CN111068048A - 一种四价流感病毒裂解疫苗的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种四价流感病毒裂解疫苗的制备方法，包括如下步骤：1）收获液制备；2）病毒灭活；3）超滤浓缩；4）浓缩后纯化一；5）纯化二；6）病毒裂解；7）裂解后纯化三；8）半成品制备；9）成品制备。本发明具有如下技术效果：本发明利用经过优化的三步纯化工艺制备的四价流感病毒裂解疫苗样品中具有更低的卵清蛋白含量，更低的杂蛋白含量以及高纯度的血凝素抗原，保证了四价流感病毒裂解疫苗的不良反应更低，疫苗的免疫效果更好，疫苗的安全性更高。

Description

一种四价流感病毒裂解疫苗的制备方法
技术领域
本发明涉及一种四价流感病毒裂解疫苗的制备方法，属于疫苗技术领域。
背景技术
流行性感冒病毒，属正粘病毒科的代表，简称流感病毒，流感病毒形态呈球形，少数呈丝状，其直径在80至120纳米之间，流感病毒结构自外而内可分为包膜、基质蛋白以及核心三部分。
2018年之前，我国已上市季节性流感疫苗以流感病毒裂解疫苗为主导，且全部为三价疫苗，上市的三价流感疫苗含两种A型和一种B型毒株(Yamagata系或者Victoria系)，由于B型病毒Yamagata系和Victoria系之间的交叉保护作用很弱，含一种B型的三价流感疫苗对另一谱系B型病毒保护效果有限。
2018年，四价流感病毒裂解疫苗在我国获批上市。四价流感病毒裂解疫苗包含甲型H1N1、甲型H3N2、乙型Yamagata系(By)、乙型Victoria系(Bv)四种流感病毒抗原成分，比之前的三价流感病毒裂解疫苗多了乙型Yamagata系(By)流感病毒抗原成分。四价流感病毒裂解疫苗包含上述两种甲型和两种乙型共四种流感病毒抗原成分，可涵盖更多的流感流行型别，将有效预防和控制流感疫情。
目前国内流感病毒裂解疫苗均采用鸡胚工艺生产，疫苗纯化工艺主要有超速区带离心或凝胶(柱)层析法。目前上市的流感病毒裂解疫苗大多采用两步纯化工艺(超速区带离心和凝胶(柱)层析法组合，或两次超速区带离心法组合)，两步纯化工艺生产的疫苗抗原纯度相对较低，而且卵清蛋白(流感疫苗中的主要过敏原)相对较高。
另外，现有的流感裂解疫苗的免疫效果和安全性还有提高的空间。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种四价流感病毒裂解疫苗的制备方法。在目前三价和四价流感疫苗的基础上，通过优化生产工艺，制备免疫效果更好、安全性更高的包括两个B型流感病毒的四价流感病毒裂解疫苗。
本发明的技术方案如下：
一种四价流感病毒裂解疫苗的制备方法，包括如下步骤：
1)收获液制备：采用世界卫生组织推荐的并经国务院药品监督管理部门批准的H1N1、H3N2、B1(B/Victoria系)和B2(B/Yamagata系)四种流行性感冒(简称流感)病毒株分别接种9-11日龄健康鸡胚，经33
Figure BDA0002325260840000021
35℃、48
Figure BDA0002325260840000022
72小时培养，2
Figure BDA0002325260840000023
8℃冷胚后收获病毒液；
2)病毒灭活：单价病毒合并液中加入终浓度200μg/ml的甲醛进行病毒灭活；
3)超滤浓缩：灭活后的收获液采用1000KD超滤膜包进行超滤浓缩，得到病毒浓缩液；
4)浓缩后纯化一：先采用蔗糖密度梯度离心法35000rpm离心纯化，在静止时以100±20ml/min的流速从连续流区带离心机转子底部泵入55％的蔗糖溶液1600ml，确认真空度小于40Pa(1mTorr＝0.133Pa)，设置转速为35000rpm；当达到35000rpm时以300±50ml/min，由下向上连续泵入浓缩液，每台离心机一次连续上样量不超过100L浓缩液；进样完毕，以100±20ml/min的速度泵入pH7.2PBS缓冲液，35000rpm离心45min后，设定转速至0rpm；待离心机转子静止，开启蠕动泵，控制泵速在100±50ml/min，从底部收样；
