CN111048154A - 一种抗体表位作图的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种抗体表位作图的方法,包括以下步骤:(1)表达框架的制备;(2)突变抗原蛋白的制备;(3)突变抗原表达水平检测;(4)抗体结合能力检测;(5)表位分析及作图。本发明通过在氨基酸定点突变技术的基础上改进升级,快速地获得含有定点突变的表达框架,并与哺乳动物表达系统相结合制备接近天然构象的突变抗原蛋白质,通过检测突变抗原与抗体的结合能力的差异以评估特定氨基酸对抗体结合的影响,从而实现表位作图。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种抗体识别抗原表位作图,能用于鉴定单克隆抗体识别的关键抗原表位
背景技术
治疗性单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高、毒副作用小等优点,已被广泛应用于癌症、免疫调节等治疗领域,2015年全球单克隆抗体药物的销售额约为980亿美元,然而在抗体产业巨大经济利益的背后是激烈的国际制药行业的竞争。我国单抗药物市场仅占全球市场的1-2%,一方面存在培养规模小、细胞系表达水平低等产业化关键技术问题,另一方面存在创新性不足、知识产权壁垒等专利问题,这些问题均限制了我国抗体产业的产能规模和行业发展。
近年,随着国家及企业在抗体药物研发和生产方面的投入力度的增加,培养规模小、细胞表达水平等技术问题已经通过设备升级、生产线优化、细胞筛选和驯化等途径和方法得以改善,这方面正在逐步与国际接轨,然而对于创新和知识产权方面的限制仍有待增强,这是因为目前已经明确的有效抗体作用抗原靶点的数量是一定的,只有少数几十个,但针对这些抗原靶点的治疗性抗体的数量要远远超过抗原靶点的数量,很容易出现多个抗体针对同一个抗原靶点的现象。由于抗原靶点通过与其受体或配体相结合从而激活信号通路发挥作用,因此,如果单抗能够特异性结合或空间阻遏抗原与其受体或配体的相互作用位点将会具有更大的成药可能,同时通过抗体结合抗原的表位专利的保护将可以提升该抗体在同抗原靶点抗体中的竞争力。因此,建立一种快速有效鉴定抗体识别抗原表位的方法,对抗体药物的研发具有重大意义。
表位作图(Epitope mapping)是指鉴别蛋白质抗原与抗体或抗体片段相结合表位的方法,对候选抗体的选择和治疗性抗体的发现和发展至关重要。抗原表位根据其功能不同分为两种类型,即线性表位(linear)和构象表位(conformational)。线性表位是由约5-20个氨基酸组成的线性肽链序列,构象表位是在空间上由蛋白质折叠而形成的区域,其精确定位相对较难,对表位作图方法的要求也更高。
表位作图的方法主要包括X-射线晶体衍射技术、肽扫描技术、噬菌体展示肽技术、氨基酸定点突变技术及生物信息技术预测等。其中X-射线晶体衍射是“金标准”,这种方法可以根据解析的晶体结果得到关于抗体和抗原结合两种类型的表位的最为详细的结果,但是这种方法对于蛋白质量的要求很高,实验技术要求高,同时价格昂贵,操作繁琐,不易实行。肽扫描技术通过合成重叠短肽检测与抗体的结合,该方法合成肽的成本高,且对线性表位的识别更有效,存在会丢失众多的构象表位信息的问题。噬菌体递呈展示随机肽库技术从噬菌体递呈的随机肽库中直接筛选出能和抗体结合的表位,既可以是线性表位,也可以是模拟的构象型表位,但该方法需要对噬菌体短肽库进行筛选和富集,操作相对复杂且实验周期长。氨基酸定点突变技术通过定点突变抗原氨基酸以检测特定氨基酸与抗体结合能力的改变,如去除氨基酸侧链上的活性基团,将其置换成体积小、无其它功能团的甲基且对蛋白质结构影响较小的丙氨酸,以观察这些改变对抗原-抗体结合能力的影响,即丙氨酸扫描法,该方法可以鉴定线性表位和构象表位,但操作较为复杂,且不能完全排除丙氨酸置换后对蛋白质结构稳定性的影响。由此可见,抗原表位作图的方法各有优缺点,因此本项目拟建立快速有效鉴定抗体识别抗原表位的技术平台,即通过在氨基酸定点突变技术的基础上进行方法改进,实现快速的氨基酸定点突变,并与哺乳动物表达系统相结合制备接近天然构象的蛋白质以检测与抗体的结合能力;另外,对已有晶体结构的蛋白将会进行结构分析以提高表位作图的准确性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于,提供一种快速有效鉴定抗体识别抗原表位和作图的方法,以克服现有技术中的抗原表位作图的方法的诸多缺点,例如成本高、耗时长。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案为:
一种抗体表位作图的方法,包括以下步骤:
(1)表达框架的制备:通过两轮PCR扩增获得由启动子、含有氨基酸突变位点的表达阅读框、Poly A尾巴、组蛋白标签组成的表达框架;
(2)突变抗原蛋白的制备:通过悬浮培养哺乳动物细胞,建立24孔小体积转染系统,使用所述表达框架直接瞬时转染哺乳动物细胞,用于突变抗原转染和表达;
(3)突变抗原表达水平检测:建立基于组蛋白标签的蛋白相对定量的方法,用于突变抗原表达量的检测;
(4)抗体结合能力检测:通过ELISA法检测突变抗原与抗体的结合能力,将突变后结合力显著下降的氨基酸位点作为潜在表位;
(5)表位分析及作图:验证所述潜在表位的准确性,并绘制空间表位图,以便直观的观察抗原表位;
具体的,所述步骤(1)中,第一轮PCR为:设计突变引物进行氨基酸位点突变,将特定的氨基酸突变成侧链只有一个甲基的丙氨酸;
具体的,所述步骤(1)中,第二轮PCR为:设计通用引物将启动子、Poly A尾和组蛋白标签等元件一并扩增,经纯化制备高质量的突变表达框架。
具体的,所述特定的氨基酸是指除丙氨酸以外的氨基酸。
具体的,所述步骤(2)中,所述哺乳动物细胞选自HEK293细胞、CHO细胞、293F细胞。
具体的,所述步骤(2)中,所述小体积是指1ml。
具体的,所述步骤(3)中,所述组蛋白标签为6个组氨酸组成的短标签。
具体的,所述步骤(3)中,针对含有所述短标签的突变抗原的定量,使用已知浓度的同种抗原蛋白作为标准品,进行定量检测方法的建立和优化。
具体的,所述步骤(3)中,结合力显著下降是指与对照相比,相对抗原蛋白的结合力下降达25%以上;优选的,下降比例达50%以上;更优选的,下降比例达75%以上。
具体的,所述步骤(5)中,通过晶体结构和生物信息学分析的方法对所述潜在表位的准确性进行验证,排除影响蛋白稳定性的氨基酸。
本发明通过在氨基酸定点突变技术的基础上改进升级,快速地获得含有定点突变的表达框架,并与哺乳动物表达系统相结合制备接近天然构象的突变抗原蛋白质,通过检测突变抗原与抗体的结合能力的差异以评估特定氨基酸对抗体结合的影响,从而实现表位作图。
本发明通过建立快速有效的抗体识别抗原表位的技术平台,可以实现研制抗体的表位作图,有利于自主知识产权创新药物的专利申请和保护。
传统的定点突变技术需要设计突变引物进行PCR扩增后插入表达载体,通过转化大肠杆菌经筛选获得含有突变位点的表达质粒,该方法十分耗时且通量较低。本发明采用两轮PCR的方法进行高质量突变表达框架的制备。
附图说明
图1为本发明一具体实施例的技术方案流程图。
图2为本发明的一具体实施例中的真核表达框架DNA片段电泳鉴定图。
图3为本发明的一具体实施例中的细胞上清中表达目的蛋白定量图。
图4为本发明的一具体实施例中的蛋白突变体与单克隆抗体的结合能力ELISA检测图。
图5为本发明的一具体实施例中的单克隆抗体表位作图图例,其中,黑色区域为特定抗体识别抗原的重要表位。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述,显然,所描述的实施例是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例一
(1)建立制备高质量的突变表达框架的方法
突变表达框架的制备是该项目的前提和先决条件。传统的定点突变技术需要设计突变引物进行PCR扩增后插入表达载体,通过转化大肠杆菌经筛选获得含有突变位点的表达质粒,该方法十分耗时且通量较低。本项目拟用两轮PCR的方法进行高质量突变表达框架的制备,首先通过设计突变引物进行氨基酸位点突变,将特定的氨基酸突变成侧链只有一个甲基的丙氨酸,然后再设计通用引物将启动子、Poly A尾和组蛋白标签等元件一并扩增,经纯化制备高质量的突变表达框架。该过程有两个难点,首选引物的设计,其次是第二轮PCR模板的用量,这些细节均可通过方法优化解决。
(2)PCR产物转染小体积哺乳动物细胞方法的建立
与传统的哺乳动物细胞转染方法不同,该平台使用PCR产物直接瞬时转染哺乳动物293F细胞,从而省去了质粒构建、转化和抽提等步骤,缩短整个项目的实验时间。但过量的PCR产物会存在潜在的细胞毒性,过少的PCR产物又会导致目的蛋白的低表达或不表达,因此,需要进行优化摸索PCR产物直接瞬时转染细胞的方法。另外,由于通量的需求,转染体积较大将会制约通量,并且会造成实验成本的浪费,因此,该项目将会建立24孔板1ml小体积的转染系统,用于支撑该平台项目。
(3)突变抗原表达水平检测方法的建立
