CN111051533B - 消除再生试剂残留的方法 - Google Patents
消除再生试剂残留的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111051533B CN111051533B CN201780094653.2A CN201780094653A CN111051533B CN 111051533 B CN111051533 B CN 111051533B CN 201780094653 A CN201780094653 A CN 201780094653A CN 111051533 B CN111051533 B CN 111051533B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequencing
- solid support
- nucleic acid
- reagent
- disulfide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims description 169
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 title claims description 57
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 title claims description 57
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 122
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 118
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 117
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 117
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 80
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 75
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 57
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 47
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims abstract description 24
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 23
- 230000003716 rejuvenation Effects 0.000 claims abstract description 15
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 251
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 21
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 21
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 16
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 16
- OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N cystamine Chemical compound CCSSCCN OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 229940099500 cystamine Drugs 0.000 claims description 12
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 claims description 12
- KYNFOMQIXZUKRK-UHFFFAOYSA-N 2,2'-dithiodiethanol Chemical compound OCCSSCCO KYNFOMQIXZUKRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 claims description 4
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-L 5-[(3-carboxylato-4-nitrophenyl)disulfanyl]-2-nitrobenzoate Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)[O-])=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C([O-])=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N D-cystine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CSSC[C@@H](N)C(O)=O LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 abstract description 17
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 abstract description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 68
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 55
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 37
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 37
- -1 EST Substances 0.000 description 34
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 29
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 24
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 description 20
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 19
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 19
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 12
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 12
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 12
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 11
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 11
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 11
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 11
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 10
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 10
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 10
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 8
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 description 8
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 description 8
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 8
- 125000000392 cycloalkenyl group Chemical group 0.000 description 8
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 8
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 7
- 125000001183 hydrocarbyl group Chemical group 0.000 description 7
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 6
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 6
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 description 6
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 6
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 6
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 6
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 6
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 6
- 238000007841 sequencing by ligation Methods 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 239000006226 wash reagent Substances 0.000 description 6
- JJLJMEJHUUYSSY-UHFFFAOYSA-L Copper hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Cu+2] JJLJMEJHUUYSSY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 239000005750 Copper hydroxide Substances 0.000 description 5
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 5
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 5
- 229910001956 copper hydroxide Inorganic materials 0.000 description 5
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 5
- RUTXIHLAWFEWGM-UHFFFAOYSA-H iron(3+) sulfate Chemical compound [Fe+3].[Fe+3].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O RUTXIHLAWFEWGM-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 5
- 229910000360 iron(III) sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- PCDQPRRSZKQHHS-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Triphosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 PCDQPRRSZKQHHS-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- XSCHRSMBECNVNS-UHFFFAOYSA-N benzopyrazine Natural products N1=CC=NC2=CC=CC=C21 XSCHRSMBECNVNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JMXMXKRNIYCNRV-UHFFFAOYSA-N bis(hydroxymethyl)phosphanylmethanol Chemical compound OCP(CO)CO JMXMXKRNIYCNRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 4
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 description 4
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- HNJBEVLQSNELDL-UHFFFAOYSA-N pyrrolidin-2-one Chemical compound O=C1CCCN1 HNJBEVLQSNELDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RWRDLPDLKQPQOW-UHFFFAOYSA-N Pyrrolidine Chemical compound C1CCNC1 RWRDLPDLKQPQOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 3
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 3
- 125000002950 monocyclic group Chemical group 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 3
- 125000006413 ring segment Chemical group 0.000 description 3
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 3
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 3
- 125000002813 thiocarbonyl group Chemical group *C(*)=S 0.000 description 3
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- LBUJPTNKIBCYBY-UHFFFAOYSA-N 1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound C1=CC=C2CCCNC2=C1 LBUJPTNKIBCYBY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WNXJIVFYUVYPPR-UHFFFAOYSA-N 1,3-dioxolane Chemical compound C1COCO1 WNXJIVFYUVYPPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FCEHBMOGCRZNNI-UHFFFAOYSA-N 1-benzothiophene Chemical compound C1=CC=C2SC=CC2=C1 FCEHBMOGCRZNNI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BAXOFTOLAUCFNW-UHFFFAOYSA-N 1H-indazole Chemical compound C1=CC=C2C=NNC2=C1 BAXOFTOLAUCFNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTWKINKGAHTPFJ-UHFFFAOYSA-N 2-(butan-2-yldisulfanyl)butane Chemical compound CCC(C)SSC(C)CC QTWKINKGAHTPFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 2-amino-7-methyl-1,7-dihydro-6H-purin-6-one Chemical class NC1=NC(O)=C2N(C)C=NC2=N1 FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YCLSOMLVSHPPFV-UHFFFAOYSA-N 3-(2-carboxyethyldisulfanyl)propanoic acid Chemical compound OC(=O)CCSSCCC(O)=O YCLSOMLVSHPPFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VRJHQPZVIGNGMX-UHFFFAOYSA-N 4-piperidinone Chemical compound O=C1CCNCC1 VRJHQPZVIGNGMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OVONXEQGWXGFJD-UHFFFAOYSA-N 4-sulfanylidene-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound SC=1C=CNC(=O)N=1 OVONXEQGWXGFJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- OIVLITBTBDPEFK-UHFFFAOYSA-N 5,6-dihydrouracil Chemical compound O=C1CCNC(=O)N1 OIVLITBTBDPEFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 5-(hydroxymethyl)cytosine Chemical compound NC=1NC(=O)N=CC=1CO RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZKLKXUYJIUGECX-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-1h-pyrimidine-2,4-dione;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.CC1=CNC(=O)NC1=O ZKLKXUYJIUGECX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HCGHYQLFMPXSDU-UHFFFAOYSA-N 7-methyladenine Chemical class C1=NC(N)=C2N(C)C=NC2=N1 HCGHYQLFMPXSDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 2
- XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N Adenosine diphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028732 Concatemer Proteins 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- CETBSQOFQKLHHZ-UHFFFAOYSA-N Diethyl disulfide Chemical compound CCSSCC CETBSQOFQKLHHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUUVPOWQJOLRAS-UHFFFAOYSA-N Diphenyl disulfide Chemical compound C=1C=CC=CC=1SSC1=CC=CC=C1 GUUVPOWQJOLRAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 2
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N Furan Chemical compound C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGWNDRXFNXRZMB-UUOKFMHZSA-N GDP Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O QGWNDRXFNXRZMB-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N Guanosine-5'-triphosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N Morpholine Chemical compound C1COCCN1 YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N Naphthalene Chemical compound C1=CC=CC2=CC=CC=C21 UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N Piperazine Chemical compound C1CNCCN1 GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KYQCOXFCLRTKLS-UHFFFAOYSA-N Pyrazine Chemical compound C1=CN=CC=N1 KYQCOXFCLRTKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N Pyrrole Chemical compound C=1C=CNC=1 KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SMWDFEZZVXVKRB-UHFFFAOYSA-N Quinoline Chemical compound N1=CC=CC2=CC=CC=C21 SMWDFEZZVXVKRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- DHXVGJBLRPWPCS-UHFFFAOYSA-N Tetrahydropyran Chemical compound C1CCOCC1 DHXVGJBLRPWPCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589500 Thermus aquaticus Species 0.000 description 2
- YTPLMLYBLZKORZ-UHFFFAOYSA-N Thiophene Chemical compound C=1C=CSC=1 YTPLMLYBLZKORZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical class O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XCCTYIAWTASOJW-XVFCMESISA-N Uridine-5'-Diphosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 XCCTYIAWTASOJW-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- DJJCXFVJDGTHFX-UHFFFAOYSA-N Uridinemonophosphate Natural products OC1C(O)C(COP(O)(O)=O)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DJJCXFVJDGTHFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000004414 alkyl thio group Chemical group 0.000 description 2
- 125000005110 aryl thio group Chemical group 0.000 description 2
- 125000004104 aryloxy group Chemical group 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CUFNKYGDVFVPHO-UHFFFAOYSA-N azulene Chemical compound C1=CC=CC2=CC=CC2=C1 CUFNKYGDVFVPHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IOJUPLGTWVMSFF-UHFFFAOYSA-N benzothiazole Chemical compound C1=CC=C2SC=NC2=C1 IOJUPLGTWVMSFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical class NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DAEAPNUQQAICNR-RRKCRQDMSA-K dADP(3-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)O1 DAEAPNUQQAICNR-RRKCRQDMSA-K 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N dCTP Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO[P@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- CIKGWCTVFSRMJU-KVQBGUIXSA-N dGDP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 CIKGWCTVFSRMJU-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- QHWZTVCCBMIIKE-SHYZEUOFSA-N dUDP Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 QHWZTVCCBMIIKE-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical class 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- YSQZSPCQDXHJDJ-UHFFFAOYSA-N di-n-pentyl disulfide Natural products CCCCCSSCCCCC YSQZSPCQDXHJDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PFRGXCVKLLPLIP-UHFFFAOYSA-N diallyl disulfide Chemical compound C=CCSSCC=C PFRGXCVKLLPLIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ALVPFGSHPUPROW-UHFFFAOYSA-N dipropyl disulfide Chemical compound CCCSSCCC ALVPFGSHPUPROW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- QGWNDRXFNXRZMB-UHFFFAOYSA-N guanidine diphosphate Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O QGWNDRXFNXRZMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N guanosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 235000013928 guanylic acid Nutrition 0.000 description 2
- 125000004438 haloalkoxy group Chemical group 0.000 description 2
- 125000001188 haloalkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 2
- 125000004475 heteroaralkyl group Chemical group 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 239000011229 interlayer Substances 0.000 description 2
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 125000001261 isocyanato group Chemical group *N=C=O 0.000 description 2
- DRAVOWXCEBXPTN-UHFFFAOYSA-N isoguanine Chemical compound NC1=NC(=O)NC2=C1NC=N2 DRAVOWXCEBXPTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- AWJUIBRHMBBTKR-UHFFFAOYSA-N isoquinoline Chemical compound C1=NC=CC2=CC=CC=C21 AWJUIBRHMBBTKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N monobenzene Natural products C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004651 near-field scanning optical microscopy Methods 0.000 description 2
- 102000044158 nucleic acid binding protein Human genes 0.000 description 2
- 108700020942 nucleic acid binding protein Proteins 0.000 description 2
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 2
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003003 phosphines Chemical class 0.000 description 2
- LFSXCDWNBUNEEM-UHFFFAOYSA-N phthalazine Chemical compound C1=NN=CC2=CC=CC=C21 LFSXCDWNBUNEEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 125000003367 polycyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical class 0.000 description 2
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 125000005017 substituted alkenyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000000547 substituted alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000004426 substituted alkynyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003107 substituted aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000005346 substituted cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 2
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N succinimide Chemical compound O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000475 sulfinyl group Chemical group [*:2]S([*:1])=O 0.000 description 2
- 125000000472 sulfonyl group Chemical group *S(*)(=O)=O 0.000 description 2
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 2
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 2
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000005152 trihalomethanesulfonyl group Chemical group 0.000 description 2
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- DJJCXFVJDGTHFX-XVFCMESISA-N uridine 5'-monophosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DJJCXFVJDGTHFX-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UGUHFDPGDQDVGX-UHFFFAOYSA-N 1,2,3-thiadiazole Chemical compound C1=CSN=N1 UGUHFDPGDQDVGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JYEUMXHLPRZUAT-UHFFFAOYSA-N 1,2,3-triazine Chemical compound C1=CN=NN=C1 JYEUMXHLPRZUAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BBVIDBNAYOIXOE-UHFFFAOYSA-N 1,2,4-oxadiazole Chemical compound C=1N=CON=1 BBVIDBNAYOIXOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YGTAZGSLCXNBQL-UHFFFAOYSA-N 1,2,4-thiadiazole Chemical compound C=1N=CSN=1 YGTAZGSLCXNBQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KTZQTRPPVKQPFO-UHFFFAOYSA-N 1,2-benzoxazole Chemical compound C1=CC=C2C=NOC2=C1 KTZQTRPPVKQPFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CIISBYKBBMFLEZ-UHFFFAOYSA-N 1,2-oxazolidine Chemical compound C1CNOC1 CIISBYKBBMFLEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LKLLNYWECKEQIB-UHFFFAOYSA-N 1,3,5-triazinane Chemical compound C1NCNCN1 LKLLNYWECKEQIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BCMCBBGGLRIHSE-UHFFFAOYSA-N 1,3-benzoxazole Chemical compound C1=CC=C2OC=NC2=C1 BCMCBBGGLRIHSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VDFVNEFVBPFDSB-UHFFFAOYSA-N 