒变体而产生的流感亚型感染。
在一些实施例中，由重组产生的流感病毒可包含禽类血凝素亚型及人类适应性的神经氨酸酶亚型；或者可替代地，是人类适应性的血凝素亚型及禽类神经氨酸酶亚型。在一个特定的实施例中，所述病毒亚型可以是H5N1，其中所述神经氨酸酶亚型衍生自禽类A型流感病毒，而血凝素成分衍生自人类适应性的A型流感病毒。
在一些实施例中，特定的病毒病原体是A型禽流感病毒，所述A型禽流感病毒可以包括：H1、H5、H7或H9亚型的血凝素成分，例如：H5N1亚型。根据其他具体实施例，本发明公开的方法、肽、组合物及/或组合可用于治疗H5N1、H1N1、H2N2及H3N3亚型中的任一种的A型流感，特别是A型流感H5N1亚型及/或H1N1亚型。如以下多个示例所示，治疗导致控制、减弱及/或抑制病毒感染引起的细胞因子风暴及其副作用。
在本发明的其他方面及实施例中，所述病毒病原体可以是属于丝状病毒科的病毒，在本文中也称为“丝状病毒(Filoviruses)”。这些病毒通常是单链负义RNA病毒，所述病毒通常感染灵长类动物。丝状病毒实际上可以在所有细胞类型中繁殖。所述丝状病毒基因组包括七个基因，这些基因编码4个病毒体结构蛋白(VP30、VP35、核蛋白及聚合酶蛋白(L-pol))及3个膜相关蛋白(VP40、糖蛋白(GP)及VP24)。丝状病毒引起出血热，并且具有高致命性。所述病毒被分为丝状病毒科的两个属：埃博拉病毒(EBOV)及马尔堡病毒(MARV)，它们在人类及非人类灵长类动物中均具有高致病性，致死率高达90％。埃博拉病毒种雷斯顿(REBOV)在猴子中具有致病性，但不会引起人类或大猿类疾病。丝状病毒感染的致命结果与循环T细胞数量的早期减少、无法发展出特定的体液免疫(humoral immunity)以及与促炎性细胞因子的释放有关。更具体地，这些病毒在大多数情况下会导致人类疾病的偶发性流行，其特征是系统性出血、多器官衰竭及死亡。疾病的发作是突然的，并且初始症状类似于流感综合征的症状。通常的症状是发烧、头痛、全身不适、肌痛、关节痛及喉咙痛并且伴随着腹泻及腹痛。通常在疾病的第一周结束时出现短暂的麻疹样皮疹，随后脱皮。其他身体检查结果包括：咽喉炎，通常是渗出性的，并且偶尔有结膜炎、黄疸及水肿。患病的第三天后，出血表现是很常见的，包括：瘀斑(petechiae)及明显的出血，其可能来自胃肠道的任何部位以及其他多个部位。随着疾病的进展，患者会出现严重的多灶性坏死及类似败血症性休克的综合征。此外，纤维蛋白溶解系统的激活与凝血因子的消耗相结合导致凝血因子的消耗及血小板膜糖蛋白的降解。
在本发明的其他方面及实施例中，如上所述，所述病毒病原体可以是属于黄病毒科的病毒，在本文中也称为“黄病毒”，特别是西尼罗河病毒(WNV)、登革热病毒(DENV)、黄热病病毒(YFV)或寨卡病毒(ZIKV)，通常是蚊子传播的。这些病毒中的每一种都有几种基因型。西尼罗病毒引起西尼罗河热，其表现为发烧、头痛、呕吐或皮疹。脑炎或脑膜炎则很少见。恢复可能需要数周到数月的时间。DNV是登革热的病因，通常在感染后三到十四天开始出现症状，其中可能包括高烧、头痛、呕吐、肌肉及关节疼痛以及特征性皮疹。恢复通常需要两天到七天。在少数情况下，所述疾病会发展为威胁生命的登革出血热，导致出血、血小板水平低及血浆渗漏，或者发展成登革热休克综合症，在登革热休克综合症中会发生危险的低血压。YFV引起黄热病，这种病毒性疾病通常持续的时间很短。在大多数情况下，症状包括：发烧、发冷、食欲不振、恶心，尤其是背部的肌肉疼痛及头痛。症状通常在五天内改善。在大约15％的人中，在一天之内又发烧，发生了腹痛，并且肝损伤开始导致皮肤发黄。如果发生这种情况，出血及肾脏问题的风险也会增加。ZKV会导致具有长达10天的潜伏期的自限性登革热(DF)样疾病。体征及症状包括相当低度的发烧、肌痛及斑丘疹，伴随有关节痛及头痛，并且较少出现水肿、喉咙痛及呕吐。在2007年及2013年爆发了ZIKV，在2016年将其引入巴西之后又爆发了一次流行病，这都归因于亚洲ZIKV基因型。不同于DF，急性寨卡热(ZF)没有那么严重。最近的一项研究表明，在寨卡DF的急性期发现了多功能T细胞活化(Th1、Th2、Th9及Th17反应)，其特征为各自细胞因子水平的升高(IL-2、IL-3、IL-13、IL-9及IL-17)，然后恢复期减短[11]。ZIKV感染与吉兰-巴雷综合征(Gillain-Barrèsyndrome)有关。在怀孕期间，所述疾病从母亲扩散到子宫中的胎儿，并可能导致婴儿出现多种问题，最明显的是小头畸形以及眼睛异常及胎儿水肿。
因此，在一些实施例中，本文所定义的病毒病原体是包含马尔堡病毒(MARV)及埃博拉病毒(EBOV)的丝状病毒科的一种病毒，或者所述病毒病原体是包含寨卡病毒(ZIKV)、西尼罗河病毒(WNV)、登革热病毒(DENV)及黄热病病毒(YFV)的黄病毒科的一种病毒。
在特定的实施例中，与病毒感染有关的症状或损害是发烧中的任何一种，例如：寨卡热、西尼罗河热、登革热或黄热，其中发烧通常伴有头痛、呕吐、皮疹、肌肉及关节疼痛以及特征性皮疹及其他影响，例如：如上文所述的症状。
在本发明的多个方面的其他特定实施例中，所述病毒病原体是冠状病毒科的成员，更特别地是导致人畜共患病毒性呼吸道疾病(2002至2003年爆发的严重急性呼吸道综合症(SARS-CoV))，在中国南方地区最终导致8098例病例，在37个国家/地区造成774例死亡。最初的症状类似于流感，可能包括：发烧、肌肉疼痛、嗜睡症状、咳嗽、喉咙痛及其他非特异性症状。所有患者唯一的共同症状是发烧超过38℃(100℉)。SARS可能最终导致呼吸急促及/或肺炎；直接病毒性肺炎或继发性细菌性肺炎。SARS的平均潜伏期为4至6天，尽管很少会短至1天或长达14天。自2004年以来没有爆发疫情。没有可用的疫苗。
在另一方面，本发明提供了一种方法，所述方法用于在需要治疗的对象中防止病毒感染的至少一种症状的恶化、中止及/或缓解所述病毒感染的至少一种症状，或防止对所述对象或所述对象的一器官或组织造成源自于所述病毒感染或与所述所述病毒感染相关的损害，并且预防所述对象死亡，所述方法包括步骤：向所述对象施用如本文所述一治疗有效量的至少一种分离的肽或施用一治疗有效量的具有相同的所述结合亲和力的所述肽的一功能性衍生物；或施用一治疗有效量的包括所述至少一种分离的肽或所述肽的功能性衍生物的一组合物，所述方法还选择性地包括步骤：向所述对象施用至少一种附加的抗病毒治疗剂。
所述病毒感染的所述症状或损害是发烧(温度大于38℃)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、多器官功能障碍综合征(MODS)、全身性炎症反应综合征(SIRS)、寨卡热(类似登革热)的低血压、心动过速、呼吸困难、缺血或组织灌注不足(尤其是涉及主要器官)、无法控制的出血、多系统器官衰竭(主要是由于缺氧或组织酸中毒引起)、严重的新陈代谢失调中的至少一种。根据本发明的这个方面的治疗可以防止所述治疗的对象死亡。
如以下示例所示，所述CD28二聚体界面模拟肽p2TA可以部分地保护小鼠免受致命的H1N1或H5N1流感病毒感染，并与所述抗病毒药物奥司他韦具有显着协同作用。使用以宿主为导向的流感治疗方法的概念避免了病原体抗药性的迅速出现，所述概念具有靶向病毒基因产物的特性，例如：神经氨酸酶抑制剂。例如，大流行性流感病毒株之间的奥司他韦抗药性正日益成为一个主要问题。下文介绍的实验表明，宿主导向的治疗性肽p2TA可以有效地与低浓度的抗病毒药物协同作用。p2TA与次优治疗浓度的抗病毒药物(例如：奥司他韦)有效地进行协同作用，以在神经氨酸酶抑制剂的剂量低时获得完全保护，并且因此不易引起病毒抗药性。相较于单独使用抗病毒剂，这具有重要的优势。
此外，如示例2所示，本身不具有任何附加的抗病毒剂的p2TA能够至少部分保护所述对象免受H1N1及H5N1感染的致死作用。所述肽促进减轻体重的小鼠能恢复体重、改善小鼠的肺功能，并导致感染动物肺部炎症细胞因子反应显着降低。
因此并且如上文所述，在特定的实施例中，如本文所定义的用于治疗病毒病原体感染的所述方法包括：向所述对象施用一治疗有效量的至少一种本文所定义的分离的肽，以及选择性地向所述对象施用至少一种附加的抗病毒治疗剂。
因此，在特定的实施例中，本发明的方法还包括步骤：向所述对象施用一治疗有效量的至少一种附加的抗病毒治疗剂。
所述术语“附加的抗病毒治疗剂”包括本领域已知的任何抗病毒治疗剂。
在本发明的所有方面的特定实施例中，所述附加的抗病毒治疗剂不是针对所述病毒病原体的抗体。
