CN111072678A - 一种具有多模态影像导航功能的酞菁钆类光敏剂及其制备方法和应用 - Google Patents
一种具有多模态影像导航功能的酞菁钆类光敏剂及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种具有多模态影像导航功能的酞菁钆类光敏剂及其制备方法和应用，属于光动力药物或光敏剂制备领域。该类光敏剂的结构式如式(I)所示。该类光敏剂结构明确，表现出高效的单线态氧产率；作为光动力治疗所使用的光敏剂具有制备工艺简单、安全环保、成像效果好等特点。以疏水性酞菁钆为例：通过MRI、光声以及光热成像等能快速识别检测恶性肿瘤并富集在该区域。本发明可实现无损伤、实时动态检测肿瘤病灶部位成像，进行多模态引导的同步诊断及多种联合方式的治疗，具有广阔的医学应用前景。此外，该光敏剂还可对组织和活体进行癌症诊断的多模态成像检测，从而达到对癌症进行治疗的同时进行诊断的目的。
Description
技术领域
本发明属于光动力药物或光敏剂制备领域，特别涉及一种酞菁钆类光敏剂及其制备方法，该酞菁钆类光敏剂可活体光声成像、光热成像及核磁共振成像，可作为多模态探针应用，属于有机功能材料领域。
背景技术
酞菁化合物是一类重要的功能材料，通过不同的结构修饰可以发展为不同用途的功能材料。在酞菁环上引入合适取代基和中心离子，便有可能开发为氧化催化剂、脱硫催化剂、非线性光学材料、光敏药物、液晶材料、光记录材料或光导材料[Tao L,Fuxi G,Opticalrecording behavior of tetra-neopentoxy phthalocyanine zinc Langmuir-Blodgettfilm.Applied Optics,1994,33(17):3760]。
酞菁化合物作为光敏剂在光动力治疗(Photodynamic Therapy)中应用前景引人瞩目。[Samuel G.Awuah and Youngjae You.RSC Adv.2012,2,11169–11183.]。光动力治疗是近些年发展起来的一种新兴的癌症治疗手段。它利用无毒性的光敏物质，待其进入肿瘤组织后用特定的波长的光照激发，在肿瘤内部产生破坏以达到治疗癌症的目的。在光动力治疗过程中，首先将特定的光敏剂以静脉注射、腹腔注射或局部注射的方式引入体内。使用与光敏剂吸收波长相对应的近红外激光对肿瘤部位进行照射，被激发的光敏剂将能量转移给氧，产生单线态氧，破坏肿瘤的脉管系统或直接导致肿瘤细胞的凋亡和坏死，从而达到治疗的目的。与传统治疗手段相比较，光动力治疗具有明显的优势：选择性的对肿瘤造成损伤，对正常组织伤害小；手术造成创伤小；光敏剂对人体无特殊毒性，且不会再体内积累，可以反复治疗；光敏剂与其他药物没有相互作用，可以与其他疗法同时使用。具体而言，光动力治疗包含三个基本要素：分子氧，光敏剂，和特定波长的光源。三个要素中每一个要素单独存在是均没有毒性，而当三者协同作用时，激发的光敏剂在照射后将能量转移到组织周围的氧气中可以产生高细胞毒性的活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)，其可用于诱导细胞凋亡和坏死。[(a)Yizhong shen,Adam J.Shuhendler,Deju Ye,Jing-Juan Xu andHong-Yuan Chen，Chem.Soc.Rev.,2016,45,6725.(b)高源，乔光明，李娜，等。光敏剂在癌症诊断和治疗中的研究进展，分析化学，2011，39(12)：1926-1931.]。
在光动力治疗过程中，光敏剂扮演着关键的角色，光动力疗效取决于光敏剂的优劣。它能够被光照射激发，并将能量传递给氧，形成能够对细胞造成伤害的活性氧。因此，光敏剂的物理化学性质和进入人体后的分布直接影响光动力治疗的效果。在光动力治疗过程中，单线态氧产率是影响其效果的最直接因素。因此制备合成一种酞菁类高效光敏剂具有重要意义。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种具有多模态影像导航功能的酞菁钆类光敏剂。
本发明的另一目的在于提供上述具有多模态影像导航功能的酞菁钆类光敏剂的制备方法。
具体的，本发明提供三种具有不同亲疏水性取代基的酞菁钆类光敏剂的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述具有多模态影像导航功能的酞菁钆类光敏剂的应用。
