CN111117860A - 一种基于光纤微光手的细胞微手术刀及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供的是一种基于光纤微光手的细胞微手术刀及其制备方法，其由多芯光纤微光手和埋附于光纤端面的微球透镜组成。其中多芯光纤微光手能稳定捕获目标细胞，并且可以旋转调整捕获细胞的姿态；多芯光纤的端面中心位置刻蚀有微槽，微槽内粘附有一微球透镜，中间纤芯的光束经过微球透镜压缩输出，形成局部能量密度很高的光刀，作用于被捕获细胞。本发明可用于单细胞的捕获操纵，定位手术，包括单细胞的穿孔、单个细胞器的摘除，多细胞的融合等操作。可广泛用于单细胞水平的生命科学研究领域。

Description

一种基于光纤微光手的细胞微手术刀及其制备方法

(一)技术领域

本发明涉及的是一种基于光纤微光手的细胞微手术刀及其制备方法，可用于单细胞的捕获操纵，定位手术，包括单细胞的穿孔、单个细胞器的摘除，多细胞的融合等操作，属于单细胞操纵技术领域。

(二)背景技术

现代生命科学的发展在很大程度上依赖于对活细胞的加工和操纵,比如切除细胞内的某些特定蛋白或细胞器等。激光细胞微手术是一个强有力的工具,近年来在细胞微手术精度控制方面取得很大的进展,并出现了一门新学科激光细胞生物学。细胞本身的体积小,直径只有几个微米到十几微米,细胞内部的结构则更加精细复杂,所以在揭示生命功能的过程中,借助于现代化的研究工具成为不可缺少的手段。激光由于具有强度高,方向性和单色性好等优点,经过透镜聚焦后可形成功率密度高而光斑直径仅为微米量级的微光束,利用激光微光束可以对细胞进行俘获、打孔、融合、切段、转移和移植等操作,在细胞生物学的研究中形成了激光光镊术、激光显微照射术、激光细胞融合术以及激光细胞打孔术等激光微光束技术。

目前，针对细胞手术操作大多基于传统显微镜结构，利用空间光镊捕获待操作细胞，结合物镜压缩的微米量级高能光束，对捕获细胞进行穿孔、融合等操作。但是空间光系统普遍存在体积大，灵活性低的缺点。

(三)发明内容

本发明的目的在于提供一种基于光纤微光手的细胞微手术刀及其制备方法，由于采用的是全光纤结构，使得本发明在单细胞操纵及手术上具有极高的灵活性，能够实现细胞的捕获、旋转、定点穿孔、细胞器清除、细胞融合等功能。

本发明的目的是这样实现的：

一种基于光纤微光手的细胞微手术刀，它由多芯光纤微光手和埋附于光纤端面的微球透镜组成。其中多芯光纤具有圆对称分布周边纤芯和中间纤芯，光纤端具有对称的圆锥台结构，使得周边纤芯内传输的捕获光束聚焦，在光纤的轴向上形成一个微光手，稳定捕获目标细胞，并且可以旋转调整捕获细胞的姿态；多芯光纤的端面中心位置刻蚀有微槽，微槽内粘附有一微球透镜，中间纤芯的光束经过微球透镜压缩输出，形成局部能量密度很高的手术光刀，作用于被捕获细胞。

下面从多芯光纤微光手的特征、功能和手术光刀的特征、功能两个方面对本发明特征结构做出说明：

(1)多芯光纤微光手的特征和功能：

所述的多芯光纤的纤芯数量应大于等于三，并且其中一个纤芯位于光纤中心，其余纤芯同轴对称分布。

多芯光纤端圆锥台结构通过精密研磨加工而成，当多芯光纤周边纤芯内的捕获光束在圆锥台结构的斜面处满足全反射条件，反射并在端面外汇聚时，可不镀制反射金属膜；当多芯光纤周边纤芯内的光束在圆锥台结构的斜面处不满足全反射条件时，可镀制一层反射金属膜，反射并汇聚周边纤芯内的捕获光束。

