CN111157719A - 一种检测dna片段含量的多通道检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测DNA片段含量的多通道检测方法，根据金纳米棒、磁珠和待测样品可形成稳定结构的特性，通过计算金纳米棒的比例关系确定待测杨样品中DNA的比例关系。本发明第一次将高光谱解码技术应用于金纳米棒的消光光谱的分解中，提出了基于高光谱解码技术解码金纳米棒消光光谱实现生物分子检测的方法，提高了金纳米棒作为编码材料应用于实际检测中的利用效率，实现了生物分子的多通道分析，有利于稀少样本的检测。

Description

一种检测DNA片段含量的多通道检测方法

技术领域

本发明涉及免疫学检测方法，尤其涉及一种新的生物分子含量检测试剂及方法。

背景技术

随着生命科学的发展，生物分子的检测和分析已成为生物医学领域不可或缺的一部分。通过定量和定性检测，可以实现生物分子的鉴定，从而完成疾病的预防和诊断。在实际应用中，通常需要同时检测和分析多种生物分子，这意味着多通道分析技术在实际检测中很重要。而近年来，许多研究人员不断努力为生物分子的检测和分析创造新的方法和技术，而新的检测和分析技术中金纳米粒子的应用就是其中重要的例子之一。

金纳米棒(AuNRs)是一种从几纳米到几百纳米的棒状金纳米粒子，具有相对稳定但非常丰富的化学和物理性质，局部表面等离子体共振(LSPR)作为其独特的光学特性，在特定波长的光下产生共振后可以使金属纳米颗粒在紫外-可见(UV-vis)光带中表现出强烈的光谱吸收。一般，金纳米棒在紫外-可见消光光谱中有两个峰：横向LSPR峰和纵向LSPR峰，随着金纳米棒长径比的不断变化，横向LSPR峰值位置基本保持不变，但纵向LSPR峰值位置则发生相应的变化。理论上，不同长径比的金纳米棒具有不同的纵向LSPR峰，若利用这一特点，可以将金纳米棒用作编码材料来检测生物分子。但是考虑到金纳米棒的半高宽比较宽，当不同长径比的金纳米棒作为编码材料混合时会发生光谱重叠，这限制了编码消光光谱在实际检测中的利用效率。

高光谱技术，起源于遥感领域，可以提供连续的光谱特征，已经应用于许多领域，其中高光谱解混是高光谱技术研究的重要一步，而在高光谱解码算法中，会假设不同的端元之间不会相互干扰，这与不同长径比的金纳米棒的消光光谱混合时互不影响特点一致。混合光谱是由不同的基本光谱线性组合得到，利用高光谱解混算法，可以实现分解混合光谱的目的。若考虑将高光谱解码算法与金纳米棒的LSPR特性组合，有望实现生物分子的多通道检测。

现有技术中，由于金纳米棒消光光谱的光谱较宽，利用金纳米棒的消光光谱作为编码元素实现生物分子检测的方法很少。高光谱解码算法并未应用于金纳米棒消光光谱的解码，高光谱解码算法结合目标生物分子、金纳米棒和磁珠形成的“三明治”结构用于生物分子检测也未得到过相应的报道与应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测DNA片段含量的多通道检测方法。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供：

一种用于检测DNA片段含量多通道检测方法的检测试剂，包括：偶联有单链核苷酸序列A的磁珠，其中，核苷酸序列A可与目标单链DNA一端的序列互补配对；偶联有单链核苷酸序列B的金纳米棒，其中，核苷酸序列B可与目标单链DNA另一端的序列互补配对。

偶联有单链核苷酸序列A的磁珠和偶联有单链核苷酸序列B的金纳米棒可以与目标单链结合成稳定结构。

当然，也可以根据实际的需要，选择其他具有特异性吸附能力的材料替代磁珠，以达到固定待测样品的作用。

在一些实例中，上述金纳米棒包括至少两种不同长径比的金纳米棒。

在一些实例中，上述不同长径比的金纳米棒上偶联有针对不同目标单链DNA的单链核苷酸序列。其目的在于区分不同目标单链DNA。

本发明的第二个方面，提供：

一种检测DNA片段含量的多通道检测方法，具体步骤为：

(1)取偶联有单链核苷酸序列A的磁珠和偶联有单链核苷酸序列B的金纳米棒，其中，核苷酸序列A可与目标单链DNA一端的序列互补配对，核苷酸序列B可与目标单链DNA另一端的序列互补配对，备用；上述目标单链DNA为待测样品双链DNA中的一条；