本发明的酞菁钆类光敏剂适用于癌症诊断的多模态成像：核磁成像(MRI)，光热成像与光声成像的联合成像。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种具有多模态影像导航功能的酞菁钆类光敏剂，是中心离子为钆的酞菁化合物，其结构式如式(I)所示。酞菁，英文名称为phthalocyanine，是四苯并四氮杂卟啉的简称。所述的具有多模态影像导航功能的酞菁钆类的结构特点是：中心为钆离子，取代基可以是疏水性或亲水性的取代基团。
根据本发明，优选的，式(I)中，R＝H、C(CH3)3或OCH2CH2OCH2CH2N(CH3)2，分别代表无支链酞菁钆、疏水性酞菁钆和亲水性酞菁钆。
根据本发明，上述式(I)所示的酞菁钆类光敏剂的制备方法，包括如下步骤：本发明所提供的三种多模态影像导航的酞菁钆类光敏剂的合成步骤如图1所示，具体如下：
A.无支链酞菁钆R＝H的合成步骤：
(1)在保护性气体氛围下，将金属锂加入有机溶剂A中，搅拌后加入原料邻苯二甲腈；随后将溶液加热至回流，反应；待反应结束后，减压除去部分有机溶剂，将剩余的蓝色糊状物倒入乙酸/丙酮中，搅拌过夜；将混合物旋蒸后，在甲醇中进行沉淀，过滤并用甲醇冲洗；浓缩有机相，经柱层析分离纯化，即可得无金属酞菁原料H2Pc(a)。
(2)在保护性气体氛围下，将上述所得的产物H2Pc(a)作为反应物，与钆盐在有机溶剂B中进行反应，加热至回流过夜；反应结束后除去有机溶剂，得到蓝绿色固体酞菁钆光敏剂。
B.疏水性酞菁钆R＝C(CH3)3的合成步骤：
(1)在保护性气体氛围下，将金属锂加入有机溶剂A中，搅拌后加入原料4-叔丁基邻苯二甲腈；随后将溶液加热回流，反应；待反应结束后，减压除去部分有机溶剂，将剩余的蓝色糊状物倒入乙酸/丙酮中，搅拌过夜；将混合物旋蒸后，在甲醇中进行沉淀，过滤并用甲醇冲洗；浓缩有机相，经柱层析分离纯化，即可得无金属酞菁原料H2Pc(b)。
(2)在保护性气体氛围下，将上述所得的产物H2Pc(b)作为反应物，与钆盐在有机溶剂B中进行反应，加热至回流过夜；反应过程中通过薄层色谱进行点板监测，待出现蓝绿色点且极性大于原料即为产物；反应结束后除去有机溶剂，经硅胶柱分离纯化得到疏水性酞菁钆光敏剂。
C.亲水性酞菁钆R＝OCH2CH2OCH2CH2N(CH3)2的合成步骤：
(1)在保护性气体氛围下，以4-硝基邻苯二甲腈为起始原料，在碱性条件下溶于有机溶剂中，与HOCH2CH2OCH2CH2N(CH3)2反应，萃取，干燥，蒸发溶剂后重结晶，制备如下式(a)所示的邻苯二甲腈类化合物，即4-取代-二氰基苯；
其中，R＝OCH2CH2OCH2CH2N(CH3)2；
(2)在保护性气体氛围下，将式(a)所述邻苯二甲腈类化合物和金属锂或DBU加入到有机溶剂a中，加热反应；将反应混合物冷却至室温后，加入正己烷并混合后，将沉淀物过滤出并用乙醚洗涤；将粗产物通过柱层析分离纯化，干燥得到绿色固体亲水性无金属酞菁原料H2Pc(c)。
其中，R＝OCH2CH2OCH2CH2N(CH3)2；
(3)在保护性气体氛围下，将所得产物H2Pc(c)作为反应物，与钆盐在有机溶剂b中反应，加热回流过夜；待反应冷却至室温后，将混合产物逐滴加入冰乙醚中，将沉淀物过滤并进行水、乙醇洗涤后将进行干燥；将粗产物通过柱层析分离纯化，干燥得到绿色亲水性酞菁钆类光敏剂。
根据本发明的方法，优选的，方案A步骤(1)中所述的有机溶剂A为正辛醇。优选为无水正辛醇，使用氢化钙进行溶剂除水。
根据本发明的方法，优选的，方案A步骤(1)中所述的反应温度为180℃。
根据本发明的方法，优选的，方案A步骤(1)中所述的邻苯二甲腈和金属锂摩尔比为1：(1～1.5)；优选为1:1.2。
根据本发明的方法，优选的，方案A步骤(1)中所述的回流的反应时间为3～5h；优选为3h。
根据本发明的方法，优选的，方案A步骤(1)中每毫摩尔反应物邻苯二甲腈，有机溶剂A正辛醇用量为2～3mL；优选为3mL。
根据本发明的方法，优选的，方案A步骤(1)中所述的乙酸/丙酮中乙酸与丙酮的体积比优选为1:1。
根据本发明的方法，优选的，方案A步骤(1)中所述的搅拌过夜的条件是搅拌的温度为室温，搅拌的时间为10h。
根据本发明的方法，优选的，方案A步骤(1)中所述的分离纯化为采用硅胶柱进行分离纯化，洗脱剂为甲醇。
根据本发明的方法，优选的，方案A步骤(2)中所述的有机溶剂B为正戊醇；优选为无水正戊醇。
根据本发明的方法，优选的，方案A步骤(2)中所述的钆盐为氯化钆；优选为无水氯化钆(GdCl3)。
根据本发明的方法，优选的，方案A步骤(2)中反应物无金属酞菁H2Pc(a)和钆盐的投料摩尔比为1：(5～8)；优选为1:8。
根据本发明的方法，优选的，方案A步骤(2)中每毫摩尔反应物无金属酞菁H2Pc(a)，有机溶剂B正戊醇用量为4～6mL；优选为5mL。