可以通过调整光纤端圆锥台的锥台底角、锥台高度等参数，来调整微光手的捕获点与光纤端面的距离。

多芯光纤微光手可通过改变每个周边纤芯内的捕获光束的功率大小，来任意旋转被捕获细胞，调整细胞的姿态。

多芯光纤微光手捕获或操纵的细胞可以是单细胞，也可以是多个细胞组成的细胞群。

(2)手术光刀的特征和功能：

所述的手术光刀是指在多芯光纤端面的中间位置刻有凹槽，里面埋附有一个微球透镜，能够实现中间纤芯光束的压缩，实现高能量密度、微纳尺寸的光刀。

凹槽内的微球透镜可以通过低折射率胶水粘附于凹槽内，也可通过静电吸附的方法附着于凹槽内。

微球透镜的折射率应大于多芯光纤纤芯折射率，其折射率分布可以是均匀的，也可以是梯度变化的。

多芯光纤的中间芯可以是单模纤芯，传输单模光束，也可以是多模纤芯，传输多模光束，还可以是环形纤芯，传输环形光束。

多芯光纤中间芯传输的光可以是连续光，也可以是脉冲光。

所述的捕获细胞可以是单个的细胞，通过手术光刀实现细胞定点穿孔、细胞器清除等功能，也可以是多个细胞群，通过手术光刀实现细胞融合的作用。

一种基于光纤微光手的细胞微手术刀的制备方法，具体步骤为：

步骤1：取一根多芯光纤，切割平整，在其端面刻蚀一个凹槽；

步骤2：在凹槽内放置一颗微球透镜，使用低折射率胶水固化微球透镜于凹槽中心；

步骤3：端面精密研磨抛光，去除多余的胶层，使多芯光纤端面平整；

步骤4：精密研磨光纤端，制备对称的反射圆锥台结构，并抛光、超声清洗、氮气吹干后备用。

本发明至少具备以下独特而显著的优点：

(1)整个细胞手术刀为全光纤结构，实现了小巧灵活的目的，这是因为光纤具有一百多微米的直径，占用空间小，并且柔韧性好，可以任意弯曲。

(2)光纤端的微光手结构不但能实现细胞的捕获，还能实现细胞的任意旋转，实现精确的细胞手术定位。

(3)可以针对不同大小、种类的细胞，通过调节圆锥台结构参数调节光手捕获点距离光纤端面的位置，还可以通过调整凹槽内的微球透镜的折射率调整手术光刀的大小、轴向位置等参数，具有高精准、低创伤手术的特点。

(4)微球透镜的能够实现光束压缩，使光束的特征尺寸突破衍射极限，实现纳米量级的空间操作分辨率，有利于高精度的、低创伤的细胞手术。

(四)附图说明

图1所示的是七芯光纤端面示意图。

图2所示的是光纤端的对称圆锥台结构，其中(a)为研磨得到的圆锥台结构，(b)为优化的弧形圆锥台结构。

图3为基于七芯光纤微光手的细胞微手术刀的系统图。

图4为七芯光纤微光手对单细胞捕获、姿态调整操作原理示意图。

图5为七芯光纤微光手用于微手术刀的原理示意图。

图6是单细胞姿态调整，多点精确定位手术示意图。

图7是多细胞融合原理示意图。

图8是直径为10um，折射率为1.6的微球透镜对手术光束的压缩效果仿真结果图。

图9是直径为10um，折射率为1.8的微球透镜对手术光束的压缩效果仿真结果图。

图10是直径为10um，折射率为1.6-1.8径向高斯梯度变化的微球透镜对手术光束的压缩效果仿真结果图。

图11是直径为10um，折射率为2.5的微球透镜对手术光束的压缩效果仿真结果图。

图12是基于光纤微光手的细胞微手术刀的制备流程图。

(五)具体实施方式

下面结合附图和具体的实施例来进一步阐述本发明。

实施例1：光纤微光手具备的强大的细胞姿态调整功能。

本实施例采用七芯光纤对本发明进行详细具体的说明，如图1所示的是七芯光纤1的端面示意图。该光纤具有1个中间纤芯和6个同轴环状分布的周边纤芯。为了实现周边纤芯内传输的捕获光能够反射汇聚，形成一个捕获势阱，需要在光纤端通过精密研磨的方法制备反射圆锥台结构，如图2所示，圆锥台结构可以是如图2(a)所示的圆锥台结构1-1。当然，为了让光束聚焦更好，使细胞的捕获效果更稳定，可以对图2(a)中的锥台结构进行优化，形成弧形的反射锥台结构1-2，如图2(b)所示。

图3是多芯光纤微光手系统的装置示意图，其中捕获光源2的波长可以根据操作粒子的特性进行选取，例如对于生物单细胞而言，采取近红外的捕获光源(如980nm)显然更为合适。捕获光源2输出的激光经由1×7的耦合器3，分为7路等能量的分支光路，其中一路接有功率计4，用于监控支路的功率大小，另外的7路分支光路分别和可调光衰减器5相连接，控制每个分支内所通过光的有无及功率大小。7个单模光纤6组成的分支光路由七芯光纤分路器7接入七芯光纤微光手(放大虚线框内)，在七芯光纤1的6个周边纤芯通道中独立传输。环形分布的6个周边纤芯a-g内的光束在光纤端的旋转对称圆锥台结构的反射下，汇聚于一点，其聚焦光场的能量分布可以通过控制每个纤芯内的功率来精确微调。光源8输出的是微手术光刀的生成光，该光源可以是连续的短波长光源(如532nm)，也可以是能量密度很高的脉冲光源(如皮秒激光器、飞秒激光器)。光源8输出的光经过可调光衰减器5和七芯光纤分路器7后接入七芯光纤1的中间纤芯传输，其手术光刀的作用将在下一个实施例中介绍。