1,3-dioxane Chemical compound C1COCOC1 VDFVNEFVBPFDSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IMLSAISZLJGWPP-UHFFFAOYSA-N 1,3-dithiolane Chemical compound C1CSCS1 IMLSAISZLJGWPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IVJFXSLMUSQZMC-UHFFFAOYSA-N 1,3-dithiole Chemical compound C1SC=CS1 IVJFXSLMUSQZMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WJJSZTJGFCFNKI-UHFFFAOYSA-N 1,3-oxathiolane Chemical compound C1CSCO1 WJJSZTJGFCFNKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OGYGFUAIIOPWQD-UHFFFAOYSA-N 1,3-thiazolidine Chemical compound C1CSCN1 OGYGFUAIIOPWQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JBYHSSAVUBIJMK-UHFFFAOYSA-N 1,4-oxathiane Chemical compound C1CSCCO1 JBYHSSAVUBIJMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DFBZGEDYBUZOCW-UHFFFAOYSA-N 1-(2-hydroxybutyldisulfanyl)butan-2-ol Chemical compound CCC(O)CSSCC(O)CC DFBZGEDYBUZOCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GAYUSSOCODCSNF-UHFFFAOYSA-N 1-(dodecyldisulfanyl)dodecane Chemical compound CCCCCCCCCCCCSSCCCCCCCCCCCC GAYUSSOCODCSNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AROCLDYPZXMJPW-UHFFFAOYSA-N 1-(octyldisulfanyl)octane Chemical compound CCCCCCCCSSCCCCCCCC AROCLDYPZXMJPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YCBVTHJPQCNICU-UHFFFAOYSA-N 1-(propan-2-yldisulfanyl)propane Chemical compound CCCSSC(C)C YCBVTHJPQCNICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TZOVOULUMXXLOJ-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-4-[(4-methylphenyl)disulfanyl]benzene Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1SSC1=CC=C(C)C=C1 TZOVOULUMXXLOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CUCJJMLDIUSNPU-UHFFFAOYSA-N 1-oxidopiperidin-1-ium Chemical compound [O-][NH+]1CCCCC1 CUCJJMLDIUSNPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HYZJCKYKOHLVJF-UHFFFAOYSA-N 1H-benzimidazole Chemical compound C1=CC=C2NC=NC2=C1 HYZJCKYKOHLVJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KHWCHTKSEGGWEX-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyadenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 KHWCHTKSEGGWEX-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- LTFMZDNNPPEQNG-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 LTFMZDNNPPEQNG-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- ZIMCZOLRXKPXLN-UHFFFAOYSA-N 2,2,4-trimethyl-4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yldisulfanyl)pentane Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)SSC(C)(C)CC(C)(C)C ZIMCZOLRXKPXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DLLMHEDYJQACRM-UHFFFAOYSA-N 2-(carboxymethyldisulfanyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CSSCC(O)=O DLLMHEDYJQACRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CLMXSBZIYJITQU-UHFFFAOYSA-N 2-(ethyldisulfanyl)-2-methylpropane Chemical compound CCSSC(C)(C)C CLMXSBZIYJITQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BKCNDTDWDGQHSD-UHFFFAOYSA-N 2-(tert-butyldisulfanyl)-2-methylpropane Chemical compound CC(C)(C)SSC(C)(C)C BKCNDTDWDGQHSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IZXIZTKNFFYFOF-UHFFFAOYSA-N 2-Oxazolidone Chemical compound O=C1NCCO1 IZXIZTKNFFYFOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IMSODMZESSGVBE-UHFFFAOYSA-N 2-Oxazoline Chemical compound C1CN=CO1 IMSODMZESSGVBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HTOVHZGIBCAAJU-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-propyl-1h-purin-6-one Chemical compound CCCC1(N)NC(=O)C2=NC=NC2=N1 HTOVHZGIBCAAJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XQCZBXHVTFVIFE-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-hydroxypyrimidine Chemical compound NC1=NC=CC(O)=N1 XQCZBXHVTFVIFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 2-aminopurine Chemical compound NC1=NC=C2N=CNC2=N1 MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LFRBEBAWOFBWRJ-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-2-(2-methylpentan-2-yldisulfanyl)pentane Chemical compound CCCC(C)(C)SSC(C)(C)CCC LFRBEBAWOFBWRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SLAMLWHELXOEJZ-UHFFFAOYSA-N 2-nitrobenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O SLAMLWHELXOEJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- USCCECGPGBGFOM-UHFFFAOYSA-N 2-propyl-7h-purin-6-amine Chemical compound CCCC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 USCCECGPGBGFOM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RVBUGGBMJDPOST-UHFFFAOYSA-N 2-thiobarbituric acid Chemical compound O=C1CC(=O)NC(=S)N1 RVBUGGBMJDPOST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BCHZICNRHXRCHY-UHFFFAOYSA-N 2h-oxazine Chemical compound N1OC=CC=C1 BCHZICNRHXRCHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 3-azaniumyl-2-hydroxypropanoate Chemical compound NCC(O)C(O)=O BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WEQPBCSPRXFQQS-UHFFFAOYSA-N 4,5-dihydro-1,2-oxazole Chemical compound C1CC=NO1 WEQPBCSPRXFQQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MRUWJENAYHTDQG-UHFFFAOYSA-N 4H-pyran Chemical compound C1C=COC=C1 MRUWJENAYHTDQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UCZQXJKDCHCTAI-UHFFFAOYSA-N 4h-1,3-dioxine Chemical compound C1OCC=CO1 UCZQXJKDCHCTAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AHASLLQCJNEMQG-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-1h-pyrimidine-2,4-dione;phosphono dihydrogen phosphate Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O.OP(O)(=O)OP(O)(O)=O AHASLLQCJNEMQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLAQATDNGLKIEV-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-2-sulfanylidene-1h-pyrimidin-4-one Chemical compound CC1=CNC(=S)NC1=O ZLAQATDNGLKIEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UJBCLAXPPIDQEE-UHFFFAOYSA-N 5-prop-1-ynyl-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound CC#CC1=CNC(=O)NC1=O UJBCLAXPPIDQEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JFZXQICPVWJFLL-UHFFFAOYSA-N 6-(6,6-dihydroxyhexyldisulfanyl)hexane-1,1-diol Chemical compound OC(O)CCCCCSSCCCCCC(O)O JFZXQICPVWJFLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCPSTSVLRXOYGS-UHFFFAOYSA-N 6-amino-1h-pyrimidine-2-thione Chemical compound NC1=CC=NC(S)=N1 DCPSTSVLRXOYGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNNARSZPGNJZIX-UHFFFAOYSA-N 6-amino-5-prop-1-ynyl-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound CC#CC1=CNC(=O)N=C1N QNNARSZPGNJZIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CKOMXBHMKXXTNW-UHFFFAOYSA-N 6-methyladenine Chemical compound CNC1=NC=NC2=C1N=CN2 CKOMXBHMKXXTNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVEXGJYMHHTVKP-UHFFFAOYSA-N 6-oxabicyclo[3.2.1]oct-3-en-7-one Chemical compound C1C2C(=O)OC1C=CC2 TVEXGJYMHHTVKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PFUVOLUPRFCPMN-UHFFFAOYSA-N 7h-purine-6,8-diamine Chemical compound C1=NC(N)=C2NC(N)=NC2=N1 PFUVOLUPRFCPMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PJRMXXVPTAABDK-UHFFFAOYSA-N 8-(8,8-dihydroxyoctyldisulfanyl)octane-1,1-diol Chemical compound OC(O)CCCCCCCSSCCCCCCCC(O)O PJRMXXVPTAABDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRYKDUPGBWLLHO-UHFFFAOYSA-N 8-azaadenine Chemical class NC1=NC=NC2=NNN=C12 HRYKDUPGBWLLHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGKBRPAAQSHTED-UHFFFAOYSA-N 8-oxoadenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1NC(=O)N2 RGKBRPAAQSHTED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 9H-purine-2,6-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035657 Abasia Diseases 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003805 Autism Diseases 0.000 description 1
- 208000020706 Autistic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZWIADYZPOWUWEW-XVFCMESISA-N CDP Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 ZWIADYZPOWUWEW-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- CUDSBWGCGSUXDB-UHFFFAOYSA-N Dibutyl disulfide Chemical compound CCCCSSCCCC CUDSBWGCGSUXDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SNGRPWPVGSSZGV-UHFFFAOYSA-N Ethyl propyl disulfide Chemical compound CCCSSCC SNGRPWPVGSSZGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WRYCSMQKUKOKBP-UHFFFAOYSA-N Imidazolidine Chemical compound C1CNCN1 WRYCSMQKUKOKBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SYNHCENRCUAUNM-UHFFFAOYSA-N Nitrogen mustard N-oxide hydrochloride Chemical compound Cl.ClCC[N+]([O-])(C)CCCl SYNHCENRCUAUNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- WOSGAAGZINXPOI-UHFFFAOYSA-N OC(CCCCSSCCCCC(O)O)O Chemical compound OC(CCCCSSCCCCC(O)O)O WOSGAAGZINXPOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCQWOFVYLHDMMC-UHFFFAOYSA-N Oxazole Chemical compound C1=COC=N1 ZCQWOFVYLHDMMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WYNCHZVNFNFDNH-UHFFFAOYSA-N Oxazolidine Chemical compound C1COCN1 WYNCHZVNFNFDNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- PCNDJXKNXGMECE-UHFFFAOYSA-N Phenazine Natural products C1=CC=CC2=NC3=CC=CC=C3N=C21 PCNDJXKNXGMECE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- WTKZEGDFNFYCGP-UHFFFAOYSA-N Pyrazole Chemical compound C=1C=NNC=1 WTKZEGDFNFYCGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000205156 Pyrococcus furiosus Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Chemical class 0.000 description 1