换句话说，本发明还提供一种用于在需要治疗的一对象中治疗一病毒病原体感染的方法，所述方法包括步骤：向所述对象施用一治疗有效量的至少一种分离的肽，所述肽以特征为约0.1至30微摩尔的一KD值的一结合亲和力而特异性地结合至CD28的晶体同型二聚体界面；或施用一治疗有效量的具有相同的所述结合亲和力的所述肽的一功能性衍生物；或施用一治疗有效量的包括所述至少一种分离的肽或所述肽的功能性衍生物的一组合物，所述方法还包括步骤：向所述对象施用至少一种附加的抗病毒治疗剂，其中所述附加的抗病毒治疗剂不是针对所述病毒病原体的抗体。
根据本发明的多个方面及实施例，其中使用的一种附加的抗病毒治疗剂可以是例如但不限于：一病毒神经氨酸酶抑制剂(例如：奥司他韦或扎那米韦)、一病毒聚合酶抑制剂(例如：利巴韦林)及一M2离子通道封阻剂(例如：金刚烷胺或金刚乙胺)中的任何一种。
任何已知的批准的病毒神经氨酸酶抑制剂可与本发明的肽一起用于本发明的方法、组合物、组合及试剂盒中。如本领域已知的术语“神经氨酸酶抑制剂”涉及阻断神经氨酸酶的一类抗病毒剂。这些试剂通常被用作抗病毒药物，因为它们通过阻止病毒从所述宿主细胞出芽(budding)而阻止病毒繁殖，从而阻断了流感病毒的病毒神经氨酸酶的功能。神经氨酸酶抑制剂的多个示例包括但不限于：
Figure BDA0002428985540000321
(磷酸奥司他韦)、Gilead/Roche(口服神经氨酸酶抑制剂)、
Figure BDA0002428985540000322
(扎那米韦)、Biota/GlaxoSmithKline(吸入性神经氨酸酶抑制剂)。应该注意的是使用II期抑制剂，例如：T-705Toyama Chemical Co.(口服聚合酶抑制剂)、
Figure BDA0002428985540000323
BioCryst(IV/IM神经氨酸酶抑制剂)或I期抑制剂，例如：CS-8958、Biota/Daiichi Sankyo(吸入性神经氨酸酶抑制剂)也包括在本发明的范围内。
病毒DNA及RNA聚合酶是负责复制病毒遗传物质的酶，并且因此是开发新型抗病毒剂的主要目标。因此，如本领域已知且如本文所用，术语“病毒聚合酶抑制剂”是指减弱、抑制或干扰病毒DNA及RNA聚合酶活性的任何试剂。少数这类型的抑制剂的非限制性示例是法匹拉韦(favipravir)及索非布韦(sofosbuvir)。
如本领域已知且如本文所用，术语“M2离子通道阻断剂”(也称为“M2质子通道阻断剂”)是指通过阻断病毒蛋白的离子通道活性而起作用的试剂，病毒蛋白的离子通道活性对于在复制生命周期的早期阶段进入宿主细胞的病毒而言是必需的，所述M2离子通道阻断剂例如但不限于：金刚烷胺及金刚乙胺。
因此，在一些实施例中，至少一种附加的抗病毒治疗剂是一病毒神经氨酸酶抑制剂、一病毒聚合酶抑制剂及一M2离子通道阻断剂中的任何一种。
在特定的其他实施例中，至少一种附加的抗病毒治疗剂是奥司他韦或扎那米韦。
如本领域已知的内容，奥司他韦(也称为“Tamiflu”)是一种用于治疗及预防A型及B型流感病毒感染的抗病毒神经氨酸酶抑制剂，通常推荐适用于在首次感染症状出现后48小时内有并发症或有高并发症风险的人。
如本领域中已知的内容，扎那米韦是一种神经氨酸酶抑制剂，用于在其他方面健康的个体中治疗及预防由A型及B型流感病毒引起的流感。
本发明人在下文的示例1中证明了当以次优的剂量使用所述奥司他韦时，所述肽(D-Ala)-p2TA-(D-Ala)与奥司他韦的治疗潜力。因此，在一些特定的实施例中，将至少一种附加的抗病毒治疗剂以一次优的剂量或以一治疗剂量施用于所述对象。
如本文所用，所述术语“次优的剂量”是指低于本领域已知的用于治疗病毒感染的剂量。在一些具体实施例中，次优的剂量可以是比本领域已知的用于治疗病毒感染的剂量降低至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或约99％。
在上文及其他实施例中，以治疗有效量(本文也称为“治疗剂量”)施用如本文所述的肽及附加的抗病毒剂。用于本文目的的治疗“有效量”或“治疗剂量”是通过本领域已知的考虑而确定的。所述用量必须足以在治疗的对象中抑制、防止、中止及/或改善所述病毒感染的至少一种症状及/或防止对所述对象或所述对象的一器官或组织造成源自于所述病毒感染或与所述所述病毒感染相关的损害，所述病毒感染可能导致细胞因子风暴。所述病毒感染的至少一种症状或对所述对象或所述对象的一器官或组织造成源自于所述病毒感染或与所述所述病毒感染相关的损害是：发烧(温度大于38℃)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、多器官功能障碍综合征(MODS)、全身性炎症反应综合征(SIRS)、低血压、心动过速、呼吸困难、缺血、组织灌注不足(尤其是涉及主要器官)、无法控制的出血、多系统器官衰竭(主要是由于缺氧或组织酸中毒引起)、严重的新陈代谢失调中的至少一种。
所述术语“治疗”或治疗的形式，以及术语“防止恶化”、“中止”及“缓解”及其形式是指至少部分治愈患者的疾病或病状。
所述术语“达到治疗效果”是指例如：减缓或防止病毒感染症状的发展、防止恶化、阻止及/或缓解至少一种病毒感染的症状、防止对所述治疗的对象或所述对象的一器官或组织造成源自于所述病毒感染或与所述所述病毒感染相关的损害，以及防止所述受试者死亡。
相较于未经治疗的对象的存活率，利用本发明公开的任何组合物、组合的组合物或试剂盒进行治疗可以使受治疗的对象的存活率增加至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或甚至至少90％或100％。
应当注意，利用本发明的任何组合物、组合的组合物或试剂盒进行的治疗可以改善肺功能的任何测量参数，例如：血氧饱和度，相较于治疗前的水平，可以增加至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％或甚至至少80％、90％或100％。在诸如体重及肺叶组织学等参数上也可以显示出类似的改善。
本文所用的术语“需要治疗的对象”是指被熟练的医师诊断为受病毒病原体感染的对象(人类、动物)。由所述病毒感染引起或与所述病毒感染相关的病毒感染的症状或对所述对象或所述对象的器官或组织的损害是熟练医师众所周知的。
尽管本发明的方法、肽、用途、组合物、组合及试剂盒特别旨在用于治疗哺乳动物，特别是人类、其他哺乳动物，本发明的方法、肽、用途、组合物、组合及试剂盒还包括用于治疗禽类，特别是家禽中的病毒感染。家禽可能是但不限于：鸡、火鸡、鹅、鸭、野鸡、鹌鹑、鸽子及鸵鸟。作为非限制性示例，哺乳动物对象还包括：猴子、马科动物、牛、犬、猫、啮齿动物(例如：小鼠及大鼠)以及猪。
因此，在上文及其他实施例中，所述对象是人类对象。在其他特定的实施例中，所述对象是禽类(鸟)。
在另一方面，本发明提供了用于在需要治疗的一对象中治疗一病毒病原体感染的一方法中的用途，本发明提供至少一种分离的肽，所述分离的肽以特征为约0.1至30微摩尔的一KD值的一结合亲和力而特异性地结合至CD28的晶体同型二聚体界面；或提供具有相同的所述结合亲和力的所述肽的一功能性衍生物；或提供包括所述至少一种分离的肽或所述肽的功能性衍生物的一组合物，所述方法还选择性地包括步骤：向所述对象施用至少一种附加的抗病毒治疗剂。
本文还公开了包含至少一种分离的肽的组合，所述肽以特征为约0.1至30微摩尔的一KD值的一结合亲和力而特异性地结合至CD28的晶体同型二聚体界面；或包括具有相同的所述结合亲和力的所述肽的一功能性衍生物以及至少一种附加的抗病毒治疗剂。
在公开的治疗组合的实施例中，所述附加的抗病毒治疗剂不是针对所述病毒病原体的一抗体。
所述公开的组合提供了一种安全、无干扰、协同或累加的疗法，特别是用于病毒感染的治疗。
在所述公开的组合中的至少一种附加的治疗性抗病毒剂可以是例如：作为附加的抗病毒剂的一神经氨酸酶抑制剂、一病毒聚合酶抑制剂及/或至少一种M2离子通道阻滞剂。在以下示例中描述了一些这样的协同组合疗法，并且可用于治疗具有一病毒病原体感染症状或与所述病毒感染相关或由此产生的损害的对象。
在一个具体的实施例中，根据本发明的组合包括：如本文所定义的肽、所述p2TA肽核心序列(SEQ ID NO.2)或所述肽的D-Ala衍生物((DA)-p2TA-(DA)(SEQ ID NO：NO.7)，并且所述至少一种抗病毒剂是神经氨酸酶抑制剂，特别是奥司他韦。
参照本文中所公开的任何方法、肽、用途、组合物、组合及试剂盒，本文所定义的“协同”是指本文所定义的肽与附加的抗病毒治疗剂的效果均大于单独施用这些化合物中任何一种的治疗效果。相对于单独施用本文定义的肽及附加的抗病毒治疗剂的效果，本文定义的肽与附加的抗病毒治疗剂的组合具有增加的效果，所述效果可以通过本领域技术人员来测量，例如：通过使用以下发明人描述的模型。