如图4(a)、(b)所示，控制纤芯通道a、c、e通入等功率的光束10，其他纤芯通道不通光。光束经过端面的旋转对称锥台结构1-1反射聚焦，形成稳定捕获的势阱，对细胞9进行稳定捕获。然后通过可调节衰减器5控制纤芯通道a、c、e通过连续稳定光束10，纤芯通道b，d，f中通入功率可调节变化的光束11，用于任意方向旋转调整被捕获细9胞的姿态。

实施例2：细胞高精度、微创手术功能。

如图5(a)所示，单细胞9经过七芯光纤微光手稳定捕获并调整姿态，使细胞9待手术部位朝向光纤端面。图5(b)为沿着光纤轴向的剖面图，图中七芯光纤纤端除了反射捕获光束的圆锥台结构1-1外，在光纤端面中间处还刻蚀有一个10um×10um×10um的凹槽13，凹槽13有用低折射率的胶水粘附的微球透镜12。图5(c)是凹槽13处的放大图，七芯光纤1中间纤芯输出的光束，经过微球透镜12压缩，能够在光纤端面外的轴向上形成一个针状光子射流14，即本专利所述的微手术光刀。该光子射流14恰能照在经由微光手固定并调整好姿态的细胞9上，由于光子射流的束腰能被微球透镜压缩到微米，甚至突破衍射极限达到纳米尺寸，因此其具有超高的空间分辨率和极高的能量密度，能对捕获细胞进行精准、微创、快速的手术加工。

由于光纤微光手能方便地任意旋转捕获的细胞，因此可以对细胞进行多点手术加工，如图6所示。这对细胞9定位穿孔手术、细胞器清除实验来说无疑是一种强大的工具。

除了对单个细胞进行手术加工外，本发明还可以对多个细胞组成的细胞群进行手术加工，实现细胞的融合功能，如图7所示。两个单细胞9同时被微光手捕获，通过调整七芯光纤周边纤芯中的光功率大小调整两个细胞的相对位置，调整至合适的位置后中间通入手术光束，经过微球透镜压缩后生成光子射流14，对两个细胞穿孔。由于光子射流的尺寸极小，其对两个细胞的细胞膜的损伤不会太大，不会导致细胞破裂而亡。随着时间的增加，两个细胞慢慢融合，细胞膜得到修复，形成融合后的新细胞。

本发明更显著的优点在于：微手术光刀的大小，位置是可以随着细胞大小、种类和手术特点进行调整的，即可以根据实际手术对象和手术特点选择合适的光刀。下面结合仿真结果对其进行举例说明。

(1)微光手的捕获点的位置可调。

首先，多芯光纤微光手是一种非接触式的光纤光镊，即光纤端面和细胞不发生接触。捕获点距离光纤端面的位置可以通过圆锥台的底角、高度等参数进行调整。对于大一些的细胞，可以调整锥台参数，使捕获点离端面远一点，对于直径小一些的细胞，使捕获点离光纤端面近一些。所以可以通过调节捕获点的位置，调节光刀和待手术细胞间的相对位置。

(2)光刀的大小和位置可调。

其次，埋附于凹槽内的微球透镜的折射率和尺寸将会影响光子射流的位置、亮度和尺寸，针对不同的手术需求，可选择不同的光刀。结合仿真结果举例来说：

图8所示的是微球透镜的直径微10um，折射率为1.6的光子射流生成结果。其中环境为水，折射率为1.33，凹槽内的胶的折射率为1.4。通过结果可以看出，光子射流能量密度最高点处(即手术刀的位置)距离光纤端面的距离较远，为10um左右，光刀的能量密度不是很高，尺寸较大，其FWHM＝1.84λ(λ＝532nm)。这种光刀适合于大细胞的大面积穿孔，细胞融合等操作。

图9所示的是直径为10um，折射率为1.8的微球透镜随手术光束的压缩效果。其形成光子射流的能量密度最高出距离光纤端面的距离为4.6um,能量密度较高，光刀的尺寸有所减小，FWHM＝1.1λ。减小的光束尺寸能使得手术的分辨率提高。