- 125000005631 S-sulfonamido group Chemical group 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589499 Thermus thermophilus Species 0.000 description 1
- 101000803959 Thermus thermophilus (strain ATCC 27634 / DSM 579 / HB8) DNA ligase Proteins 0.000 description 1
- YPWFISCTZQNZAU-UHFFFAOYSA-N Thiane Chemical compound C1CCSCC1 YPWFISCTZQNZAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N Thiazole Chemical compound C1=CSC=N1 FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- BZDVTEPMYMHZCR-JGVFFNPUSA-N [(2s,5r)-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)CC1 BZDVTEPMYMHZCR-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 1
- PGAVKCOVUIYSFO-UHFFFAOYSA-N [[5-(2,4-dioxopyrimidin-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 PGAVKCOVUIYSFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- IRLPACMLTUPBCL-FCIPNVEPSA-N adenosine-5'-phosphosulfate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@@H](CO[P@](O)(=O)OS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O IRLPACMLTUPBCL-FCIPNVEPSA-N 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 125000004450 alkenylene group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004419 alkynylene group Chemical group 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005576 amination reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 125000000732 arylene group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000852 azido group Chemical group *N=[N+]=[N-] 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- HNYOPLTXPVRDBG-UHFFFAOYSA-N barbituric acid Chemical compound O=C1CC(=O)NC(=O)N1 HNYOPLTXPVRDBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-N benzenesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940092714 benzenesulfonic acid Drugs 0.000 description 1
- MYONAGGJKCJOBT-UHFFFAOYSA-N benzimidazol-2-one Chemical compound C1=CC=CC2=NC(=O)N=C21 MYONAGGJKCJOBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- QRUDEWIWKLJBPS-UHFFFAOYSA-N benzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N[N][N]C2=C1 QRUDEWIWKLJBPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012964 benzotriazole Substances 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- LUFPJJNWMYZRQE-UHFFFAOYSA-N benzylsulfanylmethylbenzene Chemical compound C=1C=CC=CC=1CSCC1=CC=CC=C1 LUFPJJNWMYZRQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002619 bicyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- LEDIWWJKWAMGLD-UHFFFAOYSA-N bis(2-methylundecan-2-yl) disulfide Chemical compound CCCCCCCCCC(C)(C)SSC(C)(C)CCCCCCCCC LEDIWWJKWAMGLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L calcium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Ca+2] AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000920 calcium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 229910001861 calcium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002837 carbocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 125000005724 cycloalkenylene group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002993 cycloalkylene group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001995 cyclobutyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000582 cycloheptyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000640 cyclooctyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001511 cyclopentyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001559 cyclopropyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C1([H])* 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- JSRLJPSBLDHEIO-SHYZEUOFSA-N dUMP Chemical compound O1[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 JSRLJPSBLDHEIO-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- LTFMZDNNPPEQNG-UHFFFAOYSA-N deoxyguanylic acid Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1CC(O)C(COP(O)(O)=O)O1 LTFMZDNNPPEQNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- SNQXJPARXFUULZ-UHFFFAOYSA-N dioxolane Chemical compound C1COOC1 SNQXJPARXFUULZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VQRWLYMKQQBDFK-UHFFFAOYSA-N diphosphono hydrogen phosphate;5-methyl-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O.OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O VQRWLYMKQQBDFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 1
- JKFAIQOWCVVSKC-UHFFFAOYSA-N furazan Chemical compound C=1C=NON=1 JKFAIQOWCVVSKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 125000004446 heteroarylalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005549 heteroarylene group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004051 hexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- WJRBRSLFGCUECM-UHFFFAOYSA-N hydantoin Chemical compound O=C1CNC(=O)N1 WJRBRSLFGCUECM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940091173 hydantoin Drugs 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MTNDZQHUAFNZQY-UHFFFAOYSA-N imidazoline Chemical compound C1CN=CN1 MTNDZQHUAFNZQY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003253 isopropoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(O*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- ZLTPDFXIESTBQG-UHFFFAOYSA-N isothiazole Chemical compound C=1C=NSC=1 ZLTPDFXIESTBQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CTAPFRYPJLPFDF-UHFFFAOYSA-N isoxazole Chemical compound C=1C=NOC=1 CTAPFRYPJLPFDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003951 lactams Chemical class 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229940098779 methanesulfonic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- KVBGVZZKJNLNJU-UHFFFAOYSA-N naphthalene-2-sulfonic acid Chemical compound C1=CC=CC2=CC(S(=O)(=O)O)=CC=C21 KVBGVZZKJNLNJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001326 naphthylalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000006574 non-aromatic ring group Chemical group 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N olefin Natural products CCCCCCCC=C JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- WCPAKWJPBJAGKN-UHFFFAOYSA-N oxadiazole Chemical compound C1=CON=N1 WCPAKWJPBJAGKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000004043 oxo group Chemical group O=* 0.000 description 1
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 description 1
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N papa-hydroxy-benzoic acid Natural products OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 125000001147 pentyl group Chemical group C(CCCC)* 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- JTHRRMFZHSDGNJ-UHFFFAOYSA-N piperazine-2,3-dione Chemical compound O=C1NCCNC1=O JTHRRMFZHSDGNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003495 polar organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 1
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Chemical class 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- CPNGPNLZQNNVQM-UHFFFAOYSA-N pteridine Chemical compound N1=CN=CC2=NC=CN=C21 CPNGPNLZQNNVQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- USPWKWBDZOARPV-UHFFFAOYSA-N pyrazolidine Chemical compound C1CNNC1 USPWKWBDZOARPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DNXIASIHZYFFRO-UHFFFAOYSA-N pyrazoline Chemical compound C1CN=NC1 DNXIASIHZYFFRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PBMFSQRYOILNGV-UHFFFAOYSA-N pyridazine Chemical compound C1=CC=NN=C1 PBMFSQRYOILNGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JWVCLYRUEFBMGU-UHFFFAOYSA-N quinazoline Chemical compound N1=CN=CC2=CC=CC=C21 JWVCLYRUEFBMGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006894 reductive elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Chemical class 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 235000002020 sage Nutrition 0.000 description 1
