CN111041067A - 一种检测β-内酰胺酶及其抑制复合剂耐药性的试剂与方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了抗生素效果检测相关技术领域的一种检测β‑内酰胺酶及其抑制复合剂耐药性的试剂与方法,其中,检测β‑内酰胺酶的试剂,包括按重量份计的以下组分:58.5~71.5份去离子水或无RN酶纯水、0.0585~0.0715份牛血清蛋白、0.1419~0.1735份三磷酸腺苷钠、0.0901~0.1101份二硫苏糖醇和0.0047~0.0057份辅酶A,还包括按体积份计的以下组分:0.0585~0.0715份液体生物防腐剂、2.925~3.575份β‑内酰胺偶联荧光素、11.7~14.3份荧光素酶、1.17~1.43份0.9~1.1M氯化镁溶液、5.85~7.15份1.8~2.2%专利蓝溶液和0.585~0.715份0.9~1.1M 4‑羟乙基哌嗪乙磺酸溶液;其中,1重量份去离子水或无RN酶纯水换算成按体积份计为1体积份,检测β‑内酰胺酶的试剂的pH为7.8~8.0;操作简便,灵敏度和特异性高。
Description
技术领域
本发明涉及抗生素效果检测相关技术领域,特别涉及一种检测β-内酰胺酶及其抑制复合剂耐药性的试剂与方法。
背景技术
细菌耐药已成为全球性的公共卫生安全问题。2014年世界卫生组织发布的《抗菌素耐药:全球监测报告》显示:每年美国因感染超级耐药细菌而死亡的人数高达6.3万人,欧盟范围内死亡人数也有2.5万人。超级细菌每年在美国造成的死亡人数远超过感染艾滋病毒死亡的人数。如果超级细菌在全球范围的扩散而得不到有效遏制,由此造成的死亡人数将会每年增加10万人,各大洲每年死于细菌耐药人数也将会大幅度增加。而新型抗生素的问世至今已有30年未有新进展。临床误用和滥用抗生素是耐药性泛滥的最大推手,耐药细菌所致感染已构成了新世纪抗感染治疗的新挑战,是当今人类健康和生命的主要威胁。这就需要一个有效的诊断测试工具,帮助临床医生判断患者是否感染耐药细菌,并据此指导合理用药。
目前,临床使用的绝大多数抗生素均为β-内酰胺类药物,该分类主要包括青霉素类、头孢菌素类及碳青霉烯类以及与β-内酰胺酶抑制剂联合使用的复方类抗生素。β-内酰胺酶类药物的作用机理,是通过β-内酰胺功能环与青霉素结合蛋白(PBPs)结合,从而抑制细菌细胞壁的生物合成,进而促使细菌死亡,最终实现杀菌效果。
但是,β-内酰胺类抗生素的广泛使用,也刺激了细菌产生β-内酰胺酶的能力,β-内酰胺酶拥有水解破坏β-内酰胺环的功能,从而使β-内酰胺酶类抗生素失活。据统计,产生β-内酰胺酶是80%病原菌耐药的原因之一。
β-内酰胺酶抑制剂(β-Lactamaseinhibitors)是针对细菌对β-内酰胺抗生素产生耐药机制而研发的一类药物,此类抑制剂可与β-内酰胺酶发生牢固的结合,从而使该酶失去活性,主要可用于对青霉素类或头孢菌素类药物产生药物的细菌感染。
目前,临床应用的β-内酰胺酶抑制剂主要包括克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦,通常也将β-内酰胺类抗生素与β-内酰胺酶抑制剂联用,称为β-内酰胺酶抑制剂复合制剂,受专利申请标题字数规定的限制,本申请中将β-内酰胺酶抑制剂复合制剂简称为β-内酰胺酶抑制复合剂;该复合制剂治疗效果显著,β-内酰胺酶抑制剂可增强抗生素的抗菌活性,减少抗生素的用量。
但是,随着β-内酰胺酶抑制复合剂的广泛使用,临床上开始发现有对β-内酰胺酶抑制复合剂的耐药菌出现,对于这种耐药菌的感染,常规抗生素已经没法起到疗效,也更容易转为危重病症,甚至危及生命。
现有技术中的检测细菌耐药的方法以微生物培养为主,该方法操作繁琐,耗时长,容易被污染,结果不易判断,不适合在临床上广泛使用。现有技术中也还未有针对于β-内酰胺酶抑制复合剂的耐药检测试剂。因此,研发一种操作简便、快速准确的β-内酰胺酶抑制复合剂的耐药性检测方法与试剂,有着重大意义。