(2)将上述磁珠、金纳米棒和待测样品混合均匀，加热使双链DNA分离，冷却进行DNA杂交；当然，也可以根据实际的需要，选择其他方式分离双链DNA以及杂交手段。

在完全杂交后，磁珠、金纳米棒和待测样品可以形成稳定的“三明治”结构，不易脱落，以保证金纳米棒与样品在后续操作及计算中保持比例一致。

(3)分离磁珠，分离双链DNA，释放金纳米棒；

(4)基于释放的金纳米棒情况，确定待测样品中DNA的含量或比例。

在一些实例中，上述步骤(1)中金纳米棒探针包括至少两种不同长径比的金纳米棒，不同长径比的金纳米棒上偶联有针对不同目标单链DNA的单链核苷酸序列。当然，也可以根据实际的需要，调整不同长径比的金纳米棒的数量。

在一些实例中，上述步骤(4)中待测样品中DNA的含量比例的计算方式如下：

(a)基于金纳米棒的消光光谱，得到不同长径比金纳米棒比例关系；

(b)根据不同长径比金纳米棒比例关系计算待测样品中DNA含量或比例关系。

在一些实例中，上述计算方式中消光光谱检测方法为紫外-可见分光光度法。

在一些实例中，上述计算方式中消光光谱解码方式为高光谱解码算法。当然，也可以根据实际的需要，选择其他可行性替代算法。

在一些实例中，上述步骤(2)中待测样品选自DNA片段、血液样本、抗体中的至少一种。当然，也可以根据实际的需要，选择其他含有DNA的待测样品。

在一些实例中，上述步骤(3)中分离磁珠的方法为磁铁吸附。当然，也可以根据实际的需要，选择其他可替代分离方式。

本发明的有益效果是：

1.本发明第一次将高光谱解码技术应用于金纳米棒的消光光谱的分解中，提出了基于高光谱解码技术解码金纳米棒消光光谱实现生物分子检测的方法，提高了金纳米棒作为编码材料应用于实际检测中的利用效率。

2.本发明加入磁珠可以摒除了生物分子检测反应中未参与反应的金纳米棒，提高了检测准确率。

3.本发明不仅可以检测DNA分子，也可以检测其它生物分子，如抗体。

附图说明

图1(a)为两种长径比金纳米棒混合(混合比例3:1)测得的紫外可见消光光谱；

图1(b)为高光谱解码算法分解金纳米棒消光光谱图；

图2为2种长径比的金纳米棒以不同的比例混合后使用高光谱解码算法反解的光谱图；

图3(a)为AuNRs、包覆金膜的AuNRs和金纳米棒探针(AuNRs@Thiol-DNA)的归一化消光光谱；

图3(b)为AuNRs，包覆金膜的AuNRs和金纳米棒探针(AuNRs@Thiol-DNA)在水溶液中的zeta电位柱形图；

图3(c)为以HPV分子为目标分子的情况下的“三明治”结构的SEM图；

图3(d)为以HPV分子为目标分子的情况下“三明治”结构的表面信息；

图3(e)为以HBV分子为目标分子的情况下“三明治”结构的SEM图；

图3(f)为以HBV分子为目标分子的情况下“三明治”结构的表面信息；

图4为以HPV和HBV分子作为待测分子进行实验后的结果，(a)是金纳米棒探针的原始光谱，(b)是解码算法解码后的光谱图。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。

本实施例中用到的实验材料及试剂等如下：

仪器：紫外-可见分光光度计。

试剂：氯金酸和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)(Sigma-Aldrich)、硼氢化钠和十二烷基硫酸钠(大茂化学试剂厂)、硝酸银(国药集团)、抗坏血酸、N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐(阿拉丁)、羧基化磁珠(1μm)(EnrichingBiotechnologyLtd)、三(2-羧乙基)膦和乙醇胺(麦克林)、磷酸盐缓冲液(Solarbio)、氯化钠(天津致远)、DNA分子片段(上海生工)。

在本发明中所使用的DNA片段为HPV和HBV的片段，具体为：HPV：Targrt DNA5′-CCATAGATATACATTCTCTATTATCCACACCTGCATTTGCTGCATAAGCACTAGCATTTT CTGT-3′(SEQ ID NO1)。根据Targrt DNA设计探针分别为：Thiol-DNA5′-SH-(CH₂)₆-AAAAAAAAAAACAGAAAATGCTAGTGCTTAT-3′(SEQ ID NO 2)；Amino-DNA5′-ATAGAGAATGTATATCTATGGAAAAAAAAAA-NH₂-3′(SEQ ID NO 3)。

