CN111032671B - 受保护的四糖，其制备方法，及其作为转葡萄糖基酶受体底物在弗氏志贺菌特异性寡糖的化学酶促合成中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供受保护的四糖，其制备方法，及其在寡糖，特别是来自弗氏志贺菌的O‑抗原片段，例如血清型1a、1b、2a、2b、3a、X、4a、4b、5a、5b、7a或7b的合成中的用途。
Description
技术领域
本发明提供受保护的四糖，其制备方法，及其在寡糖(特别是来自弗氏志贺菌(Shigella flexneri)的O-抗原片段，例如血清型1a、1b、2a、2b、3a、X、4a、4b、5a、5b、7a或7b)的合成中的用途。
背景技术
展示在细胞和病原体表面的碳水化合物具有巨大的治疗潜力。一方面，正在详细研究人的糖组，另一方面，对微生物碳水化合物和碳水化合物结合蛋白的知识不断增加，为治疗性和预防性干预提供了新的机会。在各种各样的应用中，碳水化合物作为疫苗组分被积极研究。在这种情况下，合成的碳水化合物代表了生物来源的碳水化合物抗原的有吸引力的替代物。十多年前，的批准证明了可行性。来源于合成的寡糖的其他疫苗候选物正在开发中，无论是针对传染性疾病还是非传染性疾病(如癌症)。
由于对明确的碳水化合物的兴趣日益增加，复杂寡糖的合成方法学进展迅速。已经出现了使用与定制修饰(其为多种靶点开辟了道路)相容的骨架的报道，尤其是与高度多样化的复杂N-聚糖的合成有关。化学酶促(chemo-enzymatic)策略具有很高的吸引力，其在合成的最后阶段主要依靠糖基转移酶(glycosyltransferase)的使用。这两种方法成功地结合在一起，形成了一个小的N-聚糖文库(Science(2013)341(6144),379-83)。类似地，发现糖随机化/糖多样化(glycorandomization/glycodiversification)具有广泛的应用。然而，使用糖基转移酶的缺点包括酶的可用性、成本的增加和糖-核苷酸供体的可用性。
一种替代的策略在于使用“工程化的转糖苷酶(transglycosidase)/低成本供体”系统，所述系统适合于用于碳水化合物和糖缀合物的化学酶促合成的非天然受体的定制化(Cell.Mol.Life Sci.(2016)73,2661-79)。这种策略涉及单糖和二糖受体，证明了简单的非天然受体的可行性(J.Am.Chem.Soc.(2009)131,7379–89,Chem.Commun.(2015)51,2581-4)。但是，由于该方法的部分发散性状(partially divergent character)，其只提供对有限数量靶点的可及性。
发明内容
因此，本发明的一个目的为提供通用的核心前体，其能够以高效的发散方式产生大量的寡糖。
本发明的另一个目的为提供一种在针对志贺菌病的疫苗开发的情况下选择多种靶点的方法。已知的15种弗氏志贺菌(S.flexneri)血清型中的大多数对人是致病的，因此需要提供广泛的血清型覆盖范围的多价疫苗(Clin.Infect.Dis.(2014)59,933)。已经描述了额外的弗氏志贺菌O-抗原多样性(Biochemistry(Moscow)(2015)80,901-14)。
发明人首次证明，酶能够进行ABCD和DABC四糖的体外α-D-葡萄糖基化，所述四糖分别对应于弗氏志贺菌O-抗原的骨架重复单元及其框移(frame-shift)(Biochemistry(Moscow)(2015)80,901-14)。令人惊讶地，分支蔗糖酶(branching sucrase)，更通常地葡聚糖蔗糖酶(glucansucrase)，可以特别地使非天然的ABClAcCCl3AcD-All四糖受体葡萄糖基化(glucosylate)，以获得弗氏志贺菌特异性α-D-葡萄糖基化的五糖。
大多数已知的弗氏志贺菌O-抗原由涵盖共同的(ABCD)n四糖骨架的重复单元所定义。该特征为通过使用合成的碳水化合物半抗原开发针对弗氏志贺菌的广泛血清型覆盖范围的疫苗提供了重大机遇。
与其他策略(其中n价多糖基疫苗的设计需要独立制备n种单价多糖抗原，并将其转化为免疫原)(参见例如和其他批准的多糖-蛋白缀合疫苗)相比，合成为靶点碳水化合物半抗原的发散策略开辟了道路，所述靶点碳水化合物半抗原建立在受感兴趣的O-抗原的四糖骨架重复启发的单一多功能核心前体上。
因此，在一个方面，本发明涉及一种下式(I0)化合物：
(TD)xABZC(TD)y-R (I0)
其中：
x和y为0或1，条件是x+y＝1；
A为2)-α-L-Rhap-(1→；
B为2)-α-L-Rhap-(1→；
C为3)-α-L-Rhap-(1→；
D为3)-α-D-GlcpN-(1→；
Z为ClAc、BrAc、Ac或
T为保护基，其能够邻位协助(anchimeric assistance)，并且当Z为ClAc、BrAc或Ac或为叠氮化物(N3)时与Z正交；
R为保护基，其与链延长至O-抗原片段相容，并且当Z为ClAc、BrAc或Ac时与T和Z正交；
ClAc为ClCH2-C(O)-；
BrAc为BrCH2-C(O)-。
在一个方面，本发明涉及一种下式(I0)化合物：
(TD)xABZC(TD)y-R (I0)
其中：
x和y为0或1，条件是x+y＝1；
A为2)-α-L-Rhap-(1→；
B为2)-α-L-Rhap-(1→；
C为3)-α-L-Rhap-(1→；
D为3)-α-D-GlcpN-(1→或3)-β-D-GlcpN-(1→；
Z为ClAc、BrAc、Ac或
T为保护基，其能够邻位协助，并且特别地当Z为Ac或为叠氮化物(N3)时优选与Z正交；
