CN111122554B - 一种过氧化氢浓度的检测方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种过氧化氢浓度的检测方法和应用,所述检测方法包括利用手性半胱氨酸封端的二氧化钼进行检测。本发明提供的检测方法利用过氧化氢可以使手性半胱氨酸封端的二氧化钼的手性信号发生变化的原理实现了手性半胱氨酸封端的二氧化钼对过氧化氢浓度的检测。
Description
技术领域
本发明属于手性信号检测技术领域,涉及一种过氧化氢浓度的检测方法和应用。
背景技术
手性识别对映异构体中的手性分子非常重要,特别是在立体选择性合成、生物传感、生物成像、医药领域等方面。因此,开发有效识别和定量对映纯分子的有效方法已成为现代纳米材料设计的主要动机。
迄今为止,已经对表面修饰的金属纳米颗粒、半导体以及碳基纳米材料等进行了深入研究,以用于生物分子的手性识别。但是,当前的方法主要依靠通过表面修饰(例如化学键合和静电引力)来调节纳米材料表面和手性配体之间的相互作用。尽管已经取得了很大的进步,但是纳米材料的稳定性和手性识别的敏感性仍然不能令人满意。
具有吸收波长可调的配体诱导的手性过渡金属氧化物因其广泛的潜在应用而引起了广泛的兴趣,包括生物传感、高光谱成像和光检测等。例如,Kotov等公开的用手性配体(如脯氨酸,天冬氨酸和半胱氨酸)修饰的手性WO3-x和Co3O4纳米颗粒表现出很强的光学手性,当存在顺磁性时甚至会增强。在这种情况下,这种手性是由金属-配体电荷转移(MLCT)效应引起的,这是由于未配对电子从金属δ轨道过渡到基于配体的π和π*轨道而引起的,表明金属原子的价态对于此类原子非常重要。目前对于MLCT手性起源的研究仍然很少。
过氧化氢在临床医学和环境化学中是一种非常重要的活性中间体,其浓度的检测在化学分析、生物分析、医药、临床诊断、环境分析等领域有着重要的研究意义。目前测定过氧化氢的方法主要有极谱法、流动注射电导法、电分析法、荧光分析法、分光光度法以及化学发光等。其中电分析法由于简单,快速,灵敏,价廉而得到广泛地应用。过氧化氢一般是通过辣根过氧化物酶(HRP)催化过氧化氢在电极上反应产生电流响应来检测的,但是一般来说,HRP作为识别分子很难在电极上直接得失电子,通常需要在HRP和电极之间使用电子媒介体来转移电子,而且HRP不但价格较高,不容易长期保存,且容易失活从而导致活性降低,稳定性下降。
CN107884402A公开了一种过氧化氢一体化速测管及快速检测过氧化氢的方法,其中速测管中含有检测试剂,检测试剂由偏钒酸铵、浓盐酸、甘油组成。该专利申请虽然可以实现快速检测,但是灵敏度不够高。CN101055264A公开了一种过氧化氢的检测方法,步骤是(1)制备纳米级硫化亚铁:先将硫酸亚铁铵溶解于通氮除氧二次水中,再加入硫化物和表面活性剂的混合溶液,在超声条件下混合,反应结束后离心洗涤沉淀,真空干燥,即得到纳米级硫化亚铁样品;其中硫化物和表面活性剂剂的摩尔比为1:1,表面活性剂用量为0.014M;(2)检测准备:在玻碳电极上依次滴涂硫化亚铁纳米粒子的悬浊液和聚合物膜,晾干,老化;(3)过氧化氢的检测:在电解池里连续加入过氧化氢,进行电化学检测,记录其安培响应,即得到检测结果。虽然检测灵敏度较高,但是方法过于复杂。
因此,需要提供一种新的可以检测过氧化氢的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种过氧化氢浓度的检测方法和应用。本发明提供的检测方法利用过氧化氢可以使手性半胱氨酸封端的二氧化钼的手性信号发生变化的原理实现了手性半胱氨酸封端的二氧化钼对过氧化氢浓度的检测。
为达到此发明目的,本发明采用以下技术方案:
第一方面,本发明提供了一种过氧化氢浓度的检测方法,所述检测方法包括利用手性半胱氨酸封端的二氧化钼进行检测。
在本发明中,由于过氧化氢可以使二氧化钼的化学价发生变化,进而使手性半胱氨酸封端的二氧化钼的手性信号发生变化,因此,利用手性半胱氨酸封端的二氧化钼可以特异性的检测过氧化氢的浓度。
在本发明中,所述检测方法包括如下步骤:
(1)绘制标准曲线;
(2)将待测样品与手性半胱氨酸封端的二氧化钼混合,检测混合溶液的圆二色光谱;
(3)通过步骤(2)中得到的圆二色光谱的CD峰绝对值,对应标准曲线,得到待测样品中过氧化氢的浓度。
在本发明中,所述标准曲线以过氧化氢的浓度为横坐标,以手性半胱氨酸封端的二氧化钼的圆二色光谱的CD峰绝对值为纵坐标。
由于手性半胱氨酸封端的二氧化钼的圆二色光谱的CD峰变化值与过氧化氢浓度变化值呈线性关系,因此,标准曲线为一次线性关系,每一种过氧化氢的浓度均对应唯一的CD峰绝对值。
即测试待测样品中的手性半胱氨酸封端的二氧化钼的圆二色光谱的CD峰值,即可得到待测样品中过氧化氢的浓度。
优选地,所述标准曲线的绘制方法包括如下步骤:
(A)分别配置不同浓度的过氧化氢;
(B)将过氧化氢溶液与手性半胱氨酸封端的二氧化钼混合,利用圆二色光谱检测手性半胱氨酸封端的二氧化钼的CD峰绝对值;
(C)以过氧化氢的浓度为横坐标,以CD峰绝对值为纵坐标,绘制标准曲线。
优选地,步骤(A)所述过氧化氢溶液中过氧化氢的浓度为0-1M,例如1μM、5μM、10μM、30μM、50μM、100μM、200μM、400μM、600μM、800μM、1000μM、1mM、5mM、10mM、20mM、50mM、100mM、500mM、900mM等,优选200μM-100mM。
优选地,步骤(A)中至少配制3种以上(例如4种、5种、6种、7种、8种等)不同浓度的过氧化氢溶液,进一步优选5种以上。
步骤(B)中的混合溶液中,所述手性半胱氨酸封端的二氧化钼的浓度为0.1-100mmol/L,例如0.2mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、2mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、12mmol/L、20mmol/L、50mmol/L、80mmol/L、90mmol/L等,进一步优选10mmol/L。
优选地,步骤(B)所述混合的时间为10-120min,例如20min、30min、50min、100min、110min等,进一步优选30min。
优选地,所述手性半胱氨酸封端的二氧化钼包括L-半胱氨酸封端的二氧化钼和/或D-半胱氨酸封端的二氧化钼。
优选地,所述手性半胱氨酸封端的二氧化钼的制备方法如下:
利用手性半胱氨酸与三氧化钼反应,得到手性半胱氨酸封端的二氧化钼。
优选地,所述手性半胱氨酸和所述三氧化钼的质量比为(50-200):3,例如60:3、70:3、80:3、85:3、90:3、95:3、100:3、120:3、150:3、180:3等,进一步优选100:3。
优选地,所述反应包括超声5min后在避光反应下孵育1周。
优选地,所述三氧化钼以溶液的形式参与反应。
优选地,所述三氧化钼的制备方法包括如下步骤:
将二硫化钼与过氧化氢混合反应,得到所述三氧化钼。
优选地,所述手性半胱氨酸包括L-半胱氨酸和/或D-半胱氨酸。
优选地,所述手性半胱氨酸为L-半胱氨酸,所述手性半胱氨酸封端的二氧化钼为L-半胱氨酸封端的二氧化钼(L-Cys-MoO2 NP)。
优选地,所述手性半胱氨酸为D-半胱氨酸,所述手性半胱氨酸封端的二氧化钼为D-半胱氨酸封端的二氧化钼(D-Cys-MoO2)。
