CN111073791A - 粒子聚焦芯片、单细胞制备系统及单细胞制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种粒子聚焦芯片，包括基体及形成于所述基体上的微通道。所述微通道包括细胞溶液通道及标记溶液通道。所述细胞溶液通道包括螺旋通道，所述螺旋通道的一端设有细胞溶液入口并自所述细胞溶液入口向外螺旋延伸。所述标记溶液通道一端设有标记溶液入口并自所述标记溶液入口向外螺旋延伸。所述螺旋通道的另一端及所述标记溶液通道的另一端与所述油相通道的另一端交汇后共同连通至所述液滴生成出口。此外，还公开了采用该粒子聚焦芯片的单细胞制备系统及单细胞制备方法，旨在提供一种结构简单、操控方便，且能耗较低的单细胞制备方案。
Description
技术领域
本发明涉及细胞检测及分析技术领域，具体涉及粒子聚焦芯片及采用该粒子聚焦芯片的单细胞制备系统及单细胞制备方法。
背景技术
微流控技术在过去的十几年内得到了迅猛的发展，已被广泛应用于生物学研究，医学诊断，环境监测，分析化学等领域。其中纳升级别的液滴微流控技术近年来受到的关注日益增多，液滴微流控在生物化学领域有着独特的优势。随着越来越多的宏观现象和机理被发展应用到微尺度芯片中，微流控技术出现了诸如数字化微流控芯片，微电极阵列，介电泳芯片，光诱导介电泳芯片等新技术。惯性微流控芯片作为近几年出现的一个新技术，它是借助微尺度惯性效应来操控流体或粒子以实现某种目的。由于其存在许多其他技术所不具备的优点，已被广泛用于粒子的输运，装配，聚焦，分选及样品流的混合和反应中。
目前在单细胞分析领域，液滴微流控被广泛应用，通过微液滴同时包裹一个带特定标记的珠子和细胞来给细胞标记，最终分析单细胞数据。但是目前生成液滴所用微芯片大多采用外加场，如电场、磁场等方式来实现粒子聚焦，往往需要配备特殊领域专业人员进行操作，且结构复杂，外场耗能，成本高昂。
发明内容
有鉴于此，有必要提供一种粒子聚焦芯片及采用该粒子聚焦芯片的单细胞制备系统及单细胞制备方法，旨在提供一种结构简单、操控方便，且能耗较低的单细胞制备方案。
一种粒子聚焦芯片，包括基体及形成于所述基体上的微通道，所述微通道包括：
油相入口；
液滴生成出口；
油相通道，所述油相通道的一端与所述油相入口连通；
细胞溶液通道，包括螺旋通道，所述螺旋通道的一端设有细胞溶液入口并自所述细胞溶液入口向外螺旋延伸；及
标记溶液通道，一端设有标记溶液入口并自所述标记溶液入口向外螺旋延伸；
所述螺旋通道的另一端及所述标记溶液通道的另一端与所述油相通道的另一端交汇后共同连通至所述液滴生成出口。
作为优选，所述细胞溶液通道还包括非对称通道，所述非对称通道弯曲延伸并关于其延伸路径非对称分布；
所述螺旋通道的该另一端通过所述非对称通道与所述油相通道的该另一端交汇。
作为优选，所述液滴生成出口用于与一压力发生装置连通。
作为优选，细胞溶液入口、所述标记溶液入口及所述油相入口分别用于与一压力发生装置连通。
作为优选，所述微通道还包括液滴输出通道；
所述液滴输出通道连通于所述螺旋通道、所述标记溶液通道及所述油相通道的交汇部与所述液滴生成出口之间。
作为优选，所述油相通道关于所述油相入口及所述液滴生成出口所在的直线对称；
所述油相通道包括位于所述直线的交汇部；
所述螺旋通道的该另一端及所述标记溶液通道的该另一端连通至所述交汇部并分别与所述直线形成预定夹角。