根据本发明的方法，优选的，方案A步骤(2)中所述回流的反应温度为140～160℃，优选为160℃；反应时间为10～12h；优选为10h。
根据本发明的方法，优选的，方案B步骤(1)中所述的反应温度为180℃。
根据本发明的方法，优选的，方案B步骤(1)中所述的反应时间为3～5h；优选为3h。
根据本发明的方法，优选的，方案B步骤(1)中所述的有机溶剂A为正辛醇；优选为无水正辛醇。
根据本发明的方法，优选的，方案B步骤(1)中所述的4-叔丁基邻苯二甲腈和金属锂摩尔比为1：(1～1.5)；优选为1:1.2。
根据本发明的方法，优选的，方案B步骤(1)中每毫摩尔反应物4-叔丁基邻苯二甲腈，有机溶剂A正辛醇用量为2～3mL；优选为3mL。
根据本发明的方法，优选的，方案B步骤(1)中所述的乙酸/丙酮中乙酸与丙酮的体积比优选为1:1。
根据本发明的方法，优选的，方案B步骤(1)中所述的搅拌过夜的条件是搅拌的温度为室温，搅拌的时间为10h。
根据本发明的方法，优选的，方案B步骤(2)中所述的有机溶剂B为正戊醇；优选为无水正戊醇。
根据本发明的方法，优选的，方案B步骤(2)中所述的钆盐为氯化钆；优选为无水氯化钆(GdCl3)。
根据本发明的方法，优选的，方案B步骤(2)中反应物无金属酞菁H2Pc(b)和钆盐的投料摩尔比为1：(5～8)；优选为1:8。
根据本发明的方法，优选的，方案B步骤(2)中所述回流的反应温度为140～160℃，优选为160℃；反应时间为10～12h；优选为10h。
根据本发明的方法，优选的，方案B步骤(2)中每毫摩尔反应物无金属酞菁H2Pc(b)，有机溶剂B正戊醇用量为4～6mL；优选为5mL。
根据本发明的方法，优选的，方案B步骤(2)中所述的反应优选为采用点板监控反应，若出现蓝绿色点且极性大于原料即为产物。
根据本发明的方法，优选的，方案B步骤(1)、(2)中所述的分离纯化为采用硅胶柱进行分离纯化，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝10：1。
根据本发明的方法，优选的，方案C步骤(1)中的碱性条件是加入碳酸钾K2CO3；每毫摩尔反应物4-硝基邻苯二甲腈，K2CO3用量为2～10mmol；优选为6mmol。
根据本发明的方法，优选的，方案C步骤(1)中所述的反应物4-硝基邻苯二甲腈与HOCH2CH2OCH2CH2N(CH3)2的摩尔比为1：(3～5)；优选为1：3。
根据本发明的方法，优选的，方案C步骤(1)中所述的有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)；优选为无水DMF。
根据本发明的方法，优选的，方案C步骤(1)中每毫摩尔反应物4-硝基邻苯二甲腈，有机溶剂DMF用量为3～5mL；优选为5mL。
根据本发明的方法，优选的，方案C步骤(1)中所述的反应温度为50℃，反应时间为72h。
根据本发明的方法，优选的，方案C步骤(1)中所述的萃取操作是将反应混合物倒入饱和食盐水(100mL)，震荡摇匀，并用二氯甲烷(300mL＝3*100mL)进行萃取，随后收集有机相。
根据本发明的方法，优选的，方案C步骤(1)中所述的干燥是用无水硫酸钠进行干燥；所述的重结晶是在乙醇中重结晶。
根据本发明的方法，优选的，方案C步骤(2)中所述的邻苯二甲腈类化合物和金属锂摩尔比为1：(1～1.5)；优选为1:1.2。
根据本发明的方法，优选的，方案C步骤(2)中所述的邻苯二甲腈类化合物与DBU(1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯)的摩尔比为2：(0.8～1.5)；优选为2:1。
根据本发明的方法，优选的，方案C步骤(2)中所述的有机溶剂a为正辛醇，优选为无水正辛醇。
根据本发明的方法，优选的，方案C步骤(2)中所述的反应温度为180℃，反应时间为14h。
根据本发明的方法，优选的，方案C步骤(2)中所述的分离纯化为采用中性氧化铝柱进行分离纯化，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝99：1。
根据本发明的方法，优选的，方案C步骤(2)中所述的干燥是用无水硫酸钠干燥。
根据本发明的方法，优选的，方案C步骤(3)中所述的钆盐为氯化钆；优选为无水氯化钆(GdCl3)。
根据本发明的方法，优选的，方案C步骤(3)中所述的产物H2Pc(c)和钆盐的摩尔比为1：(5～10)；优选为1：8。
根据本发明的方法，优选的，方案C步骤(3)中所述的有机溶剂b为正戊醇；优选为无水正戊醇。