5)纯化二：采用300KD超滤膜包超滤除糖后，再采用柱层析法纯化，介质为Sepharose-4FF凝胶，每批大致等分成两个部分分次上样进行层析纯化，每次上样量不超过柱体积的8％，上样速度80～350ml/min，进样后泵入pH7.2PBS溶液进行洗脱，洗脱速度353～424ml/min(洗脱线性流速5～6mm/min)，用280nm紫外检测仪收集病毒峰，层析纯化后收集的纯化液取样进行蛋白质含量检测，控制蛋白质含量不高于1200μg/ml；
6)病毒裂解：病毒纯化液加入裂解剂Triton X-100进行病毒裂解，添加终浓度为0.5％Triton X-100，置于恒温(22℃±1℃)摇床中进行裂解16～18小时，得到病毒裂解液；
7)裂解后纯化三：病毒裂解液再次经过蔗糖密度梯度离心纯化，CP70区带离心机进入3000rpm区带模式后，从离心机加样器边孔依次进样泵入：pH7.2PBS溶液、裂解后病毒液、30％蔗糖溶液、55％蔗糖溶液，上样速度不超过300ml/min；进样完毕，设置离心机转速30000rpm、离心温度15℃、离心时间3小时，区带离心后收集蔗糖浓度为1％～42％范围内的液段；然后用超滤法去除蔗糖，纯化后的病毒裂解液经除菌过滤，即为单价原液；
8)半成品制备：根据各单价原液的血凝素含量，将各型流感病毒按同一血凝素含量进行半成品配制(血凝素配制量可在30
Figure BDA0002325260840000031
36μg/ml范围内)，加入0.01mol/L磷酸盐缓冲液稀释，即为半成品；
9)成品制备：半成品经过滤分装、包装、检定合格即为成品，用于预防四种流行性感冒病毒引起的流行性感冒。
优选地，
所述的步骤4)中，连续流区带离心机为eKII连续流超速区带离心机。
所述的步骤5)中，采用BPG300/950装填Sepharose-4FF快速流凝胶介质。
所述的步骤7)中，区带离心机采用CP70区带离心机。
本发明的方法中，主要做了如下方面的优化，
第一次纯化工艺中，采用eKII连续流超速区带离心机，连续进样解决规模化大批量生产工艺瓶颈问题。
第二次纯化工艺中，采用BPG300/950装填Sepharose-4FF快速流凝胶介质，并且每次上样量不超过柱体积8％，适应规模化生产并可达到更好的纯化效果。
第三次纯化工艺中，采用CP70区带离心机，能有效去除两次纯化裂解后仍然存在的类似病毒颗粒以及未完全裂解的病毒大颗粒。
本发明具有如下技术效果：本发明利用经过优化的三步纯化工艺制备的四价流感病毒裂解疫苗样品中具有更低的卵清蛋白含量，更低的杂蛋白含量以及高纯度的血凝素抗原，保证了四价流感病毒裂解疫苗的不良反应更低，疫苗的免疫效果更好，疫苗的安全性更高。
经过优化的三步纯化工艺具有如下技术效果：
1)利用本发明三步纯化工艺所制备的四价流感病毒裂解疫苗样品的卵清蛋白含量均值为5ng/mL，远低于两步纯化工艺所制备的四价流感病毒裂解疫苗卵清蛋白含量均值35ng/mL，并且远低于三价流感病毒裂解疫苗药典标准(卵清蛋白含量应不高于500ng/mL)。
2)利用本发明三步纯化工艺所制备的四价流感病毒裂解疫苗样品的蛋白质含量均值为196μg/mL(蛋白质含量与各型血凝素总量的比值平均值为1.45)，低于两步纯化工艺所制备的四价流感病毒裂解疫苗蛋白质含量均值341μg/mL(蛋白质含量与各型血凝素总量的比值平均值为2.51)，并且远低于三价流感病毒裂解疫苗药典标准(蛋白质含量应不高于400μg/mL，并不得超过疫苗中血凝素含量的4.5倍)。