R为保护基，其与链延长至O-抗原片段相容，并且当Z为ClAc、BrAc或Ac时与T和Z正交；
ClAc为ClCH2-C(O)-；
BrAc为BrCH2-C(O)-。
在一个特别的实施方案中：
当x＝0且y＝1时，D为3)-α-D-GlcpN-(1→或3)-β-D-GlcpN-(1→；
当x＝1且y＝0时，D为3)-β-D-GlcpN-(1→；对于式(I0)和(I)，D特别地为3)-β-D-GlcpN-(1→；
在一个特别的实施方案中，TD是指T在2D位置。
在一个特别的实施方案中，ZC是指Z在2C位置。
碳水化合物化学中的正交性和正交保护基是本领域技术人员熟知的，并且特别地描述于Agoston等人(Tetrahedron:Asymmetry 27(2016)707–728)中。
R特别地选自烯丙基(All)、对甲氧基苯基(PMP)、戊烯基(Pent)、苯基(Ph)、三异丙基甲硅烷基(TIPS)或叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)。
当x＝1时，R特别地位于1C位置的O上，或者当y＝1时，R特别地位于1D位置的O上。
当R为Ph时，1C位置的原子(当x＝1时)和1D位置的原子(当y＝1时)实际上为S。
T特别地选自三氯乙酰基(Cl3Ac)、2,2,2-三氯乙氧羰基(Troc)或烯丙氧羰基(Alloc)。
在另一个方面，本发明涉及一种下式(I)化合物：
(Cl3AcD)xABZC(Cl3AcD)y-All (I)
其中：
x和y为0或1，条件是x+y＝1；
A为2)-α-L-Rhap-(1→；
B为2)-α-L-Rhap-(1→；
C为3)-α-L-Rhap-(1→；
D为3)-α-D-GlcpN-(1→；
Z为ClAc、BrAc、Ac或
All为烯丙基；
Cl3Ac为Cl3C-C(O)-；
ClAc为ClCH2-C(O)-；
BrAc为BrCH2-C(O)-。
在另一个方面，本发明涉及一种下式(I)化合物：
(Cl3AcD)xABZC(Cl3AcD)y-All (I)
其中：
x和y为0或1，条件是x+y＝1；
A为2)-α-L-Rhap-(1→；
B为2)-α-L-Rhap-(1→；
C为3)-α-L-Rhap-(1→；
D为3)-α-D-GlcpN-(1→或3)-β-D-GlcpN-(1→；
Z为ClAc、BrAc、Ac或
All为烯丙基；
Cl3Ac为Cl3C-C(O)-；
ClAc为ClCH2-C(O)-；
BrAc为BrCH2-C(O)-。
在一个特别的实施方案中：
当x＝0且y＝1时，D为3)-α-D-GlcpN-(1→或3)-β-D-GlcpN-(1→；
当x＝1且y＝0时，D为3)-β-D-GlcpN-(1→；
式(I)化合物提供与链延长至O-抗原片段的相容性，这需要能够确保在还原残基的2位置上的邻位协助的保护基。
2C位置的正交保护基能够实现对一些血清型重要的2C-O-乙酰化模式。
最后，在还原残基的异头位置处的正交保护能够避免α/β混合物，同时促进随后的化学修饰，特别是链延长至O-抗原片段。
在一个特别的实施方案中，本发明涉及一种式(I)化合物，其中：
-Cl3Ac位于2D位置，
-Z位于2C位置，和/或
-当x＝1时，All位于1C位置，当y＝1时，All位于1D位置。
在一个特别的实施方案中，Z为ClAc，对应于式(Cl3AcD)xABClAcC(Cl3AcD)y-All的化合物。
在一个特别的实施方案中，Z为BrAc，对应于式(Cl3AcD)xABBrAcC(Cl3AcD)y-All的化合物。
在一个特别的实施方案中，Z为Ac，对应于式(Cl3AcD)xABAcC(Cl3AcD)y-All的化合物。
在一个特别的实施方案中，Z为对应于式(Cl3AcD)xABC(Cl3AcD)y-All的化合物。
在一个特别的实施方案中，本发明涉及一种式(I)化合物，其中x为0且y为1，对应于下式(Ia)：
ABZCCl3AcD-All(Ia)。
在一个特别的实施方案中，所述化合物为式ABClAcCCl3AcD-All、ABBrAcCCl3AcD-All、ABAcCCl3AcD-All或ABCCl3AcD-All。
式(I)化合物特别地为下式：
更特别地，其中Z＝H或Z＝ClAc，如下所示：
在一个特别的实施方案中，本发明涉及一种式(I)化合物，其中x为1且y为0，对应于下式(Ib)：
Cl3AcDABZC-All (Ib)。
在一个特别的实施方案中，所述化合物为式Cl3AcDABClAcC-All、Cl3AcDABBrAcC-All、Cl3AcDABAcC-All或Cl3AcDABC-All。
式(I)化合物特别地为下式：
更特别地，其中Z＝H或Z＝ClAc，如下所示：
在另一个方面，本发明涉及一种制备如上面所定义的式(I0)化合物的方法，其包括以下步骤：
(i)将受保护的ABZC-三糖基供体与受保护的TD-R受体接触以获得受保护的ABZCTD-R化合物的步骤；
(ii)将在步骤(i)中获得的受保护的化合物脱保护以获得式ABZCTD-R的化合物的一个或多个步骤。
在另一个方面，本发明涉及一种制备如上面所定义的式(I)化合物的方法，其包括以下步骤：
(i)将受保护的ABZC-三糖基供体与受保护的Cl3AcD-All受体接触以获得受保护的ABZCCl3AcD-All化合物的步骤；
(ii)将在步骤(i)中获得的受保护的化合物脱保护以获得式ABZCCl3AcD-All的化合物的一个或多个步骤。
在一个特别的实施方案中，ABZC-三糖基供体为式ABZC-Z’，其中Z’为PTFA或TCA，PTFA表示N-苯基三氟乙酰亚氨基，TCA表示三氯乙酰亚氨基，Z’更特别地为TCA。
在一个特别的实施方案中，受保护的ABZC-三糖基供体为下式之一：