如本文所用，“附加效果”是指如本文所定义的肽与所述附加的抗病毒治疗剂的组合的所述效果基本上是单独施用任何这些作为单独治疗的化合物的治疗效果的总和。应当理解，在同时使用本文所定义的肽及附加的抗病毒治疗剂的本发明的实施例中，特别是当以次优的剂量使用所述附加的治疗性抗病毒剂时，尽管如此，仍可获得一治疗效果，相较于使用最佳剂量的所述抗病毒剂，所述附加效果有所改善。因此，本发明的这些方法使用低剂量的附加抗病毒剂来提供治疗效果，这通常是临床上期望的。
在另外的具体实施例中，本发明的所述组合用于在需要治疗的一对象中治疗一病毒病原体感染。
换句话说，本发明还提供一种包括至少一种分离的肽的组合，所述组合包括：所述至少一种分离的肽或具有相同的结合亲和力的所述肽的一功能性衍生物，所述肽以特征为约0.1至30微摩尔的一KD值的一结合亲合力而特异性地结合至所述CD28的晶体同型二聚体界面；或具有相同的所述结合亲和力的所述肽的一功能性衍生物以及用于在需要治疗的一对象中治疗一病毒病原体感染的至少一种附加的抗病毒治疗剂。
应当理解，活性化合物，即本文所定义的至少一种肽及至少一种附加的抗病毒治疗剂，通常可以包含在一药物组合物中并且以药物组合物的形式施用，所述药物组合物包括一种或两种本发明的化合物(本文定义的肽或所述肽与一抗病毒治疗剂的任何组合)，选择性地与药学上可接受的添加剂、载体、稀释剂及赋形剂一起施用。
或者，每种活性化合物有时以包含所述活性化合物的一药物组合物的形式单独施用，选择地与药学上可接受的添加剂、载体、稀释剂及赋形剂一起施用。因此，可以以相同的组合物或分开地例如在一试剂盒中提供用于本发明公开的治疗病毒感染的方法中的活性化合物。不论是以相同的组合物组合还是以单独的组合物组合，每种活性剂或包括所述活性剂的组合物都可以以任何常规的口服或可注射或以其他方式施用的剂型提供，例如：吸入式的组合物等。所述多种组合物还可包括附加的活性剂，例如：蛋白酶抑制剂。
因此，在另一方面，本文提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：目前公开的活性化合物及/或所述活性化合物的组合物。根据本发明的所述试剂盒可分别包括两种药物活性化合物，即本文公开的一种肽及一种附加的抗病毒剂。每种活性化合物，即所述肽及所述附加的抗病毒剂或包含所述肽及所述附加的抗病毒剂的组合物，可以包含在单独的单位剂型中，因此所述试剂盒分别包含两个单独的第一剂量单位及第二剂量单位。所述试剂盒可包括用于容纳活性化合物、肽及附加的抗病毒剂及/或其组合物的容器，例如：分开的瓶子或分开的箔包装。然而，分开的活性化合物或其组合物也可以容纳在单个不分开的容器中。所述分开的活性化合物，即所述肽及所述附加的抗病毒剂或其组合物，也可以包含在单一组合物中，选择性地还包含药学上可接受的添加剂、载体或稀释剂，其中至少一种肽及附加的抗病毒剂在化学及药理学上兼容，例如：所述肽及所述附加的抗病毒剂之间没有药物相互作用。
换句话说，本发明进一步提供了一种试剂盒，所述试剂盒用于在需要治疗的一人类对象中治疗一病毒病原体感染及/或其至少一种症状，所述试剂盒包括：
(a)至少一种分离的肽，所述分离的肽以特征为约0.1至30微摩尔的一KD值的一结合亲合力而特异性地结合至所述CD28的晶体同型二聚体界面，并且所述分离的肽选择性地包含在一组合物中，所述组合物还包括一药学上可接受的载体或稀释剂，选择性地为一第一剂量单位形式；
(b)一附加的抗病毒治疗剂，选择性地包含在一组合物中，所述组合物还包括一药学上可接受的载体或稀释剂，选择性地为一第二剂量单位形式；
(c)多个容器装置，用于共同或分别容纳所述第一剂量单位形式及所述第二剂量单位形式；
(d)多个使用说明；以及选择性地包含：
(e)多个装置，用以向所述对象施用所述至少一种分离的肽及所述至少一种附加的抗病毒治疗剂。
在特定的实施例中，本发明的试剂盒是其中所述附加的抗病毒治疗剂不是针对所述病毒病原体的一抗体。
通常，所述公开的试剂盒包括：单独或组合的活性化合物的施用指导。当分开的活性化合物以不同的剂型(例如：口服及注射剂型，例如：静脉内或腹腔内)施用、以不同的剂量间隔施用时，或者当处方医生需要各个成分的滴定组合时，所述试剂盒形式是特别有利的。本发明的所述试剂盒可以选择性地进一步包括用于施用不同的活性化合物、本发明的肽及所述附加的抗病毒治疗剂或其组合物的工具。
根据一个实施例，如本文所述，所述公开的试剂盒旨在经受由病毒病原体或其中的至少一种症状引起的感染的对象中获得治疗效果。
换句话说，在特定的实施例中，本发明的试剂盒用于在需要治疗的对象中治疗病毒病原体感染。
进一步地，本发明提供一种治疗由病毒病原体引起的与细胞因子风暴相关病症的方法，所述方法包括步骤：向有需要的对象施用一治疗有效量的本文所定义的肽，所述肽选择性地包含在本发明的试剂盒中，所述试剂盒包括一第一剂量单位的所述肽以及选择性地包括一第二剂量单位的一附加的抗病毒剂。
应当理解，所述试剂盒的两种成分，本文定义的肽(例如：在第一剂型中)及抗病毒治疗剂(例如：在第二剂型中)都可以以同时或任何顺序地施用于所述对象。
如示例1的结果所示，在本发明的特定方法、用途、组合、组合物或试剂盒中，所述活性成分的一日剂量可包括：本发明的任何肽的用量为所述对象的体重每公斤使用约0.5微克至约5毫克。根据特定实施例，每天本发明的任何肽的有效量可以是所述对象的体重每公斤使用0.5、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、180、200、250、300、350、400、450、500、1000、2000、3000、4000及5000微克中的任何一种；以及每天的用量为所述对象的体重每公斤使用约0.1至250毫克的附加的抗病毒治疗剂，具体地，每天的用量为所述对象的体重每公斤使用0.5至200毫克的附加的抗病毒治疗剂，例如：每天以所述对象的体重每公斤使用约0.5、1、5、10、15、20、25、30、40、50、75、100、150、200以及最高至250毫克，例如：神经氨酸酶抑制剂。在一个特定的实施例中，在使用p2TA肽的情况下，优选的量可以是每天以所述对象的体重每公斤使用约20、50、180或500微克的p2TA肽及约1毫克的神经氨酸酶抑制剂，例如：奥司他韦，所述肽及附加的抗病毒治疗剂的一定量比(quantitative ratio)可以是介于约1：0.1至1：1000的范围。这些有效量的本发明的肽及抗病毒治疗剂可以选择性地包含在一剂量单位形式内。
在特定的实施例中，将本发明的所述分离的肽以所述对象的体重每公斤使用约0.05毫克至约0.5毫克的肽的一用量施用于所述人类对象。
不同条件的治疗可能要求在不同时间段使用不同剂量的每种活性成分，这对于熟练的医学从业者而言是显而易见的。
对于所述对象的所述治疗有效量或剂量取决于待治疗疾病状态的严重性及反应性，所述治疗过程持续1天至几天或几周，或直到治愈或缓解疾病状态及症状。通过测量患者体内的药物累积量，可以计算出最佳的施用方案。一般技术人员可以很容易地确定最佳剂量、施用方法及重复率。一般情况下，根据体重计算剂量，可以以每日、每周或每月施用一次或多次。本领域的普通技术人员可以根据测量的停留时间及体液或组织中活性化合物的浓度来容易地估计施用的重复率。
在本文定义的至少一种肽的不同浓度、不同比例的不同组合中，特别是所述p2TA肽的核心序列(SEQ ID NO。2)或所述肽的D-ala衍生物(D-A)-p2TA-(D-A)(SEQ ID NO.7)，以及至少一种抗病毒治疗剂(例如：奥司他韦)可以用于不同的病毒感染或不同的病毒感染症状。应当理解，可以使用任何定量比率，例如：1：1000、1：2、1：50、1：200、1：350、1：500以及任何可能的组合。
在本发明的方法、肽、组合、试剂盒及其用途的特定实施例中，在不同时间点、在多次施用之间的不同间隔、以不同的治疗期及/或以任何施用顺序，来将所述至少一种分离的肽及所述至少一种附加的抗病毒治疗剂施用于所述对象。
在本发明的所述方法、肽、组合、试剂盒及其用途的多个进一步的实施例中，所述分离的肽或包括所述分离的肽的组合物及所述附加的抗病毒治疗剂中的每一种以一个或多个相同或不同的治疗期进行一周或多周的施用，所述治疗期为每天一次、每三天一次、每五天一次或每周一次施用所述分离的肽及所述附加的抗病毒剂中的每一种，其中所述治疗期是连续的，或彼此间隔有1天或几天或1周或几周的多个非治疗间隔。
此外，根据本发明的组合的组合物或试剂盒的施用可以是周期性的，例如：周期性的施用可以是每天两次、每天三次或每天至少一次，持续至少约一天至约两周或者更多周。任何药物的较低剂量的优点对于本领域技术人员是显而易见的。除了其他之外，这些组合物或试剂盒包括降低副作用的风险、降低患者对治疗失去敏感性的风险以及降低成本。