发明内容
针对现有技术存在的缺乏一种操作简便、快速准确的β-内酰胺酶抑制复合剂的耐药性检测方法与试剂的技术问题,本发明提供一种检测β-内酰胺酶及其抑制复合剂耐药性的试剂与方法。
基于以下原理:β-内酰胺酶类药物其化学结构中均含有β-内酰胺环,其作用机理为通过β-内酰胺功能环与青霉素结合蛋白(PBPs)结合从而抑制细菌细胞壁的生物合成,引起细菌死亡而发挥杀菌作用。耐药细菌通过产生β-内酰胺酶,破坏β-内酰胺类抗生素的β-内酰胺功能环,从而使此类抗生素失活。因此,只要检测到β-内酰胺酶的存在,即可判定细菌是否具有耐药性。
研究发现,游离荧光素在荧光素酶(相关产品可通过赛莱克斯(深圳)科技有限公司获得)的作用下可发生生物化学反应,并最终以生物发光形式释放能量。如果将β-内酰胺偶联荧光素,和荧光素酶以及其他辅料混合制成β-内酰胺酶检测底物,一旦加入该β-内酰胺酶检测底物的β-内酰胺酶待测样本中含有可产生β-内酰胺酶的细菌,此类细菌即可产生β-内酰胺酶,从而水解β-内酰胺,使荧光素从β-内酰胺荧光素偶联物中释放出来,形成游离荧光素;而这一游离荧光素又立即在荧光素酶的作用下发生发生物化反应,释放出光信号,从而帮助实验人员判断检测样本中是否有产生β-内酰胺酶的耐药菌存在。
以上原理在β-内酰胺酶抑制剂存在的情况下同样适用,具体操作为,将β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸,舒巴坦,他唑巴坦等,分别与含有β-内酰胺偶联荧光素以及上述检测底物混合后,分别制成β-内酰胺酶抑制复合检测底物,通过与检测底物同样的原理与类似的操作,帮助实验人员判断β-内酰胺酶抑制剂是否起到了抑制β-内酰胺酶的耐药菌的作用。
为实现上述目的,基于前述原理,本发明的技术方案为:
一种检测β-内酰胺酶的试剂,包括按重量份计的以下组分:58.5~71.5份去离子水或无RN酶纯水、0.0585~0.0715份牛血清蛋白、0.1419~0.1735份三磷酸腺苷钠、0.0901~0.1101份二硫苏糖醇和0.0047~0.0057份辅酶A,还包括按体积份计的以下组分:0.0585~0.0715份液体生物防腐剂、2.925~3.575份β-内酰胺偶联荧光素、11.7~14.3份荧光素酶、1.17~1.43份0.9~1.1M氯化镁溶液、5.85~7.15份1.8~2.2%专利蓝溶液和0.585~0.715份0.9~1.1M 4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液;其中,1重量份所述去离子水或所述无RN酶纯水换算成按体积份计为1体积份,所述检测β-内酰胺酶的试剂的pH为7.8~8.0。
进一步的,包括按重量份计的以下组分:65份去离子水或无RN酶纯水、0.065份牛血清蛋白、0.1577份三磷酸腺苷钠、0.1001份二硫苏糖醇和0.0052份辅酶A,还包括按体积份计的以下组分:0.065份液体生物防腐剂、3.25份β-内酰胺偶联荧光素、13份荧光素酶、1.3份1M氯化镁溶液、6.5份2%专利蓝溶液和0.65份1M 4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液;其中,1重量份所述去离子水或所述无RN酶纯水换算成按体积份计为1体积份,所述检测β-内酰胺酶的试剂的pH为7.8~8.0。
一种检测β-内酰胺酶抑制复合剂耐药性的试剂,包括上述所述的检测β-内酰胺酶的试剂,还包括β-内酰胺酶抑制剂。
优选的,所述β-内酰胺酶抑制剂为按重量份计的0.0113~0.0138份克拉维酸、0.0225~0.0275份舒巴坦或0.0225~0.0275份他唑巴坦。
优选的,所述β-内酰胺酶抑制剂为按重量份计的0.0125份克拉维酸、0.0250份舒巴坦或0.0250份他唑巴坦。