由于抗原突变氨基酸的数量较多,如进行目的蛋白的纯化将会耗时费力,因此,有必要建立快速地蛋白表达定量检测的方法,该项目未选择定量方法较为成熟但长度较长的Fc标签是为了避免长片段PCR扩增造成的碱基突变,因而选用只有6个组氨酸组成的短标签。但该标签的定量方法并不成熟,少数几个定量试剂盒的价格十分昂贵,因此,该项目将建立针对组氨酸标签的抗体定量的ELISA方法,使用已知浓度的同抗原蛋白作为标准进行方法的建立和优化,使之适用于含有组氨酸标签的突变抗原的定量。
(4)检测突变抗原与抗体结合的能力
通过ELISA法检测突变抗原与抗体的结合能力,将突变后结合力显著下降的氨基酸位点作为潜在的抗原表位。
(5)表位分析及作图
虽然鉴定出潜在的抗原表位,但不能完全排除丙氨酸置换后对蛋白质结构稳定性的影响,因此通过晶体结构和生物信息学分析等方法可以验证这些潜在表位的准确性,排除影响蛋白稳定性的氨基酸,并绘制空间表位图,从空间结构上进行分析,从而更加准确地实现表位作图。
本发明的具体实施例的技术方案流程图如图1所示。
实施例二
本实施例为针对蛋白配体-1的表位作图的实施方案
1.蛋白配体-1的突变PCR产物的制备
通过分子生物学聚合酶链式反应(PCR)技术,设计突变引物,在引物中将除丙氨酸以外的氨基酸的密码子碱基替代为编码丙氨酸的密码子(对应碱基为:GCU,GCC,GCA和GCG),将编码丙氨酸的密码子用编码甘氨酸的密码子(对应碱基为:GGU,GGC,GGA和GGG)替代。以含有蛋白配体-1胞外区片段的重组真核表达质粒作为模板,按照QuikChangeLightning Multi Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technologies;210513)定点突变试剂盒中描述的方法进行PCR扩增,分别获得含有不同突变位点的蛋白配体-1的突变体的环状单链,以此片段为模板进行二次PCR,使用该真核表达载体启动子的上游引物和poly A尾巴后的下游引物并加入DNA聚合酶High-Fidelity DNA polymerase(NEB公司,货号M0530L)进行PCR的扩增,PCR条件为98℃,3分钟预变性,然后进行98℃,15秒,52℃-62℃,45秒,72℃,2分钟的30个温度循环,最后进行72℃的衍生,最终获得含有CMV启动子、信号肽、配体蛋白-1的胞外区片段突变体、组蛋白标签和Poly A尾巴组成的表达框架,进1%琼脂糖凝胶电泳鉴定目的片段的大小,部分片段电泳鉴定结果如图2所示。
2.蛋白配体-1突变体蛋白表达
转染前两天,准备60mL 293F(Life technologies)细胞用于瞬时转染。转染当天,将细胞接种到24孔板,1mL/孔,接种密度为1×106。将随后蛋白配体-1抗原变体PCR产物分别用30微升opti-MEM培养基(Gibico公司,货号51985034)稀释。2.5微升293Fectin(Invitrogen公司,货号12347019)转染试剂稀释于50微升opti-MEM培养基,静置5分钟后,将脂质体混合液加入到含有变体PCR产物的培养基中,混匀,静置20分钟。放置在参数为37℃,8%CO2,220转/分钟的细胞培养摇床中培养。培养5天后,收集细胞上清。
3.蛋白配体-1突变体的蛋白定量
含有蛋白配体-1突变体的细胞上清液的定量采用竞争ELISA的方式进行。具体实施步骤为:于96孔酶标板(Thermo;442404)中包被0.25微克/毫升的正常蛋白配体-1蛋白,4℃过夜。之后加入2%牛血清白蛋白(BSA)溶液,室温封闭1小时。将已知浓度的含有组蛋标签的正常蛋白配体-1进行梯度稀释(起点为8000ng/ml,2倍稀释)作为标准曲线。酶标板中加入梯度稀释标准曲线样品以及稀释5倍的含有蛋白配体-1突变体的细胞上清,室温孵育10-30分钟。之后加入HRP标记抗His标签的二抗(Rockland Immunochemicals公司,货号200-303-382,1:5000稀释),室温孵育1-2小时,最后催化底物显色读数。得到的数据通过四参数法拟合,得到蛋白配体-1竞争结合的标准曲线,如图3所示,从而计算出细胞上清中蛋白配体-1突变体的表达量。
4.检测蛋白配体-1突变体与抗体6M的结合
