CN111060577A - 一种消除lamp背景干扰的比率型电化学生物传感器、构建方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种消除LAMP背景干扰的比率型电化学生物传感器、构建方法及应用。本发明利用目标物短链DNA为LAMP扩增外引物,其副产物氢离子诱导i‑motif构象转换,组装金属离子DNAzyme和循环剪切,实现对LAMP复杂体系及产物进行分离纯化;无需任何酶介入,在电极表面触发两条分别标记有电活性探针亚甲蓝和二茂铁的DNA发夹进行定向杂交,二者分别远离和靠近电极表面时,其电流信号比值具有高灵敏和高特异性的目标物浓度线性相关性。本发明建立的比率型传感器的电极反应更加单一化,有效降低背景干扰和假阳性信号,显著提高灵敏度,为多种疾病标志物DNA的电化学检测提供新思路和技术手段。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学和电化学生物传感器技术领域,涉及一种消除LAMP背景干扰的比率型电化学生物传感器构建方法及应用。
背景技术
作为一种重要而高效的核酸放大技术,环介导等温扩增(LAMP)能在1小时内实现109复制扩增。LAMP反应过程中除生成长短不一的双链DNA主产物外,还有大量H+及焦磷酸,焦磷酸水解进一步产生H+。因此,LAMP反应溶液的pH会随目标引物的不同而发生改变。
由于LAMP技术具有反应条件温和、操作简便快速、无需特殊仪器、特异性高等优势,已在病原体检测、临床医疗、食品等领域得到广泛应用。目前,用于LAMP反应实时或终点产物的定量方法主要有凝胶电泳、浊度、比色和发光等;近来有报道将LAMP与电化学方法联用进行定量分析,如用pH计直接测定副产物H+的浓度,或将副产物焦磷酸转化成具有电活性的杂多酸沉淀进行间接定量。但是,这些方法的灵敏度偏低、稳定性较差、操作较繁琐,因而LAMP技术的实际应用受到极大限制。针对这些局限性,有研究者通过微流控或毛细管实施LAMP反应,或利用磁珠组装LAMP乳液微反应器等进行改进。但是这些方法需要特殊设备、成本高,且后续分离、破乳、洗脱等过程繁琐耗时;在反应体系中引入新的试剂还可能加剧整个过程的不确定性,导致LAMP反应产物更加复杂多元,给后续定量检测带来更大的潜在干扰和假阳性信号,势必显著降低LAMP技术定量检测的特异性和灵敏度。最近,申请人用两种目标长链DNA为LAMP模板,反应H+作为外部化学刺激,调控具有pH依赖性的特殊DNA纳米结构构象改变或诱导i-motif二聚体形成,将目标输入转换为氧化还原探针的电化学信号,并结合酶剪切支持的DNA行走二次放大,实现高灵敏DNA电化学生物测定。
但是,这些方法直接引入LAMP反应溶液,其复杂的产物体系易引起极大的背景干扰和假阳性信号,且仅用单一探针读出电化学信号,导致检测灵敏度偏低。因此,纯化LAMP体系及产物并结合其他生物放大技术,对于充分降低背景信号、显著改善灵敏度、进一步拓宽LAMP技术应用于超低含量疾病标志物DNA的高特异性准确检测,具有极大的必要性和重要现实意义。而这一过程也极具挑战性,实现难度较大。
金属离子DNAzymes具有比核酸酶和蛋白酶更稳定的化学性质和热稳定性,其底物链和催化链都具有良好的易编程性;无需其他蛋白酶催化,金属离子即能特异性识别相应DNAzymes的底物链并进行剪切,剪切后的两DNA片段易适应于各种不同设计体系且不影响其催化活性。催化发夹自组装通过发夹链置换即可等温快速进行,无需任何酶参与,是一种典型且简单方便的信号转换和放大方法,反应输出的众多双链具有极大的可调控性和适应性,在生物敏感和生物分析领域具有极大的应用潜力。
相较于光学方法,电化学方法作为一种定量检测手段,具有信号窗口宽、灵敏度高、稳定性良好、操作简便快速,电极表面修饰易于调控、灵活性大、通用性强等特点,在生化分析、临床医学、环境监测等领域呈现了极高的应用优势。LMAP扩增与电化学检测结合,有望进一步拓宽LAMP技术应用范围。但对LAMP反应体系进行有效的分离处理,有利于获得更加单一化的电极表面反应体系、反应进程的可控性和指向更明确。这是有效避免复杂LAMP反应体系的背景干扰和假阳性信号,进一步提高LAMP技术的分析特异性和灵敏度的前提和基础。
发明内容
鉴于此,本发明的目的在于提供一种消除LAMP背景干扰的比率型电化学生物传感器、构建方法及应用。
为达到上述目的,本发明提供如下技术方案:
1、一种消除LAMP背景干扰的比率型电化学生物传感器的构建方法,在电极表面固载MB-H1、Fc-H2以及燃料链F*,驱动H1和H2进行等温催化发夹自组装,即可完成所述传感器的构建;其中,所述F*以溶液形式滴加至电极表面,该溶液制备过程如下:先将底物链S*与纳米金修饰的磁性Fe3O4微球(Au@Fe3O4)结合,并与单链I*互补杂交,再加入hDNA(目标物DNA)为外引物的LAMP反应溶液,诱导I*转换为i-motif结构,同时驱动Mg2+-DNAzyme组装和特异性剪切并释放F*,收集含有F*的上层溶液即可。以HIV标志物DNA(21-nt)为hDNA分析模型,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
hDNA:5’-ACTGCTAGAGATTTTCCACAT-3’,如SEQ ID NO.1所示。
优选的,所述LAMP反应溶液是利用5μL不同浓度的hDNA与2μL模板DNA(10nM)、2μL外引物B3(0.5μM)、各3μL的内引物BIP(2μM)和FIP(2μM)、1μL聚合酶Bst(0.25U/μL)和1μLdNTPs(2.5mM)于PCR仪中闭管反应而得。B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示,FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
进一步优选的,闭管反应的温度为65℃,时间为30分钟。
进一步优选的,所述模板DNA是基于hDNA的碱基序列设计(197-nt),包括六个杂交区(B3-B2-B1-F1c-F2c-F3c),其F3C与hDNA互补,如SEQ ID NO.2所示。
优选的,在制备含F*的溶液过程中,每一步通过磁性离心分离实现溶液纯化,根据实验设计分别收集沉积物或上层清液。
优选的,S*与磁性Au@Fe3O4微球通过Au-N键结合,反应时间为12小时,反应温度为室温;S*与I*互补杂交反应时间为1小时,反应温度为室温;LAMP反应溶液加入后的反应时间为1小时,反应温度为室温。
进一步优选的,所述底物链S*的3’端修饰氨基-NH2,中间rA为Mg2+的特异性剪切位点,从rA靠近5’端的16个碱基序列为F*,其中靠近rA的9个碱基互补于I*。S*的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
进一步优选的,所述单链I*(19-nt)富含14个C碱基,具有pH敏感性,在弱酸性条件能折叠为分子内i-motif结构,其核苷酸序列为:5’-CCCCTCCCTTTCCCCTCCC-3’,如SEQ IDNO.6所示。
进一步优选的,所述F*含16个碱基,其序列为:5’-TTCATGGGGAGGGGAT-3’,如SEQID NO.9所示。
优选的,Mg2+-DNAzyme组装和特异性剪切反应的具体过程是:向上述溶液中加入催化链C*和Mg2+,C*与S*杂交形成Mg2+-DNAzyme,同时底物链S*被Mg2+特异性剪切为两段,其中远离Au@Fe3O4靠近5’端的序列片段为F*。
进一步优选的,所述催化链C*的5’端10个碱基和3’端6个碱基分别与C*以rA为界的3’端和5’端相应碱基互补。
进一步优选的,所述C*的序列为:5’-AAATACTTATATCCGAGCCGGTCGAAATCCCC-3’,如SEQ ID NO.8所示。
进一步优选的,C*和Mg2+加入后的反应时间为30分钟,反应温度为室温。
优选的,所述电极为直径4mm的玻碳电极,并在其表面于质量浓度1%HAuCl4溶液中进行恒电位电沉积金。
优选的,固载的具体方法是:在上述电极表面分别滴加MB-H1和封闭剂HT,再滴加含F*的溶液和Fc-H2即可。
进一步优选的,MB-H1和封闭剂HT孵育时间分别为16小时和20分钟,反应温度为室温;F*和Fc-H2孵育时间为2小时,反应温度为室温。
优选的,所述MB-H1、Fc-H2的制备方法为:在发夹H1的3’端标记亚甲蓝MB,5’端修饰氨基-NH2,即为MB-H1(电化学信号探针1);在H2的3’端标记二茂铁Fc,即为Fc-H2(电化学信号探针2);H1和H2有28个碱基互补。其核苷酸序列如下:
H1:5’-SH-TCCCCTCCCCATGAAAGAAGAGATGGGG-3’,如SEQ ID NO.10所示;
H2:5’-CCCCATCTCTTCTTTCATGGGGAGGGGAGAAAGAAGAGAT-3’,如SEQ ID NO.11所示。
2、利用上述方法构建得到的一种消除LAMP背景干扰的比率型电化学生物传感器。
3、上述传感器在相关疾病标志物目标物DNA(hDNA)定量分析检测中的应用。