3)利用本发明所制备的四价流感病毒裂解疫苗包含上述两种甲型和两种乙型共四种流感病毒抗原成分，可替代三价流感病毒裂解疫苗，涵盖更多的流感流行型别，保护范围更广，对B型流感的保护效果更好，将有效预防和控制流感疫情。
4)利用本发明所制备的四价流感病毒裂解疫苗经临床研究证明免疫原性高，各型免疫原性指标均高于欧洲药品评价局标准。临床试验安全性好，各项不良反应均低于三价对照苗。
本发明的上述技术效果均属于优化后的方法带来的意想不到的技术效果。
附图说明
图1为H1N1型全病毒电镜照片。
图2为H3N2型全病毒电镜照片。
图3为B1(B/Victoria系)型全病毒电镜照片。
图4为B2(B/Yamagata系)型全病毒电镜照片。
图5为H1N1型两步纯化法病毒裂解电镜照片。
图6为H3N2型两步纯化法病毒裂解电镜照片。
图7为B1(B/Victoria系)型两步纯化法病毒裂解电镜照片。
图8为B2(B/Yamagata系)型两步纯化法病毒裂解电镜照片。
图9为H1N1型三步纯化法病毒裂解电镜照片。
图10为H3N2型三步纯化法病毒裂解电镜照片。
图11为B1(B/Victoria系)型三步纯化法病毒裂解电镜照片。
图12为B2(B/Yamagata系)型三步纯化法病毒裂解电镜照片。
图13为试验疫苗组抗体阳转率与欧洲药品评价局标准对比。
图14为试验疫苗组血清保护率与欧洲药品评价局标准对比。
图15为试验疫苗组抗体GMI与欧洲药品评价局标准对比。
图16为局部不良反应。
图17为全身不良反应。
具体实施方式
本发明中所用的材料和设备说明如下：
毒株：流感病毒毒株H1N1型(NYMC X-179A)、H3N2型(NYMC X-263B)、B1型(NYMCBX-35，B/Victoria系)和B2型(B/Phuket/3073/2013，B/Yamagata系)，均购自英国国家生物标准与检定所(NIBSC)。
主要试剂及仪器：
四个型别的流感毒株抗体和抗原标准品均购自NIBSC；
卵清蛋白检测试剂盒购自德国Seramun Diagnostica GmbH公司，采用酶联免疫法进行检测；
磷酸二氢钠、磷酸氢二钠，均购自成都华邑药用辅料制造有限责任公司；
蔗糖、裂解剂，均购自德国Merck公司。
全自动接种机、全自动收获机，均购自美国RAME-HART公司；
eKII连续流超速区带离心机购自美国ALFA WASSERMANN公司；
层析柱购自GE公司；
CP70区带离心机购自日本日立公司；
超滤系统购自Merck公司；
Model 680酶标仪购自美国加州伯乐公司。
实施例1
本发明的四价流感病毒裂解疫苗的制备方法，包括如下步骤：
1)收获液制备：采用世界卫生组织推荐的并经国务院药品监督管理部门批准的H1N1、H3N2、B1(B/Victoria系)和B2(B/Yamagata系)四种流行性感冒(简称流感)病毒株分别接种9-11日龄健康鸡胚，经33
Figure BDA0002325260840000051
35℃、48
Figure BDA0002325260840000052
72小时培养(甲型48小时，乙型72小时)，2
Figure BDA0002325260840000053
8℃冷胚后收获病毒液。
2)病毒灭活：单价病毒合并液中加入终浓度200μg/ml的甲醛进行病毒灭活；
3)超滤浓缩：灭活后的收获液采用1000KD超滤膜包进行超滤浓缩，得到病毒浓缩液；
4)浓缩后纯化一：先采用蔗糖密度梯度离心法35000rpm离心纯化；在静止时以100±20ml/min的流速从连续流区带离心机转子底部泵入55％的蔗糖溶液1600ml，确认真空度小于40Pa(1mTorr＝0.133Pa)，设置转速为35000rpm。当达到35000rpm时以300±50ml/min，由下向上连续泵入浓缩液，每台离心机一次连续上样量不超过100L浓缩液。进样完毕，以100±20ml/min的速度泵入pH7.2PBS缓冲液，35000rpm离心45min后，设定转速至0rpm。待离心机转子静止，开启蠕动泵，控制泵速在100±50ml/min，从底部收样。