为了保证Cys-MoO2 NP在溶液中分散良好,水溶液中的样品均通过离心3分钟进行纯化,以8000rpm的转速除去沉淀物(如有沉淀),并在使用前保持在20℃。
第二方面,本发明提供了根据第一方面所述的过氧化氢浓度的检测方法在过氧化物酶或类过氧化物酶检测中的应用。
本发明利用了氧化剂可以使二氧化钼的化学价发生变化,进而使手性半胱氨酸封端的二氧化钼的手性信号发生变化的机理,因此可以应用于过氧化物酶或者类过氧化物酶等氧化剂的检测。
相对于现有技术,本发明具有以下有益效果:
(1)在本发明中,由于过氧化氢可以使二氧化钼的化学价发生变化,进而使手性半胱氨酸封端的二氧化钼的手性信号发生变化,因此,利用手性半胱氨酸封端的二氧化钼可以检测过氧化氢的浓度。
(2)由于手性半胱氨酸封端的二氧化钼的圆二色光谱的CD峰变化值与过氧化氢浓度变化值呈线性关系,因此可以利用待测样品中的手性半胱氨酸封端的二氧化钼的圆二色光谱的CD峰值得到待测样品中过氧化氢的浓度。
附图说明
图1是制备例1合成的D-Cys-MoO2 NP的HRTEM图。
图2是基于HRTEM的制备例1合成的D-Cys-MoO2 NP的粒径尺寸分布图。
图3是制备例1的圆二色光谱图。
图4是制备例1提供的样品的XPS能谱图。
图5为制备例1提供的样品的Mo 3d区域的高分辨率XPS光谱及拟合结果图。
图6是实施例1中拟合的标准曲线图。
图7是实施例2中拟合的标准曲线图。
图8是性能测试中对于过氧化氢的检测限的拟合曲线图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了,所述实施例仅仅是帮助理解本发明,不应视为对本发明的具体限制。
制备例1
一种D-半胱氨酸封端的二氧化钼纳米颗粒(D-Cys-MoO2 NP),制备方法如下:
(1)MoO3溶液的制备:
剧烈搅拌下,将0.8g原始黑色MoS2粉(5mmol)溶解在462.5mL去离子水中,之后,将37.5mL的30wt%的H2O2添加至所制备的溶液中;然后,黑色混合物变成透明的黄色,将溶液加热到80℃,除去过量的H2O2。待混合后的分散液变为透明,停止热处理。
(2)制备D-Cys-MoO2 NP:
将60mg D-半胱氨酸(D-Cys)添加到1.5mL(10mM)步骤(1)得到的MoO3溶液,将混合物超声处理5分钟,然后在黑暗中孵育1周,得到D-Cys-MoO2NP。
制备例2
一种L-半胱氨酸封端的二氧化钼纳米颗粒(L-Cys-MoO2 NP),制备方法参考制备例1,区别在于将D-Cys替换为L-Cys。
性能测试1
对制备例1-2提供的手性半胱氨酸封端的二氧化钼纳米颗粒进行性能测试,方法如下:
(1)粒径分布:利用高分辨透射电子显微镜(HRTEM)观察其粒径大小;
图1为制备例1合成的D-Cys-MoO2 NP的HRTEM图,图2是基于HRTEM的制备例1合成的D-Cys-MoO2 NP的粒径尺寸分布图,其观察并统计了100个单个纳米颗粒,由图1和图2可知,其手性半胱氨酸封端的二氧化钼纳米颗粒的粒径大小在24.9±0.8mm范围内。
(2)圆二色光谱测试:使用JASCO J-1500圆二色谱仪器进行圆二色光谱测试;
图3为制备例1的圆二色光谱图,由图可知,可以观测到很强的CD信号。分别记录了在376nm和580nm处的两个CD谱带,以下记作峰(I)和峰(II),配体的手性对映异构体显示相反的线形,而纯L-或D-半胱氨酸具有CD谱带在220nm处,表明本发明制备得到了手性半胱氨酸封端的二氧化钼纳米颗粒。
(3)样品元素分析:利用X射线光电子能谱(XPS)进行分析;