根据本发明的方法，优选的，方案C步骤(3)中每毫摩尔反应物无金属酞菁H2Pc(c)，有机溶剂b正戊醇用量为4～6mL；优选为5mL。
根据本发明的方法，优选的，方案C步骤(3)中所述的反应温度为140～160℃，优选为160℃；反应时间为10～12h，优选为12h。
根据本发明的方法，优选的，方案C步骤(3)中所述的分离纯化为采用中性氧化铝柱进行分离纯化，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝20：1。
根据本发明的方法，优选的，方案C步骤(3)中所述的干燥是用无水硫酸钠干燥。
根据本发明的方法，优选的，方案A、方案B、方案C中所述的保护性气体均优选为氮气。
本发明如有特殊说明，均按本领域常规操作。
所述的具有多模态影像导航功能的酞菁钆类光敏剂作为光动力治疗试剂用于高效的癌症治疗。
具体的，所述的具有多模态影像导航功能的酞菁钆类光敏剂在制备用于光动力肿瘤治疗及成像诊断药物中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明合成的化合物结构明确，表现出高效的单线态氧产率。
(2)本发明合成的光敏剂作为光动力治疗所使用的光敏剂具有制备工艺简单、安全环保等特点。
(3)本发明选择生物相容性优良的过渡稀土金属钆作为酞菁化合物的中心离子，钆的优势是T2亮信号且适用症广；
(4)本发明合成的光敏剂具有诊疗一体化的特性，有效避免了传统纳米材料合成过程中引入的化学试剂以及纳米材料稳定剂对有机体造成的生物毒性。
(5)本发明的酞菁钆类造影剂可应用于肿瘤相关疾病的多模态成像检测中，成像效果好。结果表明：以疏水性酞菁钆为例：通过MRI、光声以及光热成像等能快速识别检测恶性肿瘤并富集在该区域。本发明可实现无损伤、实时动态检测肿瘤病灶部位成像，进行多模态引导的同步诊断及多种联合方式的治疗，具有广阔的医学应用前景。此外，该光敏剂还可以对组织和活体进行癌症诊断的多模态成像检测：核磁成像(MRI)，光热成像与光声成像，从而达到对癌症进行治疗的同时进行诊断的目的。
附图说明
图1为本发明实施例1中所述具有多模态影像导航功能的三种酞菁钆类光敏剂的制备合成路线图。
图2为本发明实施例2中所述的三类酞菁钆类光敏剂的吸收光谱图。
图3为本发明实施例3中所述的疏水性酞菁钆光敏剂的吸收光谱图。
图4为本发明实施例3中所述的疏水性酞菁钆光敏剂的荧光光谱图。
图5为本发明实施例3中所述光敏剂的质谱表征。
图6为本发明实施例4中所述光敏剂的光声强度。
图7为本发明实施例4中所述光敏剂的弛豫率。
图8为本发明实施例4中所述光敏剂的光热曲线。
图9为本发明实施例4中所述光敏剂的光热成像。
图10为本发明实施例5中所述光敏剂在光照条件下单线态氧的产生情况。
图11为本发明实施例5中所述光敏剂在光照条件下单线态氧的产率计算。
图12为本发明实施例6中所述光敏剂通过使用单线态氧检测探针SOSG检测其在癌细胞HepG2中产生单线态氧的能力。
图13为本发明实施例7中所述光敏剂对肿瘤细胞的暗毒性。
图14为本发明实施例7中所述光敏剂对肿瘤细胞的光动力治疗。
图15为本发明实施例7中所述光敏剂对肿瘤细胞的光声治疗。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修饰均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
实施例1：三种多模态影像导航的酞菁钆类光敏剂的制备。
1、本发明所提供的三种多模态影像导航的酞菁钆类光敏剂的合成步骤如图1所示，R＝H，C(CH3)3或OCH2CH2OCH2CH2N(CH3)2，分别代表无支链酞菁钆、疏水性酞菁钆和亲水性酞菁钆。具体如下：
(1)无支链酞菁钆R＝H的合成步骤：其合成路线图如图1中(a)所示。
在氮气保护下，将金属锂(82mg，12mmol)加入无水正辛醇(25mL)中，搅拌30分钟后加入原料邻苯二甲腈(1.28g，10mmol)。随后将溶液加热至180℃，几分钟后溶液变为绿色，再进行加热回流，反应时间为3h。待反应结束后，减压除去部分正辛醇，将剩余的蓝色糊状物倒入乙酸/丙酮(1:1)中，搅拌过夜。将混合物旋蒸后，在甲醇中进行沉淀，过滤并用甲醇冲洗。浓缩有机相，经柱层析(硅胶柱：甲醇洗脱)分离纯化，即可得无金属酞菁原料H2Pc(a)。
在保护性气体氛围下，将上述所得的产物H2Pc(a)(100mg，0.58mmol)作为反应物，与无水氯化钆GdCl3(1.2g，4.64mmol)在无水正戊醇(3mL)中进行反应，加热至160℃回流过夜。反应结束后除去有机溶剂，得到蓝绿色固体酞菁钆光敏剂。