HBV:Targrt DNA5′-TTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTA-3′(SEQ ID NO 4)。根据Targrt DNA设计探针分别为：Thiol-DNA5′-SH-AAAAAAAAATACCACATCATCCAT-3′(SEQ ID NO5)；Amino-DNA5′-ATAACTGAAAGCCAAAAAAAAAAAA-NH₂-3′(SEQ ID NO 6)。

1.合成金纳米棒

制备金纳米棒种子溶液：向50mL的圆底烧瓶加入4mL 100mM CTAB溶液、40μL 24mM氯金酸溶液和24μL 100mM在冰水中新鲜配置的硼氢化钠溶液，搅拌90s，得到种子溶液。

在50mL圆底烧瓶中，以2min为间隔，依次加入20mL 0.2M的CTAB溶液、400μL 24mM氯金酸溶液、150μL 5M盐酸溶液以及50μL 40mM硝酸银溶液，之后加入160μL 0.1M抗坏血酸溶液，充分搅拌。然后将28μL种子溶液加入混合液中并搅拌30s，在30℃恒温箱中静置12h，得到金纳米棒溶液。

2.金纳米棒和巯基DNA片段偶联

取5mL金纳米棒溶液，加入10μL的0.05mM氯金酸溶液和10μL 0.1M抗坏血酸溶液，于室温下搅拌12h得到表面包覆一层金膜的金纳米棒。然后将200μL TCEP溶液(20mM)与30μL 100uM巯基-DNA混合并静置1h。将TCEP活化的巯基-DNA溶液加入到包覆一层金膜的金纳米棒悬浮液中并在室温下搅拌10h。此后，以30min的间隔滴加120μL老化盐溶液(10mM PBS、0.3M氯化钠和0.15M氯化镁)。将老化处理后的金纳米棒溶液以8000rpm离心12min，并重悬于0.01M PBS缓冲液中，得到金纳米棒探针。

3.磁珠与氨基-DNA的偶联

PBS溶液(10mM，PH＝6.8，含0.03％SDS)浸泡洗涤磁珠4次。将溶于PBS溶液中的氨基-DNA探针加入到磁珠溶液中并搅拌混合均匀，同时加入EDC(100μL，50mg/mL，溶于PBS溶液)和NHS(100μL，50mg/mL，溶于PBS溶液)，室温下搅拌30min，随后将50μL 50mM乙醇胺溶液(溶于10mM PBS，pH＝8.0，含有0.03％SDS)加入到得到的磁珠溶液中，得到磁珠探针。

4.捕获目标DNA片段

目标DNA待测样品为以0.43:1的比例混合的HPV和HBV片段。选择两种纵向LSPR峰为674nm和738nm的金纳米棒，巯基-DNA探针1(对应于HPV片段)和巯基-DNA探针2(对应于HBV片段)分别与两种长径比金纳米棒偶联，得到金纳米棒探针1和探针2。将氨基-DNA探针1(对应于HPV片段)和探针2(对应于HBV片段)与磁珠偶联，得到磁珠探针1和探针2。将磁珠探针和金纳米棒探针与目标DNA待测样本混合杂交，杂交反应在摇床上60℃缓慢震荡2h，得到“三明治”结构：磁珠-目标DNA-金纳米棒。引入磁铁收集磁珠，除去上清液后，用洗涤液(0.01M PBS，0.15M氯化钠和0.03％SDS)洗涤所得的磁珠数次，在最后一次洗涤完成后加入200μL超纯水分散聚集的磁珠，之后置于90℃水浴中30min，破坏DNA的双链结构，将金纳米棒从磁珠表面释放，再通过高光谱解码算法分解所得到的两种长径比的金纳米棒探针的混合溶液的消光光谱，反解得到两种金纳米棒探针之间的比例关系，根据目标DNA之间的比例关系和两种金纳米棒探针之间的比例关系一致的原则，得到目标DNA片段之间的比例关系。

5.结果分析

(1)可行性验证

由于本发明是第一次将高光谱解码算法应用于金纳米棒的消光光谱的分解之中，需要对此进行验证，以证明此方法的可行性。本发明中，研究人员首先合成不同长径比的金纳米棒，并按照不同的比例将其混合均匀后，利用紫外可见分光光度计，测得混合溶液的光谱，利用高光谱解码算法分解混合光谱后，得到如图2所示的结果。根据结果，发现算法解出的比例与研究人员预先设定的比例在一定的误差范围内基本一致(混合比例3:1，反解比例为2.92:1)，这表明了高光谱解码算法在分解金纳米棒的消光光谱中确实可行。