一种检测β-内酰胺酶的方法,按照上述所述各组分的用量,通过包括以下步骤的操作进行:
S1)准确称量所述去离子水或所述无RN酶纯水,并将称量得的所述去离子水分成第一去离子水和第二去离子水,其中所述第一去离子水的重量占所述去离子水总重量的35~45%,或者,将称量得的所述无RN酶纯水分成第一无RN酶纯水和第二无RN酶纯水,其中所述第一无RN酶纯水的重量占所述无RN酶纯水总重量的35~45%;
S2)准确称量所述牛血清蛋白、所述三磷酸腺苷钠、所述二硫苏糖醇、所述辅酶A、所述液体生物防腐剂、所述β-内酰胺偶联荧光素、所述荧光素酶、所述氯化镁溶液、所述专利蓝溶液和所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液,并依次加入S1)所得的所述第一去离子水或所述第一无RN酶纯水中,充分混合并调节pH值;
S3)用所述第二去离子水或者所述第二无RN酶纯水将S2)制得的溶液的体积调整至与所述去离子水或所述无RN酶纯水的体积相等,充分混合,制得β-内酰胺酶检测底物;
S4)将β-内酰胺酶待测样本加入S3)制得的所述β-内酰胺酶检测底物中并充分混合后通过检测仪器观察结果。
一种检测β-内酰胺酶抑制复合剂耐药性的方法,包括以下步骤:
S1)准确称量通过如权利要求6所述检测β-内酰胺酶的方法制备的所述β-内酰胺酶检测底物9~11体积份,并向其中加入前文所述的检测β-内酰胺酶抑制复合剂耐药性的试剂中所述的β-内酰胺酶抑制剂,充分混合并调节pH值;
S2)用所述β-内酰胺酶检测底物将S1)制得的溶液的总体积调配至15~17体积份,充分混合,制得β-内酰胺酶抑制复合检测底物;
S3)将β-内酰胺酶待测样本加入S2)制得的所述β-内酰胺酶抑制复合检测底物中并充分混合后通过检测仪器观察结果。
进一步的,所述β-内酰胺酶检测底物和/或所述β-内酰胺酶抑制复合检测底物在配置完成后,在2~8℃条件下静置1~2h然后冻干保存,使用前再用β-内酰胺酶待测样本缓冲溶液稀释。
进一步的,所述冻干的具体操作包括:将所述β-内酰胺酶检测底物和/或所述β-内酰胺酶抑制复合检测底物分别分装在容器中,在-40±10℃、20Pa±10%的条件下预冻100±20min;再在-10±10℃、10Pa±10%的条件下真空干燥660±20min;最后在20±10℃、10Pa±10%的条件下真空恒温360±20min。
进一步的,所述β-内酰胺酶待测样本缓冲溶液包括按重量份计的以下组分:100~120份无RN酶纯水、0.14~1.76份六水氯化镁、0.594~0.726份二水氯化钙和0.306~0.374份咪唑;还包括按体积份计的以下组分:0.45~0.55份曲拉通X-100和0.09~0.11份液体生物防腐剂Proclin 300;其中,1重量份所述无RN酶纯水换算成体积份计为1体积份;所述样本缓冲溶液的pH值为7.8~8.0。
本发明具有如下优点:
1.本发明公开的β-内酰胺酶抑制复合剂的耐药性检测试剂,基于生物新型仿生生物发光均相检测技术,利用荧光素和荧光素酶的特异性快速发光反应,操作简单,仅15min,即可得到结果;
2.通过与传统的药敏测试结果比对,灵敏度和特异性都达到了95%以上。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是,对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明,但并不构成对本发明的限定。此外,在以下说明中,省略了对公知结构、技术及操作的描述,以避免不必要地混淆本发明的概念。另外,下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