图4为制备例1提供的样品的XPS能谱图,图5为Mo 3d区域的高分辨率XPS光谱及拟合结果图,图4中证实了半胱氨酸以及钼和氧的存在,图5中对Mo 3d的高分辨率XPS光谱进行拟合时,Mo 3d5/2-Mo 3d3/2双峰的拆分能量约为3.15eV,固定面积比为3:2,拟合需要在钼的3d5/2峰上使用两个位置,一个用于Mo(IV),一个用于Mo(VI),分别在229.2eV和232.5eV位置,这与文献报道吻合;Mo(Mo VI)的这种较高氧化态的贡献(<5%)可能是由于MoO2纳米颗粒的部分表面氧化所致。根据XPS结果得出的Mo IV比率约为94.8%。既证明了二氧化钼的存在;226.9eV处的肩峰可能是由于嫁接在NP上的半胱氨酸配体的S 2s贡献,这也可以通过161.8eV的S 2p峰证实。
实施例1
一种过氧化氢浓度的检测方法如下:
(1)绘制标准曲线:
a.制备过氧化氢溶液,其中过氧化氢的浓度分别为200μM、400μM、600μM、800μM、1000μM、10mM和100mM。
b.将200μL D-Cys-MoO2溶液(10mM)添加到步骤(1)得到的溶液(1.8mL)中,将反应体系连续搅拌30min,利用圆二色光谱检测手性半胱氨酸封端的二氧化钼的CD峰绝对值。
c.以过氧化氢的浓度为横坐标,以CD峰绝对值为纵坐标,绘制标准曲线。
(2)将待测样品、D-Cys-MoO2和溶剂混合,检测混合溶液的圆二色光谱;
(3)通过步骤(2)中得到的圆二色光谱的CD峰绝对值,对应标准曲线,确定待测样品中过氧化氢的浓度。
图6为实施例1中拟合的标准曲线图,由图可知,相关系数R2=0.981>0.98,表明线性关系良好。
实施例2
与实施例1的区别在于,将D-Cys-MoO2替换为L-Cys-MoO2。
图7为实施例2中得到的标准曲线,由图可知,相关系数R2=0.994>0.99,表明线性关系良好。
性能测试2
对实施例1-2提供的检测方法进行验证,方法如下:
(1)准确性验证:
制备过氧化氢待测液,其中,过氧化氢浓度分别为350μM、555μM、983μM,然后利用实施例提供的检测方法进行检测,检测结果见表1:
表1
检测方法 | 实测值(μM) | 制备值(μM) | 误差/% |
实施例1 | 374.2 | 350 | 6.9% |
实施例1 | 552.2 | 555 | 0.5% |
实施例1 | 928.9 | 983 | 5.5% |
实施例2 | 371.4 | 350 | 6.1% |
实施例2 | 539.5 | 555 | 2.8% |
实施例2 | 973.2 | 983 | 1.0% |
由实施例和性能测试可知,本发明提供的检测方法可以准确的进行过氧化氢浓度的检测,检测准确度较高,误差较小,在7%以下。
(2)检测限(LOD):分别配制过氧化氢浓度为0μM、1μM、3μM、5μM、10μM、30μM和50μM的溶液,参照绘制标准曲线的方法进行测试
图8为检测限的拟合曲线图,由图可知,拟合曲线y=a+bx,a=1.708,b=0.553,R2=0.979;计算得到检测限(LOD)为0.176μM。
由实施例和性能测试可知,本发明提供的检测方法可以实现对过氧化氢浓度的检测,检测准确度、灵敏度高,对过氧化氢的检测限为0.176μM以下。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的过氧化氢浓度的检测方法和应用,但本发明并不局限于上述工艺步骤,即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (22)
1.一种过氧化氢浓度的检测方法,其特征在于,所述检测方法包括利用手性半胱氨酸封端的二氧化钼进行检测。
2.根据权利要求1所述的过氧化氢浓度的检测方法,其特征在于,所述检测方法包括如下步骤:
(1)绘制标准曲线;
(2)将待测样品与手性半胱氨酸封端的二氧化钼混合,检测混合溶液的圆二色光谱;