尤其是
其中：
TES为三乙基甲硅烷基；
Lev为乙酰丙酰基(levulinyl)；
Nap为2-萘甲基(2-naphytlmethyl)；
PMB为对甲氧基苄基。
乙酰丙酰基(或乙酰丙酰基(levulinoyl))是指CH3-CO-CH2-CH2-CO-基团。
在整个说明书中，波浪键(如)表示相应的取代基位于轴向和/或平伏位置。
因此，含有这种波浪键的化合物以α和β异头物的混合物形式存在，或仅以α或β异头物形式存在。
在一个特别的实施方案中，受保护的ABZC-三糖基供体为上面提及的式之一，其中至少一个TES基团或每个TES基团独立地被选自TBS(叔丁基二甲基甲硅烷基)、TIPS(三异丙基甲硅烷基)、PMB、Nap和Lev的基团替代。
在一个特别的实施方案中，受保护的ABZC-三糖基供体为上面提及的式之一，其中至少一个BDA基团或每个BDA(丁烷2,3-二缩醛)基团独立地被选自1,2-二缩醛家族的基团，特别是CDA(环己烷-1,2-二缩醛)替代。CDA基团描述于例如Chem.Rev.(2001)101,53-80中。
在一个特别的实施方案中，受保护的ABZC-三糖基供体为上面提及的式之一，其中至少一个Nap基团或每个Nap基团独立地被选自TBS、TIPS和PMB的基团替代。
在一个特别的实施方案中，受保护的Cl3AcD-All受体为下式：
在一个特别的实施方案中，受保护的ABZCCl3AcD-All化合物为下式之一：
在一个特别的实施方案中，受保护的ABZCCl3AcD-All化合物为上面提及的式之一，其中至少一个TES基团或每个TES基团独立地被选自TBS、TIPS、PMB、Nap和Lev的基团替代。
在一个特别的实施方案中，受保护的ABZCCl3AcD-All化合物为上面提及的式之一，其中至少一个相邻Nap/TES对或每个相邻Nap/TES对独立地被选自BDA和CDA的基团替代。
Nap/TES对特别是指与Nap或TES基团相邻的Nap，如下所示：
在一个特别的实施方案中，受保护的ABZCCl3AcD-All化合物为上面提及的式之一，其中至少一个Nap基团或每个Nap基团独立地被选自TBS、TIPS和PMB的基团替代。
在另一个方面，本发明涉及一种制备如上面所定义的式(I0)化合物的方法，其包括以下步骤：
(i)将受保护的ABZC-R受体与受保护的TD供体接触以获得受保护的TDABZC-R化合物的步骤；
(ii)将在步骤(i)中获得的受保护的化合物脱保护以获得式TDABZC-R的化合物的一个或多个步骤。
在另一个方面，本发明涉及一种制备如上面所定义的式(I)化合物的方法，其包括以下步骤：
(i)将受保护的ABZC-All受体与受保护的Cl3AcD供体接触以获得受保护的Cl3AcDABZC-All化合物的步骤；
(ii)将在步骤(i)中获得的受保护的化合物脱保护以获得式Cl3AcDABZC-All的化合物的一个或多个步骤。
特别地，ABZC-All受体为下式之一：
其中：
TES为三乙基甲硅烷基；
Lev为乙酰丙酰基；
Nap为2-萘甲基；
PMB为对甲氧基苄基。
在一个特别的实施方案中，ABZC-All受体化合物为上面提及的式之一，其中至少一个TES基团或每个TES基团独立地被选自TBS、TIPS、PMB和Nap的基团替代。
在一个特别的实施方案中，受保护的ABZCCl3AcD-All化合物为上面提及的式之一，其中至少一个Nap基团或每个Nap基团独立地被选自TBS、TIPS和PMB的基团替代。
在一个特别的实施方案中，受保护的ABZC-All受体为上面提及的式之一，其中至少一个相邻Nap/TES对或每个相邻Nap/TES对独立地被选自BDA和CDA的基团替代。
特别地，Cl3AcD供体为式Cl3AcD-Z’，其中Z’为PTFA或TCA，PTFA表示N-苯基三氟乙酰亚氨基，TCA表示三氯乙酰亚氨基。
特别地，受保护的Cl3AcD供体为下式之一或相应的噁唑啉：
并且尤其是：
“相应的噁唑啉”是指以下基团：
1,2-噁唑啉可以由分子内环化和1位上的离去基离去而获得。
在一个特别的实施方案中，Cl3AcD供体化合物为上面提及的式之一，其中TES基团独立地被选自TIPS、PMB和Nap的基团替代。
当ABZC-All受体为式(a)且Cl3AcD供体在3D位置带有TES保护基时，特别地仅存在一个脱保护步骤(ii)。在其他情况下，可能存在两个脱保护步骤。
在一个特别的实施方案中，受保护的Cl3AcDABZC-All化合物为下式之一：
在一个特别的实施方案中，受保护的Cl3AcDABZC-All化合物为上面提及的式之一，其中至少一个TES基团或每个TES基团独立地被选自TBS、TIPS、PMB和Nap的基团替代。
在一个特别的实施方案中，受保护的Cl3AcDABZC-All化合物为上面提及的式之一，其中至少一个相邻Nap/TES对或每个相邻Nap/TES对独立地被选自BDA和CDA的基团替代。
在一个特别的实施方案中，受保护的Cl3AcDABZC-All化合物为上面提及的式之一，其中至少一个TBS基团或每个TBS基团被选自PMB、Nap、Lev、TIPS和Lev的基团替代。
在一个特别的实施方案中，受保护的Cl3AcDABZC-All化合物为上面提及的式之一，其中4,6-O-苯亚甲基缩醛被4,6-O-异亚丙基缩醛替代。
在另一个方面，本发明涉及一种由下式定义的化合物，其中Z为ClAc、BrAc或Ac：
尤其是并且
在一个特别的实施方案中，所述化合物为上面提及的式之一，其中至少一个相邻Nap/TES对或每个相邻Nap/TES对独立地被选自BDA和CDA的基团替代。
在另一个方面，本发明涉及一种制备糖的方法，其包括以下步骤：