需要说明的是,对于本技术方案中的“第一”和“第二”,仅为对相同或相似组分或组分的混合物的称谓区分,不是对重要性的排列,也没有排序、或比较大小、或其他含义。
实施例A1~3:β-内酰胺酶待测样本缓冲溶液的配置:
实施例A1:
准确称量按重量份计的以下组分:120份无RN酶纯水、0.14份六水氯化镁、0.594份二水氯化钙和0.306份咪唑;按体积份计的以下组分:0.45份曲拉通X-100和0.09份液体生物防腐剂Proclin 300;其中,1重量份无RN酶纯水换算成体积份计为1体积份;将称得的所有组分充分混合,并调节pH值为7.8。
实施例A2:
准确称量按重量份计的以下组分:110份无RN酶纯水、0.16份六水氯化镁、0.66份二水氯化钙和0.34份咪唑;按体积份计的以下组分:0.5份曲拉通X-100和0.1份液体生物防腐剂Proclin 300;其中,1重量份无RN酶纯水换算成体积份计为1体积份;将称得的所有组分充分混合,并调节pH值为7.9。
实施例A3:
准确称量按重量份计的以下组分:100份无RN酶纯水、1.76份六水氯化镁、0.726份二水氯化钙和0.374份咪唑;按体积份计的以下组分:0.55份曲拉通X-100和0.11份液体生物防腐剂Proclin 300;其中,1重量份无RN酶纯水换算成体积份计为1体积份;将称得的所有组分充分混合,并调节pH值为8.0。
实施例B1~3:检测β-内酰胺酶的方法
实施例B1:
S1)按重量份准确称取71.5份无RN酶纯水,将称量得的无RN酶纯水分成第一无RN酶纯水和第二无RN酶纯水,其中第一无RN酶纯水的重量占无RN酶纯水总重量的45%;
S2)准确称量:按重量份计的以下组分:0.0585份牛血清蛋白、0.1419份三磷酸腺苷钠、0.0901份二硫苏糖醇和0.0047份辅酶A;按体积份计的以下组分:0.0585份液体生物防腐剂、2.925份β-内酰胺偶联荧光素、11.7份荧光素酶、1.17份1.1M氯化镁溶液、5.85份2.2%专利蓝溶液和0.585份1.1M 4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液;其中,1重量份无RN酶纯水换算成按体积份计为1体积份;并将称量得到的各组分依次加入S1)所得的第一无RN酶纯水中,充分混合并调节pH值为7.8;
S3)用第二无RN酶纯水将S2)制得的溶液的体积调整至与无RN酶纯水的体积相等,充分混合,制得β-内酰胺酶检测底物;
S4)将β-内酰胺酶待测样本加入S3)制得的β-内酰胺酶检测底物中并充分混合后通过检测仪器观察结果。
实施例B2:
S1)按重量份准确称取65份无RN酶纯水,将称量得的无RN酶纯水分成第一无RN酶纯水和第二无RN酶纯水,其中第一无RN酶纯水的重量占无RN酶纯水总重量的40%;
S2)准确称量:按重量份计的以下组分:0.065份牛血清蛋白、0.1577份三磷酸腺苷钠、0.1001份二硫苏糖醇和0.0052份辅酶A;按体积份计的以下组分:0.065份液体生物防腐剂、3.25份β-内酰胺偶联荧光素、13份荧光素酶、1.3份1M氯化镁溶液、6.5份2%专利蓝溶液和0.65份1M 4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液;其中,1重量份无RN酶纯水换算成按体积份计为1体积份;并将称量得到的各组分依次加入S1)所得的第一无RN酶纯水中,充分混合并调节pH值为7.9;
S3)用第二无RN酶纯水将S2)制得的溶液的体积调整至与无RN酶纯水的体积相等,充分混合,制得β-内酰胺酶检测底物;
S4)将β-内酰胺酶待测样本加入S3)制得的β-内酰胺酶检测底物中并充分混合后通过检测仪器观察结果。
实施例B3:
S1)按重量份准确称取58.5份无RN酶纯水,将称量得的无RN酶纯水分成第一无RN酶纯水和第二无RN酶纯水,其中第一无RN酶纯水的重量占无RN酶纯水总重量的35%;