4、对上述传感器测定电化学响应信号,利用电流比值实现对hDNA的定量电化学检测。
优选的,具体方法是:将传感器温和洗涤后,在磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH 7.0,含10mM Na2HPO4,10mM KH2PO4和2mM MgCl2)中测定MB和Fc的方波伏安(SWV)信号,二者峰电流的比值对tDNA浓度具有线性依赖性,实现对hDNA的高灵敏和高特异性定量检测。
本发明的有益效果在于:
本发明建立的比率型电化学检测方法,选用的目标物短链DNA作为LAMP扩增的外引物,利用反应H+诱导i-motif构象改变,并组装Mg2+-DNAzyme及特异性剪切,将分析目标物转换为另一序列特异性单链DNA片段的放大输出;引发电极表面两条标记有电活性探针亚甲蓝和二茂铁的发夹进行定向一步自组装,二次放大响应信号的同时引起两种探针分别远离和靠近电极表面,获得一减一增的电流信号。其有益效果概括如下:
(1)本发明以Au@Fe3O4磁性微球为基底,借助Mg2+-DNAzyme组装及剪切,通过磁性离心分离对LAMP反应后的复杂体系及产物进行纯化;
(2)无需任何酶的介入,修饰电极表面的定向原位反应体系更加单一化,有效降低背景干扰引起的假阳性信号;
(3)利用催化发夹自组装二次放大响应信号,并引起两种电活性小分子分别远离和靠近电极表面,其电流信号的比值具有目标DNA浓度线性相关性。本发明降低LAMP背景干扰的比率型电化学生物传感器方法能显著提高检测灵敏度和改善特异性,为多种疾病标志物DNA的电化学检测提供新的思路和技术手段。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚,本发明提供如下附图进行说明:
图1:Mg2+-DNAzyme包含有底物链S*和催化链C*的碱基序列、包含F*片段的S*序列、以及MB和-NH2标记的H1(MB-H1)和Fc标记的H2(Fc-H2)的发夹结构及其碱基序列。
图2:LAMP扩增反应释放H+(LAMP(H+))过程示意图(目标HIV标志物hDNA为ALMP外引物F3)。插入图片为无tDNA参与的空白(Blank)和有tDNA参与的LAMP反应焦磷酸镁(Mg2P2O7)白色沉淀。
图3:LAMP(H+)诱导i-motif形成组装Mg2+-DNAzyme并剪切释放F*过程示意图。注:每一步过程都经磁性离心分离进行纯化。
图4:低背景比率型电化学生物传感器构建过程示意图。将分离后的F*滴加到修饰电极表面,引发MB-H1和Fc-H2等温催化发夹自组装,MB离开而Fc靠近电极表面,二者的SWV电流信号分别减小和增强。插图为该比率型传感器检测体系中没有和有目标物hDNA存在的SWV响应曲线。
图5:电极逐步修饰过程的(A)循环伏安和(B)交流阻抗图,曲线a~e分别为裸玻碳电极(GCE)、depAu/GCE、H1/depAu/GCE、HT/H1/depAu/GCE、和H2+F*/HT/H1/depAu/GCE注:用无MB标记H1和无Fc标记H2孵育电极,测试底液为5mM[Fe(CN)6]3-/4-。
图6:比率型电化学传感器在PBS(pH 7.0)中的SWV信号,曲线a~c分别为MB-H1/depAu/GCE、HT/MB-H1/depAu/GCE(无hDNA)和Fc-H2+F*/HT/MB-H1/depAu/GCE(有10pMhDNA)。
具体实施方式
下面将结合附图,对本发明的优选实施例进行详细的描述。
本发明涉及的室温是指25℃。
实施例1:
1、序列设计:
以HIV特异性标志物DNA为目标物(hDNA)分析模型并作为LAMP反应外引物F3,在NUPACK网站(www.nupack.org)设计全部基于hDNA的相关碱基序列。如表1所示。
表1.本发明所用DNA碱基序列
其中,由S*和C*杂交形成的Mg2+-DNAzyme、MB-H1及Fc-H2的发夹构型及碱基序列如图1所示。
2、一种消除LAMP背景干扰的比率型电化学生物传感器、构建方法及应用,具体步骤如下:
(1)LAMP反应(图2):目标物hDNA(F3)与模板DNA、B3、BIP、FIP、聚合酶Bst和dNTPs于PCR仪中闭管反应,扩增产物溶液含大量H+(LAMP(H+))