作为优选，微通道还包括液滴输出通道，所述液滴输出通道连通于所述交汇部与所述液滴生成出口之间；所述液滴输出通道与所述油相通道在所述交汇部垂直交叉。
一种单细胞制备系统，包括：
细胞溶液存储单元；
标记溶液存储单元；
油相存储单元；
液滴收集单元；及
压力发生装置；
其中，所述单细胞制备系统还包括前述任一粒子聚焦芯片；
所述细胞溶液存储单元与所述细胞溶液入口连通；所述标记溶液存储单元与所述标记溶液入口连通；所述油相存储单元与所述油相入口连通；所述液滴收集单元连通于所述液滴生成出口；所述压力发生装置连通至所述微通道。
作为优选，所述压力发生装置连通至所述液滴生成出口且为一流速可调的抽吸式微泵。
一种单细胞制备方法，所述单细胞制备方法利用前述单细胞制备系统实现并包括步骤：
利用所述压力发生装置同时向所述细胞溶液通道泵入细胞溶液、向所述标记溶液通道泵入标记溶液及向所述油相通道泵入油相溶液；
利用所述螺旋通道对所述细胞溶液中的细胞进行聚焦排序及利用所述标记溶液通道对所述标记溶液中的用于标记的珠子进行聚焦排序；
利用油相溶液形成液滴,捕捉聚焦排序后的细胞及用于标记的珠子；及
收集液滴。
上述粒子聚焦芯片及采用该粒子聚焦芯片的单细胞制备系统及单细胞制备方法中，以压力发生装置为动力源，结构简单、操控方便，且能耗较低。利用螺旋形的螺旋通道对所述细胞溶液中的细胞进行聚焦排序及利用所述标记溶液通道对所述标记溶液中的用于标记的珠子进行聚焦排序，细胞或珠子最终在微通道中成单排排列，可减少生成的液滴中同时包裹两个及两个以上的珠子或细胞的比例，对于单细胞领域或者其他要求液滴中包裹单粒子的应用情境具有重要意义。
附图说明
图1为单细胞制备系统在一较优实施例中的结构示意图。
图2为图1中的单细胞制备系统中的粒子聚焦芯片的结构示意图。
图3为螺旋通道中细胞的受力示意图。
图4为单细胞制备方法在一较优实施例中的流程示意图。
图5为一实施例中用于标记的珠子在标记溶液通道中的流动聚焦实拍图。
图6为另一实施例中用于标记的珠子在标记溶液通道中的流动聚焦实拍图。
图7为又一实施例中的液滴实拍图。
主要元件符号说明
10 粒子聚焦芯片
20 细胞溶液存储单元
30 标记溶液存储单元
40 油相存储单元
50 液滴收集单元
60 负压发生装置
100 单细胞制备系统
110 细胞溶液通道
120 标记溶液通道
130 油相通道
140 液滴生成出口
150 液滴输出通道
160 交汇部
170 基体
1101 细胞溶液入口
1102 螺旋通道
1103 非对称通道
1201 标记溶液入口
1301 油相入口
如下具体实施方式将结合上述附图进一步说明本发明。
具体实施方式
如图1所示，单细胞制备系统100包括粒子聚焦芯片10、细胞溶液存储单元20、标记溶液存储单元30、油相存储单元40、液滴收集单元50及负压发生装置60。
同时参图1及图2所示，所述粒子聚焦芯片10包括基体170及形成于所述基体170上的微通道(图中未标出)。
该微通道包括油相入口1301、细胞溶液通道110、标记溶液通道120、油相通道130及液滴生成出口140。
所述液滴生成出口140与所述负压发生装置60连通。
所述油相通道130的一端与所述油相入口1301连通。
所述细胞溶液通道110包括螺旋通道1102，所述螺旋通道1102的一端设有细胞溶液入口1101，且所述螺旋通道1102自所述细胞溶液入口1101向外螺旋延伸。
所述标记溶液通道120的一端设有标记溶液入口1201，且所述标记溶液通道120自所述标记溶液入口1201向外螺旋延伸。
