CN111118152A - 一种原位检测CHRNA5基因SNP rs16969968的方法 - Google Patents

一种原位检测CHRNA5基因SNP rs16969968的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种原位检测CHRNA5基因SNP rs16969968的方法。本发明提供了用于检测CHRNA5基因rs16969968位点的成套原位杂交探针，由cRNA原位杂交探针1和cRNA原位杂交探针2组成；所述cRNA原位杂交探针1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述cRNA原位杂交探针2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明实现了在原位检测CHRNA5基因的rs16969968位点不同基因型及突变状态的原位检测，以保留细胞位置、类型等关键细胞信息，为针对性干预CHRNA5表达提供依据。

Description

一种原位检测CHRNA5基因SNP rs16969968的方法
技术领域
本发明涉及生物技术及医学检测领域，具体涉及一种原位检测CHRNA5基因SNPrs16969968的方法。
背景技术
尼古丁乙酰胆碱受体(Nicotinic acetylcholine receptors，nAChRs)是一种配体门控离子通道蛋白，在神经系统和许多非神经元组织细胞中均表达，如皮肤、胰腺、正常人支气管上皮细胞和肺癌细胞等，研究表明nAChRs除了在突触传递中的作用外，还可能参与其他生物学过程。
近年来，全基因组关联研究(genome-wide association studies，GWAS)表明，染色体15q24-15q25.1上nAChRs簇的等位基因变异rs16969968与肺癌的发病风险有关。许多研究证实，含有CHRNA5/A3/B4的15q25.1染色体上的nAChR基因簇的突变与吸烟及肺癌密切相关，编码α5-nAChR的CHRNA5基因与肺癌的发生尤为有关。Sun H等研究表明抑制α5-nAChR的表达能够抑制A549细胞的迁移和侵袭，促进E-cadherin的表达。另外，α5-nAChR也被证实在胃癌中发挥作用，α5-nAChR在胃癌组织中表达上调，并且沉默α5-nAChR能够消除尼古丁对顺铂诱导的细胞凋亡的抑制作用。因此，α5-nAChR具有潜在的肿瘤治疗靶点作用，可能用于肿瘤的靶向治疗。Wu W等通过对2298例黑色素瘤病例和6654例对照的全基因组关联研究表明CHRNA5-A3-B4基因簇多态性与黑色素瘤的发展相关。
发明内容
本发明的目的是提供一种原位检测CHRNA5基因SNP rs16969968的方法。
第一方面，本发明要求保护一种用于检测CHRNA5基因rs16969968位点的成套原位杂交探针。
本发明所要求保护的用于检测CHRNA5基因rs16969968位点的成套原位杂交探针，由cRNA原位杂交探针1和cRNA原位杂交探针2组成；
所述cRNA原位杂交探针1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述cRNA原位杂交探针2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
CHRNA5基因，cholinergic receptor nicotinic alpha 5是指尼古丁乙酰胆碱受体alpha 5基因，其编码产物为a5-尼古丁乙酰胆碱受体(a5-nicotinic acetylcholinereceptor a5-nAChR)。该基因与肺癌等发展密切相关，是近年来肿瘤研究的热点之一。
其中，所述rs16969968位点的核苷酸为G或A。所述cRNA原位杂交探针1用于检测所述rs16969968位点为G的情况(野生型)；所述cRNA原位杂交探针2用于检测所述rs16969968位点为A的情况(突变型)。
进一步地，所述cRNA原位杂交探针1上带有标记分子A；所述cRNA原位杂交探针2上带有标记分子B；所述标记分子A和所述标记分子B不同。
在本发明的具体实施方式中，所述标记分子A为地高辛；所述标记分子B为生物素。
在本发明的具体实施方式中，所述标记分子A(地高辛)标记在所述cRNA原位杂交探针1的尿嘧啶核糖核苷酸上；所述标记分子B(生物素)标记在所述cRNA原位杂交探针2的尿嘧啶核糖核苷酸上。