(i)通过蔗糖活性酶将如上面所定义的式(I0)化合物α-D-葡萄糖基化以获得α-D-葡萄糖基化的(TD)xABZC(TD)y-R化合物的步骤，所述蔗糖活性酶选自GH13家族的酶、GH70家族的酶、其变体、所述酶或变体的肽片段，以及来源于所述酶、变体或片段的修饰的酶/肽；
(ii)任选地，并且特别地当y为1时，将3A位置和/或6D位置乙酰化以获得3A-和/或6D-O-乙酰化的化合物的步骤；
(iii)任选地，裂解由C所携带的ClAc或BrAc保护基以获得2C-羟基化的化合物的步骤；
(iv)任选地，(a)将C所携带的ClAc或BrAc保护基转化为乙酰基(Ac)，(b)将D所携带的Cl3Ac掩蔽基团转化为乙酰基(Ac)，(c)将D所携带的烯丙基保护基转化为丙基(Pr)部分，然后如果需要，将2C位置脱-O-酰化，以获得2C-酰化的或2C-羟基化的化合物的步骤；
(v)任选地，由如上面所定义的式(I)化合物的酶促α-D-葡萄糖基化产生的化合物的一个或两个末端的链延长的步骤。
在另一个方面，本发明涉及一种制备糖的方法，其包括以下步骤：
(i)通过蔗糖活性酶将如上面所定义的式(I)化合物α-D-葡萄糖基化以获得α-D-葡萄糖基化的(Cl3AcD)xABZC(Cl3AcD)y-All化合物的步骤，所述蔗糖活性酶选自GH13家族的酶、GH70家族的酶、其变体、所述酶或变体的肽片段，以及来源于所述酶、变体或片段的修饰的酶/肽；
(ii)任选地，并且特别地当y为1时，将3A位置和/或6D位置乙酰化以获得3A-和/或6D-O-乙酰化的化合物的步骤；
(iii)任选地，裂解由C所携带的ClAc或BrAc保护基以获得2C-羟基化的化合物的步骤；
(iv)任选地，(a)将C所携带的ClAc或BrAc保护基转化为乙酰基(Ac)，(b)将D所携带的Cl3Ac掩蔽基团转化为乙酰基(Ac)，(c)将D所携带的烯丙基保护基转化为丙基(Pr)部分，然后如果需要，将2C位置脱-O-酰化，以获得2C-酰化的或2C-羟基化的化合物的步骤；
(v)任选地，由如上面所定义的式(I)化合物的酶促α-D-葡萄糖基化产生的化合物的一个或两个末端的链延长的步骤。
例如，步骤(ii)为1,2-顺式二醇系统的伯羟基及平伏羟基上的区域选择性O-酰化，已经例如对于多元醇(包括碳水化合物)利用硼酸催化的区域选择性步骤描述(J.Am.Chem.Soc.(2011)133,3724-7)。可替代地，已经描述了对伯羟基的O-酰化有选择性的方法，包括酶促O-酰化(Tetrahedron:Asymm.(2000)11,3647–51)。这种转化也可以特别地设想使用如下讨论的α-D-葡萄糖基化的ABAcCAcD-Pr底物(其中Pr＝丙基，Ac＝乙酰基)或α-D-葡萄糖基化的ABCAcD-Pr底物。
可以使用硫脲实现步骤(iii)(Carbohydr.Res.(2012)356,115-31)。
关于步骤(iv)，可以通过Pd/C或Pd(OH)2介导的氢化实现将α-D-葡萄糖基化的(Cl3AcD)xABZC(Cl3AcD)y-All化合物转化为相应的(AcD)xABAcC(AcDy)-Pr(Pr＝丙基，Ac＝乙酰基)(Chem.Asian J.(2017)12,419-39)，并随后通过常规的酯交换，例如通过使用甲醇钠的甲醇溶液，容易地实现在2C位置的脱O-乙酰化(Chem.Eur.J.(2016)22,10892-911)。
关于步骤(v)，例如，利用残基A中的顺式-邻二醇(不适用于酶促α-D-葡萄糖基化发生在弗氏志贺菌3a O-抗原的3A位置的情况)，可以将2A和3A羟基直接掩蔽为异亚丙基缩醛，或在选择性掩蔽伯羟基后掩蔽为异亚丙基缩醛(J.Org.Chem.(2015)80,11237-57)。根据需要将伯醇脱掩蔽后，可以用永久性保护基(优选苄基醚)掩蔽残余的羟基(J.Org.Chem.(2015)80,11237-57)。在酸水解条件下去除异亚丙基，然后通过使用与所有适当的OH正交的保护基(例如PMB或甲硅烷基醚，如TES)选择性掩蔽3A-OH，可以提供与在2A-OH处的链延长相容的五糖受体。可替代地，2A位置的羟基的乙酰丙酰化(levulinylation)可以提供完全正交的受保护的五糖构建块(building block)，可以通过选择性去除烯丙基醚，然后将所得的半缩醛活化为酰亚胺(imidate)供体(异头的OPTFA或OTCA取代)，将所述构建块转化为供体(J.Org.Chem.(2015)80,11237-57)。
在本文中，公开了适合于有效合成各种弗氏志贺菌O-抗原的片段的定制糖砖(glycobrick)的化学酶促策略。这些糖砖可以组装成同源寡聚体，从而提供弗氏志贺菌类型特异性半抗原的新路线，特别是通过链延长的步骤(v)。
同源寡聚体对应于这样的片段，其涵盖来自选定的弗氏志贺菌血清型的O抗原的n个重复单元。例如，对于弗氏志贺菌2a鉴定了对应于O抗原的三个重复单元片段的15聚体半抗原(J.Immunol.(2009)182,2241-7,Bioconjugate Chem.(2016)27,883-92)。此外，现有数据提示，至少15聚体，最可能是20聚体(对应于O-抗原的三个和四个重复单元片段)可以充当合适的弗氏志贺菌3a半抗原。
糖苷水解酶(glycoside hydrolase)EC 3.2.1和EC 2.4.1为一大类的酶，其水解两个或多个碳水化合物间的糖苷键，或碳水化合物与非碳水化合物部分间的糖苷键。基于序列相似性的糖苷水解酶分类系统定义了>100个不同的家族。该分类对于本领域技术人员是熟知的，并且可以特别地在CAZy(http://www.cazy.org)网站上获得。