(3)通过步骤(2)中得到的圆二色光谱的CD峰绝对值,对应标准曲线,得到待测样品中过氧化氢的浓度。
3.根据权利要求2所述的过氧化氢浓度的检测方法,其特征在于,所述标准曲线以过氧化氢的浓度为横坐标,以手性半胱氨酸封端的二氧化钼的圆二色光谱的CD峰绝对值为纵坐标。
4.根据权利要求2或3所述的过氧化氢浓度的检测方法,其特征在于,所述标准曲线的绘制方法包括如下步骤:
(A)分别配置不同浓度的过氧化氢溶液;
(B)将过氧化氢溶液与手性半胱氨酸封端的二氧化钼混合,利用圆二色光谱检测手性半胱氨酸封端的二氧化钼的CD峰绝对值;
(C)以过氧化氢的浓度为横坐标,以CD峰绝对值为纵坐标,绘制标准曲线。
5.根据权利要求4所述的过氧化氢浓度的检测方法,其特征在于,步骤(A)所述过氧化氢溶液中过氧化氢的浓度为0-1M。
6.根据权利要求5所述的过氧化氢浓度的检测方法,其特征在于,所述过氧化氢溶液中过氧化氢的浓度为200μM-100mM。
7.根据权利要求4所述的过氧化氢浓度的检测方法,其特征在于,步骤(A)中配制3种以上不同浓度的过氧化氢溶液。
8.根据权利要求7所述的过氧化氢浓度的检测方法,其特征在于,步骤(A)中配制5种以上不同浓度的过氧化氢溶液。
9.根据权利要求4所述的过氧化氢浓度的检测方法,其特征在于,步骤(B)中的混合溶液中,所述手性半胱氨酸封端的二氧化钼的浓度为0.1-100mmol/L。
10.根据权利要求9所述的过氧化氢浓度的检测方法,其特征在于,步骤(B)中的混合溶液中,所述手性半胱氨酸封端的二氧化钼的浓度为10mmol/L。
11.根据权利要求4所述的过氧化氢浓度的检测方法,其特征在于,步骤(B)所述混合的时间为10-120min。
12.根据权利要求11所述的过氧化氢浓度的检测方法,其特征在于,步骤(B)所述混合的时间为30min。
13.根据权利要求1所述的过氧化氢浓度的检测方法,其特征在于,所述手性半胱氨酸封端的二氧化钼包括L-半胱氨酸封端的二氧化钼和/或D-半胱氨酸封端的二氧化钼。
14.根据权利要求1所述的过氧化氢浓度的检测方法,其特征在于,所述手性半胱氨酸封端的二氧化钼的制备方法如下:
利用手性半胱氨酸与三氧化钼反应,得到手性半胱氨酸封端的二氧化钼。
15.根据权利要求14所述的过氧化氢浓度的检测方法,其特征在于,所述手性半胱氨酸和所述三氧化钼的摩尔比为(50-200):3。
16.根据权利要求14所述的过氧化氢浓度的检测方法,其特征在于,所述反应包括超声5min后在避光反应下孵育1周。
17.根据权利要求14所述的过氧化氢浓度的检测方法,其特征在于,所述三氧化钼以溶液的形式参与反应。
18.根据权利要求14所述的过氧化氢浓度的检测方法,其特征在于,所述三氧化钼的制备方法包括如下步骤:
将二硫化钼与过氧化氢混合反应,得到所述三氧化钼。
19.根据权利要求14所述的过氧化氢浓度的检测方法,其特征在于,所述手性半胱氨酸包括L-半胱氨酸和/或D-半胱氨酸。
20.根据权利要求19所述的过氧化氢浓度的检测方法,其特征在于,所述手性半胱氨酸为L-半胱氨酸,所述手性半胱氨酸封端的二氧化钼为L-半胱氨酸封端的二氧化钼。
21.根据权利要求19所述的过氧化氢浓度的检测方法,其特征在于,所述手性半胱氨酸为D-半胱氨酸,所述手性半胱氨酸封端的二氧化钼为D-半胱氨酸封端的二氧化钼。
22.根据权利要求1-21中的任一项所述的过氧化氢浓度的检测方法在过氧化物酶或类过氧化物酶检测中的应用。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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