第二方面，本发明要求保护含有前文所述成套原位杂交探针的试剂盒。
本发明所要求保护的试剂盒中还含有能够与所述标记分子A特异性结合且标记有荧光基团A的物质A，以及能够与所述标记分子B特异性结合且标记有荧光基团B的物质B；所述荧光基团A和所述荧光基团B不同。
进一步地，所述荧光基团A可为Fluorescein；所述荧光基团B可为Alexa 594。
在本发明的具体实施方式中，所述物质A为标记有Fluorescein的抗地高辛抗体；所述物质B为标记有Alexa 594的链霉亲和素。
第三方面，本发明要求保护前文所述成套原位杂交探针的制备方法。
本发明所要求保护的所述成套原位杂交探针的制备方法，可包括按照如下(A1)制备所述cRNA原位杂交探针1的步骤和按照如下(A2)制备所述cRNA原位杂交探针2的步骤；
(A1)将SEQ ID No.3所示的核苷酸序列插入到pBluescript SK(+)质粒的多克隆位点处(如HindIII/EcoRI)，得到重组质粒；将所述重组质粒以HindIII酶切进行线性化处理，得到线性化质粒；以所述线性化质粒为模板，利用T3 RNA聚合酶进行体外转录，其中dUTP经所述标记分子A标记，所得标记序列即为所述cRNA原位杂交探针1；
(A2)将SEQ ID No.4所示的核苷酸序列插入到pBluescript SK(+)质粒的多克隆位点处(如HindIII/EcoRI)，得到重组质粒；将所述重组质粒以HindIII酶切进行线性化处理，得到线性化质粒；以所述线性化质粒为模板，利用T3 RNA聚合酶进行体外转录，其中dUTP经所述标记分子B标记，所得标记序列即为所述cRNA原位杂交探针2。
第四方面，本发明要求保护前文所述的成套原位杂交探针或所述的试剂盒在荧光原位杂交检测CHRNA5基因rs16969968位点中的应用。
进一步地，所述应用可为非疾病诊断治疗性应用。
第五方面，本发明要求保护一种原位检测CHRNA5基因rs16969968位点的方法。
本发明所要求保护的原位检测CHRNA5基因rs16969968位点的方法，可包括如下步骤：
(B1)用前文所述的成套原位杂交探针或所述的试剂盒对待测组织切片进行荧光原位杂交；
(B2)根据杂交结果按照如下确定所述待测组织切片上CHRNA5基因rs16969968位点的SNP状态：仅仅显示所述荧光基团A所发荧光的所述待测组织切片，其对应CHRNA5基因rs16969968位点为G的纯合型；仅仅显示所述荧光基团B所发荧光的所述待测组织切片，其对应CHRNA5基因rs16969968位点为A的纯合型；同时显示所述荧光基团A所发荧光和所述荧光基团B所发荧光的所述待测组织切片，其对应CHRNA5基因rs16969968位点为G和A的杂合型。
进一步地，所述方法可为非疾病诊断治疗性方法。
本发明的有益效果是：本发明对病理组织或动物模型组织，通过不同荧光标记的cRNA探针与组织中CHRNA5基因的mRNA发生特异性的结合，加入荧光抗体，方便、准确的观察到组织中CHRNA5基因mRNA不同核酸的变化。本发明使用的CHRNA5的探针序列，对CHRNA5SNP的显示有明确的特异性，实现了对CHRNA5基因SNP状态(WT，杂合突变，纯杂突变)的显示作用。
本发明实现了在原位检测CHRNA5基因的rs16969968位点不同基因型及突变状态的原位检测，以保留细胞位置、类型等关键细胞信息，为针对性干预CHRNA5表达提供依据。
附图说明
图1为荧光原位杂交检测黑素瘤组织和肺癌组织中CHRNA5基因rs16969968位点状态。A为黑素瘤组织；B为肺癌组织。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、荧光原位杂交的CHRNA5基因的cRNA原位杂交探针的设计与制备
一、用于检测CHRNA5基因rs16969968位点的cRNA原位杂交探针的设计
根据CHRNA5基因的Genebank序列，设计特异性针对CHRNA5基因rs16969968位点的cRNA原位杂交探针。CHRNA5基因rs16969968位点的核苷酸有G和A两种情况，G为野生型，A为突变型。
用于检测CHRNA5基因rs16969968位点野生型G的cRNA原位杂交探针命名为WT-cRNA探针；其对应的模板序列称为WT序列。
WT序列：
Figure BDA0002348778310000041
Figure BDA0002348778310000042