所述螺旋通道1102的另一端及所述标记溶液通道120的另一端与所述油相通道130的另一端交汇后共同连通至所述液滴生成出口140。
所述细胞溶液存储单元20与所述细胞溶液入口1101连通。所述标记溶液存储单元30与所述标记溶液入口1201连通。所述油相存储单元40与所述油相入口1301连通。所述液滴收集单元50连通于所述液滴生成出口140与所述负压发生装置60之间。
预先配制完成的细胞溶液存储于所述细胞溶液存储单元20中，配制的标记溶液存储于所述标记溶液存储单元30中。油相溶液存储于所述油相存储单元40中。
所述负压发生装置60通过负压带动细胞溶液从所述细胞溶液存储单元20中进入所述螺旋通道1102，细胞溶液中的细胞粒子经所述螺旋通道1102聚焦排序后依次流动至与油相通道130汇合。
同时，所述负压发生装置60通过负压带动标记溶液从所述标记溶液存储单元30中进入所述标记溶液通道120。标记溶液中的珠子经所述螺旋通道1102聚焦排序后依次流动至与油相通道130汇合。
聚焦排序后的细胞粒子及聚焦排序后的珠子通过油相溶液的剪切、包裹形成液滴。
通过设置所述螺旋通道1102及所述标记溶液通道120，可减少生成的液滴中同时包裹两个及两个以上的珠子或细胞的比例。
需要说明的是，在其他实施方式中，所述单细胞制备系统100还可以在所述细胞溶液入口1101、所述标记溶液入口1201及所述油相入口1301处分别连接一压力发生装置，对应驱动细胞溶液、标记溶液及油相溶液在所述微通道中流动。
在一优选实施方式中，所述细胞溶液通道110还包括非对称通道1103。所述非对称通道1103弯曲延伸并关于其延伸路径非对称分布。所述螺旋通道1102的所述另一端通过所述非对称通道1103与所述油相通道130的该另一端交汇。
在弯曲的非对称通道1103中，完全聚焦较之直形通道的聚焦行程距离更短，从而允许细胞颗粒更快地聚焦。
在具体实施中，为保证珠子的聚焦速度与细胞的聚焦速度相当，可将所述标记溶液通道120的螺旋直径设置为大于所述螺旋通道1102的螺旋直径。所述标记溶液通道120的长度也可大于所述细胞溶液通道1102的长度。
所述螺旋通道1102的螺旋方向与所述标记溶液通道1102的螺旋方向相反。
在另一优选实施方式中，所述油相通道130关于所述油相入口1301及所述液滴生成出口140所在的直线对称。
所述油相通道130还包括位于所述直线的交汇部160。
所述螺旋通道1102的该另一端及所述标记溶液通道120的该另一端连通至所述交汇部160并分别与所述直线形成预定夹角。
所述微通道还可以包括液滴输出通道150，所述液滴输出通道150连通于所述交汇部160与所述液滴生成出口140之间。所述液滴输出通道150与所述油相通道130在所述交汇部160垂直交叉，从而使油相溶液分别与输送至所述交汇部160的细胞溶液及珠子溶液形成剪切，从而包裹形成液滴。
以下将结合具体实施例及结果验证作详细阐述。
在具体实施中，可先配制标记溶液及细胞溶液。例如，可将用于标记的珠子悬浮于细胞裂解液中以配制标记溶液，将细胞悬于PBS-BSA中以配制细胞溶液。
为便于验证液滴中同时包裹两个及两个以上的珠子或细胞的比例，可在配制标记溶液及细胞溶液的同时对珠子和细胞进行计数。
通过在粒子聚焦芯片10细胞溶液入口1101设置螺旋通道1102，并在所述标记溶液入口1201设置螺旋形的标记溶液通道120，可利用螺旋形通道的离心力及通道中流体的粘性拖拽力和剪切及螺旋形通道内壁的壁面升力使对应的细胞或珠子聚焦在一预定的平衡位置。