使用本发明内容的方法、肽、用途、组合、组合物及试剂盒进行的治疗可根据主治医务人员的确认而进行至少1、2、3、4或5天或更长时间的施用。
在本发明的多种方法、肽、组合、试剂盒及其用途的各种实施例中，将至少一种分离的肽及至少一种附加的抗病毒治疗剂同时或连续地施用于所述对象，其中本发明的所述肽可以在所述附加的抗病毒治疗剂施用之前或之后施用。
在特定的实施例中，将至少一种分离的肽及至少一种附加的抗病毒治疗剂同时施用于所述对象。
在本发明的多种方法、肽、组合、试剂盒及其用途的特定实施例中，通过单次施用单剂量的试剂盒来施用本发明的肽。
在本发明内容的方法、肽、组合、试剂盒及其用途的各种实施例中，所述分离的肽或包括所述分离的肽的所述组合物及所述附加的抗病毒剂的中的每一种，在暴露于所述病毒后立即施用，或在暴露后约30分钟至约10天内施用，在临床症状/损害，特别是本文所述的症状/损害表现之前或之后，选择性地通过单次施用单剂量的所述分离的肽或包括所述分离的肽的所述组合物及所述附加的抗病毒剂。
在熟练医师的能力范围内能够确定所述对象暴露于所述病毒的时间(或换句话说，已经暴露于病毒的时间)。
在本发明内容的方法、肽、组合、试剂盒及其用途的进一步实施例中，所述至少一种分离的肽与所述至少一种附加的抗病毒治疗剂的施用之间的所述间隔为约5分钟至约5小时。
可以使用本领域已知的标准方法合成本文定义的肽。本发明的肽的直接合成可以使用固相肽合成、溶液相合成或其他常规手段来完成。例如，在固相合成中，适当保护的氨基酸残基通过其羧基连接至不溶的聚合物载体，例如：交联的聚苯乙烯或聚酰胺树脂。在本文的上下文中，受保护的氨基酸是指在所述氨基酸的氨基以及任何侧链官能团上都存在保护基团。侧链保护基团的优点在于它们通常对于整个合成过程中使用的溶剂、试剂及反应条件而言是稳定的，并且在不影响最终肽产物的情况下是可移除的。通常，通过从起始羧基末端去除所述N-保护基团并将所述N-保护基团与多肽序列中的下一个氨基酸偶联(coupling)来进行多肽的逐步合成。通过形成反应性基团(例如：形成碳二亚胺、对称酸酐或活性酯基，例如：羟基苯并三唑(hydroxybenzotriazole)或五氟苯基酯(pentafluorophenyl esters))，引入的氨基酸的羧基可以被激活以与结合氨基酸的N-端发生反应。所述固相肽合成方法包括：BOC及FMOC方法，它们分别使用叔丁氧羰基(tert-butyloxycarbonyl)及9-芴基甲氧羰基(9-fluorenylmethloxycarbonyl)作为α-氨基保护基，这两种方法都是本领域技术人员众所周知的(Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港出版社，纽约冷泉港；Ausubel等人，《分子生物学的最新方案》，约翰·威利父子出版社，纽约，1995年)。
另外，如上文所述，肽也可以制备并以盐类的形式存储。所述肽的各种盐类形式也可以通过本领域已知的各种方法中的任何一种形成或互换，例如：通过使用各种离子交换色谱法。可以用于所述组合物中的阳离子抗衡离子(Cationic counter ions)包括但不限于：胺，例如：铵离子、金属离子，尤其是碱金属的一价、二价或三价离子，包括：钠、钾、锂、铯；碱土金属，包括：钙、镁、钡；过渡金属，例如：铁、锰、锌、镉、钼；其他金属，例如：铝；以及这些的可能组合。可以在下文描述的组合物中使用的阴离子抗衡离子包括：氯离子、氟离子、醋酸盐、三氟乙酸酯、磷酸根、硫酸根、碳酸根、柠檬酸根、抗坏血酸根、山梨酸根、戊二酸根、酮戊二酸根以及它们的可能组合。
本文定义的肽也可以使用重组DNA技术方法来制备。
本发明的肽也可以由提供肽合成作为服务的公司(例如：宾夕法尼亚州普鲁士国王的BACHEM Bioscience公司；加利福尼亚州圣何塞的AnaSpec公司)来商业制备。本发明也可以使用诸如Perkin-Elmer Applied Biosystems制造的自动肽合成机。
如上所述，在特定的实施例中，本发明的所述组合物包括药学上可接受的添加剂、载体、稀释剂及赋形剂中的至少一种。
本文公开的药物组合物及制剂包括：适于口服、直肠、鼻或肠胃外(包括：皮下、肌肉内、腹膜内(IP)、静脉内(IV)及皮内)施用的那些药物组合物及制剂。
适用于注射的药物形式包括：无菌水溶液或分散液及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉剂。在所有情况下，所述形式必须是无菌的，并且必须具有易于注射的程度的流动性。在生产及储存条件下，所述适用于注射的药物必须是稳定的，并且必须保存以防止微生物(例如：细菌及真菌)的污染。
可以通过各种抗菌剂及抗真菌剂来预防微生物的作用，例如：对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞及其相似物。在许多情况下，优选地包括等渗剂，例如：糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如：单硬脂酸铝及明胶，可以使所述可注射组合物的吸收延长。
通过将所需用量的活性化合物(在本例中为本发明的肽及至少一种附加的抗病毒治疗剂)掺入适当的溶剂中，并根据需求将上述列举的各种其他成分掺入来制备无菌注射溶液，然后进行过滤灭菌。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入无菌赋形剂中来制备分散液，所述无菌赋形剂包含基本分散介质及以上列举的那些所需的其他成分。
在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥及冷冻干燥技术，所述技术从先前的无菌过滤溶液中产生活性成分及任何其他所需成分的粉末。
所述公开的药物组合物通常包括：缓冲剂，调节所述药物组合物的渗透压的试剂，以及选择性地包括：一种或多种本领域已知的药学上可接受的添加剂、载体、稀释剂及赋形剂。补充的活性成分也可以掺入所述组合物中。
本文所用的术语“药学上可接受的添加剂载体、稀释剂及赋形剂”是指任何及所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂及抗真菌剂及其相似物。这些介质及试剂用于药物活性化合物的用途是众所周知的，除了与活性化合物不相容的任何常规介质或试剂外，所述介质及试剂在本领域中是有效的。
所述载体可以是溶剂或分散介质，所述载体包括例如：水、乙醇、多元醇(例如：甘油、丙二醇及液体聚乙二醇及其相似物)，所述载体的合适混合物及植物油。例如，可以通过使用包衣(例如：卵磷脂)，在分散液的情况下通过维持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。
口服施用的组合物及制剂包括：粉剂或颗粒剂，在水或非水介质中的悬浮液或溶液、胶囊剂、袋状剂或片剂。增稠剂、矫味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可能是理想的。
当前公开的药物组合物可以方便地以单位剂型存在，所述药物组合物可以根据制药工业中众所周知的常规技术制备。这样的技术包括将所述活性成分与所述药物添加剂、载体或赋形剂结合。通常，制剂是通过将活性成分与液体载体或细分的固体载体或两者均匀且紧密地结合在一起，然后，如果需要，成型所述产品以制备所述制剂。
根据本发明的组合物可以配制成许多可能的剂型中的任何一种，例如但不限于：片剂、胶囊剂、液体糖浆剂、软凝胶剂、栓剂及灌肠剂。本发明的组合物也可以配制成在水性、非水性或混合介质中的悬浮液。水性悬浮液可以进一步包括增加所述悬浮液粘度的物质，包括例如：羧甲基纤维素钠、山梨醇及/或葡聚糖。所述悬浮液也可以包含稳定剂。本发明的药物组合物还包括但不限于：乳剂(emulsions)及含脂质体的制剂。
所有这些化合物的性质、可得性及来源以及施用方式，包括在一对象中产生理想效果所必需的有效量，在本领域中是众所周知的，因此在此不再赘述。药物组合物的制备是本领域技术人员众所周知的，并且已经在许多文章及教科书中进行了描述，参见例如：Remington's Pharmaceutical Sciences，Gennaro A.R.ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990年，特别是第1521至1712页。