WT-cRNA探针：(U用地高辛DIG标记)
Figure BDA0002348778310000043
Figure BDA0002348778310000044
用于检测CHRNA5基因rs16969968位点突变型A的cRNA原位杂交探针命名为SNP-cRNA探针；其对应的模板序列称为SNP序列。
SNP序列：
Figure BDA0002348778310000045
Figure BDA0002348778310000046
SNP-cRNA探针：(U用生物素biotin标记)
Figure BDA0002348778310000047
Figure BDA0002348778310000048
二、用于检测CHRNA5基因rs16969968位点的cRNA原位杂交探针的制备
1、构建用于制备检测CHRNA5基因rs16969968位点的cRNA原位杂交探针的探针质粒，全基因合成探针模版序列(SEQ ID No.3或SEQ ID No.4)，然后将其连入pBluescriptSK(+)质粒的酶切位点HindIII/EcoRI处，得到重组质粒。
其中，在pBluescript SK(+)质粒的酶切位点HindIII/EcoRI处插入SEQ ID No.3所示DNA片段的重组质粒命名为pBluescript SK-WT；在pBluescript SK(+)质粒的酶切位点HindIII/EcoRI处插入SEQ ID No.4所示DNA片段的重组质粒命名为pBluescript SK-SNP。
将探针质粒pBluescript SK-WT和pBluescript SK-SNP分别转化细菌后，细菌培养后进行扩大培养，提取质粒。
2、用限制性内切酶HindIII将两种探针质粒(pBluescript SK-WT和pBluescriptSK-SNP)分别进行线性化处理，得到线性化质粒。然后以线性化质粒为模板，利用T3 RNA聚合酶进行体外转录，其中dUTP经地高辛(对应pBluescript SK-WT线性化质粒)或生物素(对应pBluescript SK-SNP线性化质粒)标记，所得标记序列即为用于检测模板序列(SEQ IDNo.3或SEQ ID No.4)的dRNA原位杂交探针(SEQ ID No.1或SEQ ID No.2，也称为反义探针)。
用限制性内切酶EcoRI将两种探针质粒(pBluescript SK-WT和pBluescript SK-SNP)分别进行线性化处理，得到线性化质粒。然后以线性化质粒为模板，利用T7RNA聚合酶进行体外转录，其中dUTP经地高辛(对应pBluescript SK-WT线性化质粒)或生物素(对应pBluescript SK-SNP线性化质粒)标记，所得标记序列为正义探针(SEQ ID No.1的反向互补序列或SEQ ID No.2的反向互补序列)。正义探针为反义探针的对照。
实施例2、荧光原位杂交检测CHRNA5基因rs16969968位点
供试材料：已知CHRNA5基因rs16969968位点为GG纯合型(野生)的黑素瘤组织；已知CHRNA5基因rs16969968位点为AA纯合型(纯合突变)的肺癌组织。相关组织的CHRNA5基因rs16969968位点基因型经预先反转录PCR测序验证过。
按照如下步骤对供试组织进行荧光原位杂交检测CHRNA5基因rs16969968位点的状态：
1、取材并固定包埋组织及切片；
取材及固定的方式：将肿瘤组织切成2mm×2mm见方小块，用4％多聚甲醛固定24h后，将组织转移并浸没于70％酒精置于-20℃存放。
2、组织石蜡包埋方法：
(l)将4％多聚甲醛固定的组织按以下顺序，上行脱水：70％酒精——80％酒精——95％酒精——95％酒精——100％酒精——100％酒精，10分钟每级；
(2)再按以下顺序进行包埋：二甲苯：石蜡(2:1)——二甲苯:石蜡(l:l)——石蜡I——石蜡II——石蜡III，20分钟每级，浸蜡包埋(石蜡溶点为55℃)；
(3)包埋组织切片，厚度为4-6微米；
3、原位杂交及观察
(l)将6微米组织切片分为实验组、正义对照组、空白对照组。
(2)新鲜的二甲苯脱蜡，20min。
(3)组织切片依次经过梯度酒精100％、95％、80％、70％、50％、30％各5min，DEPC水2次，每次5min。
(4)将组织切片在PBS(pH7.4，DEPC水配制)中孵育2min。
(5)在含0.3％TritonX-100的PBS中孵育15min；PBS洗涤2min。