GH13家族的酶是指对蔗糖有活性的糖苷水解酶家族13的酶，其为糖苷水解酶家族，特别是淀粉蔗糖酶家族(亚家族)，也包含在“葡聚糖蔗糖酶(glucansucrase)”家族中。该分类对于本领域技术人员是熟知的，并且可以特别地在CAZy(GH13.4 http://www.cazy.org/GH13_4.html)网站上获得。
GH13家族的酶是指特别地野生型糖苷水解酶，更特别地转葡糖基酶(transglucosylase)，甚至更特别地如在专利申请EP 2 100 966中所描述的淀粉蔗糖酶(EC 2.4.1.4)或蔗糖水解酶(EC 3.2.1.-)，甚至更特别地来自多糖奈瑟球菌(Neisseriapolysaccharea)的淀粉蔗糖酶，优选选自1G5A、1ZS2、1MVY、1MW0、1S46、1JGI、1MW2、1MW3、1MW1和1JG9蛋白(如在Protein Data Base(PDB,https://www.rcsb.org/)中所记载且在专利申请EP 2 100 966中所描述)，或如在专利申请EP 2 100 966中所描述的蛋白的突变体。
GH70家族的酶是指由乳酸菌产生的转葡糖基酶，所述乳酸菌来自例如链球菌属(Streptococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、韦氏菌属(Weisella)或乳杆菌属(Lactobacillus)。该分类对于本领域技术人员是熟知的，并且可以特别地在CAZy(http://www.cazy.org/GH70.html)网站上获得。特别地，GH70家族的酶为分支蔗糖酶和葡聚糖蔗糖酶(EC 2.4.1)。可以在本发明的框架中使用的GH70家族的酶为来自柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)(更特别地NRRL B-1355株)的交替蔗糖酶(alternansucrase)。
特别地，所述酶选自BRS-B、BRS-B-D1、BRS-B-D2、BRS-C、BRS-A、BRS-D、BRS-E、GBD-CD2、GBD-CD2 W2135V、GBD-CD2 W2135C-F2136I、GBD-CD2 W2135S-F2136L、GBD-CD2W2135I-F2136C、GBD-CD2 W2135N-F2136Y、GBD-CD2 W2135N、GBD-CD2 W2135I-F2136Y、GBD-CD2 W2135L、GBD-CD2 W2135C、GBD-CD2 W2135N-F2136H、GBD-CD2 W2135L-F2136L、GBD-CD2W2135F-F2136I、GBD-CD2 W2135C-F2136N、GBD-CD2 W2135G、GBD-CD2 W2135F、GBD-CD2F2163G、GBD-CD2 L2166I、GBD-CD2 F2163H、GBD-CD2 F2163G L2166I、GBD-CD2 A2162EF2163L、GBD-CD2 F2163L、GBD-CD2 F2163I-D2164E-L2166I酶。
特别地，所述酶选自BRS-B、BRS-B-D1、BRS-B-D2、BRS-C、BRS-A、BRS-D、BRS-E、GBD-CD2、GBD-CD2 W2135V、GBD-CD2 W2135C-F2136I、GBD-CD2 W2135S-F2136L、GBD-CD2W2135I-F2136C、GBD-CD2 W2135C、GBD-CD2 W2135L-F2136L、GBD-CD2 W2135F-F2136I、GBD-CD2 W2135C-F2136N、GBD-CD2 W2135G、GBD-CD2 W2135F、GBD-CD2 F2163G、GBD-CD2L2166I、GBD-CD2 F2163G L2166I、GBD-CD2 A2162E F2163L、GBD-CD2 F2163L、GBD-CD2F2163I-D2164E-L2166I酶。
如在以下实施例中所提及，已在本领域中描述了这些酶。
特别地，所述酶为BRS-B-D2酶(SEQ ID NO:4)的突变体，如下表所定义：
特别地，所述酶为BRS-B。
特别地，所述酶为BRS-B-D2。
特别地，所述酶为GBD-CD2 F2163G。
特别地，所述酶为GBD-CD2 W2135I-F2136C或GBD-CD2 W2135L-F2136L或GBD-CD2W2135S-F2136L。
特别地，所述糖为来自弗氏志贺菌，特别是血清型1a、1b、2a、2b、3a、X、4a、4b、5a、5b、7a或7b的O-抗原的片段。
特别地，所述糖包含以下片段：
-[((E1→2)a’(E1→4)a(M)b AcD)x(L)c A(E1→3)d B(E1→4)e(Ac)zC((E1→2)a’(E1→4)a(M)b AcD)y]n-
其中：
L为E1→3或在3A位置的Ac；
M为E1→6或在6D位置的Ac；
a和b为0或1，条件是a+b＝0或1；
a’为：
-当a为1时，0或1；
-当a为0时，0；
c、d和e为0或1；
a、b、c、d和e特别地为例如a+b+c+d+e＝1或2；
z在每次出现时独立地为0或1，特别地z在所有出现时均为0或1；
E表示α-D-Glcp-残基；
n为大于或等于1的整数，特别地为1至10。
特别地，所述糖包含以下片段：
-[((E1→2)a’(E1→4)a(M)b AcD)x(L)c(E1→4)c’A(E1→3)d(E1→4)d’B(E1→4)e(Ac)zC((E1→2)a’(E1→4)a(M)b AcD)y]n-
其中：
L为E1→3或在3A位置的Ac；
M为E1→6或在6D位置的Ac；
a为0或1；
a’为：
-当a为1时，0或1；
-当a为0时，0；
e为0或1；