(2)LAMP(H+)诱导Mg2+-DNAzyme组装及剪切(图3):首先,将新制备的纳米金修饰在磁性Fe3O4微球表面(Au@Fe3O4),底物链S*通过Au-S键结合并与I*互补杂交;然后,加入上述LAMP反应溶液,LAMP(H+)诱导I*转换为i-motif构象后,加入C*和Mg2+,S*与C*杂交形成Mg2+-DNAzyme,同时S*被Mg2+特异性剪切为两段,远离Au@Fe3O4近5’端的序列片段为燃料链F*;收集含F*的上层溶液备用。(说明:上述每一步合成过程都经磁性离心分离,根据实验设计收集底部沉积物或上层清液。)
(3)电极修饰及组装(图4):在电沉积金的玻碳电极表面分别滴加MB-H1和封闭剂HT;继续滴加含F*的上层清液和Fc-H2,H1和H2发夹打开并杂交;每一步孵育后都经温和洗涤。
上述过程中:
步骤(1)中反应温度为65℃,PCR仪闭管反应时间为30分钟。
步骤(2)中S*通过Au-N键结合的反应时间为12小时,反应温度为室温;
步骤(2)中S*与I*互补杂交反应时间为1小时,反应温度为室温;
步骤(3)中LAMP反应副产物H+加入后的孵育时间为1小时,温度为室温;
步骤(3)中C*和Mg2+加入后的反应时间为30分钟,反应温度为室温;
步骤(4)中MB-H1和封闭剂HT孵育时间分别为16小时和20分钟,反应温度为室温;
步骤(5)中F*和Fc-H2孵育时间为2小时,反应温度为室温。
(4)电化学行为可行性验证(图5)
上述电极制备过程中,每一步温和洗涤后表征其电化学响应行为,在含5mM[Fe(CN)6]3-/4-的1.0mL PBS(pH 7.0)中分别测定CV和EIS信号。特别说明:电极用无MB和Fc标记的H1和H2进行孵育。CV的电位扫描范围为-0.2~0.6V,扫速为100mV s-1;EIS的频率范围为10-1~105Hz,激发电压为5mV,表观电位为220mV。
(5)电化学响应信号检测(图6):按上述方法,分别用MB-H1和Fc-H2制备电极,将其置于0.1M PBS(pH 7.0)中,测定MB和Fc的SWV电化学信号,电位扫描范围为-0.5~0.6V,频率为15Hz。
测定不同浓度hDNA进行LAMP反应后,修饰电极的SWV信号,通过MB和Fc的峰电流比值考察定量测定hDNA的线性范围、检测下限、灵敏度、稳定性、重现性及实际应用可行性等分析性能(平行测定10次)。
最后说明的是,以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述,但本领域技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其做出各种各样的改变,而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 西南大学
<120> 一种消除LAMP背景干扰的比率型电化学生物传感器、构建方法及应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
actgctagag attttccaca t 21
<210> 2
<211> 197
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
actttatgct tccggctcgt atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag 60
gaaacgtacc cggggatcct ctagagtcga cctgcaggca tgcaagctta caacgtcgtg 120
actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcggtaata gcgaagaggc ccgcacatgt 180
ggaaaatctc tagcagt 197
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
actttatgct tccggctcgt a 21
<210> 4
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgactctaga ggatccccgg gtactttttg ttgtgtggaa ttgtgagcgg at 52
<210> 5
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acaacgtcgt gactgggaaa accctaagaa aagaaaaggt gcgggcctct tcgctattac 60
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cccctccctt tcccctccc 19