(2)疏水性酞菁钆R＝C(CH3)3的合成步骤：其合成路线图如图1中(b)所示。
在氮气保护下，将金属锂(82mg，12mmol)加入无水正辛醇(25mL)中，搅拌30分钟后加入原料4-叔丁基邻苯二甲腈(2.2g，10mmol)。随后将溶液加热至180℃，几分钟后溶液变为绿色，再进行加热回流，反应时间为3h。待反应结束后，减压除去部分正辛醇，将剩余的蓝色糊状物倒入乙酸/丙酮中，搅拌过夜。将混合物旋蒸后，在甲醇中进行沉淀，过滤并用甲醇冲洗。浓缩有机相，经柱层析(硅胶柱：二氯甲烷与甲醇的体积比＝10：1洗脱)分离纯化，即可得无金属酞菁原料H2Pc(b)。产量：1.31g(71％)。
在保护性气体氛围保护下，将上述所得的产物H2Pc(b)(90mg，0.12mmol)作为反应物，与无水氯化钆GdCl3(0.26g，0.974mmol)在无水正戊醇(0.6mL)中进行反应，加热至160℃回流过夜。反应过程中通过薄层色谱进行点板监测，待出现蓝绿色点且极性大于原料即为产物。反应结束后除去有机溶剂，经硅胶柱(二氯甲烷与甲醇的体积比＝10：1洗脱)分离得到蓝绿色固体酞菁钆光敏剂。产量：10mg(37.25％)。
(3)亲水性酞菁钆R＝OCH2CH2OCH2CH2N(CH3)2的和成步骤：其合成路线图如图1中(c)所示。
在保护性气体氛围保护下，将4-硝基邻苯二甲腈(0.5g，2.89mmol)溶解于无水DMF(9mL)，之后加入HOCH2CH2OCH2CH2N(CH3)2(1.15g，8.67mmol)，搅拌15min后，在2小时内分批加入无水K2CO3(2.4g，17.34mmol)。反应温度为50℃，反应时间为72h。将反应混合物倒入饱和食盐水(100mL)，震荡摇匀，并用二氯甲烷(300mL＝3*100mL)进行萃取。随后收集有机相，并用无水硫酸钠进行干燥。蒸发溶剂，在乙醇中重结晶得到产物邻苯二甲腈类化合物。产量：0.3g(40％)。
在保护性气体氛围下，将上述所得产物邻苯二甲腈类化合物(0.3g，1.16mmol)，无水正辛醇(3mL)和1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU，0.09mL，0.58mmol)置于标准双口瓶中并脱气3次。反应温度为180℃，反应14h，将反应混合物冷却至室温后，加入正己烷(70mL)并混合半小时后，将沉淀物过滤出并用乙醚洗涤。将粗产物通过中性氧化铝柱色谱纯化，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝99：1，用无水硫酸钠干燥得到绿色固体亲水性无金属酞菁原料H2Pc(c)。产量：0.18g(65％)。
在保护性气体保护下，将上述所得的无金属酞菁原料H2Pc(c)(0.12g，0.112mmol)作为反应物，与无水氯化钆GdCl3(236.0mg，0.896mmol)在无水正戊醇(0.5mL)中进行反应，加热至160℃回流。反应时间为12h。待反应冷却至室温后，将混合产物逐滴加入冰乙醚中，将沉淀物过滤并进行水、乙醇洗涤后将进行干燥。将粗产物通过中性氧化铝柱色谱纯化，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝20：1，用无水硫酸钠干燥得到绿色亲水性酞菁钆光敏剂。产量：40.15mg(30％)。
实施例2：实施例1制备的三种光敏剂的吸收光谱。
配制实施例1中获得的三种酞菁钆类光敏剂Pc-Gd的DMF有机溶液，使用紫外-可见分光光度仪(UV-Vis)测定三种酞菁钆类光敏剂的吸收。吸收光谱如图2所示。从图2可知，三种酞菁钆类化合物在650～700nm处均有一个最强吸收峰，可以在近红外区用作为光吸收剂。
实施例3：实施例1制备的疏水性酞菁钆光敏剂的吸收和荧光光谱，及其质谱表征。
配制实施例1中获得的疏水性酞菁钆光敏剂Pc-Gd的PBS缓冲液(记为PBS)以及加入0.1％TritonX-100的Pc-Gd的PBS缓冲液(记为PBS+TX)，光敏剂的浓度均为10μM，分别使用紫外-可见分光光度仪(UV-Vis)，荧光分光光度计测定其吸收和荧光。吸收光谱如图3所示，荧光光谱如图4所示。从图3、4可知，疏水性酞菁钆在PBS缓冲液中会发生聚集，在加入TritonX-100(非离子型表面活性剂)后，酞菁钆分子以游离的形式存在在溶液中，吸收和荧光强度明显提高。
取1～2mg的疏水性酞菁钆化合物，将其溶于二氯甲烷或甲醇中，送检进行化合物分子量的检测。表征数据如图5所示，证明所合成的化合物是正确的。
表征数据：MALDI-TOF(图5)：calcd.for[M+]894.3248,found:894.3237.