c’为0或1；
d和d’为0或1，条件是d+d’＝0或1；
当L为Ac时，c在每次出现时独立地为0或1，特别地c在所有出现时均为0或1，条件是c+c’＝0或1；
当L为E1→3时，c为0或1，条件是c+c’＝0或1；
当M为Ac时，b在每次出现时独立地为0或1，特别地b在所有出现时均为0或1，条件是a+b＝0或1；
当M为E1→6时，b为0或1，条件是a+b＝0或1；
a、b、c、c’、d、d’和e特别地为例如a+b+c+c’+d+d’+e＝1、2或3；
z在每次出现时独立地为0或1，特别地z在所有出现时均为0或1；
E表示α-D-Glcp-残基；
n为大于或等于1的整数，特别地为1至10。
在以上和以下段落中，L和/或M特别地在至少一次出现时为Ac，更特别地在所有出现时均为Ac。
在以上和以下段落中，L和/或M特别地在所有出现时分别为E1→3和E1→6。
特别地，所述糖包含以下片段：
-[((E1→2)a’(E1→4)a(M)b AcD)x(L)c A(E1→3)d B(E1→4)e(Ac)zC((E1→2)a’(E1→4)a(M)b AcD)y]n-All
其中：
L为E1→3或在3A位置的Ac；
M为E1→6或在6D位置的Ac；
a和b为0或1，条件是a+b＝0或1；
a’为：
-当a为1时，0或1；
-当a为0时，0；
c、d和e为0或1；
a、b、c、d和e特别地为例如a+b+c+d+e＝1或2；
z在每次出现时独立地为0或1，特别地z在所有出现时均为0或1；
E表示α-D-Glcp-残基；
n为大于或等于1的整数，特别地为1至10。
特别地，所述糖包含以下片段：
-[((E1→2)a’(E1→4)a(M)b AcD)x(L)c(E1→4)c’A(E1→3)d(E1→4)d’B(E1→4)e(Ac)zC((E1→2)a’(E1→4)a(M)b AcD)y]n-All
其中：
L为E1→3或在3A位置的Ac；
M为E1→6或在6D位置的Ac；
a为0或1；
a’为：
-当a为1时，0或1；
-当a为0时，0；
e为0或1；
c’为0或1；
d和d’为0或1，条件是d+d’＝0或1；
当L为Ac时，c在每次出现时独立地为0或1，特别地c在所有出现时均为0或1，条件是c+c’＝0或1；
当L为E1→3时，c为0或1，条件是c+c’＝0或1；
当M为Ac时，b在每次出现时独立地为0或1，特别地b在所有出现时均为0或1，条件是a+b＝0或1；
当M为E1→6时，b为0或1，条件是a+b＝0或1；
a、b、c、c’、d、d’和e特别地为例如a+b+c+c’+d+d’+e＝1、2或3。
特别地，所述糖包含以下片段：
-[((E1→2)a’(E1→4)a(M)b AcD)x(L)c A(E1→3)d B(E1→4)e(Ac)zC((E1→2)a’(E1→4)a(M)b AcD)y]n-Pr
其中：
L为E1→3或在3A位置的Ac；
M为E1→6或在6D位置的Ac；
a和b为0或1，条件是a+b＝0或1；
a’为：
-当a为1时，0或1；
-当a为0时，0；
c、d和e为0或1；
a、b、c、d和e特别地为例如a+b+c+d+e＝1或2；
z在每次出现时独立地为0或1，特别地z在所有出现时均为0或1；
E表示α-D-Glcp-残基；
n为大于或等于1的整数，特别地为1至10；
Pr为丙基。
特别地，所述糖包含以下片段：
-[((E1→2)a’(E1→4)a(M)b AcD)x(L)c(E1→4)c’A(E1→3)d(E1→4)d’B(E1→4)e(Ac)zC((E1→2)a’(E1→4)a(M)b AcD)y]n-Pr
其中：
L为E1→3或在3A位置的Ac；
M为E1→6或在6D位置的Ac；
a为0或1；
a’为：
-当a为1时，0或1；
-当a为0时，0；
e为0或1；
c’为0或1；
d和d’为0或1，条件是d+d’＝0或1；
当L为Ac时，c在每次出现时独立地为0或1，特别地c在所有出现时均为0或1，条件是c+c’＝0或1；
当L为E1→3时，c为0或1，条件是c+c’＝0或1；
当M为Ac时，b在每次出现时独立地为0或1，特别地b在所有出现时均为0或1，条件是a+b＝0或1；
当M为E1→6时，b为0或1，条件是a+b＝0或1；
a、b、c、c’、d、d’和e特别地为例如a+b+c+c’+d+d’+e＝1、2或3；
Pr为丙基。
特别地，所述糖包含以下片段：
-[((E1→2)a’(E1→4)a(E1→6)b AcD)x(E1→3)c A(E1→3)d B(E1→4)e(Ac)zC((E1→2)a’(E1→4)a(E1→6)b AcD)y]n-
其中：
a和b为0或1，条件是a+b＝0或1；
a’为：
-当a为1时，0或1；
-当a为0时，0；
c、d和e为0或1；
a、b、c、d和e特别地为例如a+b+c+d+e＝1或2；
z在每次出现时独立地为0或1，特别地z在所有出现时均为0或1；
E表示α-D-Glcp-残基；
n为大于或等于1的整数，特别地为1至10。
特别地，所述糖包含以下片段：
-[((E1→2)a’(E1→4)a(E1→6)b AcD)x(E1→3)c(E1→4)c’A(E1→3)d(E1→4)d’ B(E1→4)e(Ac)zC((E1→2)a’(E1→4)a(E1→6)b D)y]n-
其中：
a为0或1；
a’为：
-当a为1时，0或1；
-当a为0时，0；
e为0或1；
c’为0或1；
d和d’为0或1，条件是d+d’＝0或1；
c为0或1，条件是c+c’＝0或1；
b为0或1，条件是a+b＝0或1；
a、b、c、c’、d、d’和e特别地为例如a+b+c+c’+d+d’+e＝1、2或3。
特别地，所述糖包含以下片段：