为了进一步缩小光子射流的尺寸，实现更高的空间分辨率，可采用折射率渐变的微球透镜。如图10所示，微球透镜的同样为10um，折射率在径向上满足高斯分布，球心处折射率最大，为1.8，球面处折射率最小，为1.6。仿真结果显示，其光子射流的尺寸可压缩至FWHM＝0.86λ，突破了衍射极限。这能实现细胞的超精度加工，甚至精确到对细胞膜上或细胞内的某一蛋白分子的加工。

当然，微手术光刀的尺寸仍可以减小，如图11所示，微球透镜的直径仍为10um，折射率为2.5，其光子射流尺寸可压缩到FWHM＝0.46λ。但是射流的位置位于光纤端面处，这类光刀使用的时候需要微光手操纵的细胞恰好能和光纤端面接触。

实施例3：基于光纤微光手的细胞微手术刀的制备方法。

步骤1：取一根多芯光纤1，切割平整，在其端面使用飞秒激光刻蚀一个凹槽13，大小10um×10um×10um；

步骤2：在凹槽内放置一颗微球透镜，使用低折射率胶水固化微球透镜12于凹槽13中心；

步骤3：端面精密研磨抛光，去除多余的胶层15，使多芯光纤端面平整；

步骤4：精密研磨光纤端，制备对称的反射圆锥台结构1-1，并抛光、超声清洗、氮气吹干后备用。

Claims (10)

1.一种基于光纤微光手的细胞微手术刀，其特征是：它由多芯光纤微光手和埋附于光纤端面的微球透镜组成。其中多芯光纤具有圆对称分布周边纤芯和中间纤芯，光纤端具有对称的圆锥台结构，使得周边纤芯内传输的捕获光束聚焦，在光纤的轴向上形成一个微光手，稳定捕获目标细胞，并且可以旋转调整捕获细胞的姿态；多芯光纤的端面中心位置刻蚀有微槽，微槽内粘附有一微球透镜，中间纤芯的光束经过微球透镜压缩输出，形成局部能量密度很高的光刀，作用于被捕获细胞。

2.根据权利要求1所述的一种基于光纤微光手的细胞微手术刀，其特征是：所述的多芯光纤的纤芯数量应大于等于三，并且其中一个纤芯位于光纤中心，其余纤芯同轴对称分布。

3.根据权利要求1所述的一种基于光纤微光手的细胞微手术刀，其特征是：所述的多芯光纤端圆锥台结构通过精密研磨加工而成，当多芯光纤周边纤芯内的捕获光束在圆锥台结构的斜面处满足全反射条件，反射并在端面外汇聚时，可不镀制反射金属膜；当多芯光纤周边纤芯内的光束在圆锥台结构的斜面处不满足全反射条件时，可镀制一层反射金属膜，反射并汇聚周边纤芯内的捕获光束。

4.根据权利要求1所述的一种基于光纤微光手的细胞微手术刀，其特征是：所述多芯光纤微光手可通过改变每个周边纤芯内的捕获光束的功率大小，来调整被捕获细胞的姿态。

5.根据权利要求1所述的一种基于光纤微光手的细胞微手术刀，其特征是：所述的凹槽内的微球透镜可以通过低折射率胶水粘附于凹槽内，也可通过静电吸附的方法附着于凹槽内。

6.根据权利要求1所述的一种基于光纤微光手的细胞微手术刀，其特征是：所述的微球透镜的折射率应大于多芯光纤纤芯折射率，并且折射率分布可以是均匀的，也可以是梯度变化的。

7.根据权利要求1所述的一种基于光纤微光手的细胞微手术刀，其特征是：多芯光纤的中间芯可以是单模纤芯，传输单模光束，也可以是多模纤芯，传输多模光束，还可以是环形纤芯，传输环形光束。

8.根据权利要求1所述的一种基于光纤微光手的细胞微手术刀，其特征是：多芯光纤中间芯传输的光可以是连续光，也可以是脉冲光。

9.根据权利要求1所述的一种基于光纤微光手的细胞微手术刀，其特征是：所述的捕获细胞可以是单个的细胞，也可以是多个细胞组成的群体。

10.一种基于光纤微光手的细胞微手术刀的制备方法，其特征是：

步骤1：取一根多芯光纤，切割平整，在其端面刻蚀一个凹槽；

步骤2：在凹槽内放置一颗微球透镜，使用低折射率胶水固化微球透镜于凹槽中心；

步骤3：端面精密研磨抛光，去除多余的胶层，使多芯光纤端面平整；

步骤4：精密研磨光纤端，制备对称的反射圆锥台结构，并抛光、超声清洗、氮气吹干后备用。

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