(6)在10μg/ml无RNase的蛋白激酶K的TE溶液中，37℃培育15-30min；以增加切片的通透性。在含100mM甘氨酸的PBS中培育2×5min。PBS清洗2×5min。
(7)4％多聚甲醛的PBS溶液于4℃后固定组织片5min。
(8)PBS清洗组织片2×5min。
(9)切片置于新配制的含有025％(v/v)乙酸酐(Aceticanhydride)的0.1mM三乙醇胺(Triethanolamine)缓冲液(pH8.0)的容器中，震荡孵育2min，以进行乙酰化。
(10)在预杂交液中，37℃孵育1-2h。
(11)去除预杂交液，并在每张切片上铺杂交缓冲液。
(12)玻片上覆上一张硅化盖玻片，42℃的湿盒中孵育过夜(两种探针1:1摩尔浓度很好)。
(13)弃去杂交液，用4×SSC42℃震荡洗涤15-30min。
(14)37℃分别用2×SSC,l×SSC震荡清洗组织片3×5min。
(15)在含有20μg/ml RNaseA的NTE缓冲液中消化清除未结合的探针30min
(16)在52℃在含50％甲酞胺的2×SSC液中震荡清洗3×5min。
(17)37℃分别用大量2×SSC，1×SSC液中震荡清洗15min。
(18)用大量的0.1×SSC在37℃震荡清洗组织片20min。
(19)用摇床在缓冲液1(配方：100mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl)中清洗组织片2×5min。
(20)以封闭液l(配方：0.1％体积百分含量TrionX-100，2％正常绵羊血清，溶于上述缓冲液1)覆盖组织片30min。
(21)弃去封闭液，用抗体液1(配方：上述封闭液1加入1/1000体积的Fluorescein-anti-DIG-antibody(Sigma，货号11207741910，绿色荧光)和1/1000体积的Alexa594-avidin(Thermo，S11227，红色荧光))覆盖经封闭后的组织片2h。
(22)在缓冲液2(配方：100mM Tris-HCl，pH7.5，100mM NaCl)中孵育20min。
(23)在缓冲液3(配方：100mM Tris-HCl，pH9.5，150mM NaCl)中孵育20min。
(24)将上述切片用PBS室温洗涤3次，每次5min；
(25)使用荧光封片剂将上述组织切片封片，荧光显微镜下观察。
结果如图1所示，对于黑素瘤组织，用于检测SEQ ID No.3的cRNA原位杂交探针(SEQ ID No.1，反义探针)具有明显的绿色荧光信号，无红色荧光信号；对于肺癌组织用于检测SEQ ID No.4的cRNA原位杂交探针(SEQ ID No.2，反义探针)具有明显的红色荧光信号，无绿色荧光信号。而对应的正义探针均无荧光检测信号。以上结果说明，本发明所提供的用于检测CHRNA5基因rs16969968位点的cRNA原位杂交探针(SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2)对CHRNA5 SNP的显示有明确的特异性，实现了对CHRNA5基因SNP状态(WT，杂合突变，纯杂突变)的显示作用。
本发明实现了在原位检测CHRNA5基因的rs16969968位点不同基因型及突变状态的原位检测，以保留细胞位置、类型等关键细胞信息，为针对性干预CHRNA5表达提供依据。
序列表
<110> 山东第一医科大学（山东省医学科学院）
<120> 一种原位检测CHRNA5基因SNP rs16969968的方法
<130> GNCLN1902004
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 62
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
cuuguaaugu agcgaauaga aucgagcgca gcuuccaaug uguuucuaga agauuuuggu 60
cc 62
<210> 2
<211> 62
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
cuuguaaugu agcgaauaga auugagcgca gcuuccaaug uguuucuaga agauuuuggu 60
cc 62
<210> 3
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