-[((E1→2)a’(E1→4)a(Ac1→6)b AcD)x(Ac1→3)c(E1→4)c’A(E1→3)d(E1→4)d’ B(E1→4)e(Ac)zC((E1→2)a’(E1→4)a(E1→6)b D)y]n-
其中：
a为0或1；
a’为：
-当a为1时，0或1；
-当a为0时，0；
e为0或1；
c’为0或1；
d和d’为0或1，条件是d+d’＝0或1；
c在每次出现时独立地为0或1，特别地c在所有出现时均为0或1，条件是c+c’＝0或1；
b在每次出现时独立地为0或1，特别地b在所有出现时均为0或1，条件是a+b＝0或1；
a、b、c、c’、d、d’和e特别地为例如a+b+c+c’+d+d’+e＝1、2或3。
特别地，所述糖包含以下片段：
-[((E1→2)a’(E1→4)a(E1→6)b AcD)x(Ac1→3)c(E1→4)c’A(E1→3)d(E1→4)d’ B(E1→4)e(Ac)zC((E1→2)a’(E1→4)a(E1→6)b D)y]n-
其中：
a为0或1；
a’为：
-当a为1时，0或1；
-当a为0时，0；
e为0或1；
c’为0或1；
d和d’为0或1，条件是d+d’＝0或1；
c在每次出现时独立地为0或1，特别地c在所有出现时均为0或1，条件是c+c’＝0或1；
b为0或1，条件是a+b＝0或1；
a、b、c、c’、d、d’和e特别地为例如a+b+c+c’+d+d’+e＝1、2或3。
特别地，所述糖包含以下片段：
-[((E1→2)a’(E1→4)a(Ac1→6)b AcD)x(E1→3)c(E1→4)c’A(E1→3)d(E1→4)d’ B(E1→4)e(Ac)zC((E1→2)a’(E1→4)a(E1→6)b D)y]n-
其中：
a为0或1；
a’为：
-当a为1时，0或1；
-当a为0时，0；
e为0或1；
c’为0或1；
d和d’为0或1，条件是d+d’＝0或1；
c为0或1，条件是c+c’＝0或1；
b在每次出现时独立地为0或1，特别地b在所有出现时均为0或1，条件是a+b＝0或1；
a、b、c、c’、d、d’和e特别地为例如a+b+c+c’+d+d’+e＝1、2或3。
“z在每次出现时独立地为0或1”是指对于重复n次的重复单元的每次出现，z可以独立地为0或1。换言之，对于大于或等于2的n，在所述糖内2C位置可以未被O-乙酰化，完全被O-乙酰化或部分被乙酰化。
“当L为Ac时，c在每次出现时独立地为0或1”是指对于重复n次的重复单元的每次出现，当L为Ac时，c可以独立地为0或1。换言之，对于大于或等于2的n，在所述糖内3A位置可以未被O-乙酰化，完全被O-乙酰化或部分被乙酰化。
“当M为Ac时，b在每次出现时独立地为0或1”是指对于重复n次的重复单元的每次出现，当M为Ac时，b可以独立地为0或1。换言之，对于大于或等于2的n，在所述糖内6D位置可以未被O-乙酰化，完全被O-乙酰化或部分被乙酰化。
更特别地，所述糖包含以下片段：
-[AB(Ac)zC(E1→6)AcD]n-
在一个特别的实施方案中，蔗糖活性酶选自BRS-B、BRS-B-D2、BRS-C、BRS-A、BRS-D、BRS-E、GBD-CD2、GBD-CD2 W2135V、GBD-CD2 W2135C-F2136I、GBD-CD2 W2135S-F2136L、GBD-CD2 W2135I-F2136C、GBD-CD2 W2135C、GBD-CD2 W2135L-F2136L、GBD-CD2 W2135F-F2136I、GBD-CD2 W2135C-F2136N、GBD-CD2 W2135G、GBD-CD2 W2135F、GBD-CD2 F2163G、GBD-CD2 L2166I、GBD-CD2 F2163G L2166I、GBD-CD2 A2162E F2163L、GBD-CD2 F2163L、GBD-CD2 F2163I-D2164E-L2166I酶，以及BRS-B-D2 M6、BRS-B-D2 M21、BRS-B-D2 M23、BRS-B-D2 M28、BRS-B-D2 M30、BRS-B-D2 M31、BRS-B-D2 M34、BRS-B-D2 M35、BRS-B-D2 M40和BRS-B-D2 M41酶，所述酶更特别地为BRS-B。
更特别地，所述糖包含以下片段：
-[(E1→3)AB(Ac)zCAcD]n-
在一个特别的实施方案中，蔗糖活性酶选自BRS-B、BRS-B-D2、BRS-C、BRS-A、BRS-D、BRS-E、GBD-CD2、GBD-CD2 W2135V、GBD-CD2 W2135C-F2136I、GBD-CD2 W2135S-F2136L、GBD-CD2 W2135I-F2136C、GBD-CD2 W2135N-F2136Y、GBD-CD2 W2135N、GBD-CD2 W2135I-F2136Y、GBD-CD2 W2135L、GBD-CD2 W2135C、GBD-CD2 W2135N-F2136H、GBD-CD2 W2135L-F2136L、GBD-CD2 W2135F-F2136I、GBD-CD2 W2135C-F2136N、GBD-CD2 W2135G、GBD-CD2W2135F、GBD-CD2 F2163G、GBD-CD2 L2166I、GBD-CD2 F2163H、GBD-CD2 F2163G L2166I、GBD-CD2 A2162E F2163L、GBD-CD2 F2163L、GBD-CD2 F2163I-D2164E-L2166I酶，以及BRS-B-D2 M14、BRS-B-D2 M18、BRS-B-D2 M21、BRS-B-D2 M23、BRS-B-D2 M28、BRS-B-D2 M30、BRS-B-D2 M34、BRS-B-D2 M35、BRS-B-D2 M40和BRS-B-D2 M41酶，所述酶更特别地为BRS-B、GBD-CD2 W2135G或GBD-CD2 F2163I-D2164E-L2166I。