- 229960004889 salicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 125000002914 sec-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 1
- 125000000446 sulfanediyl group Chemical group *S* 0.000 description 1
- PXQLVRUNWNTZOS-UHFFFAOYSA-N sulfanyl Chemical compound [SH] PXQLVRUNWNTZOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 1
- XTQHKBHJIVJGKJ-UHFFFAOYSA-N sulfur monoxide Chemical compound S=O XTQHKBHJIVJGKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000004213 tert-butoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C(O*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 1
- VLLMWSRANPNYQX-UHFFFAOYSA-N thiadiazole Chemical compound C1=CSN=N1.C1=CSN=N1 VLLMWSRANPNYQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CBDKQYKMCICBOF-UHFFFAOYSA-N thiazoline Chemical compound C1CN=CS1 CBDKQYKMCICBOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- BRNULMACUQOKMR-UHFFFAOYSA-N thiomorpholine Chemical compound C1CSCCN1 BRNULMACUQOKMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930192474 thiophene Natural products 0.000 description 1
- 150000003852 triazoles Chemical class 0.000 description 1
- 125000005423 trihalomethanesulfonamido group Chemical group 0.000 description 1
- KQBSGRWMSNFIPG-UHFFFAOYSA-N trioxane Chemical compound C1COOOC1 KQBSGRWMSNFIPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 235000012431 wafers Nutrition 0.000 description 1
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
提供了处理其上固定有核酸分子的固体支持物的方法，其中所述固体支持物已用再生试剂进行了处理，所述再生试剂包含可从3’阻断的经标记的核苷酸上除去阻断基团和标记的还原剂，所述方法包括：使用添加了含有二硫键结构的化合物的洗涤溶液处理所述固体支持物。所述固体支持物在用所述洗涤溶液处理后任选地还使用含有聚合酶、3’阻断的经标记的核苷酸和任选地引物的反应溶液进行处理，例如，所述引物含有与所述固体支持物上的每一个核酸分子的至少一部分互补的序列。
Description
技术领域
本发明涉及核酸测序领域。具体地，本发明涉及消除再生试剂残留的方法，其包括：a.提供其上固定有核酸分子的固体支持物，b.使用再生试剂处理所述固体支持物，所述再生试剂包含还原剂，和c.使用添加了含有二硫键结构的化合物的洗涤溶液处理所述固体支持物，其中在步骤b之前，任选地使用含有测序试剂的一种或多种反应溶液处理所述固体支持物，以在固体支持物上产生代表所述核酸分子的核苷酸序列的信号，并且其中所述再生试剂可以消除固体支持物上的所述信号，其中经过步骤c的处理之后，任选地还使用含有测序试剂的一种或多种反应溶液处理所述固体支持物。
背景技术
第二代测序技术基于第一代Sanger测序技术发展而来，具有低成本，高通量，自动化等特征，极大地推进了基因测序产业的发展。二代测序技术目前已经广泛应用于全基因组测序，转录组测序，宏基因组测序等，是分析生物的进化与分类，研究癌症，自闭症等疾病相关基因，以及进行体外诊断等的有力工具，促进了人们对于生命科学的进一步了解，也推动了健康产业的发展。
现有的第二代测序技术主要包括合成法测序(Sequencing-by-Synthesis，SBS)技术(包括BGI的联合探针锚定聚合技术(cPAS))，半导体测序技术，以及连接法测序(Sequencing-by-Ligation，SBL)技术。
对于现有的广泛使用的合成法或连接法测序平台，例如BGISEQ-500测序平台，在测序过程中，在用再生试剂对可检测标记进行切除后，再生试剂会残留在固体支持物表面或试剂输送管道中，对后续的测序试剂造成污染，从而使测序数据质量下降，影响测序准确性。尽管采用了高盐溶液来清洗芯片或管道，但是由于高盐溶液通过稀释作用和通过降低再生试剂与芯片、核酸或管道的物理结合力来降低再生试剂的残留量，因而需要耗费大量的高盐溶液，而且仅能够尽量地降低测序试剂中再生试剂的残留，而难以完全除去再生试剂，从而导致测序数据质量和测序准确性降低。
因此，本领域迫切需要一种新的方法来解决测序试剂中再生试剂残留的问题。
发明内容
本发明通过使用包含含有二硫键结构的化合物的洗涤溶液解决了上述问题。
在一个方面，本发明提供了消除再生试剂残留的方法，其包括：a.提供其上固定有核酸分子的固体支持物，b.使用再生试剂处理所述固体支持物，所述再生试剂包含还原剂，和c.使用添加了含有二硫键结构的化合物的洗涤溶液处理所述固体支持物。优选地，经过步骤c的处理之后，所述固体支持物上不含或基本上不含再生试剂。优选地，经过步骤c的处理之后，所述固体支持物上不含或基本上不含包含在再生试剂中的还原剂。
在一个实施方案中，在步骤b之前，任选地使用含有测序试剂的一种或多种反应溶液处理所述固体支持物，以在固体支持物上产生代表所述核酸分子的核苷酸序列的信号，并且其中所述再生试剂可以消除固体支持物上的所述信号。
在一个实施方案中，经过步骤c的处理之后，任选地还使用含有测序试剂的一种或多种反应溶液处理所述固体支持物。
令人惊讶地发现，在使用本发明的添加了含有二硫键结构的化合物的洗涤溶液处理已用再生试剂处理过的固体支持物后，所述固体支持物上不含或基本上不含再生试剂，优选地，所述固体支持物上不含或基本上不含包含在再生试剂中的还原剂。如本文所用，术语“基本上不含再生试剂”意指固体支持物上含有的再生试剂(或优选地，在再生试剂中的还原剂)的量足够小以使得将固体支持物与含有测序试剂的反应溶液接触时，相对于未添加含有二硫键结构的化合物的洗涤溶液，不会造成再生试剂(或优选地，在再生试剂中的还原剂)对反应溶液的显著污染。例如，在使用本发明的添加了含有二硫键结构的化合物的洗涤溶液处理已用再生试剂处理过的固体支持物后，随后将这样的固体支持物使用含有测序反应试剂的反应溶液进行处理时，反应溶液中的再生试剂(或优选地，在再生试剂中的还原剂)的浓度不多于约10％，不多于约5％，不多于约2％，不多于约1％，不多于约0.5％，不多于约0.2％，不多于约0.1％，不多于约0.05％，不多于约0.02％，不多于约0.001％，或甚至更低。
如本文所用，“处理固体支持物”包括使固体支持物与试剂或溶液接触的任何方式，包括但不限于使试剂或溶液流动通过固体支持物或将固体支持物浸泡在试剂或溶液中。使试剂或溶液流动通过固体支持物的方式包括例如使用与固体支持物流体连通的入口流动通道将试剂或溶液输送至固体支持物和使用与固体支持物流体连通的出口流动通道将试剂或溶液从固体支持物排出(国际申请公开WO 91/06678中描述了这样的一种处理方式)。将固体支持物浸泡在试剂或溶液中包括使得固体支持物部分或全部浸没在试剂或溶液中的任何方式。固体支持物可以例如以垂直、倾斜或水平的方式部分或全部浸泡在试剂或溶液中，优选地，固体支持物上固定的所有核酸分子与反应容器中的试剂接触。
如本文所用，术语“核酸”可以与“核酸分子”、“多核苷酸”互换使用，其可以是任何类型的核酸，例如核酸可以是脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或由核苷酸类似物制成的DNA或RNA的类似物。核酸可以是单链的、双链的或含有单链和双链序列两者。核酸分子可以来源于双链DNA(dsDNA)形式(例如，基因组DNA、PCR和扩增产物等)，或者可以来源于如DNA(ssDNA)或RNA的单链形式并且其可以转化为dsDNA形式，并且反之亦然。在一些实施方案中，被测序的核酸可以是单分子的形式(可以是天然分子、修饰分子如标记的分子，或包括核苷酸类似物的核酸)、序列的多联体(concatamer)，等等)，可以扩增(例如扩增为多联体、扩增为多个具有相同或相似序列的个体分子，等等)，和/或可以为任何其它形式。核酸分子的准确序列可以是已知的或未知的。以下是核酸的示例性实例：基因或基因片段(例如，探针、引物、EST或SAGE标签)、基因组DNA、基因组DNA片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核糖酶、cDNA、核酸文库、重组多核苷酸、合成多核苷酸、分枝多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、任何上述序列的核酸探针、引物或扩增拷贝。
核酸可以包括核苷酸或核苷酸类似物。核苷酸通常含有糖、核碱基和至少一个磷酸基。核苷酸可以是无碱基的(即，缺少核碱基)。核苷酸包括脱氧核糖核苷酸、修饰的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸、肽核苷酸、修饰的肽核苷酸、修饰磷酸盐糖主链核苷酸及其混合物。核苷酸的实例包括(例如)腺苷一磷酸(AMP)、腺苷二磷酸(ADP)、腺苷三磷酸(ATP)、胸苷一磷酸(TMP)、胸苷二磷酸(TDP)、胸苷三磷酸(TTP)、胞苷酸(CMP)、胞苷二磷酸(CDP)、胞苷三磷酸(CTP)、鸟苷一磷酸(GMP)、鸟苷二磷酸(GDP)、鸟苷三磷酸(GTP)、尿苷一磷酸(UMP)、尿苷二磷酸(UDP)、尿苷三磷酸(UTP)、脱氧腺苷酸(dAMP)、脱氧腺苷二磷酸(dADP)、脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胸腺嘧啶核苷一磷酸(dTMP)、脱氧胸腺嘧啶核苷二磷酸(dTDP)、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)、去氧胞二磷(dCDP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、脱氧鸟苷一磷酸(dGMP)、脱氧鸟苷二磷酸(dGDP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧尿苷一磷酸(dUMP)、脱氧尿苷二磷酸(dUDP)和脱氧尿苷三磷酸(dUTP)。还可以在本文所述的方法中使用包含修饰的核碱基的核苷酸类似物。无论是具有天然主链还是类似结构，可以包含在多核苷酸中的示例性修饰的核碱基包括(例如)肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、2-氨基腺嘌呤、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鸟嘌呤、2-丙基鸟嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-硫脲嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、2-硫胞嘧啶、15-卤代脲嘧啶、15-卤代胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、8-卤代腺嘌呤或鸟嘌呤、8-氨基腺嘌呤或鸟嘌呤、8-硫腺嘌呤或鸟嘌呤、8-硫烷基腺嘌呤或鸟嘌呤、8-羟基腺嘌呤或鸟嘌呤、5-卤素取代的尿嘧啶或胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、7-去氮鸟嘌呤、7-去氮腺嘌呤、3-去氮鸟嘌呤、3-去氮腺嘌呤等。如本领域中已知的，某些核苷酸类似物不能引入多核苷酸，例如，核苷酸类似物，如腺苷5′-磷酰硫酸。
在本发明的具体实施方案中被测序的核酸分子可以具有任意长度。一般说来，有用的核酸的示例性长度包括(例如)至少约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、1,000、5,000或10,000、100,000个核苷酸或更长。作为另外一种选择或者另外，所述长度可以不长于1,000,000、100,000、10,000、1,000、100个核苷酸或更少。核酸分子的长度还可以包括以上示例性数目之间的所有整数。因此，被测序的核酸可以(例如)在短多核苷酸、片段、cDNA、基因和基因组片段的范围内。
在本发明的具体实施方案中被测序的核酸分子可以为任意数量，例如可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个或者更多个相同或不同的核酸分子。被测序的核酸分子的数量还可以是例如200、300、400、500、1000、5000、10000、50000、1x105、2x105、3x105、4x105、5x105、6x105、7x105、8x105、9x105、1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106或1x107个或更多个相同或不同的核酸分子。被测序的核酸分子的数量还可以包括以上示例性数目之间的所有整数。
核酸可以从任何来源获得。例如，核酸可以由从一种生物获得的核酸分子制备，或者由从包括一种或多种生物的天然来源获得的核酸分子群制备。核酸分子的来源包括但不限于细胞器、细胞、组织、器官或生物体。可以用作核酸分子来源的细胞可以是原核的(例如细菌)；或真核的，如真菌(例如酵母)、植物、原生动物和其它寄生虫，和动物(包括昆虫、线虫)，和哺乳动物(例如，大鼠、小鼠、猴、非人类灵长类动物和人类))；或者核酸分子可以来源于病毒。
在一些实施方案中，核酸可以从特定生物来源获得。在一个优选的实施方案中，核酸是从人获得的人核酸，例如，人组织的样品。在另一个优选的实施方案中，核酸是人线粒体核酸。在另一个优选的实施方案中，核酸可以从宏基因组样品获得。在其它实施方案中，核酸可以从不再包含活生物的环境来源获得。
如本文所用的，术语“固定”当提及核酸使用时，意指经由共价键或非共价键直接或间接附接至固体支持物。在本公开内容的某些实施方案中，可以使用共价附接，但是通常仅需要的是在期望使用固体支持物的条件下(例如在需要核酸扩增和/或测序的应用中)核酸保持固定或附接至固体支持物。通常，待用作捕获引物或扩增引物的寡核苷酸被固定，使得3'末端对于酶促延伸是可利用的并且该引物序列的至少一部分能够杂交至互补核酸序列。固定可以经由杂交至表面附接的寡核苷酸发生，在这种情况下固定的寡核苷酸或多核苷酸可以为3'-5'方向。另一种非共价附接的方式可以是通过氨基化修饰将核酸结合蛋白质结合在固体支持物上，并通过核酸结合蛋白质捕获核酸分子。可选地，固定可以通过除碱基配对杂交之外的其他方式发生，例如上文描述的共价附接。核酸与固体支持物附接方式的非限制性示例包括核酸杂交、生物素链霉亲和素结合、巯基结合、光活化结合、共价结合、抗体-抗原、经由水凝胶或其他多孔聚合物的物理限制等。用于将核酸固定在固体支持物上的各种示例性方法可参见例如G.Steinberg-Tatman等人,Bioconjugate Chemistry 2006,17,841-848；Xu X.等人Journal of the American Chemical Society 128(2006)9286-9287；美国专利申请US 5639603、US 5641658、US2010248991；国际专利申请WO2001062982、WO 2001012862、WO 2007111937、WO0006770，为了所有目的，特别是为了与制备形成其上固定有核酸的固体支持物有关的全部教导，以上文献均通过引用全文并入本文。
如本文所使用的，术语“固体支持物”意指核酸可以与其附接的任何不可溶的基底或基质，诸如例如，乳胶珠、葡聚糖珠、聚苯乙烯表面、聚丙烯表面、聚丙烯酰胺凝胶、金表面、玻璃表面、芯片和硅晶片。固体支持物的表面可以是任何所需形状，所述形状包括，例如，适合用于特定应用的平面的、球形的或多孔的。例如，固体支持物可以是平面的玻璃表面。固体支持物可以被安装在流动池的内部，以允许与多个试剂的溶液相互作用。也可以移动固体支持物以使其分别与多个反应容器中的溶液接触。
在某些实施方案中，固体支持物可以包括惰性基底或基质，该惰性基底或基质已经例如通过应用中间材料的层或涂层被化学官能化，所述中间材料具有允许共价附接至多核苷酸的反应性基团。中间材料可以经由共价键或非共价键直接或间接附接至固体支持物。作为用于非共价附接至固体支持物的非限制性实例，这类支持物可以包括在惰性基底例如玻璃上的聚丙烯酰胺水凝胶层。在这类实施方案中，多核苷酸可以直接共价附接至中间层(例如，水凝胶)，但是中间层本身可以非共价附接至其他基底或基质(例如玻璃基底)层。
如本文所用，术语“信号”包括能够被检测到的任何信号，包括但不限于光信号、电信号、电磁信号、放射信号等。术语“代表核酸分子的核苷酸序列的信号”意指该信号携带核苷酸序列的信息并能够被解码为被测序的核酸分子的核苷酸序列。例如，在使用经标记(例如荧光标记)的测序探针的情况下，由标记产生的信号携带测序探针的核苷酸序列信息，并且通过该信号可获知被测序的核酸分子上与该测序探针互补配对的位置的核苷酸序列。又例如，在使用经标记(例如荧光标记)的核苷酸的情况下，由标记产生的信号携带核苷酸的身份信息，并且通过该信号可获知被测序的核酸分子上与该核苷酸互补配对的位置的核苷酸序列。在优选的实施方案中，所述信号是荧光信号。在优选的实施方案中，所述标记是荧光标记。检测荧光标记或信号的方式是本领域熟知的。例如，可以通过检测荧光的波长的装置来实现。这样的装置是本领域熟知的。例如，这样的装置可以是共焦扫描显微镜，其用激光扫描固体支持物的表面，以便使直接结合被测序的核酸分子上的荧光团成像。另外，可以例如用灵敏的2-D探测器，如电荷偶连的探测器(CCD)观察所产生的每一种信号。还可以例如使用诸如扫描近场光学显微方法(SNOM)的其他技术。
如本文所用，术语“测序试剂”是指适合用于对固体支持物上的核酸分子进行测序的任何测序方法中所使用的试剂。例如，这样的测序方法可以包括但不限于电泳测序、合成法测序(包括联合探针锚定聚合测序)、连接法测序、杂交测序、单分子测序和实时测序方法。一般而言，将测序试剂与固体支持物上的核酸分子进行接触后，在固体支持物上会产生代表所述核酸分子的核苷酸序列的信号(例如，荧光信号)。在本发明的方法中所使用的具体的测序试剂以及含有测序试剂的一种或多种反应溶液将取决于所采用的测序方法。根据测序方法确定在本发明的方法中所使用的具体的测序试剂以及含有测序试剂的一种或多种反应溶液在本领域技术人员的能力范围内。
在一个实施方案中，测序试剂包括用于连接法测序的测序试剂。这样的试剂可在被测序的核酸分子上产生连接产物并生成代表所述核酸分子的核苷酸序列的信号。