实施例4：实施例1制备的疏水性酞菁钆光敏剂Pc-Gd具备了MRI、光声成像、光热成像功能。
使用磁共振成像系统，光声成像系统及光热成像系统，对Pc-Gd疏水性光敏剂进行表征，具体测试结果如下：
(1)不同浓度的光敏剂的光声成像图和光声信号强度图。
配置浓度为0，50，100，200，300，400μM的探针Pc-Gd的PBS缓冲溶液(含0.1％TritonX-100)，用光声计算机断层扫描仪测定6组溶液的光声信号，以及光声二维图(图6)。由图可知，光声信号随浓度的增加，光敏剂在680nm的光声信号强度逐渐增强。
(2)MRI磁共振成像
配置浓度为0，0.025，0.05，0.1，0.2μM的探针Pc-Gd的PBS缓冲液(记为Pc-Gd)和含0.1％TritonX-100的Pc-Gd的PBS缓冲液(记为Pc-Gd+TX)。用核磁成像仪分别测定溶液的弛豫率(图7)。由图可知，较纯探针溶液而言，加入TritonX-100的探针Pc-Gd的PBS缓冲液弛豫率明显增强。
(3)光热曲线及成像
配置浓度为0，25，50，100，150，200μM的Pc-Gd的PBS缓冲液(含0.1％TritonX-100)。使用热偶温度计测定不同浓度下溶液的温度变化(图8)。由图可知，探针的光热效应随着浓度的增强逐渐增强。并对不同浓度的溶液进行了光热成像实验(图9)。
实施例5：实施例1制备的疏水性酞菁钆光敏剂Pc-Gd在近红外激光照射下单线态氧的产生情况。
(1)SOSG检测单线态氧的产生
配制浓度为10μM的Pc-Gd的PBS缓冲液(含0.1％的TritonX-100)，加单线态氧检测探针SOSG(浓度为5μM)，测试此时溶液中SOSG在545nm处的荧光即可得到探针在未照射0s时的光谱图，之后将比色皿置于光源5cm处照射10s，然后测试溶液的荧光光谱，如此重复(图10)。从图中可以看出Pc-Gd在680nm光照的条件，SOSG荧光逐渐增强。说明本发明所述的光敏剂能够在680nm照射下产生单线态氧。
(2)DPBF计算探针的单线态氧产率。
称取DPBF(1,3-二苯基异苯并呋喃)配制成浓度约为10μM的DMF溶液，然后取1mL该溶液转移至石英比色皿中，再加入事先配好的10mM的探针Pc-Gd的PBS缓冲液(含0.1％的TritonX-100)20μL并吹匀，此时探针的浓度约为20μM，测试此时溶液的吸光度即可得到探针在未照射0s时的光谱图。之后将比色皿置于光源5cm处照射10s，然后测试溶液的紫外可见光谱，如此重复(图11)。由图可知，DPBF在415nm处的吸收峰随着光照时间的延长而逐渐降低，但探针的Q带吸收峰保持不变。说明该探针能够在稳定的情况下产生单线态氧。同时以时间为横坐标，DPBF在415nm处的吸收峰值即特征吸收峰值为纵坐标作图并线性拟合，发现DPBF是线性降解的。经计算可知，探针的单线态氧产率为0.69。
实施例6：实施例1制备的疏水性酞菁钆光敏剂Pc-Gd在癌细胞HepG2内产生单线态氧的能力。
配置浓度为20μM的疏水性酞菁钆光敏剂Pc-Gd的PBS缓冲溶液(含0.1％的TritonX-100)，将癌细胞HepG2(购买于北京北纳创联生物技术研究院)孵育在共聚焦皿内，分为2组，第一组不作处理(对照组)，第二组加入Pc-Gd溶液(其用量为20μL)(实验组)。向这两组细胞内加入单线态氧探针SOSG后，分别用680nm激光照射，用共聚焦显微镜检测SOSG的荧光强度。实验结果见图12。从图中可以看出光敏剂Pc-Gd在光照条件下可以产生单线态氧，有很好的光动力效应。
实施例7：实施例1制备的疏水性酞菁钆类光敏剂Pc-Gd的细胞杀伤能力。
将癌细胞HepG2培养至贴壁细胞的96孔板取出，依次加入一系列含有不同浓度(如浓度为5，10，15，20，25μmol/L)的所述疏水性酞菁钆类光敏剂的培养液，在培养箱中培养4小时。平行培养三板细胞，一板进行光动力治疗(连续激光680nm)，一板进行光声治疗(光照前需加入维生素C——单线态氧清除剂，脉冲激光680nm)，最后一板进行暗毒性实验(避光处理)；均以不作处理作为对照组。光照组分别在680nm近红外激光器照射5min后，将光照组和避光组均置于培养箱中继续培养1天。最后，利用细胞增殖与活性检测试剂盒(CCK8)检测细胞成活率。