(2)准确性试验

在验证了算法的可行性之后，为了进一步验证解码算法的有效性，通过反复实验来验证解码算法的准确性。图2为以2种长径比的金纳米棒混合，并对混合溶液测得的混合光谱进行分解得到的结果。利用算法反解出的五种混合比例分别为0.96：1、1.24：1、1.40：1、1.89：1和3.95：1。此实验证明该方法可以应用于多通道分析，且解码算法可以识别不同长径比金纳米棒的强度比例的微小差异，可以使编码数量得到增加。

在验证高光谱解码算法在金纳米棒消光光谱分解中的可行性和准确性后，还进行了DNA分子的多通道检测实验。图3a和3b是对金纳米棒探针做的光谱表征和zeta电位表征，结果表明，在利用金纳米棒作为标记时，其可以偶联DNA片段，得到金纳米棒探针。而图3c～f是“三明治”结构的表征，表明通过待检DNA片段，可以将磁珠探针和金纳米棒探针结合到一起，而此时待检DNA片段和金纳米棒探针之间有一定的比例关系，以此可以作为利用金纳米棒的消光光谱实现DNA片段多通道分析的基础。

以HPV和HBV分子作为待测分子进行实验后的结果如图4所示。图4a是金纳米棒探针的原始消光光谱，图4b中的虚线为实验测得的混合光谱，利用解码算法解码后得到图4b中的两条实线，并计算出其比例为0.43:1，实验解码结果与预先设定的比例保持一致。因此，可以看出，在待检测样本是实验人员确定比例后混合目标DNA片段得到的情况下，通过本发明的DNA片段多通道分析分法得到的目标DNA片段的比例与实验人员预先混合的比例基本一致，这在一定程度上说明了本发明的可行性。实验结果表明，本发明可用于以后的实际样品检测，利用已知的探针去确定实际样品是否含有相配对的DNA片段以及确定实际样品中的含量，达到检测肿瘤等的目的。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下做出若干替代或明显变型，而且性能或用途相同，都应当视为属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 清华珠三角研究院

广州广华深启科技有限责任公司

<120> 一种检测DNA片段含量的多通道检测方法

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccatagatat acattctcta ttatccacac ctgcatttgc tgcataagca ctagcatttt 60

ctgt 64

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aaaaaaaaaa acagaaaatg ctagtgctta t 31

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atagagaatg tatatctatg gaaaaaaaaa a 31

<210> 4

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<212> DNA

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ttggctttca gttatatgga tgatgtggta 30

<210> 5

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<212> DNA

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aaaaaaaaat accacatcat ccat 24

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ataactgaaa gccaaaaaaa aaaaa 25

Claims (10)

1.一种用于检测DNA片段含量或比例的检测试剂，其特征在于，包括：

偶联有单链核苷酸序列A的磁珠，所述核苷酸序列A可与目标单链DNA一端的序列互补配对；

偶联有单链核苷酸序列B的金纳米棒，所述核苷酸序列B可与目标单链DNA另一端的序列互补配对。

2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述金纳米棒包括至少两种不同长径比的金纳米棒。

3.根据权利要求2所述的检测试剂，其特征在于，所述不同长径比的金纳米棒上偶联有针对不同目标单链DNA的单链核苷酸序列。

4.一种检测DNA片段含量或比例的方法，其特征在于，包括：

(1)取偶联有单链核苷酸序列A的磁珠和偶联有单链核苷酸序列B的金纳米棒，所述核苷酸序列A可与目标单链DNA一端的序列互补配对，所述核苷酸序列B可与目标单链DNA另一端的序列互补配对，备用；所述目标单链DNA为待测样品双链DNA中的一条；

(2)将所述磁珠、所述金纳米棒和待测样品混合均匀，加热使双链DNA分离，然后冷却使DNA杂交；

(3)分离磁珠，分离双链DNA，释放金纳米棒；

(4)基于释放的金纳米棒情况，确定待测样品中DNA的含量或比例。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述金纳米棒包括至少两种不同长径比的金纳米棒，不同长径比的金纳米棒上偶联有针对不同目标单链DNA的单链核苷酸序列B。

6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤(4)中所述待测样品中DNA的含量或比例的计算方式如下：

(1)基于金纳米棒的消光光谱，得到不同长径比金纳米棒比例关系；

(2)根据所得不同长径比金纳米棒比例关系，计算待测样品中不同DNA的含量或比例。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述消光光谱检测方法为紫外-可见分光光度法。

8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述消光光谱解码方式为高光谱解码算法。

9.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述待测样品选自DNA片段、血液样本、抗体中的至少一种。

10.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中所述分离磁珠的方法为磁铁吸附。

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