如本文所用的连接法测序是本领域熟知的各种连接法测序方法。基本地，连接法测序涉及经标记(例如荧光标记)的测序探针和锚定探针(在SOLiD测序中也被称为“引物”)与DNA链的杂交和连接。测序探针包含一或两个固定已知的测序碱基(单碱基测序探针或双碱基测序探针)和一系列简并或通用碱基，其使得测序探针与核酸模板之间进行互补配对。锚定探针序列与核酸模板上的衔接子序列(衔接子序列意指核酸模板中的序列已知的寡核苷酸)互补并提供起始连接的位点的已知序列。连接之后，对模板成像并鉴定测序探针中的所述一或两个已知碱基。在锚定探针-测序探针复合物的完全移除或者经过切割除去标记(例如荧光团)之后并再生连接位点之后，开始下一个连接测序循环。
因此，在使用用于连接法测序的测序试剂的一个实施方案中，测序试剂包括锚定探针、经标记(例如荧光标记)的测序探针、连接酶或其混合物，并且含有测序试剂的一种或多种反应溶液包括包含锚定探针、经标记(例如荧光标记)的测序探针、连接酶或其混合物的溶液，前提是固体支持物与锚定探针、经标记的测序探针、连接酶中的每一种均发生接触，并且其中固体支持物上的所述信号由互补结合至固体支持物上的核酸分子的经标记的测序探针产生,所述经标记的测序探针经由连接酶连接至互补结合至同一核酸分子的锚定探针。或者，测序试剂可不包含锚定探针，并且在使用含有测序试剂的一种或多种反应溶液处理固体支持物之前，将固体支持物与锚定探针(在SOLiD测序中也被称为“引物”)接触，以使得锚定探针杂交至所述固体支持物上的核酸分子。
所述含有测序试剂的一种或多种反应溶液的具体组成取决于所采用的具体连接法测序方法而不同。例如，在采用单一锚定探针的情况下，含有测序试剂的一种或多种反应溶液可以包括仅一种反应溶液，该反应溶液包含连接酶和经标记的测序探针，任选地，还包含锚定探针；或者含有测序试剂的一种或多种反应溶液也可以包括两种反应溶液，其中一种反应溶液包含锚定探针，另一种反应溶液包含经标记的测序探针，并且这两种反应溶液至少之一包含连接酶，在这样的情况下，对核酸分子的测序包括将固体支持物浸泡在包含锚定探针的反应溶液中、洗涤，随后浸泡在包含经标记的测序探针的反应溶液中、洗涤。或者，含有测序试剂的一种或多种反应溶液还可以包括三种反应溶液，其分别包含锚定探针、经标记的测序探针和连接酶，在这样的情况下，对核酸分子的测序包括如下过程：将固体支持物浸泡在包含锚定探针的反应溶液中、洗涤，随后浸泡在包含经标记的测序探针的反应溶液中、洗涤，随后浸泡在包含连接酶的反应溶液中、洗涤。类似地，在采用双重锚定探针的情况下，含有测序试剂的一种或多种反应溶液可以包括同时包含连接酶、第一锚定探针、第二锚定探针和经标记的测序探针的仅一种反应溶液，或分别包含连接酶、第一锚定探针、第二锚定探针、经标记的测序探针或其混合物的多种反应溶液。
关于连接法测序，特别是关于锚定探针、测序探针的描述，可参见例如WO2013066975、美国专利No.60/992,485、61/026,337、61/035,914和61/061,134中的记载。关于连接法测序的详细描述还可参见例如Landegren,U.,Kaiser,R.,Sanders,J.&Hood,L.Aligase-mediated gene detection technique.Science 241,1077–1080(1988)，美国专利No.6969488、美国专利No.6172218和美国专利No.6306597(其公开内容在此全部引入作为参考)。在优选的实施方案中，连接法测序包括联合探针锚定连接(cPAL)测序(参见WO2013066975的记载)。
如本文所用，术语“连接酶”是指催化核酸链的5'-磷酸和3'-羟基末端之间磷酸二酯键的分子内形成和分子间形成的核酸修饰酶。连接酶可以获自重组或天然来源。可以使用一种或多种低温(例如，室温或更低)连接酶(例如，T3 DNA连接酶、T4 DNA连接酶、T7 DNA连接酶和/或大肠杆菌DNA连接酶)。连接酶也可以是热稳定的连接酶。可以使用来自嗜热生物的热稳定连接酶。热稳定DNA连接酶的例子包括但不限于：Tth DNA连接酶(来自嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)，可购自例如欧基公司(Eurogentec)和GeneCraft公司)；PfuDNA连接酶(来自激烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)的超嗜热连接酶)；Taq连接酶(来自水生栖热菌(Thermus aquaticus))，以及任何其他合适的热稳定连接酶，或其任意组合。
在另一个实施方案中，测序试剂包括用于合成法测序的测序试剂。这样的试剂可以以被测序的核酸分子为模板进行聚合反应并生成代表所述核酸分子的核苷酸序列的信号的试剂，
如本文所用的合成法测序是本领域熟知的各种合成法测序方法。基本地，合成法测序涉及首先将被测序的核酸分子与测序引物杂交，随后在聚合酶的存在下，以被测序的核酸分子为模板在测序引物的3’端聚合经标记(例如荧光标记)的核苷酸。聚合之后，通过检测所述标记来鉴定该经标记的核苷酸。在从经标记的核苷酸上除去标记(例如荧光团)之后，开始下一个聚合测序循环。在一个实施方案中，被测序的核酸分子通过与固定在固体支持物上的测序引物杂交而固定在固体支持物上。在另一个实施方案中，在使用含有测序试剂的一种或多种反应溶液处理其上固定有核酸分子的固体支持物之前，将所述固体支持物与测序引物接触，以使得测序引物杂交至所述固体支持物上的核酸分子。在优选的实施方案中，利用BGISEQ-500测序平台对固体支持物上的核酸分子进行测序。
因此，在使用用于合成法测序的测序试剂的一个实施方案中，测序试剂包括聚合酶、经标记(例如荧光标记)的核苷酸或其混合物，并且含有测序试剂的一种或多种反应溶液包括包含聚合酶、经标记(例如荧光标记)的核苷酸或其混合物的溶液，前提是固体支持物与聚合酶、经标记的核苷酸中的每一种均发生接触，并且其中固体支持物上的所述信号由互补结合至固体支持物上的核酸分子的经标记的核苷酸产生，所述经标记的核苷酸经由聚合酶以固体支持物上的核酸分子为模板聚合至测序引物的3’端。在这样的实施方案中，再生试剂包括用于从经标记(例如荧光标记)的核苷酸除去标记的试剂。在使用用于合成法测序的测序试剂的优选实施方案中，在步骤b之前，任选地使用包含聚合酶和经标记(例如荧光标记)的核苷酸的反应溶液处理所述固体支持物。在优选的实施方案中，测序试剂包括用于BGISEQ-500测序平台的测序试剂盒中的试剂，例如BGISEQ-500高通量测序试剂盒(SE50 V3.0，深圳华大智造科技有限公司，货号PF-UM-PEV30)中的测序试剂。
适合用于合成法测序的经标记(例如荧光标记)的核苷酸以及用于从经标记(例如荧光标记)的核苷酸除去标记的试剂是本领域熟知的，这样的核苷酸和试剂的非限制性实例可参见例如WO04018497、WO04018493、美国专利No.7427673和美国专利No.7057026(其公开内容在此全部引入作为参考)中公开的经标记的核苷酸和用于从经标记的核苷酸除去标记的试剂。
在某些实施方案中，经标记的核苷酸还可包含3’阻断基团。所述3’阻断基团在该经标记的核苷酸聚合到生长的核苷酸链上时阻止其他核苷酸的掺入。优选地，3’阻断基团与标记一起除去。合适的3’阻断基团以及用于从核苷酸除去3’阻断基团的试剂是本领域熟知的，这样的3’阻断基团和试剂的非限制性实例可参见例如：Greene&Wuts，ProtectiveGroups in Organic Synthesis，John Wiley&Sons。Guillier；Metzker等人(NucleicAcids Research,22(20):4259-4267,1994)；WO91/06678、WO2002/029003、WO2014139596、WO2004/018497，上述参考文献均通过引用整体并入本文。
在优选的实施方案中，经标记的核苷酸上的标记本身可用作3’阻断基团。不受理论约束，例如这样的标记可以具有足以发挥阻断其他核苷酸掺入到多核苷酸链上的大小或结构。所述阻断可能是由于空间位阻造成的，或者可能是由于大小、电荷和结构的组合造成的。在某些实施方案中，经标记的核苷酸上的标记和阻断基团可以是不同的，但优选可采用相同的方式从核苷酸上除去所述标记和阻断基团。在这样的情况下，本文所述的再生试剂包含可从经标记的核苷酸上同时除去标记和3’阻断基团的试剂。在另外的一些实施方案中，本文所述的再生试剂可以包括可从经标记的核苷酸上除去标记的试剂和可从经标记的核苷酸上除去3’阻断基团的试剂。
如本文所用，术语“聚合酶”是指合成核酸链或聚合物的酶，包括DNA聚合酶和RNA聚合酶。优选地，本文所用的聚合酶是DNA聚合酶。可以使用的一种聚合酶是SequenaseTM(来源于噬菌体7DNA聚合酶的酶，其被修饰以改善其测序性质-参见Tabor and Richarson,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,84:4767-4771(1987)，可购自例如United States BiochemicalCorporation,Cleveland,Ohio)。可用于代替SequenaseTM的其它聚合酶包括但不限于DNA聚合酶I的Klenow片段，AMV逆转录酶以及Taq聚合酶。关于聚合酶的其他描述还可参见WO05024010和WO06120433，其全部内容通过引用并入本文。
通常使用的聚合条件是本领域已知的这些酶的聚合条件。在SequenaseTM的情况下，聚合条件包括在约室温至约45℃范围内的温度；pH 7至8的缓冲液，优选pH 7.3至7.7；酶浓度为约0.01单位/微升至约1单位/微升，反应时间为约1至约20分钟，优选1至5分钟。用于SequenaseTM的典型缓冲液由以下组成：0.040M Tris HCl(pH7.5)0.050M氯化钠，0.010M氯化镁，0.010M二硫苏糖醇。在DNA聚合酶I的Klenow片段的情况下，这些典型的条件包括在约10℃至约45℃范围内的温度，优选约15℃至约40℃；pH 6.8至7.4的缓冲液，优选pH 7.0至7.4；酶浓度为约0.01单位/微升至约1单位/微升，优选约0.02至约0.15单位/微升，反应时间为约1至约40分钟。用于DNA聚合酶I的Klenow片段的典型缓冲液由以下组成：0.05M三羟甲基氨基甲烷氯化物，pH 7.5 0.05M氯化镁，0.05M氯化钠，0.010M二硫苏糖醇。
应当理解，这些条件仅是示例性的。当使用其它聚合酶时，应该使用最适合它们的条件，因为通常希望尽可能快地进行聚合反应。为此，通常对于逆转录酶需要使用42℃的温度；对于Klenow聚合酶为24℃；对于SequenaseTM为37℃；和对于Taq聚合酶为72℃。此外，为了增强反应，特别是在使用经修饰的dNTP的情况下，使用显著过量的dNTP(超过化学计量)或修饰其他条件如盐浓度可以是有利的。
如本文所用，术语“互补”或“基本互补”是指核苷酸或核酸之间的杂交或碱基配对或者双链体形成。如果在一个给定位置上一个核酸的核苷酸能够与另一个核酸的核苷酸形成氢键，则这两个核酸被认为在该位置上是彼此互补的。互补核苷酸一般是A和T(或A和U)或者C和G。当在最佳地比对和比较并适当地进行了核苷酸插入或缺失的情况下，一条链的核苷酸与另一条链的至少大约80％、通常至少大约90％到约95％，甚至大约98％到100％配对时，这两个单链RNA或DNA分子被称为基本互补。
如本文所用，术语“杂交”是指互补的核苷酸或核苷酸碱基之间足够的氢键结合，其可以是，例如，Watson-Crick，Hoogsteen或反向的Hoogsteen氢键结合，以使得核酸链之间发生稳定和特异性结合。杂交能力根据严格条件(包括合适的缓冲液浓度和温度，其允许特异性杂交至具有完全或部分互补性区域的靶核酸)确定。因此，不是核酸的所有核苷酸都需要是互补的。此外，当核酸链与靶核酸的所有、部分或重叠区域杂交时，核酸链是“基本互补”的。建立用于设计本发明的寡核苷酸或引物的严格杂交条件的定性和定量考虑事项是本领域已知的，参见，例如，Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology(4thed.，John Wiley&Sons 1999)；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(3d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)：Nucleic Acid Hybridisation：A Practical Approach(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.，IRL Press 1985)。
如本文所用，术语“再生试剂”是指在对固体支持物上的核酸分子进行测序后，能够消除固体支持物上的测序信号(例如，荧光信号)以使得能够进行下一轮测序的试剂。在本发明的方法中所使用的具体的再生试剂将取决于所采用的测序方法。根据测序方法确定在本发明的方法中所使用的具体的再生试剂在本领域技术人员的能力范围内。
例如，在连接法测序中，再生试剂包括从被测序的核酸分子上消除代表所述核酸分子的核苷酸序列的信号并使得能够起始下一个连接测序反应的试剂，优选地，这样的试剂是还原剂。在一个实施方案中，再生试剂包括从经标记(例如荧光标记)的测序探针上除去标记(例如荧光标记)的试剂，优选地，这样的试剂是还原剂。
又例如，在合成法测序中，再生试剂包含用于从被测序的核酸分子上消除代表所述核酸分子的核苷酸序列的信号并使得能够起始下一个聚合测序反应的试剂，优选地，这样的试剂是还原剂。在一个实施方案中，再生试剂包括从经标记(例如荧光标记)的核苷酸除去标记(例如荧光标记)的试剂，优选地，这样的试剂是还原剂。
在优选的实施方案中，从经标记(例如荧光标记)的测序探针或核苷酸上除去标记(例如荧光标记)的试剂可以是还原剂，例如在使用对还原裂解敏感的官能团将标记连接至核苷酸的情况下。这样的还原剂的实例包括但不限于金属催化剂例如镍催化剂、铂催化剂、钯催化剂，醇类化合物，酚类化合物，醛类化合物，烯烃类化合物，胺类化合物，酮类化合物，含磷化合物，过氧化物、硫醇类化合物例如β-巯基乙醇、二硫苏糖醇，膦(例如三(羟甲基)膦(THP),三(2-羧乙基)膦等)(TCEP)，等，其他还原剂的实例还可参见例如网页http://www.organic-chemistry.org/chemicals/reductions/上列举的那些。优选地，还原剂是能够还原二硫键的任何合适的还原剂，包括但不限于硫醇类化合物例如β-巯基乙醇、二硫苏糖醇，膦(例如三(羟甲基)膦(THP),三(2-羧乙基)膦等)(TCEP)等。应理解，在本发明的实施方案中使用的含有还原剂的再生试剂应当能够从经标记(例如荧光标记)的测序探针或核苷酸上除去标记(例如荧光标记)同时不会破坏测序探针、核苷酸、合成的多核苷酸、固体支持物上的核酸分子的化学结构以及核酸分子与固体支持物的结合。在优选的实施方案中，再生试剂包括用于BGISEQ-500测序平台的测序试剂盒中的再生试剂，例如BGISEQ-500高通量测序试剂盒(SE50 V3.0，深圳华大智造科技有限公司，货号PF-UM-PEV30)中的再生试剂。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及消除再生试剂残留的方法，其包括：a.提供其上固定有核酸分子的固体支持物，b.使用用于BGISEQ-500测序平台的测序试剂盒中的再生试剂，例如BGISEQ-500高通量测序试剂盒(SE50 V3.0，深圳华大智造科技有限公司，货号PF-UM-PEV30)中的再生试剂处理所述固体支持物，所述再生试剂包含还原剂，和c.使用添加了含有二硫键结构的化合物的洗涤溶液处理所述固体支持物。优选地，经过步骤c的处理之后，所述固体支持物上不含或基本上不含再生试剂。在一个实施方案中，在步骤b之前，任选地使用含有用于BGISEQ-500测序平台的测序试剂盒中的测序试剂(例如BGISEQ-500高通量测序试剂盒(SE50 V3.0，深圳华大智造科技有限公司，货号PF-UM-PEV30)中的测序试剂)的一种或多种反应溶液处理所述固体支持物，以在固体支持物上产生代表所述核酸分子的核苷酸序列的信号(例如荧光信号)，并且其中所述再生试剂可以消除固体支持物上的所述信号(例如荧光信号)。在一个实施方案中，经过步骤c的处理之后，任选地还使用含有用于BGI-SEQ500测序平台的测序试剂盒中的测序试剂(例如BGISEQ-500高通量测序试剂盒(SE50 V3.0，深圳华大智造科技有限公司，货号PF-UM-PEV30)中的测序试剂)的一种或多种反应溶液处理所述固体支持物。
在一个方面，本发明还涉及测序用的试剂盒，所述试剂盒包括如本文所述的测序试剂、洗涤试剂、包含还原剂的再生试剂和添加了含有二硫键结构的化合物的洗涤溶液，其中所述测序试剂可以在其上固定有核酸分子的固体支持物上产生代表所述核酸分子的核苷酸序列的信号(例如，荧光信号)，并且其中所述再生试剂可以消除固体支持物上的所述信号。在一个实施方案中，所述测序试剂包括用于连接法测序或合成法测序的测序试剂。如本文所用，洗涤试剂是能够将固体支持物上与其非特异性结合的物质洗掉并且不会不利地影响后续反应的任何溶液。适当地，洗涤试剂含有缓冲剂，例如有机盐，以保持约pH 6至pH9的稳定pH，并且可能还包含一价或二价阳离子，从而从固体支持物除去非特异性结合的分子。示例性的洗涤试剂可以包括例如pH 6.5的100mM Tris-HCl缓冲液、TE缓冲液(Tris-HClpH 8,10mM和EDTA,1mM)等。缓冲剂还可以是例如如下文所述的缓冲剂。
如本文所用，含有二硫键结构的化合物包括其化学结构中含有-S-S-形式的硫原子间的键(也称为二硫键)的任何化合物。
在某些实施方案中，含有二硫键结构的化合物具有通式-R-S-S-R’-，其中R和R’各自独立地选自氢、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的环烷基、任选取代的环烯基、任选取代的环炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂环基、任选取代的杂脂环基、任选取代的芳烷基或任选取代的(杂脂环基)烷基。
在某些实施方案中，含有二硫键结构的化合物具有通式-C(R1)m(R2)m’-C(R3)p-S-S-C(R4)q-C(R5)n(R6)n’-，其中R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地选自氢、氧代、羟基、被保护的羟基、烃氧基、芳氧基、酰基、巯基、烷硫基、芳硫基、氰基、卤素、硫代羰基、O-氨基甲酰基、N-氨甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、S-磺酰氨基、N-磺酰氨基、C-羧基、被保护的C-羧基、O-羧基、异氰酸基、硫代氰酸基、异硫代氰酸基、硝基、甲硅烷基、氧硫基、亚磺酰基、磺酰基、卤代烷基、卤代烃氧基、三卤代甲磺酰基、三卤代甲磺酰氨基、氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的环烷基、任选取代的环烯基、任选取代的环炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂环基、任选取代的杂脂环基、任选取代的芳烷基或任选取代的(杂脂环基)烷基，其中m和m’各自为0-3的整数，条件是0<m+m’≤3，n和n’各自为0-3的整数，条件是0<m+m’≤3，p和q各自为1或2的整数。在一些实施方案中，R1、R2、R5和R6各自独立地选自氢、羟基或氨基，R3和R4选自氢。