5)纯化二：采用300KD超滤膜包超滤除糖后，再采用柱层析法纯化，介质为Sepharose-4FF凝胶，每次上样量不超过柱体积的8％，上样速度80～350ml/min，进样后泵入pH7.2PBS溶液进行洗脱，洗脱速度353～424ml/min(洗脱线性流速5～6mm/min)，用280nm紫外检测仪收集病毒峰，层析纯化后收集的纯化液取样进行蛋白质含量检测，控制蛋白质含量不高于1200μg/ml。
6)病毒裂解：病毒纯化液加入裂解剂Triton X-100进行病毒裂解，添加终浓度为0.5％Triton X-100，置于恒温(22℃±1℃)摇床中进行裂解16～18小时，得到病毒裂解液；
7)裂解后纯化三：病毒裂解液再次经过蔗糖密度梯度离心纯化，CP70区带离心机进入3000rpm区带模式后，从离心机加样器边孔依次进样泵入：pH7.2PBS溶液190ml、裂解后病毒液800ml、30％蔗糖溶液300ml、55％蔗糖溶液400ml，上样速度不超过300ml/min。进样完毕，设置离心机转速30000rpm、离心温度15℃、离心时间3小时，区带离心后收集蔗糖浓度为1％～42％范围内的液段。然后用超滤法去除蔗糖，纯化后的病毒裂解液经除菌过滤，即为单价原液；
8)半成品制备：根据各单价原液的血凝素含量，将各型流感病毒按同一血凝素含量进行半成品配制(血凝素配制量可在30
Figure BDA0002325260840000061
36μg/ml范围内)，加入0.01mol/L磷酸盐缓冲液稀释，即为半成品；
9)成品制备：半成品经过滤分装、包装、检定合格即为成品，用于预防本株病毒引起的流行性感冒。
对照例1
采用现有的两步纯化工艺制备四价流感病毒裂解疫苗，包括如下步骤：
1)收获液制备：四种流行性感冒(简称流感)病毒株分别接种9-11日龄健康鸡胚，经33
Figure BDA0002325260840000071
35℃、48
Figure BDA0002325260840000072
72小时培养(甲型48小时，乙型72小时)，2
Figure BDA0002325260840000073
8℃冷胚后收获病毒液。
2)病毒灭活：单价病毒合并液中加入终浓度200μg/ml的甲醛进行病毒灭活；
3)超滤浓缩：灭活后的收获液采用1000KD超滤膜包进行超滤浓缩，得到病毒浓缩液。
4)浓缩后纯化一：先采用蔗糖密度梯度离心法35000rpm离心纯化，在静止时以100±20ml/min的流速从连续流区带离心机转子底部泵入55％的蔗糖溶液1600ml，确认真空度小于40Pa(1mTorr＝0.133Pa)，设置转速为35000rpm。当达到35000rpm时以300±50ml/min，由下向上连续泵入浓缩液，每台离心机一次连续上样量不超过100L浓缩液。进样完毕，以100±20ml/min的速度泵入pH7.2PBS缓冲液，35000rpm离心45min后，设定转速至0rpm。待离心机转子静止，开启蠕动泵，控制泵速在100±50ml/min，从底部收样。
5)纯化二：采用300KD超滤膜包超滤除糖后，再采用柱层析法纯化，介质为Sepharose-4FF凝胶，每次上样量不超过柱体积的8％，上样速度80～350ml/min，进样后泵入pH7.2PBS溶液进行洗脱，洗脱速度353～424ml/min(洗脱线性流速5～6mm/min)，用280nm紫外检测仪收集病毒峰，层析纯化后收集的纯化液取样进行蛋白质含量检测，控制蛋白质含量不高于1200μg/ml。