具体而言，流体在弯曲管道中流动时，受到离心力作用，离心力指向弯曲管道外侧。由于在中心的流体与通道的近壁区域之间的下游方向上的速度不匹配，管道中心流体的速度大，受到的离心力也大，因而以较大的二次流速度向外侧流动，管道上下壁面附近的流体被迫向管道内侧流动，形成Dean二次流。
流体中的粒子受到沿主流动方向拖拽而加速至和周围流体同样的速度，同时在垂直于主流动方向惯性升力的作用下横向迁移至动力学意义上的平衡位置，即在Dean二次流产生的粘性拖拽力和剪切及壁面产生的升力的共同作用下，使得粒子最终在管道中只有一个平衡位置。当惯性升力为主要力时，粒子最终会靠近通道壁面流动。因此所有的粒子将会聚焦排序依次通过微流道，最终产生的液滴中，双包(同时包裹了两个粒子的液滴)的比例将会大大降低。
例如，请参阅图3，螺旋通道1102中细胞的受力如图3所示。
应用该螺旋通道1102实现细胞单排排列的原理为：在连续弯曲的螺旋通道1102中，细胞主要受升力FL和漩涡力FD两种力，在螺旋通道1102的不同位置细胞受到两种力的方向发生不断的变化，FL和FD之间的平衡决定了细胞在弯曲几何形状的螺旋通道1102的优选位置。当FL＞FD时，细胞聚焦在一起，当FL＜FD时，细胞相互混合；细胞在弯曲通道中进行多次循环流动，直到FD和FL平衡，细胞最终在微通道中成单排排列。
基于相同的原理，可利用螺旋形的标记溶液通道120实现珠子的单排排列。
以下通过标记溶液通道120实现珠子的单排排列的一实例验证单细胞制备系统100的效果。
验证前需在显微镜下观察确粒子聚焦保芯片10的微通道完整并干净。本实例中芯片高度120μm，螺旋通道1102是2圈螺旋通道，最内层半径为740μm，通道宽度80μm，相邻两圈之间间隔100μm。
标记溶液通道120是5圈螺旋通道，最内层半径为760μm，通道宽度120μm，相邻两圈之间间隔100μm。此设计，可使粒子在一定流量条件下，由于粘性拖拽力和升力的共同作用在微通道中聚焦流动。
考虑到珠子大小，以及制造工艺水平及生成液滴的大小，将芯片高度先确定为120μm，此外珠子大小不均匀，为了防止珠子在通道内堵塞，确定标记溶液通道120宽度也为120μm。
对于标记溶液通道120进行分析，珠子聚焦较好地条件之一为珠子雷诺数近似于1(对应流量为5mL/h)，粒子雷诺数可根据如下公式确定。
其中，Re为通道流体雷诺数，Dh为通道水力直径，ap是珠子的直径。
其中，w和h分别为珠子相通道的宽度和高度，ρ是流体的密度，μ是流体的动力粘度,U为流速。从各自的表达式中可看出流速是关键因素。
将流量设置为5mL/h，即在通道中的流速为：
则水力直径Dh为：
流体雷诺数为：
珠子雷诺数Rep为：
由于粘性流体流动和通道中心与通道边缘之间的速度差异使得Dean二次流产生拖拽力FD，Dean二次流的大小可以用无量纲数De来描述,De为：
其中，R是通道初始半径。Dean流产生的拖拽力FD经验公式如下：
FD＝5.4×10-4×π×μ×De1.63×ap＝5.4×10-4×3.14×1.01×10-3×3.541.63×34×10-6＝4.57×10-10除了粘性拖拽力，还有净升力FL也作用于粒子上，它是剪切梯度引起的惯性升力(FIL)和壁面引起的升力(FWL)的合力。FL为：
其中，CL是升力系数，其是微通道横截面上颗粒位置的函数，平均值为0.5。