在优选的实施方案中，含有二硫键结构的化合物可以选自但不限于诸如二乙基二硫醚、二-n-丙基二硫醚、二-n-丁基二硫醚、二-仲-丁基二硫醚、二-叔丁基二硫醚、二-n-戊基二硫醚、二-叔戊基二硫醚、二-叔-己基二硫醚、二-n-辛基二硫醚、二-叔辛基二硫醚、二-n-十二烷基二硫醚、二-叔十二烷基二硫醚、二-n-硬脂二硫醚、乙基-n-丙基二硫醚、乙基-叔-丁基二硫醚、乙基-叔-丁基二硫醚、n-丙基-异丙基二硫醚等的二烷基二硫醚化合物；诸如二苯基二硫醚、二苄基硫醚、二-p-甲苯基二硫醚等的芳香族二硫醚化合物；诸如二丙撑二硫醚、二丁撑二硫醚、二环己基二硫醚等的环状二硫醚化合物；诸如胱胺、二氨基二苯基二硫醚等的含氨基的二硫醚化合物；诸如二硫代二乙醇酸、二硫代二丙酸、二硫代二乙醇酸-2-乙基己基等的羧酸及羧酸衍生物的二硫醚化合物；诸如二烯丙基二硫醚等的不饱和键合的二硫醚化合物等；诸如2-羟乙基二硫化物、2-n-羟丙基二硫化物、2-羟丁基二硫化物、二-羟戊基二硫醚、二-羟己基二硫醚、二-羟辛基二硫醚、等羟基取代的二烷基二硫醚化合物；以及其任意衍生物。
在优选的实施方案中，含有二硫键结构的化合物选自胱胺、胱胺酸、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)和2-羟乙基二硫化物及其衍生物。
如本文中使用的，R、R’、R1、R2、R3、R4、R5和R6基团代表能够与指定的原子连接的取代基。R、R’、R1、R2、R3、R4、R5和R6基团可以是取代的也可以是未取代的。R、R’、R1、R2、R3、R4、R5和R6基团与它们所连接的原子一起能够形成环烷基、芳基、杂芳基或杂环。
当将基团描述为“任选取代的”时，该基团可以为未取代的，或者被一个或多个指定的取代基取代。同样的，当描述基团为“未取代的或取代的”时，如果是取代的，则取代基可选自一个或多个指定的取代基。如果没有指定取代基，则意味着指定的“任选取代的”或“取代的”基团可以单独地且独立地被一个或多个基团取代，所述基团单独地且独立地选自官能团，其包括但不限于：烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基、羟基、被保护的羟基、烃氧基、芳氧基、酰基、巯基、烷硫基、芳硫基、氰基、卤素、硫代羰基、O-氨基甲酰基、N-氨甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、S-磺酰氨基、N-磺酰氨基、C-羧基、被保护的C-羧基、O-羧基、异氰酸基(isocyanato)、硫代氰酸基(thiocyanato)、异硫代氰酸基(isothiocyanato)、硝基、甲硅烷基、氧硫基、亚磺酰基、磺酰基、卤代烷基、卤代烃氧基、三卤代甲磺酰基、三卤代甲磺酰氨基、氨基、单取代的氨基、二取代的氨基及其被保护的衍生物。
如本文中使用的，“烷基”指直链或支链的烃链，其包括完全饱和的(无双键或三键)的烃基。在某些实施方案中，所述烷基可以具有1-20个碳原子(每当其在本文中出现时，如“1-20”的数值范围是指给定范围内的包括端点在内的每个整数；例如，“1-20个碳原子”意味着烷基可以由1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等组成，直到并包括20个碳原子，然而本定义也涵盖了未指定数值范围的术语“烷基”的出现)。所述烷基也可以是具有约7个-约10个碳原子的中等大小的烷基。所述烷基也可以是具有1-6个碳原子的低级烷基。化合物的烷基可以被指定为“C1-C4的烷基”或类似的指定。仅举例说明，“C1-C4的烷基”表示烷基链中存在一到四个碳原子，即所述烷基链选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。典型的烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基和己基。所述烷基可以是取代的或未取代的。
如本文中使用的，“烯基”指在直链或支链的烃链中含有一个或多个双键的烃基基团。烯基可以是未取代的或取代的。
如本文中使用的，“炔基”指在直链或支链的烃链中含有一个或多个三键的烃基基团。炔基可以是未取代的或取代的。
如本文中使用的，“环烷基”指完全饱和的(无双键或三键)单环或多环的烃环系统。当由两个或更多个环组成时，所述环可以以稠合的形式结合在一起。环烷基可以在环中含有3-10个原子。在某些实施方案中，环烷基可以在环中含有3-8个原子。环烷基可以是未取代的或取代的。典型的环烷基包括但绝不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。
如本文中使用的，“芳基”指碳环(全部为碳)的单环或多环芳香环系统(包括，例如，稠环、桥环或螺环系统，其中两个碳环共享化学键，例如，一个或多个芳环带有一个或多个芳环或非芳环)，其具有遍及至少一个环的完全离域的π电子系统。芳基中的碳原子数可变。例如，在某些实施方案中，所述芳基可以为C6-C14芳基、C6-C10芳基或C6芳基。芳基的实例包括但不限于苯、萘和甘菊环。芳基可以是取代的或未取代的。
如本文中使用的，“杂环基”指包含至少一个杂原子(例如，O、N、S)的环系统。这类系统可以是不饱和的，可以包括部分不饱和，或可以包含一些芳香部分，或为完全芳香的。杂环基可以是未取代的或取代的。
如本文中使用的，“杂芳基”指单环或多环的芳香环系统(环系统具有至少一个为完全离域的π电子系统的环)，其包含一个或多个杂原子，即碳以外的元素，包括但不限于氮、氧和硫，并且包含至少一个芳香环。杂芳基的环中的原子数可变。例如，在某些实施方案中，杂芳基可包含4-14个环内原子、5-10个环内原子或5-6个环内原子。此外，术语“杂芳基”包括稠环系统，其中两个环，例如至少一个芳环和至少一个杂芳环，或者至少两个杂芳环共享至少一个化学键。杂芳环的实例包括但不限于呋喃、呋咱、噻吩、苯并噻吩、酞嗪、吡咯、噁唑、苯并噁唑、1,2,3-噁二唑、1,2,4-噁二唑、噻唑、1,2,3-噻二唑、1,2,4-噻二唑、苯并噻唑、咪唑、苯并咪唑、吲哚、吲唑、吡唑、苯并吡唑、异噁唑、苯并异噁唑、异噻唑、三唑、苯并三唑、噻二唑、四唑、吡啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪、嘌呤、蝶啶、喹啉、异喹啉、喹唑啉、喹喔啉、邻二氮杂萘和三嗪。杂芳基可以是取代的或未取代的。
如本文中使用的，“杂脂环族的”或“杂脂环基”指三、四、五、六、七、八、九、十，直至18元的单环、二环和三环的环系统，其中碳原子与1-5个杂原子一起组成所述环系统。杂环可以任选地含有一个或多个以如下这样方式定位的不饱和键，然而在遍及所有的环中不存在完全离域的π电子系统。所述杂原子独立地选自氧、硫和氮。杂环可以进一步包含一个或多个羰基或硫代羰基官能团，使本定义包括氧代系统和硫代系统，诸如内酰胺、内酯、环状酰亚胺、环状硫代酰亚胺和环状氨基甲酸酯。当由两个或更多个环组成时，这些环可以以稠合形式结合在一起。另外，在杂脂环中的任何氮可以被季铵化。杂脂环基或杂脂环族的基团可以是未取代的或取代的。这种“杂脂环族的”或“杂脂环基”基团的实例包括但不限于1,3-二噁英、1,3-二氧六环、1,4-二氧六环、1,2-二氧戊环、1,3-二氧戊环、1,4-二氧戊环、1,3-氧硫杂环己烷、1,4-氧硫杂环己二烯、1,3-氧硫杂环戊烷、1,3-二硫杂环戊二烯、1,3-二硫戊环、1,4-氧硫杂环己烷、四氢-1,4-噻嗪、2H-1,2-噁嗪、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、巴比妥酸、硫代巴比妥酸、二氧代哌嗪、乙内酰脲、二氢尿嘧啶、三噁烷、六氢-1,3,5-三嗪、咪唑啉、咪唑烷、异噁唑啉、异噁唑烷、噁唑啉、噁唑烷、噁唑烷酮、噻唑啉、噻唑烷、吗啉、环氧乙烷、哌啶N-氧化物、哌啶、哌嗪、吡咯烷、吡咯烷酮、吡咯烷二酮(pyrrolidione)、4-哌啶酮、吡唑啉、吡唑烷、2-氧代吡咯烷、四氢吡喃、4H-吡喃、四氢噻喃、硫吗啉、硫吗啉亚砜、硫吗啉砜，以及它们的苯并-稠合的类似物(例如，苯并咪唑啉酮、四氢喹啉、3,4-亚甲基二氧基苯基)。
如本文中使用的，“芳烷基”和“芳基(烷基)”指通过低级亚烷基连接的作为取代基的芳基。芳烷基的低级亚烷基和芳基可以是取代的或未取代的。实例包括但不限于苄基、2-苯基烷基、3-苯基烷基和萘基烷基。
如本文中使用的，“杂芳烷基”和“杂芳基(烷基)”指通过低级亚烷基连接的作为取代基的杂芳基。杂芳烷基的低级亚烷基和杂芳基可以是取代的或未取代的。实例包括但不限于2-噻吩基烷基、3-噻吩基烷基、呋喃基烷基、噻吩基烷基、吡咯基烷基、吡啶基烷基、异噁唑基烷基和咪唑基烷基，以及它们的苯并-稠合的类似物。
如本文中使用的，“烃氧基”指式–OR，其中R为上文定义的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基或环炔基。烃氧基的非限制性实例为甲氧基、乙氧基、正丙氧基、1-甲基乙氧基(异丙氧基)、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基和叔丁氧基。烃氧基可以是取代的或未取代的。
如本文中使用的，“C-酰氨基”基团指“-C(＝O)N(RaRb)”基团，其中Ra和Rb可以独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基或(杂脂环基)烷基。C-酰氨基可以是取代的或未取代的。
如本文中使用的，“N-酰氨基”基团指“RC(＝O)N(Ra)-”基团，其中R和Ra可以独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基或(杂脂环基)烷基。N-酰氨基可以是取代的或未取代的。
本文使用的术语“卤素原子”、“卤素”或“卤代”意为元素周期表的第七列的放射稳定原子中的任一种，诸如氟、氯、溴和碘。
本文使用的术语“胺”指–NH2基团，其中一个或多个氢可以任选地被R基团取代。R可以独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基或(杂脂环基)烷基。
本文使用的术语“醛”指–Rc-C(O)H基团，其中Rc可以不存在，或独立地选自亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、亚芳基、亚杂芳基、亚杂脂环基、亚芳烷基或亚(杂脂环基)烷基。
本文使用的术语“氨基”指–NH2基团。
本文使用的术语“羟基”指–OH基团。
本文使用的术语“氰基”指“-CN”基团。
本文使用的术语“叠氮基”指–N3基团。
本文使用的术语“巯基”指–SH基团。
本文使用的术语“羧酸”指–C(O)OH。
本文使用的术语“硫氰酸根”指–S-C≡N基团。
本文使用的术语“氧基胺(oxo-amine)”指–O-NH2基团，其中–NH2上的一个或多个氢可以任选地被R基团取代。R可以独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基或(杂脂环基)烷基。
如本文所用，术语“衍生物”意指通过物理或化学过程从指定化合物衍生的相似化合物。衍生物可以使用标准程序来制备，所述标准程序是合成有机化学领域的技术人员已知的并且例如由J.March,“Advanced Organic Chemistry:Reactions,Mechanisms andStructure(《高等有机化学：反应、机制及结构》)”,第4版(纽约：Wiley-Interscience,1992)描述。举例来说，碱加成盐是使用常规手段从化合物制备而来的，包括使化合物的一个或多个游离羟基与合适的碱反应。一般来说，将化合物溶解于如甲醇或乙醇的极性有机溶剂中并且将碱添加于其中。所得的盐沉淀或者可以通过添加极性较小的溶剂而从溶液中析出。适用于形成碱加成盐的胱胺的盐是指衍生自无机和有机酸和碱的胱胺盐。合适酸的实例包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸k、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、三氟乙酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸和草酸。还包括衍生自氨基酸(例如L-精氨酸，L-赖氨酸)的盐。合适的碱的实例包括但不限于无机碱，如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、三甲胺等。
如本文所用，包含含有二硫键结构的化合物的洗涤溶液还含有缓冲剂。所述缓冲剂是适合处理其上固定有核酸分子的固定支持物的任何缓冲液。应理解，这样的缓冲剂对固体支持物的处理不应对固体支持物上的核酸分子的结构、核酸分子与固体支持物的结合以及后续的测序试剂中测序酶、探针和核苷酸结构及活性造成不利的影响。合适的缓冲剂是本领域技术人员能够容易确定的。合适的缓冲剂可以包含例如有机盐，以保持约pH 6至pH 9的稳定pH，并且可能还包含一价或二价阳离子或去垢剂，从而从固体支持物除去非特异性结合的分子。示例性的缓冲剂可以包括例如Tris-HCl缓冲液(例如pH 6.5的100mMTris-HCl缓冲液)、SSC缓冲液(例如0.3xSSC/0.1％Tween)、TE缓冲液(例如含有pH 8的10mM Tris-HCl和1mM EDTA的TE缓冲液)等。
在作出本发明的过程中，本发明人令人惊讶地发现，本发明的含有二硫键的化合物能够与再生试剂中的还原剂发生氧化还原反应，同时，本发明的这样的含有二硫键的化合物还不会对核酸的测序造成任何显著的不利影响，例如不会对测序试剂(例如测序酶、经标记的探针或核苷酸)的性质、固体支持物上的核酸分子的性质和固体支持物与其上固定的核酸分子的结合造成任何显著的不利影响。相比之下，其它很多常用的氧化剂会对测序引起不良影响，例如破坏dNTP的结构，影响聚合酶的活性等。
在优选的实施方案中，本发明的含有二硫键结构的化合物的氧化性可以仅来自于二硫键结构。也就是说，本发明的含有二硫键结构的化合物可以不含有除-S-S-以外的任何其它氧化基团。在一些实施方案中，本发明的含有二硫键结构的化合物可以含有至少一个二硫键。例如，含有二硫键结构的化合物可以含有至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个二硫键。在优选的实施方案中，含有二硫键结构的化合物含有1-3个二硫键。在优选的实施方案中，含有二硫键结构的化合物含有1-2个二硫键。在优选的实施方案中，含有二硫键结构的化合物仅含有1个二硫键。
在本发明的实施方案中，含有二硫键结构的化合物在含有该化合物的溶液中的量是足以显著降低或甚至消除在测序过程中固体支持物上或与固体支持物流体连通的流动通道上的再生试剂的残留的任何量。在一个实施方案中，含有二硫键结构的化合物在含有该化合物的溶液中的量可以是例如至少约0.1mM、至少约0.2mM、至少约0.3mM、至少约0.4mM、至少约0.5mM、至少约0.6mM、至少约0.7mM、至少约0.8mM、至少约0.9mM、至少约0.10mM、至少约1mM、至少约2mM、至少约3mM、至少约4mM、至少约5mM、至少约6mM、至少约7mM、至少约8mM、至少约9mM、至少约10mM、至少约15mM、至少约20mM、至少约25mM、至少约30mM、至少约35mM、至少约40mM、至少约45mM、至少约50mM、至少约55mM、至少约60mM、至少约70mM、至少约80mM、至少约90mM、至少约100mM或更高，或前述任何两个值之间的范围。在一个实施方案中，含有二硫键结构的化合物在含有该化合物的溶液中的量可以是例如至多约1mM、至多约2mM、至多约3mM、至多约4mM、至多约5mM、至多约6mM、至多约7mM、至多约8mM、至多约9mM、至多约10mM、至多约15mM、至多约20mM、至多约25mM、至多约30mM、至多约35mM、至多约40mM、至多约45mM、至多约50mM、至多约55mM、至多约60mM、至多约70mM、至多约80mM、至多约90mM、至多约100mM，或前述任何两个值之间的范围。在一个实施方案中，含有二硫键结构的化合物在含有该化合物的溶液中的量可以是例如约1mM-约50mM。在一个实施方案中，含有二硫键结构的化合物在含有该化合物的溶液中的量可以是例如约2mM-约20mM。在一个实施方案中，含有二硫键结构的化合物在含有该化合物的溶液中的量可以是例如约5mM-约10mM。
如本文所用，术语“RunOn”用于评价测序中的碱基合成超前现象。RunOn值越高，表明碱基合成超前现象越严重。碱基合成超前直接导致测序数据质量下降。可以根据BGISEQ-500测序平台自带的软件(深圳华大智造科技有限公司)或其它合适的方法来执行和报告RunOn的检测。在测序过程中，再生试剂的残留通常会导致较高的RunOn值。令人惊讶地，如实施例所证实的，本发明人发现在测序程序中洗涤再生试剂的过程中，如本文所述的含有二硫键结构的化合物的添加能够显著降低RunOn值并且不会不利地影响后续测序循环中使用的测序试剂的反应活性。相比之下，其它氧化剂例如过氧化氢、硫酸铁和氢氧化铜则严重干扰测序反应，导致无法测量RunOn值。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域普通技术人员所通常理解含义相同的含义。使用术语“包括”以及该术语的其他形式并非是限制性的。使用术语“具有”以及该术语的其他形式并非是限制性的。如本说明书中所使用的，不论在过渡短语中还是在权利要求书中，术语“包含”应解释为具有开放性的含义。即，以上术语应与短语“至少含有”或“至少包括”同义地进行解释。例如，当在方法的上下文中使用时，术语“包含”意味着该方法至少包括已叙述的步骤，但可以包括另外的步骤。当在化合物、组合物、或装置的上下文中使用时，术语“包含”意味着该化合物、组合物或装置至少包括已叙述的特征或组分，但可以包括另外的特征或组分。
附图说明
图1显示使用添加或未添加胱胺的洗涤溶液进行测序的RunOn值的比较。
图2显示使用添加或未添加胱胺酸的洗涤溶液进行测序的RunOn值的比较。
图3显示使用添加或未添加5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)的洗涤溶液进行测序的RunOn值的比较。
图4显示使用添加或未添加2-羟乙基二硫化物的洗涤溶液进行测序的RunOn值的比较。
图5显示使用添加或未添加胱胺的洗涤溶液进行测序的RunOn值的比较。
图6显示使用添加添加过氧化氢、硫酸铁或氢氧化铜或2-羟乙基二硫化物的洗涤溶液进行测序的信号强度的比较。
实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
按照制造商的说明书，利用MGIEasyTM DNA文库制备试剂盒(深圳华大智造科技有限公司)以大肠杆菌标准菌株为原料提取DNA构建用于测序的DNA文库，加载到测序芯片上。按照制造商的说明书，使用BGISEQ-500高通量测序试剂盒(SE50 V3.0，深圳华大智造科技有限公司，货号PF-UM-PEV30)，将制备好的测序芯片加载至BGISEQ-500测序平台(深圳华大智造科技有限公司)完成30个碱基的序列测定，选择1*1的拍照面积。
在BGI-SEQ500测序试剂盒V3.0的洗涤试剂1(在用再生试剂处理芯片后用于洗涤芯片的试剂)中添加2mM胱胺，采用上面段落中所述的相同程序完成30个碱基序列测定。
利用BGI-SEQ500测序平台自带的软件分别评估两组测序实验的每个循环的RunOn值，得到的结果如图1所示，另外，利用BGISEQ-500测序平台自带的软件评估了平均RunOn值。
结论：胱胺的添加使得每个循环RunOn值显著降低，使得平均RunOn值从0.15降低到0.11。