本发明的药物组合物可以根据良好的医学实践来施用及给药。各种施用方法可用于将本文定义的肽或本发明的组合物递送至需要的对象。肽或包含所述肽的组合物可以利用肠胃外递送，例如：经肠胃外递送。通过静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)、腹膜内(i.p.)或皮下(s.c.)注射或口服(以液体形式或制成剂量单位形式，例如：胶囊、丸剂、锭剂等)来进行施用。为了达到有效的治疗效果，所述肽或包括所述肽的组成物的制备方式应使其能够在注射或口服后在系统中稳定。
在特定的实施例中，所述至少一种分离的肽或包括所述至少一种分离的肽的所述组合物或所述至少一种附加的抗病毒剂均通过选自于由下述所组成的群组中的一途径来施用于所述对象，所述群组包含：静脉、肌肉或腹腔施用；鞘内或皮下注射；口服、直肠内、鼻内、眼及局部施用。
所述公开的肽及附加的抗病毒剂及其药物组合物还可以通过其他途径来施用，所述施用取决于是否需要局部治疗或全身治疗以及要治疗的区域。因此，所述施用也可以是局部施用(包括：眼睛施用及粘膜施用，包括：阴道及直肠递送法)、肺部施用，例如：通过吸入或吹入粉末或气雾剂，包括：通过喷雾器来进行施用。
如本文所用，所述术语“约”应理解为指定值的±10％。
应当理解，本发明不限于本文公开且描述的特定实施例、方法步骤及组合物，因为这样的方法步骤及组合物可以有所变化。还应当理解，本文中使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而无意于限制本发明，因为本发明的范围将仅由所附权利要求及其等同物限制。
必须注意，除非内容另有明确规定，如在本说明书及所附权利要求书中所使用的用语，单数形式“一(a)”、“一(an)”及“所述(the)”包括复数指示物。
在整个说明书以及随后的示例及权利要求中，除非上下文另有要求，否则所述词语“包括”以及诸如“包含”及“含有”之类的变体应理解为暗示包括所述整数或步骤或群组，但不排除任何其他整数或步骤或一组整数或步骤。
下列多个示例代表发明人在实施本发明方面时采用的技术。应当理解，尽管这些技术是用于实施本发明的优选实施例的示例，但是根据本发明公开的内容，本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的精神及预期范围的情况下，可以对本发明进行多种修改。
多个示例：
实验步骤：
多种肽：使用芴基-甲氧基羰基化学合成肽、裂解并用三氟乙酸将侧链去除保护。通过高压液相色谱分析，多种肽的纯度＞95％；通过MALDI-TOF质谱法验证分子量。在生物学分析中，肽的两个末端都与D-Ala邻接以增强蛋白酶的抗性，并且与Cys连接以进行表面等离子体共振[9]。超抗原毒素与所述CD28同型二聚体界面的结合对于诱导介导致死性休克的细胞因子基因而言是相当重要的[9；12]。超级抗原通过增强B7-2/CD28共刺激受体相互作用来高度诱导炎症细胞因子[12]。
多种抗体：本发明使用小鼠单克隆抗CD28(MAB342，克隆37407)、抗CD3(克隆UCHT1)[9]、山羊多克隆抗CD28及抗B7-2(R&D Systems)、辣根过氧化物酶偶联山羊抗鼠IgG或驴抗羊(KPL)抗体。
诱导细胞因子基因表达：将人类PBMC在Ficoll Paque(Amersham)上分离，利用50毫升的RPMI 1640培养基洗涤两次、重悬于4x106细胞/毫升，并且在这个培养基中培养，所述培养基补充具有2％胎牛血清、2毫摩尔的谷氨酰胺、10毫摩尔的MEM非特异性氨基酸、100毫摩尔的丙酮酸钠、10毫摩尔的pH值为7.2的缓冲液、5x10-5摩尔的2-巯基乙醇、100U/毫升的青霉素、100微克/毫升的链霉素及5微克/毫升的制霉菌素。使用0.1微克/毫升的αCD3、2.5微克/毫升的αCD28或两者进行诱导。使用Quantikine ELISA试剂盒(R&D Systems)对分泌的细胞因子进行三重复的定量。
道德认证：涉及小鼠的实验在美国犹他州立大学获得AAALAC认可的实验动物研究中心进行，并得到机构动物护理及使用委员会的批准。
感染流感病毒的小鼠：将雌性BALB/c小鼠(18至20克，未治疗组n＝15，治疗组n＝10)(Charles River Laboratories，威尔明顿，马萨诸塞州)以鼻内施用的方式感染50至130微升的A型流感病毒。所述A型禽流感/H5N1病毒(H5N1/A/鸭子/MN/1525/81)由RobertWebster博士(田纳西州孟菲斯圣裘德儿童研究医院)提供。所述病毒在Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞中传代了一次，在小鼠中传代了三次[13]。利用ZnAL42及其他金属离子制剂以口服灌药处理的方式对感染A型H5N1及H1N1流感病毒的小鼠的影响(Antivir.Chem.Chemother.18，125-132)。将H5N1病毒以1：400的比例(LD100～1×105)稀释。适应大流行性A流感/H1N1病毒(H1N1/A/California/04/09)的所述小鼠由圣裘德儿童研究医院的Elena Govorkova博士提供。所述病毒首先在MDCK细胞中传代、然后在胚胎鸡卵中生长、通过9次连续传代以适应小鼠、在MDCK细胞中纯化噬菌斑(plaque)并在胚胎鸡卵中扩增。然后将所述病毒在MDCK细胞中生长以制备储备的病毒(Nguyen等人，2012年，金刚烷胺、奥司他韦及利巴韦林在体内联合治疗对敏感性及具有金刚烷胺抗性的流感病毒的疗效[14]。小鼠暴露于H1N1病毒的3LD50(103.39PFU)。通过21天监测生存及组织病理学。
治疗及给药：利用口服及腹膜内的方式给予磷酸盐缓冲盐水(PSS)作为阴性对照组。所有治疗均用于在病毒感染后的前五天，每天两次腹膜内半剂量注射，注射间隔为8小时。阳性对照组以腹膜内注射接收利巴韦林(每天75毫克/公斤)。治疗组以腹膜内注射接受不同剂量的肽p2TA、病毒神经氨酸酶抑制剂，每天口服1或3毫克/公斤的奥司他韦(Tamiflu，Roche)或p2TA及奥司他韦的组合。为了确定肺中的细胞因子及趋化因子水平，每组另外包括5只小鼠；在第6天，将来自尸检的每个肺的一片肺叶用50微克/毫升的庆大霉素在1毫升的最小基本培养基中均匀化，并在三次细胞因子分析(Quansys BioScience Inc.)之前，在三倍稀释液中冷冻多个样品。多个结果转换为肺的皮克/克。
动脉血的测定：从第5天开始，使用Biox 3800脉搏血氧仪(Ohmeda，Louisville，OH)，在放置用于肺部分析的小鼠上确定动脉血氧饱和度。使用耳探针附件，将探针放置在动物的大腿上。在30秒的稳定时间后读取读数[15]。
示例1：
CD28二聚体界面肽对H5N1禽流感致死性感染的保护作用
如上文所述，当前的H5N1感染治疗策略主要集中在神经氨酸酶抑制剂(例如：FDA批准的抗病毒药物奥司他韦)上，但所述病毒会迅速突变以产生抗药性。多种治疗旨在操纵宿主免疫系统以干扰及防止由病毒性病原体(例如：H5N1)衍生的抗原促炎性Th1细胞激活而引发的细胞因子风暴，以及同时针对病毒及宿主的联合治疗，所述联合治疗可能在控制及防止细胞因子风暴相关疾病方面具有更大的潜力。
因此，发明人研究了通过源自人类CD28的二聚体界面的短肽对超级抗原诱导的Th1细胞活化的抑制是否可以减少或防止由Th1细胞因子引起的细胞因子风暴，并且因此可以用于治疗及防止与细胞因子风暴有关的疾病。
本发明使用禽流感感染的致死小鼠模型[16]，本发明人测试了利用衍生自或结合至本文所述的CD28二聚体界面的一种肽来阻断病毒诱导的Th1细胞因子风暴是否能保护小鼠免于死亡。为此目的，利用在其两个末端邻接D-丙氨酸的人类CD28二聚体界面肽p2TA(由SEQ ID NO.7表示，在本文中也称为(D-A)-p2TA-(D-A))来治疗感染H5N1的小鼠，所述治疗持续五天。如图1A所示，在未经治疗的对照组中，死亡率为100％。在最低测试剂量(0.4微克)下，利用p2TA来治疗可以延迟死亡，但在9倍的高剂量(3.6微克)下，可在21天的监测时间内提供部分保护(30％存活)(图1A仅显示存活至第14天)。发明人还测试了当用FDA批准的抗病毒药物奥司他韦(剂量过低无法单独产生完全的保护效果)(此处也称为“次优剂量”或“次治疗剂量”)对小鼠进行治疗的保护效果，并且发现所述肽与奥司他韦具有协同作用：即使以最低剂量的p2TA，使用所述组合治疗的100％的小鼠也能存活21天。图1B中所示的血氧饱和度数据说明，即使在最低剂量下，用p2TA处理的小鼠的肺功能也有明显改善。对于未经治疗的动物，单独的肽可以防止所述参数的逐步下降。