6)病毒裂解：病毒纯化液加入裂解剂Triton X-100进行病毒裂解，添加终浓度为0.5％Triton X-100，置于恒温(22℃±1℃)摇床中进行裂解16～18小时，得到病毒裂解液。
7)用超滤法去除蔗糖及裂解剂，纯化后的病毒裂解液经除菌过滤，即为单价原液。
8)半成品制备：根据各单价原液的血凝素含量，将各型流感病毒按同一血凝素含量进行半成品配制(血凝素配制量可在30
Figure BDA0002325260840000074
36μg/ml范围内)，加入0.01mol/L磷酸盐缓冲液稀释，即为半成品。半成品经过滤分装、包装、检定合格。
实施例2 用实施例1和对照例1的制备的疫苗进行对照试验
一、卵清蛋白含量检测方法:
1)在使用前把所有试剂在室温条件下平衡到室温，至少平衡30分钟；
2)用样品稀释液稀释样品，其中单价原液参考稀释倍数为原倍、2.5倍、5倍、10倍；半成品及成品参考稀释倍数为原倍、2.5倍、5倍；其它样品则根据预估值进行适当倍数的稀释；如不同稀释度测定值均大于标准品20ng/ml所对应的吸光度值，则需将样本做进一步稀释测定，使其测定值居于0.31～20ng/ml所对应的吸光度值区间；
3)取出酶标板，每试验孔加100μlHRP结合物；
4)每试验孔加100μl已稀释好的样品，100μl卵清蛋白标准品0.31、0.625、1.25、2.5、5、10、20ng/ml，100μl的内部参比品，每样品平行加样2孔；
5)将酶标板在37℃条件下温育60分钟；配制洗液，洗液做10倍稀释备用；
6)每孔加洗液300μl，每次浸泡30秒左右，自动洗板机洗板5次，最后手动拍干；
7)每试验孔加100μl SUBSTR TMB，室温条件下避光温育10分钟；
8)加100μl反应停止液STOP，混匀；
9)10分钟内，用酶标仪在双波长450nm/≥620nm下读取OD值。
10)以吸光值对其相应标准曲线中卵清蛋白含量作直线回归，求得直线回归方程，代入供试品吸光值，即可得到供试品的卵清蛋白含量。
二、血凝素含量检测方法
采用单向免疫扩散试验测定血凝素含量。
将抗原参考品和供试品分别加至含有抗体参考品的1.5％琼脂糖凝胶板上，孔径为3mm，每孔10μl，于20～25℃放置至少18个小时。用PBS浸泡1小时后，干燥、染色、脱色。准确测量抗原参考品和供试品形成的沉淀环的直径，以抗原参考品形成的沉淀环的直径对其相应抗原浓度作直线回归，求得直线回归方程，代入供试品的沉淀环直径，即可得到供试品的血凝素含量。
试验对象：按照实施例1的三步纯化工艺制备四价流感病毒裂解疫苗，按照对照例1的两步纯化工艺制备的四价流感病毒裂解疫苗，分别取三个批号的样品作为检测对象。
检测结果：检测结果分别如表1和2所示。
表1三步纯化工艺制备的四价流感病毒裂解疫苗检测结果
Figure BDA0002325260840000091
表2两步纯化工艺制备的四价流感病毒裂解疫苗检测结果
Figure BDA0002325260840000092
表3三步纯化工艺制备的四价流感病毒裂解疫苗送中国食品药品检定研究院(NIFDC)检测结果
Figure BDA0002325260840000093
注：*为临床试验批次
从表1和表2可以看出：
1)利用本发明三步纯化工艺所制备的四价流感病毒裂解疫苗样品的卵清蛋白含量均值为5ng/mL，远低于两步纯化工艺所制备的四价流感病毒裂解疫苗卵清蛋白含量均值35ng/mL，并且远低于三价流感病毒裂解疫苗药典标准(卵清蛋白含量应不高于500ng/mL)。
2)利用本发明三步纯化工艺所制备的四价流感病毒裂解疫苗样品的蛋白质含量均值为196μg/mL(蛋白质含量与各型血凝素总量的比值平均值为1.45)，低于两步纯化工艺所制备的四价流感病毒裂解疫苗蛋白质含量均值341μg/mL(蛋白质含量与各型血凝素总量的比值平均值为2.51)，并且远低于三价流感病毒裂解疫苗药典标准(蛋白质含量应不高于400μg/mL，并不得超过疫苗中血凝素含量的4.5倍)。