FL>FD，则升力占主导，根据既有实验证明，粒子聚焦需要满足
本设计中，
另外珠子聚焦，至少需要的通道长度为：
粒子聚焦芯片100中，标记溶液通道120长度远远长于0.00737m。最终珠子可以很好地在标记溶液通道120聚焦流动。
细胞在所述螺旋通道1102的流动可采用相同的计算予以验证。
在一优选实施方式中，所述负压发生装置60可为一流速可调的抽吸式微泵。根据上述验证过程可知，流速是影响珠子聚焦的关键因素，通过流速可调的抽吸式微泵可将流体的流速调整至合理的范围之内，并能够使所述粒子聚焦芯片10满足不同细胞或珠子的聚焦排序。
计算验证完成后，可继续进行后续实验步骤。
实验中液滴收集单元50采用1.5mLEP管。
在管盖中打两个小孔，插入两根聚乙烯微管(外径1.02mm)并用环氧树脂AB胶密封固定，以确保良好的气密性。其中伸到接近管底部的一根管子连接到粒子聚焦芯片100的液滴生成出口140，将另一根管子连接到固定于负压发生装置60上。
细胞溶液存储单元20、标记溶液存储单元30、油相存储单元40也采用1.5mLEP管。
混匀的珠子溶液与细胞裂解液，混匀的细胞相溶液与PBS-BSA，油相溶液分别加入对应的1.5mL EP管中，然后将聚乙烯微管插入到粒子聚焦芯片10的对应入口。
设置负压发生装置60为抽吸模式，并将负压发生装置60的流量参数设置为20-35mL/h。
根据实验验证，当流量高于35mL/h时，液滴生成模式为射流(jetting)，此种模式下液滴生成不稳定，无法制备得到尺寸均一的液滴。
流量设置为30mL/h时，液滴生成稳定，大小均匀(约为110μm)，此时细胞和珠子被随机包裹在液滴中。实验制备得到的液滴收集于干净的手工制作的1.5mL EP管中。本验证中通过高速相机的光学显微镜在标记溶液通道120和交汇部160处捕获连续图像。通过计算包裹细胞或珠子的液滴数目来评估液滴中细胞和珠子的包裹率。
在该实例中，珠子采用30μm的磁珠，其密度与裂解液的密度基本一样，可以很好地悬浮于其中，保证整个实验过程中浓度基本一致。用10μm的珠子代替细胞以方便实验后包裹率观察统计，将此珠子悬于PBS-BSA试剂中。待试剂全部加入1.5mL EP管中，负压发生装置60设置为抽吸模式，流量设置为30mL/h，运行并收集产生的液滴。包裹率测试实验每次只用一种尺寸粒子，以方便后续统计包裹率。
实验观察发现，在此粒子聚焦芯片100中的设计条件下，珠子浓度在1200个/uL以下，细胞浓度在600个/uL以下时均可以在微通道中较好地排序。收集产生的液滴，在显微镜下观察并拍照，后续用ImageJ软件协助计算统计珠子和细胞的包裹率。实验中不同浓度条件下珠子在微通道中的流动聚焦情况如图5、图6所示。珠子浓度为800个/μL时，收集液滴图片(如图7所示)进行观察，并统计液滴中包裹一个珠子(单包)的比例和液滴中包裹两个及以上珠子(双包及多包)的比例。统计结果表明，此浓度下，单包比例为21.4％，双包及多包比例为0.8％，此双包及多包比例远低于同浓度下没有螺旋结构的双包及多包比例。
需要说明的是，上述实例中的具体参数仅为举例验证单细胞制备系统100的效果，并非用于进一步限定所述单细胞制备系统100。
此外，参阅图4所示，还公开了一种单细胞制备方法。
所述单细胞制备方法利用前述单细胞制备系统100实现，并包括如下步骤。
S101.利用所述负压发生装置60同时向所述细胞溶液通道110泵入细胞溶液、向所述标记溶液通道120泵入标记溶液及向所述油相通道130泵入油相溶液。