实施例2
按照制造商的说明书，利用MGIEasyTM DNA文库制备试剂盒(深圳华大智造科技有限公司)以大肠杆菌标准菌株为原料提取DNA构建用于测序的DNA文库，加载到测序芯片上。按照制造商的说明书，使用BGISEQ-500高通量测序试剂盒(SE50 V3.0，深圳华大智造科技有限公司，货号PF-UM-PEV30)，将制备好的测序芯片加载至BGISEQ-500测序平台(深圳华大智造科技有限公司)完成20个碱基的序列测定，选择1*1的拍照面积。
在BGISEQ-500测序试剂盒V3.0的洗涤试剂1(在用再生试剂处理芯片后用于洗涤芯片的试剂)中添加10mM胱胺酸，采用上面段落中所述的相同程序完成20个碱基序列测定。
利用BGISEQ-500测序平台自带的软件分别评估两组测序实验的每个循环的RunOn值，得到的结果如图2所示，另外，利用BGISEQ-500测序平台自带的软件评估了平均RunOn值。
结论：胱胺的添加使得每个循环RunOn值显著降低，使得平均RunOn值从0.14降低到0.09。
实施例3
按照制造商的说明书，利用MGIEasyTM DNA文库制备试剂盒(深圳华大智造科技有限公司)以大肠杆菌标准菌株为原料提取DNA构建用于测序的DNA文库，加载到测序芯片上。按照制造商的说明书，使用BGISEQ-500高通量测序试剂盒(SE50 V3.0，深圳华大智造科技有限公司，货号PF-UM-PEV30)，将制备好的测序芯片加载至BGISEQ-500测序平台(深圳华大智造科技有限公司)完成40个碱基的序列测定，选择1*1的拍照面积。
在BGISEQ-500测序试剂盒V3.0的洗涤试剂1(在用再生试剂处理芯片后用于洗涤芯片的试剂)中添加1mM 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，采用上面段落中所述的相同程序完成40个碱基序列测定。
利用BGISEQ-500测序平台自带的软件分别评估两组测序实验的每个循环的RunOn值，得到的结果如图3所示，另外，利用BGISEQ-500测序平台自带的软件评估了平均RunOn值。
结论：胱胺的添加使得每个循环RunOn值显著降低，使得平均RunOn值从0.12降低到0.07。
实施例4
按照制造商的说明书，利用MGIEasyTM DNA文库制备试剂盒(深圳华大智造科技有限公司)以大肠杆菌标准菌株为原料提取DNA构建用于测序的DNA文库，加载到测序芯片上。按照制造商的说明书，使用BGISEQ-500高通量测序试剂盒(SE50 V3.0，深圳华大智造科技有限公司，货号PF-UM-PEV30)，将制备好的测序芯片加载至BGISEQ-500测序平台(深圳华大智造科技有限公司)完成50个碱基的序列测定，选择1*1的拍照面积。
在BGISEQ-500测序试剂盒V3.0的洗涤试剂1(在用再生试剂处理芯片后用于洗涤芯片的试剂)中添加20mM 2-羟乙基二硫化物，采用上面段落中所述的相同程序完成50个碱基序列测定。
利用BGISEQ-500测序平台自带的软件分别评估两组测序实验的每个循环的RunOn值，得到的结果如图4所示，另外，利用BGISEQ-500测序平台自带的软件评估了平均RunOn值。
结论：2-羟乙基二硫化物的添加使得每个循环RunOn值显著降低，使得平均RunOn值从0.11降低到0.07。
实施例5
按照制造商的说明书，利用MGIEasyTM DNA文库制备试剂盒(深圳华大智造科技有限公司)以大肠杆菌标准菌株为原料提取DNA构建用于测序的DNA文库，加载到测序芯片上。将制备好的测序芯片按照以下程序完成50个碱基的序列测定，选择1*1的拍照面积：
将芯片浸泡在聚合反应试剂中约1min，移出芯片，随后浸泡在洗涤试剂2中约1min，移出芯片，随后浸泡在保护试剂中约1min，移出芯片，对其进行20-30min的拍照以检测代表一个碱基的身份信息的荧光信号，随后将芯片浸泡在再生试剂中约1min，移出芯片，随后浸泡在洗涤试剂1中约1min，移出芯片；随后对芯片重复前述的操作步骤以进行下一个碱基的测序；所使用的试剂均来自BGISEQ-500测序试剂盒(SE50 V3.0，深圳华大智造科技有限公司，货号PF-UM-PEV30)，各步骤的温度等反应条件以及拍照程序均参照试剂盒的说明书以及BGISEQ-500测序平台的标准程序进行。
在BGISEQ-500测序试剂盒V3.0的洗涤试剂1(在用再生试剂处理芯片后用于洗涤芯片的试剂)中添加20mM胱胺，采用上面段落中所述的相同程序完成30个碱基序列测定。
利用BGISEQ-500测序平台自带的软件分别评估两组测序实验的每个循环的RunOn值，得到的结果如图5所示，另外，利用BGISEQ-500测序平台自带的软件评估了平均RunOn值。
结论：胱胺的添加使得每个循环RunOn值显著降低，使得平均RunOn值从0.94降低到0.14。
实施例6
按照制造商的说明书，使用大肠杆菌基因组DNA，利用MGIEasyTM DNA文库制备试剂盒(深圳华大智造科技有限公司)以大肠杆菌标准菌株为原料提取DNA构建用于测序的DNA文库，加载到测序芯片上。按照制造商的说明书，使用BGISEQ-500高通量测序试剂盒(SE50V3.0，深圳华大智造科技有限公司，货号PF-UM-PEV30)，将制备好的测序芯片加载至BGISEQ-500测序平台(深圳华大智造科技有限公司)完成50个碱基的序列测定，选择1*1的拍照面积，其中使用的BGISEQ-500测序试剂盒V3.0中的洗脱试剂1(在用再生试剂处理芯片后用于洗涤芯片的试剂)中添加50mM2-羟乙基二硫化物。
在BGISEQ-500测序试剂盒V3.0的洗脱试剂1(在用再生试剂处理芯片后用于洗涤芯片的试剂)中添加2％过氧化氢，采用上面段落中所述的相同程序完成50个碱基序列测定。
在BGISEQ-500测序试剂盒V3.0的洗脱试剂1(在用再生试剂处理芯片后用于洗涤芯片的试剂)中添加2mM硫酸铁，采用上面段落中所述的相同程序完成50个碱基序列测定。
在BGISEQ-500测序试剂盒V3.0的洗脱试剂1(在用再生试剂处理芯片后用于洗涤芯片的试剂)中添加2mM氢氧化铜，采用上面段落中所述的相同程序完成50个碱基序列测定。
利用BGISEQ-500测序平台自带的程序输出四组测序实验的荧光信号强度值，得到的结果如图6所示。
结论：添加过氧化氢、硫酸铁或氢氧化铜使荧光信号强度(荧光信号强度是测序过程获得的最基础数据，如果信号值过低，RunOn等其它质量指标都无法计算)急剧下降，已接近背景值，说明过氧化氢、硫酸铁和氢氧化铜严重影响测序过程；而添加2-羟乙基二硫化物使信号强度呈线性稳定下降，属于测序过程中信号的正常下降情况。
Claims (20)
1.一种消除再生试剂残留的方法，其包括：
a.提供其上固定有核酸分子的固体支持物，
b.使用再生试剂处理所述固体支持物，所述再生试剂包含还原剂，和
c.使用添加了含有二硫键结构的化合物的洗涤溶液处理所述固体支持物；
其中在步骤b之前，使用含有测序试剂的一种或多种反应溶液处理所述固体支持物，以在固体支持物上产生代表所述核酸分子的核苷酸序列的信号，并且其中所述再生试剂用来消除固体支持物上的所述信号；
其中，所述含有二硫键结构的化合物选自胱胺、胱胺酸、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)和2-羟乙基二硫化物。
2.权利要求1的方法，其中所述信号为荧光信号。
3.权利要求1的方法，其中经过步骤c的处理之后，还使用含有测序试剂的一种或多种反应溶液处理所述固体支持物。
4.权利要求3的方法，其中所述测序试剂包括用于连接法测序或合成法测序的测序试剂。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述洗涤溶液还包含缓冲剂。
6.权利要求1-4任一项的方法，其中所述含有二硫键结构的化合物在所述洗涤溶液中的浓度为1-50mM。
7.权利要求1-4任一项的方法，其中所述含有二硫键结构的化合物在所述洗涤溶液中的浓度为2mM或20mM。
8.如权利要求1-7任一项定义的含有二硫键结构的化合物用于消除再生试剂残留的用途，其包括：
a.提供其上固定有核酸分子的固体支持物，
b.使用再生试剂处理所述固体支持物，所述再生试剂包含还原剂，和
c.使用添加了含有二硫键结构的化合物的洗涤溶液处理所述固体支持物；
其中，在步骤b之前，任选地使用含有测序试剂的一种或多种反应溶液处理所述固体支持物，以在固体支持物上产生代表所述核酸分子的核苷酸序列的信号，并且其中所述再生试剂用来消除固体支持物上的所述信号。
9.权利要求8的用途，其中，所述信号为荧光信号。
10.权利要求8的用途，其中经过步骤c的处理之后，还使用含有测序试剂的一种或多种反应溶液处理所述固体支持物。
11.权利要求10的用途，其中所述测序试剂包括用于连接法测序或合成法测序的测序试剂。
12.权利要求8的用途，所述洗涤溶液还包含缓冲剂。
13.权利要求8的用途，所述含有二硫键结构的化合物在洗涤溶液中的浓度为1-50mM。
14.权利要求8的用途，所述含有二硫键结构的化合物在洗涤溶液中的浓度为2mM或20mM。
15.实施权利要求1-7任一项所述的方法的试剂盒，所述试剂盒包括测序试剂、洗涤试剂、包含还原剂的再生试剂和添加了含有二硫键结构的化合物的洗涤溶液；
其中所述测序试剂用来在其上固定有核酸分子的固体支持物上产生代表所述核酸分子的核苷酸序列的信号，并且其中所述再生试剂用来消除固体支持物上的所述信号。
16.权利要求15所述的试剂盒，其中，所述试剂盒通过权利要求1-7任一项所述的方法来进行测序。
17.权利要求15所述的试剂盒，其中，所述信号为荧光信号。
18.权利要求15所述的试剂盒，其中，所述测序试剂包括用于连接法测序或合成法测序的测序试剂。
19.权利要求15所述的试剂盒，其中，所述洗涤溶液还包含缓冲剂。
20.权利要求15所述的试剂盒，其中，所述含有二硫键结构的化合物在洗涤溶液中的浓度为1-50mM。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/CN2017/106972 WO2019075711A1 (zh) | 2017-10-20 | 2017-10-20 | 消除再生试剂残留的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111051533A CN111051533A (zh) | 2020-04-21 |
| CN111051533B true CN111051533B (zh) | 2024-02-02 |
Family
ID=66173131
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201780094653.2A Active CN111051533B (zh) | 2017-10-20 | 2017-10-20 | 消除再生试剂残留的方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111051533B (zh) |
| WO (1) | WO2019075711A1 (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102140523A (zh) * | 2011-01-28 | 2011-08-03 | 东南大学 | 高通量测序模板的原位复制及其增加阅读长度的测序方法 |
| CN102329884A (zh) * | 2011-10-20 | 2012-01-25 | 东南大学 | 两核苷酸同时合成dna测序方法及其应用 |
| CN102971335A (zh) * | 2009-03-23 | 2013-03-13 | 史蒂芬·阿尔伯特·本纳 | 可逆终止引物延伸试剂 |
| CN103484106A (zh) * | 2013-09-05 | 2014-01-01 | 上海交通大学 | 四色荧光标记可逆终端及其在dna测序中的用途 |
| CN106117288A (zh) * | 2015-05-08 | 2016-11-16 | 桑特里莱恩科技控股公司 | 二硫键连接的可逆终止子 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9279149B2 (en) * | 2013-04-02 | 2016-03-08 | Molecular Assemblies, Inc. | Methods and apparatus for synthesizing nucleic acids |
-
2017
- 2017-10-20 CN CN201780094653.2A patent/CN111051533B/zh active Active
- 2017-10-20 WO PCT/CN2017/106972 patent/WO2019075711A1/zh active Application Filing
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102971335A (zh) * | 2009-03-23 | 2013-03-13 | 史蒂芬·阿尔伯特·本纳 | 可逆终止引物延伸试剂 |
| CN102140523A (zh) * | 2011-01-28 | 2011-08-03 | 东南大学 | 高通量测序模板的原位复制及其增加阅读长度的测序方法 |
| CN102329884A (zh) * | 2011-10-20 | 2012-01-25 | 东南大学 | 两核苷酸同时合成dna测序方法及其应用 |
| CN103484106A (zh) * | 2013-09-05 | 2014-01-01 | 上海交通大学 | 四色荧光标记可逆终端及其在dna测序中的用途 |
| CN106117288A (zh) * | 2015-05-08 | 2016-11-16 | 桑特里莱恩科技控股公司 | 二硫键连接的可逆终止子 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| "A new class of cleavable fluorescent nucleotides: synthesis and optimization as reversible terminators for DNA sequencing by synthesis;Gerardo Turcatti等;《Nucleic Acids Res》;摘要和第3-4页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN111051533A (zh) | 2020-04-21 |
| WO2019075711A1 (zh) | 2019-04-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10508306B2 (en) | Bi-directional sequencing compositions and methods | |
| EP3115462B1 (en) | Methods and apparatus for synthesizing nucleic acids | |
| EP3670672A1 (en) | Method for sequencing a polynucleotide template | |
| CA2641851A1 (en) | Method for sequencing a polynucleotide template | |
| US20190345549A1 (en) | Thiolated nucleotide analogues for nucleic acid synthesis | |
| AU2019445584A1 (en) | Single-channel sequencing method based on self-luminescence | |
| US20230272467A1 (en) | Nucleic acid sequencing method | |
| CN111051533B (zh) | 消除再生试剂残留的方法 | |
| WO2017196676A1 (en) | Metal chelation post incorporation detection methods | |
| AU2015270298B2 (en) | Methods of reducing density-dependent GC bias in amplification | |
| CN118086478A (zh) | 核酸测序方法 | |
| CN118086479A (zh) | 核酸测序方法 | |
| CN118109572A (zh) | 核酸测序方法 | |
| CN118086480A (zh) | 核酸测序方法 | |
| CA3177299A1 (en) | Catalytically controlled sequencing by synthesis to produce scarless dna | |
| US20140127698A1 (en) | Reiterative oligonucleotide synthesis | |
| JP2022523711A (ja) | 核酸を合成するための再使用可能な開始剤 | |
| CN117813399A (zh) | 用于化学裂解表面结合的多核苷酸的高碘酸盐组合物和方法 | |
| CN117940577A (zh) | 用于化学裂解表面结合的多核苷酸的高碘酸盐组合物和方法 | |
| Gerrity | Investigations in readlength improvements for DNA sequencing by synthesis | |
| WO2006003638A2 (en) | Novel method for labeling nucleic acid in a sequence-specific manner, and method for detecting nucleic acid using the same |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: Comprehensive Building and 2nd Floor, Building 11, Beishan Industrial Zone, Yantian District, Shenzhen City, Guangdong Province Patentee after: Shenzhen Huada Zhizao Technology Co.,Ltd. Country or region after: China Patentee after: COMPLETE GENOMICS Inc. Country or region after: U.S.A. Address before: 518083 the comprehensive building of Beishan industrial zone and 11 2 buildings in Yantian District, Shenzhen, Guangdong. Patentee before: MGI TECH Co.,Ltd. Country or region before: China Patentee before: COMPLETE GENOMICS Inc. Country or region before: U.S.A. |
|
| CP03 | Change of name, title or address |