S2)准确称量:按重量份计的以下组分:0.0715份牛血清蛋白、0.1735份三磷酸腺苷钠、0.1101份二硫苏糖醇和0.0057份辅酶A;按体积份计的以下组分:0.0715份液体生物防腐剂、3.575份β-内酰胺偶联荧光素、14.3份荧光素酶、1.43份0.9M氯化镁溶液、7.15份1.8%专利蓝溶液和0.715份0.9M 4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液;其中,1重量份无RN酶纯水换算成按体积份计为1体积份;并将称量得到的各组分依次加入S1)所得的第一无RN酶纯水中,充分混合并调节pH值为8.0;
S3)用第二无RN酶纯水将S2)制得的溶液的体积调整至与无RN酶纯水的体积相等,充分混合,制得β-内酰胺酶检测底物;
S4)将β-内酰胺酶待测样本加入S3)制得的β-内酰胺酶检测底物中并充分混合后通过检测仪器观察结果。
实施例B1~3中,使用的无RN酶纯水均可以用等量的去离子水代替。
实施例C1~9:检测β-内酰胺酶抑制复合剂耐药性的方法
实施例C1:
S1)准确称量实施例B1的第三步中制得的β-内酰胺酶检测底物11体积份,并向其中加入0.0113重量份克拉维酸,充分混合并调节pH值至7.8;
S2)用实施例B1的第三步中制得的β-内酰胺酶检测底物将S1)制得的溶液的总体积调配至17体积份,充分混合,制得β-内酰胺酶抑制复合检测底物;
S2-1)将S2)制得的β-内酰胺酶抑制复合检测底物在2℃条件下静置1h然后分装在容器中,按照下述步骤冻干保存:
a:-50℃、18Pa的条件下预冻80min;
b:再在-20℃、9Pa的条件下真空干燥640min;
c:最后在10℃、9Pa的条件下真空恒温340min处理冻干态保存;
S2-2)需要使用时,用实施例A1制备的β-内酰胺酶待测样本缓冲溶液将冻干态溶解成β-内酰胺酶抑制复合检测底物,再进行下一步操作;
S3)将β-内酰胺酶待测样本加入S2)制得的β-内酰胺酶抑制复合检测底物中并充分混合后通过检测仪器观察结果。
实施例C2:
S1)准确称量实施例B2的第三步中制得的β-内酰胺酶检测底物10体积份,并向其中加入0.0125重量份克拉维酸,充分混合并调节pH值至7.9;
S2)用实施例B2的第三步中制得的β-内酰胺酶检测底物将S1)制得的溶液的总体积调配至16体积份,充分混合,制得β-内酰胺酶抑制复合检测底物;
S2-1)将S2)制得的β-内酰胺酶抑制复合检测底物在4℃条件下静置1.5h然后分装在容器中,按照下述步骤冻干保存:
a:-40℃、20Pa的条件下预冻100min;
b:再在-10℃、10Pa的条件下真空干燥660min;
c:最后在20℃、10Pa的条件下真空恒温360min处理冻干态保存;
S2-2)需要使用时,用实施例A2制备的β-内酰胺酶待测样本缓冲溶液将冻干态溶解成β-内酰胺酶抑制复合检测底物,再进行下一步操作;
S3)将β-内酰胺酶待测样本加入S2)制得的β-内酰胺酶抑制复合检测底物中并充分混合后通过检测仪器观察结果。
实施例C3:
S1)准确称量实施例B3的第三步中制得的β-内酰胺酶检测底物9体积份,并向其中加入0.0138重量份克拉维酸,充分混合并调节pH值至8.0;
S2)用实施例B3的第三步中制得的β-内酰胺酶检测底物将S1)制得的溶液的总体积调配至15体积份,充分混合,制得β-内酰胺酶抑制复合检测底物;
S2-1)将S2)制得的β-内酰胺酶抑制复合检测底物在8℃条件下静置2h然后分装在容器中,按照下述步骤冻干保存:
a:-30℃、22Pa的条件下预冻120min;
b:再在0℃、11Pa的条件下真空干燥680min;
c:最后在30℃、11Pa的条件下真空恒温380min处理冻干态保存;
S2-2)需要使用时,用实施例A3制备的β-内酰胺酶待测样本缓冲溶液将冻干态溶解成β-内酰胺酶抑制复合检测底物,再进行下一步操作;