暗毒性组实验结果：避光组的细胞成活率均在95％以上，说明该光敏剂具有可以忽略的暗毒性，见图13。
光动力治疗组实验结果说明：在连续激光680nm照射下，随着光敏剂探针的浓度增加，细胞的成活率逐渐下降，且对照组细胞状态良好，说明该光敏剂具有良好的光动力效果，见图14。
光声治疗组实验结果说明：在脉冲激光680nm照射下(在照射前加入Vc消除光动力治疗)，随着光敏剂探针的浓度增加，细胞的成活率逐渐下降，且对照组细胞状态良好，说明该光敏剂具有良好的光声治疗效果，见图15。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种具有多模态影像导航功能的酞菁钆类光敏剂，其特征在于：所述的光敏剂是中心离子为钆的酞菁化合物，其结构式如式(I)所示，取代基R是疏水性或亲水性的取代基团；
2.根据权利要求1所述的具有多模态影像导航功能的酞菁钆类光敏剂，其特征在于：
式(I)中，R＝H、C(CH3)3或OCH2CH2OCH2CH2N(CH3)2，分别代表无支链酞菁钆、疏水性酞菁钆和亲水性酞菁钆。
3.权利要求2所述的具有多模态影像导航功能的酞菁钆类光敏剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
A.无支链酞菁钆R＝H的合成步骤：
(1)在保护性气体氛围下，将金属锂加入有机溶剂A中，搅拌后加入原料邻苯二甲腈；随后将溶液加热至回流，反应；待反应结束后，减压除去部分有机溶剂，将剩余的蓝色糊状物倒入乙酸/丙酮中，搅拌过夜；将混合物旋蒸后，在甲醇中进行沉淀，过滤并用甲醇冲洗；浓缩有机相，经柱层析分离纯化，即可得无金属酞菁原料H2Pc(a)；
(2)在保护性气体氛围下，将上述所得的产物H2Pc(a)作为反应物，与钆盐在有机溶剂B中进行反应，加热至回流过夜；反应结束后除去有机溶剂，得到蓝绿色固体酞菁钆光敏剂；
B.疏水性酞菁钆R＝C(CH3)3的合成步骤：
(1)在保护性气体氛围下，将金属锂加入有机溶剂A中，搅拌后加入原料4-叔丁基邻苯二甲腈；随后将溶液加热回流，反应；待反应结束后，减压除去部分有机溶剂，将剩余的蓝色糊状物倒入乙酸/丙酮中，搅拌过夜；将混合物旋蒸后，在甲醇中进行沉淀，过滤并用甲醇冲洗；浓缩有机相，经柱层析分离纯化，即可得无金属酞菁原料H2Pc(b)；
(2)在保护性气体氛围下，将上述所得的产物H2Pc(b)作为反应物，与钆盐在有机溶剂B中进行反应，加热至回流过夜；反应过程中通过薄层色谱进行点板监测，待出现蓝绿色点且极性大于原料即为产物；反应结束后除去有机溶剂，经硅胶柱分离纯化得到疏水性酞菁钆光敏剂；
C.亲水性酞菁钆R＝OCH2CH2OCH2CH2N(CH3)2的合成步骤：
(1)在保护性气体氛围下，以4-硝基邻苯二甲腈为起始原料，在碱性条件下溶于有机溶剂中，与HOCH2CH2OCH2CH2N(CH3)2反应，萃取，干燥，蒸发溶剂后重结晶，制备如下式(a)所示的邻苯二甲腈类化合物，即4-取代-二氰基苯；
其中，R＝OCH2CH2OCH2CH2N(CH3)2；
(2)在保护性气体氛围下，将式(a)所述邻苯二甲腈类化合物和金属锂或DBU加入到有机溶剂a中，加热反应；将反应混合物冷却至室温后，加入正己烷并混合后，将沉淀物过滤出并用乙醚洗涤；将粗产物通过柱层析分离纯化，干燥得到绿色固体亲水性无金属酞菁原料H2Pc(c)；
其中，R＝OCH2CH2OCH2CH2N(CH3)2；
(3)在保护性气体氛围下，将所得产物H2Pc(c)作为反应物，与钆盐在有机溶剂b中反应，加热回流过夜；待反应冷却至室温后，将混合产物逐滴加入冰乙醚中，将沉淀物过滤并进行水、乙醇洗涤后将进行干燥；将粗产物通过柱层析分离纯化，干燥得到绿色亲水性酞菁钆类光敏剂。
4.根据权利要求3所述的具有多模态影像导航功能的酞菁钆类光敏剂的制备方法，其特征在于：
方案A步骤(1)中所述的有机溶剂A为正辛醇；
方案A步骤(1)中所述的反应温度为180℃；
方案A步骤(1)中所述的邻苯二甲腈和金属锂摩尔比为1：(1～1.5)；
方案A步骤(1)中所述的回流的反应时间为3～5h；
方案A步骤(1)中每毫摩尔反应物邻苯二甲腈，有机溶剂A用量为2～3mL；
方案A步骤(1)中所述的乙酸/丙酮中乙酸与丙酮的体积比为1:1；
方案A步骤(1)中所述的分离纯化为采用硅胶柱进行分离纯化，洗脱剂为甲醇。