使用ELISA方法进行特异结合蛋白配体-1的抗体6M与不同蛋白配体-1突变体的结合鉴定。具体实施例为:将2微克/毫升的抗体6M包被于96孔酶标板(Thermo公司,货号442404),4℃过夜。之后加入2%BSA溶液,室温封闭1小时。待检蛋白配体-1突变体稀释到70纳克/毫升,室温孵育1-2小时。之后加入HRP标记抗His标签的二抗(RocklandImmunochemicals公司,货号200-303-382,1:5000稀释),室温孵育1-2小时,最后加入催化底物显色,于酶标仪上读取450纳米波长的吸光度值。将蛋白配体-1突变体的吸光度值与正常蛋白配体-1的吸光度值相比,获得相对比值结果如图5所示,在选定的27个氨基酸蛋白配体-1突变体与抗体6M的结合强度不一,比值越小的氨基酸位点对于抗体6M抗体的结合的贡献越大,有4个氨基酸位点(K46A、L48A、L50A、I54A)突变后与抗体6M的结合能力下降了75%以上,有4个氨基酸位点(A52G、H69A、Y118A、G119Y)突变后与抗体6M的结合能力下降了50-75%,有6个氨基酸位点(F19A、E45A、Q47A、V68A、M115A、I116A)突变后与抗体6M结合能力下降了25-50%,另有13个氨基酸位点突变后与6M的结合能力相对影响较小,为小于25%。
5.表位分析及作图
在蛋白配体-1晶体结构上进行影响抗体结合突变位点氨基酸的进一步分析,从而排除影响蛋白稳定性的氨基酸,并绘制空间表位图,根据结构分析的结果将标定的氨基酸标记在蛋白配体-1结构上,如图5所示,蛋白配体-1氨基酸位点突变后与抗体结合能力下降超过50%的位点如图中黑色所示,相对影响较小(25-50%)的氨基酸位点标记为深灰色。同时为了显示抗体6M的作用机制,将蛋白受体-1的结构也显示在图5中(以卡通结构显示),通过空间构象的关系可以看出抗体6M通过空间位阻作用阻挡了蛋白受体-1与蛋白配体-1的结合。
综上所述,上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限定本发明的保护范围,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,皆应包含在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种抗体表位作图的方法,包括以下步骤:
(1)表达框架的制备:通过两轮PCR扩增获得由启动子、含有氨基酸突变位点的表达阅读框、Poly A尾巴、组蛋白标签组成的表达框架;
(2)突变抗原蛋白的制备:通过悬浮培养哺乳动物细胞,建立24孔小体积转染系统,使用所述表达框架直接瞬时转染哺乳动物细胞,用于突变抗原转染和表达;
(3)突变抗原表达水平检测:建立基于组蛋白标签的蛋白相对定量的方法,用于突变抗原表达量的检测;
(4)抗体结合能力检测:通过ELISA法检测突变抗原与抗体的结合能力,将突变后结合力显著下降的氨基酸位点作为潜在表位;
(5)表位分析及作图:验证所述潜在表位的准确性,并绘制空间表位图,以便直观的观察抗原表位。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(1)中,第一轮PCR为:设计突变引物进行氨基酸位点突变,将特定的氨基酸突变成侧链只有一个甲基的丙氨酸。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(1)中,第二轮PCR为:设计通用引物将启动子、Poly A尾和组蛋白标签等元件一并扩增,经纯化制备高质量的突变表达框架。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述特定的氨基酸是指除丙氨酸以外的氨基酸。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)中,所述哺乳动物细胞选自HEK293细胞、CHO细胞、293F细胞。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)中,所述小体积是指1ml。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(3)中,所述组蛋白标签为6个组氨酸组成的短标签。
8.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(3)中,针对含有所述短标签的突变抗原的定量,使用已知浓度的同种抗原蛋白作为标准品,进行定量检测方法的建立和优化。
9.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(3)中,结合力显著下降是指与对照相比,相对抗原蛋白的结合力下降达25%以上。
10.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(5)中,通过晶体结构和生物信息学分析的方法对所述潜在表位的准确性进行验证,排除影响蛋白稳定性的氨基酸。
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