S3)将β-内酰胺酶待测样本加入S2)制得的β-内酰胺酶抑制复合检测底物中并充分混合后通过检测仪器观察结果。
实施例C4:
将实施例C1中的0.0113重量份克拉维酸替换成0.0225重量份舒巴坦,其他条件和操作过程均与实施例C1中相同。
实施例C5:
将实施例C2中的0.0125重量份克拉维酸替换成0.0250重量份舒巴坦,其他条件和操作过程均与实施例C2中相同。
实施例C6:
将实施例C3中的0.0138重量份克拉维酸替换成0.0275重量份舒巴坦,其他条件和操作过程均与实施例C3中相同。
实施例C7~9:
分别将实施例C4~6中的舒巴坦替换成他唑巴坦,其他条件和操作过程均与原实施例中相同且对应,不再赘述。
其中,实施例B1~3中制备的β-内酰胺酶检测底物在制备完成后,也可以像实施例C1~3中S2-1)的冻干保存和S2-2)溶解操作,以提高β-内酰胺酶检测底物的保存周期。
具体样本检测过程:
采集100名泌尿感染者的尿液样本,每个样本取6份,每份100μL,加入样本缓冲液管内,混合均匀;并其中三份分别通过实施例C2、实施例C5和实施例C8进行检测,另外三份通过传统药敏方式测试;另外,冻干底物溶解的操作为在室温下反应15min,检测结果通过Helios 2000Analyzer(cellex.us)处理。
其中,部分结果统计如下:
按照与上表同样的统计方式,对采集100名泌尿感染者的尿液样本进行检测后,通过与传统的药敏测试结果比对,灵敏度和特异性都达到了95%以上。
目前市面上检测细菌耐药的方法以微生物培养为主,该方法操作繁琐,耗时长,容易被污染,结果不易判断,不适合在临床上广泛使用。本发明公开的β-内酰胺酶抑制复合剂的耐药性检测试剂,基于生物新型仿生生物发光均相检测技术,利用荧光素和荧光素酶的特异性快速发光反应,操作简单,仅15min,即可得到结果。
以上对本发明的实施方式作了详细说明,但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言,在不脱离本发明原理和精神的情况下,在没有做出创造性劳动前提下,对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型,仍落入本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种检测β-内酰胺酶的试剂,其特征在于:包括按重量份计的以下组分:58.5~71.5份去离子水或无RN酶纯水、0.0585~0.0715份牛血清蛋白、0.1419~0.1735份三磷酸腺苷钠、0.0901~0.1101份二硫苏糖醇和0.0047~0.0057份辅酶A,还包括按体积份计的以下组分:0.0585~0.0715份液体生物防腐剂、2.925~3.575份β-内酰胺偶联荧光素、11.7~14.3份荧光素酶、1.17~1.43份0.9~1.1M氯化镁溶液、5.85~7.15份1.8~2.2%专利蓝溶液和0.585~0.715份0.9~1.1M 4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液;其中,1重量份所述去离子水或所述无RN酶纯水换算成按体积份计为1体积份,所述检测β-内酰胺酶的试剂的pH为7.8~8.0。
2.根据权利要求1所述的检测β-内酰胺酶的试剂,其特征在于:包括按重量份计的以下组分:65份去离子水或无RN酶纯水、0.065份牛血清蛋白、0.1577份三磷酸腺苷钠、0.1001份二硫苏糖醇和0.0052份辅酶A,还包括按体积份计的以下组分:0.065份液体生物防腐剂、3.25份β-内酰胺偶联荧光素、13份荧光素酶、1.3份1M氯化镁溶液、6.5份2%专利蓝溶液和0.65份1M 4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液;其中,1重量份所述去离子水或所述无RN酶纯水换算成按体积份计为1体积份,所述检测β-内酰胺酶的试剂的pH为7.8~8.0。