发明人使用的奥司他韦的剂量通常应该仅产生10至30％的存活率，但是在这个实验中，存活率达到70％。这些数据清楚地表明，在H5N1感染中，无论所述肽单独使用或与抗病毒药物联用，阻断细胞因子风暴的多种肽具有减弱CD28信号传导的治疗潜力。
示例2：
通过CD28二聚体界面肽p2TA对致死性H1N1猪流感感染的保护作用
本发明还评估了p2TA肽对另一种流感病毒H1N1的抗病毒活性。利用鼻内施用致死剂量的流行性A流感H1N1病毒(H1N1/A/加利福尼亚04/09流感，3LD50)来感染小鼠，并在感染的BALB/c小鼠(18至20克，未治疗组(对照组)的n＝15，而治疗组的n＝10)中监测存活率。从第0天的时间0开始，如下所述在感染后0至4天进行治疗，每天两次、间隔8小时。腹膜内施用p2TA肽，每只小鼠施用5微克或10微克。口服施用的奥司他韦(Osel)的剂量为0.3毫克/公斤。利巴韦林剂作为阳性对照组，以75毫克/公斤进行腹膜内施用。
如图2A所示，仅从感染时到感染后第4天施用时，本身不是抗病毒剂的p2TA肽至少能够部分保护小鼠免受致命流行性的A型H1N1流感病毒的感染。p2TA的这种保护作用是剂量依赖性的：以5微克的剂量施用时，所述肽仅产生10％的存活率(1/10)，所述存活率超过在未经治疗的对照组中的0％的存活率(0/10)，而在10微克的剂量下，所述肽产生40％的存活率(4/10)(图2A)。
在这些小鼠中，所述肽还可以在经由感染引起的体重减轻中产生一部分的体重恢复，这也是剂量依赖性的，并且与用作阳性对照组的抗病毒药物利巴韦林在第8天后的体重恢复相互对应(图3A及图3B)。有趣地，到第17天，两组的体重都增加了近20％(图3A及图3B)。
令人惊讶地，所述肽p2TA与所述病毒神经氨酸酶抑制剂奥司他韦具有强烈的协同作用。如图2B所示，在一次独立的严重H1N1大流行性A流感病毒感染中，每只小鼠施用10微克剂量的p2TA肽并不能证明所述p2TA肽本身具有保护性。次优治疗剂量的奥司他韦(0.3毫克/公斤)仅产生30％的存活率。然而，p2TA(每只小鼠10微克)及奥司他韦(0.3毫克/公斤)的组合可显着提高存活率，达到80％(8/10)(图2B)。
除了上述示例1所述的结果外，p2TA保护小鼠免受致命性流感感染的能力还扩展到了流行性禽类IAV株(H5N1/鸭子/MN/1525/81流感，1：400稀释，LD100～1×105，鼻内施用)。如图2C及图2D所示，当以低剂量单独施用时，与未治疗的对照组相比，所述肽p2TA提供了中等的、剂量依赖性的存活时间的延长。
应当注意，即使在如图2C及图2D所示的没有保护作用的最低浓度下(每只小鼠0.4微克)，p2TA在死亡率快速增加(图4A)时，在第7天仍显着改善了感染小鼠的动脉血氧饱和度水平。因此，p2TA治疗对肺功能具有积极作用。
此外，p2TA的剂量太低而无法单独提供保护，即每只小鼠施用0.4微克的p2TA，p2TA与以次优治疗剂量(1毫克/公斤)施用的奥司他韦药剂具有强烈协同作用，所述剂量可以提供50％的存活率(单独施用时)，从致命的H5N1 IAV感染中获得100％(10/10)的存活率(图2D)(相对于1毫克/公斤的奥司他韦，p＜0.001)。如图4B所示，所述肽p2TA再次提高了被感染小鼠的动脉血氧饱和度水平(在实验的第6天确定)，在此方面，所述肽也明显与奥司他韦具有协同作用，达到了接近与所述抗病毒药物利巴韦林一起使用的效果(作为阳性对照组)。
应当注意，尽管每只小鼠以0.4微克的剂量施用时，p2TA没有保护作用并且不会降低H5N1病毒感染的死亡率(图2D)，但所述剂量足以显着降低肺中的炎性细胞因子水平，对于IFN-γ、IL-6、IL-1β、IL-1α及趋化因子单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)，如图4C所示。p2TA治疗均一地抑制了这些炎症介质的表达，但相比之下，并未显着降低抗炎细胞因子IL-10的水平(图4C及图4D)。确实地，不同于IFN-γ的诱导，IL-10的诱导不依赖于CD28的信号传导[9]。因此，如图4A及图4B所示，p2TA介导的肺功能改善与肺部炎症反应的减少有关。
SEQUENCE LISTING
<110> 耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展有限公司
<120> 用于治疗病毒感染的肽
<130> 2572744
<150> US 62/569,295
<151> 2017-10-06
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 202
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr Asp Asn
1 5 10 15
Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser Arg Glu
20 25 30
Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu Val Cys
35 40 45
Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser Lys Thr
50 55 60
Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr Phe Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys Lys Ile
85 90 95
Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly
100 105 110
Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe
115 120 125
Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val
130 135 140
Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp
145 150 155 160
Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met
165 170 175
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala
180 185 190
Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
195 200
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(8)
<223> p2TA核心序列
<400> 2
Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr Asp
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(9)
<223> p1TA核心序列
<400> 3
His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro
1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(8)
<223> p3TA核心序列
<400> 4
His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val
1 5
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(8)
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Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr
1 5
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<213> Artificial Sequence
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Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys
1 5
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X等同于D-Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> X等同于D-Ala