5.根据权利要求3或4所述的具有多模态影像导航功能的酞菁钆类光敏剂的制备方法，其特征在于：
方案A步骤(2)中所述的有机溶剂B为正戊醇；
方案A步骤(2)中所述的钆盐为氯化钆；
方案A步骤(2)中反应物无金属酞菁H2Pc(a)和钆盐的投料摩尔比为1：(5～8)；
方案A步骤(2)中每毫摩尔反应物无金属酞菁H2Pc(a)，有机溶剂B用量为4～6mL；
方案A步骤(2)中所述回流的反应温度为140～160℃；反应时间为10～12h；
方案A中所述的保护性气体均为氮气。
6.根据权利要求3所述的具有多模态影像导航功能的酞菁钆类光敏剂的制备方法，其特征在于：
方案B步骤(1)中所述的反应温度为180℃；
方案B步骤(1)中所述的反应时间为3～5h；
方案B步骤(1)中所述的有机溶剂A为正辛醇；
方案B步骤(1)中所述的4-叔丁基邻苯二甲腈和金属锂摩尔比为1：(1～1.5)；
方案B步骤(1)中每毫摩尔反应物4-叔丁基邻苯二甲腈，有机溶剂A用量为2～3mL；
方案B步骤(1)中所述的乙酸/丙酮中乙酸与丙酮的体积比为1:1。
7.根据权利要求3或6所述的具有多模态影像导航功能的酞菁钆类光敏剂的制备方法，其特征在于：
方案B步骤(2)中所述的有机溶剂B为正戊醇；
方案B步骤(2)中所述的钆盐为氯化钆；
方案B步骤(2)中反应物无金属酞菁H2Pc(b)和钆盐的投料摩尔比为1：(5～8)；
方案B步骤(2)中所述回流的反应温度为140～160℃；反应时间为10～12h；
方案B步骤(2)中每毫摩尔反应物无金属酞菁H2Pc(b)，有机溶剂B用量为4～6mL；
方案B步骤(1)、(2)中所述的分离纯化为采用硅胶柱进行分离纯化，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝10：1；
方案B中所述的保护性气体均为氮气。
8.根据权利要求3所述的具有多模态影像导航功能的酞菁钆类光敏剂的制备方法，其特征在于：
方案C步骤(1)中的碱性条件是加入碳酸钾K2CO3；每毫摩尔反应物4-硝基邻苯二甲腈，K2CO3用量为2～10mmol；
方案C步骤(1)中所述的反应物4-硝基邻苯二甲腈与HOCH2CH2OCH2CH2N(CH3)2的摩尔比为1：(3～5)；
方案C步骤(1)中所述的有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺；
方案C步骤(1)中每毫摩尔反应物4-硝基邻苯二甲腈，有机溶剂用量为3～5mL；
方案C步骤(1)中所述的反应温度为50℃，反应时间为72h；
方案C步骤(1)中所述的萃取操作是将反应混合物倒入饱和食盐水，震荡摇匀，并用二氯甲烷进行萃取，随后收集有机相；
方案C步骤(2)中所述的邻苯二甲腈类化合物和金属锂摩尔比为1：(1～1.5)；
方案C步骤(2)中所述的邻苯二甲腈类化合物与DBU的摩尔比为2：(0.8～1.5)；
方案C步骤(2)中所述的有机溶剂a为正辛醇；
方案C步骤(2)中所述的反应温度为180℃，反应时间为14h；
方案C步骤(2)中所述的分离纯化为采用中性氧化铝柱进行分离纯化，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝99：1。
9.根据权利要求3或8所述的具有多模态影像导航功能的酞菁钆类光敏剂的制备方法，其特征在于：
方案C步骤(3)中所述的钆盐为氯化钆；
方案C步骤(3)中所述的产物H2Pc(c)和钆盐的摩尔比为1：(5～10)；
方案C步骤(3)中所述的有机溶剂b为正戊醇；
方案C步骤(3)中每毫摩尔反应物无金属酞菁H2Pc(c)，有机溶剂b用量为4～6mL；
方案C步骤(3)中所述的反应温度为140～160℃；反应时间为10～12h；
方案C步骤(3)中所述的分离纯化为采用中性氧化铝柱进行分离纯化，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝20：1；
方案C中所述的保护性气体均为氮气。
10.权利要求1或2所述的具有多模态影像导航功能的酞菁钆类光敏剂在制备用于光动力肿瘤治疗及成像诊断药物中的应用。
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