从表3可以看出：公司四价流感病毒裂解疫苗自检结果与中国食品药品检定研究院检定结果基本一致。
另外，图1为H1N1型全病毒电镜照片。图2为H3N2型全病毒电镜照片。图3为B1(B/Victoria系)型全病毒电镜照片。图4为B2(B/Yamagata系)型全病毒电镜照片。
图5为H1N1型两步纯化法病毒裂解电镜照片。图6为H3N2型两步纯化法病毒裂解电镜照片。图7为B1(B/Victoria系)型两步纯化法病毒裂解电镜照片。图8为B2(B/Yamagata系)型两步纯化法病毒裂解电镜照片。
图9为H1N1型三步纯化法病毒裂解电镜照片。图10为H3N2型三步纯化法病毒裂解电镜照片。图11为B1(B/Victoria系)型三步纯化法病毒裂解电镜照片。图12为B2(B/Yamagata系)型三步纯化法病毒裂解电镜照片。
从采用两步纯化工艺生产的流感病毒裂解疫苗原液电镜照片，即图5-8可以看出，大部分病毒已被裂解，但局部仍有类似病毒颗粒以及未完全裂解病毒大颗粒存在。
从采用三步纯化工艺生产的流感病毒裂解疫苗原液电镜照片，即图9-12，可以看出，所有病毒已被彻底裂解，均为细小碎片，无完整病毒及未完全裂解病毒大颗粒。
实施例3 免疫效果试验
临床试验概述、免疫原性研究终点、免疫原性检测方法
采用实施例1的方法制备的S201510001-1批次的四价流感病毒裂解疫苗经中国食品药品检定研究院检测合格后进行临床试验，在国内完成的一项随机、双盲、对照的Ⅲ期临床试验中，共入组3664名3岁及以上受试者，按照2:1:1比例随机接种一剂次本品四价流感试验疫苗和两种三价季节性流感对照疫苗。
采集受试者免前和免后28天的血样，采用微量血凝抑制试验方法测定受试者血清的流感病毒HI抗体滴度(GMT)。
接种本发明实施例1所制备疫苗的试验疫苗组全研究人群免后H1N1、H3N2、B(Y)和B(V)抗体GMT分别为345.66、397.35、172.22和72.30。
另外，
从图13可以看出，试验疫苗组H1N1、H3N2、B(Y)和B(V)抗体阳转率分别为87.73％、80.69％、83.30％和72.40％；明显高于欧洲药品评价局标准。
从图14可以看出，试验疫苗组H1N1、H3N2、B(Y)和B(V)血清保护率分别为93.98％、99.03％、94.78％和77.29％；明显高于欧洲药品评价局标准。
从图15可以看出，试验疫苗组H1N1、H3N2、B(Y)和B(V)抗体GMI分别为23.77、10.82、8.86和9.23；明显高于欧洲药品评价局标准。
结论：采用本发明的三步纯化生产的四价流感病毒裂解疫苗临床试验免疫原性高，各型免疫原性指标均高于欧洲药品评价局标准。
实施例4 安全性试验
共3664名3岁及以上受试者参加了本品在国内开展的1项临床研究，其中1829名受试者接种了至少一剂本发明的实施例1制备的疫苗。
对本品系统的安全性观察自疫苗接种开始至全程接种后28天，对大部分受试者的长期安全性观察自全程接种后29天至180天。
按照国际医学科学组织委员会(CIOMS)推荐的不良反应发生率的分类：十分常见(≥10％)，常见(1％-10％，含1％)，偶见(0.1％-1％，含0.1％)，罕见(0.01％-0.1％，含0.01％)，十分罕见(<0.01％)，进行如下描述：
本品临床试验
1局部不良反应见图16
常见(1％-10％，含1％)：疼痛
偶见(0.1％-1％，含0.1％)：肿、硬结、注射部位瘙痒、红
2全身不良反应见图17
十分常见(≥10％)：发热
偶见(0.1％-1％，含0.1％)：咳嗽、头痛、肌肉痛、疲劳乏力、腹泻、恶心呕吐
罕见(0.01％-0.1％，含0.01％)：食欲减退、胃痛、过敏性紫癜