S102.利用所述螺旋通道1102对所述细胞溶液中的细胞进行聚焦排序及利用所述标记溶液通道120对所述标记溶液中的用于标记的珠子进行聚焦排序。
S103.利用油相溶液捕捉聚焦排序后的细胞及用于标记的珠子，形成液滴。
S104.收集液滴。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种粒子聚焦芯片，包括基体及形成于所述基体上的微通道，其特征在于，所述微通道包括：
油相入口；
液滴生成出口；
油相通道，所述油相通道的一端与所述油相入口连通；
细胞溶液通道，包括螺旋通道，所述螺旋通道的一端设有细胞溶液入口并自所述细胞溶液入口向外螺旋延伸；及
标记溶液通道，一端设有标记溶液入口并自所述标记溶液入口向外螺旋延伸；
所述螺旋通道的另一端及所述标记溶液通道的另一端与所述油相通道的另一端交汇后共同连通至所述液滴生成出口。
2.如权利要求1所述的粒子聚焦芯片，其特征在于：所述细胞溶液通道还包括非对称通道，所述非对称通道弯曲延伸并关于其延伸路径非对称分布；
所述螺旋通道的该另一端通过所述非对称通道与所述油相通道的该另一端交汇。
3.如权利要求1所述的粒子聚焦芯片，其特征在于：所述液滴生成出口用于与一压力发生装置连通。
4.如权利要求1所述的粒子聚焦芯片，其特征在于：所述细胞溶液入口、所述标记溶液入口及所述油相入口分别用于与一压力发生装置连通。
5.如权利要求1所述的粒子聚焦芯片，其特征在于：所述微通道还包括液滴输出通道；
所述液滴输出通道连通于所述螺旋通道、所述标记溶液通道及所述油相通道的交汇部与所述液滴生成出口之间。
6.如权利要求1所述的粒子聚焦芯片，其特征在于，所述油相通道关于所述油相入口及所述液滴生成出口所在的直线对称；
所述油相通道包括位于所述直线的交汇部；
所述螺旋通道的该另一端及所述标记溶液通道的该另一端连通至所述交汇部并分别与所述直线形成预定夹角。
7.如权利要求6所述的粒子聚焦芯片，其特征在于：微通道还包括液滴输出通道，所述液滴输出通道连通于所述交汇部与所述液滴生成出口之间；所述液滴输出通道与所述油相通道在所述交汇部垂直交叉。
8.一种单细胞制备系统，包括：
细胞溶液存储单元；
标记溶液存储单元；
油相存储单元；
液滴收集单元；及
压力发生装置；
其特征在于，所述单细胞制备系统还包括权利要求1-7中任一项所述的粒子聚焦芯片；
所述细胞溶液存储单元与所述细胞溶液入口连通；所述标记溶液存储单元与所述标记溶液入口连通；所述油相存储单元与所述油相入口连通；所述液滴收集单元连通于所述液滴生成出口；所述压力发生装置连通至所述微通道。
9.如权利要求8所述的单细胞制备系统，其特征在于：所述压力发生装置为连通至所述液滴生成出口且流速可调的抽吸式微泵。
10.一种单细胞制备方法，其特征在于，所述单细胞制备方法利用权利要求8所述的单细胞制备系统实现并包括步骤：
利用所述压力发生装置同时向所述细胞溶液通道泵入细胞溶液、向所述标记溶液通道泵入标记溶液及向所述油相通道泵入油相溶液；
利用所述螺旋通道对所述细胞溶液中的细胞进行聚焦排序及利用所述标记溶液通道对所述标记溶液中的用于标记的珠子进行聚焦排序；
利用油相溶液形成液滴,捕捉聚焦排序后的细胞及用于标记的珠子；及
收集液滴。
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