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttcatgggga ggggatgata agtattt 27
<210> 8
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aaatacttat atccgagccg gtcgaaatcc cc 32
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttcatgggga ggggat 16
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tcccctcccc atgaaagaag agatgggg 28
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccccatctct tctttcatgg ggaggggaga aagaagagat 40
Claims (10)
1.一种消除LAMP背景干扰的比率型电化学生物传感器的构建方法,其特征在于,在电极表面固载MB-H1、Fc-H2以及燃料链F*,驱动H1和H2进行等温催化发夹自组装,即可完成所述传感器的构建;其中,所述F*以溶液形式滴加至电极表面,该溶液制备过程如下:先将底物链S*与纳米金修饰的磁性Fe3O4微球结合,并与单链I*互补杂交,再加入目标DNA为外引物F3的LAMP反应溶液,诱导I*转换为i-motif结构,同时驱动Mg2+-DNAzyme组装和特异性剪切并释放F*,收集含有F*的上层溶液即可。
2.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述LAMP反应溶液是利用5μL不同浓度的hDNA与2μL模板DNA、2μL外引物B3、各3μL的内引物BIP和FIP、1μL聚合酶Bst和1μLdNTPs于PCR仪中闭管反应而得。
3.根据权利要求2所述的构建方法,其特征在于,S*与磁性Au@Fe3O4微球通过Au-N键结合,反应时间为12小时,反应温度为室温;S*与I*互补杂交反应时间为1小时,反应温度为室温;LAMP反应溶液加入后的反应时间为1小时,反应温度为室温。
4.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,Mg2+-DNAzyme组装和特异性剪切反应的具体过程是:向上述溶液中加入催化链C*和Mg2+,C*与S*杂交形成Mg2+-DNAzyme,同时底物链S*被Mg2+特异性剪切为两段,其中远离Au@Fe3O4靠近5’端的序列片段为F*。
5.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述电极为直径4mm的玻碳电极,并在其表面于HAuCl4溶液中进行恒电位电沉积金。
6.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,固载的具体方法是:在上述电极表面分别滴加MB-H1和封闭剂HT,再滴加含F*的溶液和Fc-H2即可。
7.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述MB-H1、Fc-H2的制备方法为:在发夹H1的3’端标记亚甲蓝MB,5’端修饰氨基-NH2,即为MB-H1;在H2的3’端标记二茂铁Fc,即为Fc-H2;H1和H2有28个碱基互补。
8.利用权利要求1~7中任一项所述方法构建得到的一种消除LAMP背景干扰的比率型电化学生物传感器。
9.权利要求8所述电化学生物传感器在相关疾病标志物目标DNA定量检测中的应用。
10.一种消除LAMP背景干扰的比率型定量检测方法,利用权利要求8所述传感器测定MB和Fc的电化学响应信号,从而实现对目标DNA的定量检测。
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CN114200137B (zh) * | 2020-09-16 | 2023-09-01 | 四川大学 | 一种以商品化磁珠为内标的比率免疫分析方法 |
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CN111060577B (zh) | 2022-03-11 |
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