3.一种检测β-内酰胺酶抑制复合剂耐药性的试剂,其特征在于:包括如权利要求1或2所述的检测β-内酰胺酶的试剂,还包括β-内酰胺酶抑制剂。
4.根据权利要求3所述的检测β-内酰胺酶抑制复合剂耐药性的试剂,其特征在于:所述β-内酰胺酶抑制剂为按重量份计的0.0113~0.0138份克拉维酸、0.0225~0.0275份舒巴坦或0.0225~0.0275份他唑巴坦。
5.根据权利要求3所述的检测β-内酰胺酶抑制复合剂耐药性的试剂,其特征在于:所述β-内酰胺酶抑制剂为按重量份计的0.0125份克拉维酸、0.0250份舒巴坦或0.0250份他唑巴坦。
6.一种检测β-内酰胺酶的方法,其特征在于:按照如权利要求1或2所述各组分的用量,通过包括以下步骤的操作进行:
S1)准确称量所述去离子水或所述无RN酶纯水,并将称量得的所述去离子水分成第一去离子水和第二去离子水,其中所述第一去离子水的重量占所述去离子水总重量的35~45%,或者,将称量得的所述无RN酶纯水分成第一无RN酶纯水和第二无RN酶纯水,其中所述第一无RN酶纯水的重量占所述无RN酶纯水总重量的35~45%;
S2)准确称量所述牛血清蛋白、所述三磷酸腺苷钠、所述二硫苏糖醇、所述辅酶A、所述液体生物防腐剂、所述β-内酰胺偶联荧光素、所述荧光素酶、所述氯化镁溶液、所述专利蓝溶液和所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液,并依次加入S1)所得的所述第一去离子水或所述第一无RN酶纯水中,充分混合并调节pH值;
S3)用所述第二去离子水或者所述第二无RN酶纯水将S2)制得的溶液的体积调整至与所述去离子水或所述无RN酶纯水的体积相等,充分混合,制得β-内酰胺酶检测底物;
S4)将β-内酰胺酶待测样本加入S3)制得的所述β-内酰胺酶检测底物中并充分混合后通过检测仪器观察结果。
7.一种检测β-内酰胺酶抑制复合剂耐药性的方法,其特征在于:包括以下步骤:
S1)准确称量通过如权利要求6所述检测β-内酰胺酶的方法制备的所述β-内酰胺酶检测底物9~11体积份,并向其中加入如权利要求4或5所述的检测β-内酰胺酶抑制复合剂耐药性的试剂中所述的β-内酰胺酶抑制剂,充分混合并调节pH值;
S2)用所述β-内酰胺酶检测底物将S1)制得的溶液的总体积调配至15~17体积份,充分混合,制得β-内酰胺酶抑制复合检测底物;
S3)将β-内酰胺酶待测样本加入S2)制得的所述β-内酰胺酶抑制复合检测底物中并充分混合后通过检测仪器观察结果。
8.根据权利要求7所述的检测β-内酰胺酶抑制复合剂耐药性的方法,其特征在于:所述β-内酰胺酶检测底物和/或所述β-内酰胺酶抑制复合检测底物在配置完成后,在2~8℃条件下静置1~2h然后冻干保存,使用前再用β-内酰胺酶待测样本缓冲溶液稀释。
9.根据权利要求8所述的检测β-内酰胺酶抑制复合剂耐药性的方法,其特征在于:所述冻干的具体操作包括:将所述β-内酰胺酶检测底物和/或所述β-内酰胺酶抑制复合检测底物分别分装在容器中,在-40±10℃、20Pa±10%的条件下预冻100±20min;再在-10±10℃、10Pa±10%的条件下真空干燥660±20min;最后在20±10℃、10Pa±10%的条件下真空恒温360±20min。
10.根据权利要求8或9所述的检测β-内酰胺酶抑制复合剂耐药性的方法,其特征在于:所述β-内酰胺酶待测样本缓冲溶液包括按重量份计的以下组分:100~120份无RN酶纯水、0.14~1.76份六水氯化镁、0.594~0.726份二水氯化钙和0.306~0.374份咪唑;还包括按体积份计的以下组分:0.45~0.55份曲拉通X-100和0.09~0.11份液体生物防腐剂Proclin300;其中,1重量份所述无RN酶纯水换算成体积份计为1体积份;所述样本缓冲溶液的pH值为7.8~8.0。