ggaccaaaat cttctagaaa cacattggaa gctgcgctcg attctattcg ctacattaca 60
ag 62
<210> 4
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
ggaccaaaat cttctagaaa cacattggaa gctgcgctca attctattcg ctacattaca 60
ag 62

Claims (10)

1.用于检测CHRNA5基因rs16969968位点的成套原位杂交探针，由cRNA原位杂交探针1和cRNA原位杂交探针2组成；
所述cRNA原位杂交探针1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述cRNA原位杂交探针2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.根据权利要求1所述的成套原位杂交探针，其特征在于：所述cRNA原位杂交探针1上带有标记分子A；所述cRNA原位杂交探针2上带有标记分子B；所述标记分子A和所述标记分子B不同。
3.根据权利要求2所述的成套原位杂交探针，其特征在于：所述标记分子A为地高辛；所述标记分子B为生物素。
4.根据权利要求2或3所述的成套原位杂交探针，其特征在于：所述标记分子A标记在所述cRNA原位杂交探针1的尿嘧啶核糖核苷酸上；所述标记分子B标记在所述cRNA原位杂交探针2的尿嘧啶核糖核苷酸上。
5.含有权利要求1-4中任一所述的成套原位杂交探针的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有能够与所述标记分子A特异性结合且标记有荧光基团A的物质A，以及能够与所述标记分子B特异性结合且标记有荧光基团B的物质B；所述荧光基团A和所述荧光基团B不同。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述荧光基团A为Fluorescein；所述荧光基团B为Alexa 594。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述物质A为标记有Fluorescein的抗地高辛抗体；所述物质B为标记有Alexa 594的链霉亲和素。
8.权利要求1-4中任一所述成套原位杂交探针的制备方法，包括按照如下(A1)制备所述cRNA原位杂交探针1的步骤和按照如下(A2)制备所述cRNA原位杂交探针2的步骤；
(A1)将SEQ ID No.3所示的核苷酸序列插入到pBluescript SK(+)质粒的多克隆位点处，得到重组质粒；将所述重组质粒以HindIII酶切进行线性化处理，得到线性化质粒；以所述线性化质粒为模板，利用T3 RNA聚合酶进行体外转录，其中dUTP经所述标记分子A标记，所得标记序列即为所述cRNA原位杂交探针1；
(A2)将SEQ ID No.4所示的核苷酸序列插入到pBluescript SK(+)质粒的多克隆位点处，得到重组质粒；将所述重组质粒以HindIII酶切进行线性化处理，得到线性化质粒；以所述线性化质粒为模板，利用T3 RNA聚合酶进行体外转录，其中dUTP经所述标记分子B标记，所得标记序列即为所述cRNA原位杂交探针2。
9.权利要求1-4中任一所述的成套原位杂交探针或权利要求5-7中任一所述的试剂盒在荧光原位杂交检测CHRNA5基因rs16969968位点中的应用。
10.一种原位检测CHRNA5基因rs16969968位点的方法，包括如下步骤：
(B1)用权利要求1-4中任一所述的成套原位杂交探针或权利要求5-7中任一所述的试剂盒对待测组织切片进行荧光原位杂交；
(B2)根据杂交结果按照如下确定所述待测组织切片上CHRNA5基因rs16969968位点的SNP状态：仅仅显示所述荧光基团A所发荧光的所述待测组织切片，其对应CHRNA5基因rs16969968位点为G的纯合型；仅仅显示所述荧光基团B所发荧光的所述待测组织切片，其对应CHRNA5基因rs16969968位点为A的纯合型；同时显示所述荧光基团A所发荧光和所述荧光基团B所发荧光的所述待测组织切片，其对应CHRNA5基因rs16969968位点为G和A的杂合型。
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