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Xaa Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr Asp Xaa
1 5 10
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<220>
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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Xaa His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Xaa
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Xaa His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Xaa
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Xaa Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Xaa
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
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<223> X等同于D-Ala
<400> 11
Xaa Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Xaa
1 5 10

Claims (47)

1.一种用于在需要治疗的一对象中治疗一病毒病原体感染的方法，其特征在于：所述方法包括步骤：向所述对象施用一治疗有效量的至少一种分离的肽，所述肽以特征为约0.1至30微摩尔的一KD值的一结合亲和力而特异性地结合至CD28的晶体同型二聚体界面；或施用一治疗有效量的具有相同的所述结合亲和力的所述肽的一功能性衍生物；或施用一治疗有效量的包括所述至少一种分离的肽或所述肽的功能性衍生物的一组合物，所述方法还选择性地包括步骤：向所述对象施用至少一种附加的抗病毒治疗剂。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述治疗用于控制及/或减弱及/或抑制由所述病毒病原体诱导的一细胞因子风暴。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述治疗用于防止所述病毒感染的至少一种症状的恶化、中止及/或缓解所述病毒感染的至少一种症状，或防止对所述对象或所述对象的一器官或组织造成源自于所述病毒感染或与所述所述病毒感染相关的损害。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述症状或损害是发烧(温度大于38℃)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、多器官功能障碍综合征(MODS)、全身性炎症反应综合征(SIRS)、低血压、心动过速、呼吸困难、缺血、组织灌注不足(尤其是涉及主要器官)、无法控制的出血、多系统器官衰竭(主要是由于缺氧或组织酸中毒引起)或严重的新陈代谢失调中的至少一种。
5.如权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于：所述治疗用于防止所述对象死亡。
6.如权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于：所述病毒病原体是正粘病毒科、丝状病毒科、黄病毒科、冠状病毒科或痘病毒科中任何一种的病毒。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述病毒病原体是正粘病毒科中的一种病毒，包括：A型流感病毒、B型流感病毒或C型流感病毒或其任何亚型或重组型中的任何一种。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述病毒病原体是A型禽流感病毒或其任何亚型或重组型。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述A型禽流感病毒具有H5、H7或H9亚型的血凝素成分。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述病毒病原体是A型猪流感病毒H1N1亚型。
11.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述病毒病原体是A型禽流感病毒H5N1亚型。
12.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述病毒病原体是所述丝状病毒科中的一种病毒，包括：马尔堡病毒(MARV)及埃博拉病毒(EBOV)；或所述病毒病原体是所述黄病毒科中的一种病毒，包括：寨卡病毒(ZIKV)、西尼罗河病毒(WNV)、登革热病毒(DENV)及黄热病毒(YFV)；或所述病毒病原体是所述冠状病毒科中的一种病毒，包括：严重急性呼吸系统综合症病毒(SARS-CoV)。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于：所述症状或损害是寨卡热、西尼罗河热、登革热或黄热中的任何一种。
14.如前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于：所述至少一种分离的肽是下述肽中的任何一种：由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列SPMLVAYD组成的肽，在本文中也称为p2TA核心序列；由SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列HVKGKHLCP组成的一种肽，在本文中也称为p1TA核心序列；由SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列HKGLDSAV组成的一种肽，在本文中也称为p3TA核心序列；由SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列YVNQTDIY组成的一种肽，在本文中也称为p4TA核心序列；由SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列SNGTIIHVK组成的一种肽，在本文中也称为p5TA核心序列；以及同样具有与所述CD28的结晶同二聚体界面的所述结合亲和力的所述肽的多种功能性衍生物；或所述肽的多种药学上可接受的盐类及酯类。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于：所述至少一种分离的肽是：
(a)与权利要求14所定义的一种肽具有至少80％同源的一种肽；
(b)如权利要求14所述的一种肽，且所述肽通过存在于SEQ ID NO.1的所述氨基酸序列的相应相邻位置中的1至3个连续的氨基酸残基而延伸；
(c)如权利要求14或在(a)或(b)中所定义的一种肽，且所述肽通过下述而在N末端及/或C末端延伸：
(i)通过在所述N端为一月桂基半胱氨酸，在所述C端为一半胱氨酸而延伸；或
(ii)通过一非天然存在或合成的氨基酸残基的一有机部分而延伸；或
(iii)通过相同的一个或多个疏水性氨基酸残基而延伸，所述疏水性氨基酸残基可以是天然存在的或合成的氨基酸残基；
(iv)通过一棕榈酰赖氨酸尾段而延伸，其中所述尾段在所述N末端处；或者
(d)权利要求15所定义的一个肽的一个二聚体或多聚体，或由(a)、(b)或(c)中任一项得到的所述肽的一个二聚体或多聚体；
其中(a)、(b)、(c)或(d)中任一项的所述得到的所述肽维持有以一结合亲和力与所述人类CD28同型二聚体界面特异性结合的能力，所述结合亲和力的特征为低于30微摩尔的KD值，更特别地为约0.1至约30微摩尔的KD值；并且维持有在一病毒病原体感染的治疗中达到一治疗效果的能力。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于：权利要求14的所述分离的肽利用D-丙氨酸在所述肽的N-末端及/或C-末端延伸。