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Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003066819A2 (en) * | 2002-02-06 | 2003-08-14 | University Of Southern California | A novel artemis/dna-dependent protein kinase complex and methods of use thereof |
WO2009051838A1 (en) * | 2007-10-19 | 2009-04-23 | Becton Dickinson And Company | Methods and compositions for the detection of beta-lactamases |
CN102914651A (zh) * | 2012-09-07 | 2013-02-06 | 杭州华得森生物技术有限公司 | 一种检测髓过氧化物酶的方法及试剂盒 |
CN106661607A (zh) * | 2014-04-15 | 2017-05-10 | 李兴祥 | 酶抑制剂耐药性检测方法与装置 |
-
2019
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Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003066819A2 (en) * | 2002-02-06 | 2003-08-14 | University Of Southern California | A novel artemis/dna-dependent protein kinase complex and methods of use thereof |
WO2009051838A1 (en) * | 2007-10-19 | 2009-04-23 | Becton Dickinson And Company | Methods and compositions for the detection of beta-lactamases |
CN102914651A (zh) * | 2012-09-07 | 2013-02-06 | 杭州华得森生物技术有限公司 | 一种检测髓过氧化物酶的方法及试剂盒 |
CN106661607A (zh) * | 2014-04-15 | 2017-05-10 | 李兴祥 | 酶抑制剂耐药性检测方法与装置 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
HO-WAH AU ET AL.: "Thermostable β-Lactamase Mutant with Its Active Site Conjugated with Fluorescein for Efficient β-Lactam Antibiotic Detection", 《ACS OMEGA》 * |
李爱霞等: "玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63 及其抗生素高产菌株差异蛋白分析", 《农业生物技术学报》 * |
杨波等: "德清地区2013 -2016 年淋球菌耐药监测结果分析", 《中国公共卫生管理》 * |
王亦根: "用生物发光技术测定ATPase活性的微量方法", 《国际检验医学杂志》 * |
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