结论：本发明的疫苗不良反应发生率低，疫苗临床使用安全性好。

Claims (4)

1.一种四价流感病毒裂解疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)收获液制备：采用世界卫生组织推荐的并经国务院药品监督管理部门批准的H1N1、H3N2、B1(B/Victoria系)和B2(B/Yamagata系)四种流行性感冒病毒株分别接种9-11日龄健康鸡胚，经
Figure FDA0002325260830000011
小时培养，
Figure FDA0002325260830000012
冷胚后收获病毒液；
2)病毒灭活：单价病毒合并液中加入终浓度200μg/ml的甲醛进行病毒灭活；
3)超滤浓缩：灭活后的收获液采用1000KD超滤膜包进行超滤浓缩，得到病毒浓缩液；
4)浓缩后纯化一：先采用蔗糖密度梯度离心法35000rpm离心纯化，在静止时以100±20ml/min的流速从连续流区带离心机转子底部泵入55％的蔗糖溶液1600ml，确认真空度小于40Pa，设置转速为35000rpm；当达到35000rpm时以300±50ml/min，由下向上连续泵入浓缩液，每台离心机一次连续上样量不超过100L浓缩液；进样完毕，以100±20ml/min的速度泵入pH7.2 PBS缓冲液，35000rpm离心45min后，设定转速至0rpm；待离心机转子静止，开启蠕动泵，控制泵速在100±50ml/min，从底部收样；
5)纯化二：采用300KD超滤膜包超滤除糖后，再采用柱层析法纯化，介质为Sepharose-4FF凝胶，每批等分成两个部分分次上样进行层析纯化，每次上样量不超过柱体积的8％，上样速度80～350ml/min，进样后泵入pH7.2PBS溶液进行洗脱，洗脱速度353～424ml/min，用280nm紫外检测仪收集病毒峰，层析纯化后收集的纯化液取样进行蛋白质含量检测，控制蛋白质含量不高于1200μg/ml；
6)病毒裂解：病毒纯化液加入裂解剂Triton X-100进行病毒裂解，添加终浓度为0.5％Triton X-100，置于恒温摇床中进行裂解16～18小时，得到病毒裂解液；
7)裂解后纯化三：病毒裂解液再次经过蔗糖密度梯度离心纯化，CP70区带离心机进入3000rpm区带模式后，从离心机加样器边孔依次进样泵入：pH7.2PBS溶液、裂解后病毒液、30％蔗糖溶液、55％蔗糖溶液，上样速度不超过300ml/min；进样完毕，设置离心机转速30000rpm、离心温度15℃、离心时间3小时，区带离心后收集蔗糖浓度为1％～42％范围内的液段；然后用超滤法去除蔗糖，纯化后的病毒裂解液经除菌过滤，即为单价原液；
8)半成品制备：根据各单价原液的血凝素含量，将各型流感病毒按同一血凝素含量进行半成品配制，血凝素配制量在
Figure FDA0002325260830000021
范围内，加入0.01mol/L磷酸盐缓冲液稀释，即为半成品；
9)成品制备：半成品经过滤分装、包装、检定合格即为成品，用于预防四种流行性感冒病毒引起的流行性感冒。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤4)中，连续流区带离心机为eKII连续流超速区带离心机。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤5)中，采用BPG300/950装填Sepharose-4FF快速流凝胶介质。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤7)中，区带离心机采用CP70区带离心机。
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