17.如前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于：所述至少一种分离的肽具有：如SEQ ID NO.2所示的所述氨基酸序列SPMLVAYD，在本文中也称为p2TA核心序列；或如SEQ IDNO.7所示的所述氨基酸序列(D-Ala)-SPMLVAYD-(D-Ala)，在本文中也称为(D-Ala)-p2TA-(D-Ala)。
18.如前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于：所述方法还包括步骤：向所述对象施用一治疗有效量的至少一种附加的抗病毒治疗剂。
19.如前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于：在所述临床症状/损害的表现之前或之后，在暴露于所述病毒病原体后，将所述至少一种分离的肽及选择性使用的所述至少一种附加的抗病毒治疗剂施用于所述对象。
20.如前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于：所述附加的抗病毒治疗剂不是针对所述病毒病原体的一抗体。
21.如权利要求1至20任一项所述的方法，其特征在于：所述至少一种附加的抗病毒治疗剂是一病毒神经氨酸酶抑制剂、一病毒聚合酶抑制剂及一M2离子通道封阻剂中的任何一种。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于：所述神经氨酸酶抑制剂是奥司他韦或扎那米韦。
23.如前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于：将所述至少一种附加的抗病毒治疗剂以一次优的剂量或以一治疗剂量施用于所述对象。
24.如前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于：所述至少一种分离的肽或包括所述至少一种分离的肽的所述组合物或所述至少一种附加的抗病毒剂的每一个均通过选自于由下述所组成的群组中的一途径来施用于所述对象，所述群组包含：静脉、肌肉或腹腔施用；鞘内或皮下注射；口服、直肠内、鼻内、眼及局部施用。
25.如前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于：所述对象是一人类对象。
26.如前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于：所述分离的肽以所述对象的体重每公斤使用约0.05毫克至约0.5毫克的肽的一用量施用于所述人类对象。
27.如前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于：将所述至少一种分离的肽及所述至少一种附加的抗病毒治疗剂同时施用于所述对象。
28.如前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于：在不同时间点、在多次施用之间的不同间隔、以不同的治疗期及/或以任何施用顺序，来将所述至少一种分离的肽及所述至少一种附加的抗病毒治疗剂施用于所述对象。
29.如前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于：所述分离的肽或包括所述分离的肽的组合物及所述附加的抗病毒治疗剂中的每一种以一个或多个相同或不同的治疗期进行一周或多周的施用，所述治疗期为每天一次、每三天一次、每五天一次或每周一次施用所述分离的肽及所述附加的抗病毒剂中的每一种，其中所述治疗期是连续的，或彼此间隔有1天或几天或1周或几周的多个非治疗间隔。
30.如前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于：所述分离的肽或包括所述分离的肽的所述组合物及所述附加的抗病毒剂的中的每一种，在暴露于所述病毒后立即施用，或在暴露后约30分钟至约10天内施用。
31.如权利要求28至30任一项所述的方法，其特征在于：所述至少一种分离的肽与所述至少一种附加的抗病毒治疗剂的施用之间的所述间隔为约5分钟至约5小时。
32.如前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于：所述组合物包括药学上可接受的添加剂、载体、稀释剂及赋形剂中的至少一种。
33.一种将至少一种分离的肽，或具有相同的结合亲和力的所述肽的一功能性衍生物，或包括所述至少一种分离的肽或所述肽的功能性衍生物的一组合物应用于在需要治疗的一对象中治疗一病毒病原体感染的一方法中的用途，其特征在于：所述肽以特征为约0.1至30微摩尔的一KD值的一结合亲合力而特异性地结合至所述CD28的晶体同型二聚体界面，所述方法还选择性地包括：向所述对象施用至少一种附加的抗病毒治疗剂。
34.一种包括至少一种分离的肽的组合，其特征在于：所述组合包括：所述至少一种分离的肽或具有相同的结合亲和力的所述肽的一功能性衍生物，所述肽以特征为约0.1至30微摩尔的一KD值的一结合亲合力而特异性地结合至所述CD28的晶体同型二聚体界面；及至少一种附加的抗病毒治疗剂。
35.如权利要求34所述的组合，其特征在于：所述分离的肽为权利要求14至16中任一项所定义的肽。
36.如权利要求35所述的组合，其特征在于：所述分离的肽具有：如SEQ ID NO.2所示的所述氨基酸序列SPMLVAYD，在本文中也称为p2TA核心序列；或如SEQ ID NO.7所示的所述氨基酸序列(D-Ala)-SPMLVAYD-(D-Ala)，在本文中也称为(D-Ala)-p2TA-(D-Ala)。
37.如权利要求33至35任一项所述的组合，其特征在于：所述至少一种附加的抗病毒治疗剂不是针对所述病毒病原体的一抗体。
38.如权利要求34至37任一项所述的组合，其特征在于：所述附加的抗病毒治疗剂是一病毒神经氨酸酶抑制剂、一病毒聚合酶抑制剂或一M2离子通道封阻剂。
39.如权利要求38所述的组合，其特征在于：所述神经氨酸酶抑制剂是奥司他韦或扎那米韦。
40.如权利要求34至39任一项所述的组合，其特征在于：所述组合用于在需要治疗的一对象中治疗一病毒病原体感染。
41.一种用于在需要治疗的一对象中治疗一病毒病原体感染及/或其至少一种症状的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：
(a)至少一种分离的肽，所述分离的肽以特征为约0.1至30微摩尔的一KD值的一结合亲合力而特异性地结合至所述CD28的晶体同型二聚体界面，并且所述分离的肽选择性地包含在一组合物中，所述组合物还包括一药学上可接受的载体或稀释剂，选择性地为一第一剂量单位形式；
(b)一附加的抗病毒治疗剂，选择性地包含在一组合物中，所述组合物还包括一药学上可接受的载体或稀释剂，选择性地为一第二剂量单位形式；
(c)多个容器装置，用于共同或分别容纳所述第一剂量单位形式及所述第二剂量单位形式；
(d)多个使用说明；以及选择性地包含：
(e)多个装置，用以向所述对象施用所述至少一种分离的肽及所述至少一种附加的抗病毒治疗剂。
42.如权利要求41所述的试剂盒，其特征在于：所述分离的肽为权利要求14至16中任一项所定义的肽。
43.如权利要求41所述的试剂盒，其特征在于：所述分离的肽具有：如SEQ ID NO.2所示的所述氨基酸序列SPMLVAYD，在本文中也称为p2TA核心序列；或由SEQ ID NO.7所示的所述氨基酸序列(D-Ala)-SPMLVAYD-(D-Ala)，在本文中也称为(D-Ala)-p2TA-(D-Ala)。
44.如权利要求41至43任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述附加的抗病毒治疗剂不是针对所述病毒病原体的一抗体。
45.如权利要求41至44任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述附加的抗病毒治疗剂是一病毒神经氨酸酶抑制剂、一病毒聚合酶抑制剂或一M2离子通道阻滞剂。
46.如权利要求45所述的试剂盒，其特征在于：所述神经氨酸酶抑制剂是奥司他韦或扎那米韦。
47.如权利要求41至46任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒用于在需要治疗的一对象中治疗一病毒病原体感染。
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