更特别地，所述糖包含以下片段：
-[(E1→4)AB(Ac)zCAcD]n-
在一个特别的实施方案中，蔗糖活性酶选自BRS-B、BRS-B-D2、BRS-C、BRS-A、BRS-D、BRS-E、GBD-CD2、GBD-CD2 W2135V、GBD-CD2 W2135C-F2136I、GBD-CD2 W2135S-F2136L、GBD-CD2 W2135I-F2136C、GBD-CD2 W2135N-F2136Y、GBD-CD2 W2135N、GBD-CD2 W2135I-F2136Y、GBD-CD2 W2135L、GBD-CD2 W2135C、GBD-CD2 W2135N-F2136H、GBD-CD2 W2135L-F2136L、GBD-CD2 W2135F-F2136I、GBD-CD2 W2135C-F2136N、GBD-CD2 W2135G、GBD-CD2W2135F、GBD-CD2 F2163G、GBD-CD2 L2166I、GBD-CD2 F2163H、GBD-CD2 F2163G L2166I、GBD-CD2 A2162E F2163L、GBD-CD2 F2163L、GBD-CD2 F2163I-D2164E-L2166I酶，以及BRS-B-D2 M14、BRS-B-D2 M18、BRS-B-D2 M21、BRS-B-D2 M23、BRS-B-D2 M28、BRS-B-D2 M30、BRS-B-D2 M34、BRS-B-D2 M35、BRS-B-D2 M40和BRS-B-D2 M41酶，所述酶更特别地为BRS-B、GBD-CD2 W2135G或GBD-CD2 F2163I-D2164E-L2166I。
更特别地，所述糖包含以下片段：
-[A(E1→4)B(Ac)zCAcD]n-
在一个特别的实施方案中，蔗糖活性酶选自GBD-CD2 W2135S-F2136L、GBD-CD2W2135I-F2136C、GBD-CD2 W2135L-F2136L酶，以及BRS-B-D2 M14、BRS-B-D2 M18、BRS-B-D2M21、BRS-B-D2 M23、BRS-B-D2 M28、BRS-B-D2 M30、BRS-B-D2 M35、BRS-B-D2 M40和BRS-B-D2 M41酶。
在另一个方面，本发明涉及一种下式之一的化合物：
((E1→2)a’(E1→4)a(E1→6)bCl3AcD)x(E1→3)c(E1→4)c’A(E1→3)d(E1→4)d’B(E1→4)e ClAcC((E1→2)a’(E1→4)a(E1→6b)Cl3AcD)y-All；
((E1→2)a’(E1→4)a(E1→6)bCl3AcD)x(E1→3)c(E1→4)c’A(E1→3)d(E1→4)d’B(E1→4)eC((E1→2)a’(E1→4)a(E1→6)b Cl3AcD)y-All；
((E1→2)a’(E1→4)a(E1→6)bCl3AcD)x(E1→3)c(E1→4)c’A(E1→3)d(E1→4)d’B(E1→4)e AcC((E1→2)a’(E1→4)a(E1→6)b Cl3AcD)y-All；
((E1→2)a’(E1→4)a(E1→6)bCl3AcD)x(E1→3)c(E1→4)c’A(E1→3)d(E1→4)d’B(E1→4)e AcC((E1→2)a’(E1→4)a(E1→6)b Cl3AcD)y；
((E1→2)a’(E1→4)a(E1→6)bCl3AcD)x(E1→3)c(E1→4)c’A(E1→3)d(E1→4)d’B(E1→4)e ClAcC((E1→2)a’(E1→4)a(E1→6)b Cl3AcD)y；
((E1→2)a’(E1→4)a(E1→6)bCl3AcD)x(E1→3)c(E1→4)c’A(E1→3)d(E1→4)d’B(E1→4)eC((E1→2)a’(E1→4)a(E1→6)b Cl3AcD)y；
((E1→4)a(E1→6)bCl3AcD)x(E1→3)c(E1→4)c’A(E1→3)d(E1→4)d’B(E1→4)e ClAcC((E1→4)a(E1→6b)Cl3AcD)y-All；
((E1→4)a(E1→6)b Cl3AcD)x(E1→3)c(E1→4)c’A(E1→3)d(E1→4)d’B(E1→4)eC((E1→4)a(E1→6)b Cl3AcD)y-All；
((E1→4)a(E1→6)b Cl3AcD)x(E1→3)c(E1→4)c’A(E1→3)d(E1→4)d’B(E1→4)e AcC((E1→4)a(E1→6)b Cl3AcD)y-All；
((E1→4)a(E1→6)b Cl3AcD)x(E1→3)c(E1→4)c’A(E1→3)d(E1→4)d’B(E1→4)e AcC((E1→4)a(E1→6)b Cl3AcD)y；
((E1→4)a(E1→6)bCl3AcD)x(E1→3)c(E1→4)c’A(E1→3)d(E1→4)d’B(E1→4)e ClAcC((E1→4)a(E1→6)b Cl3AcD)y；
((E1→4)a(E1→6)b Cl3AcD)x(E1→3)c(E1→4)c’A(E1→3)d(E1→4)d’B(E1→4)eC((E1→4)a(E1→6)b Cl3AcD)y；
((E1→4)a(E1→6)bCl3AcD)x(E1→3)cA(E1→3)dB(E1→4)eClAcC((E1→4)a(E1→6)b Cl3AcD)y-All；
((E1→4)a(E1→6)b Cl3AcD)x(E1→3)c A(E1→3)d B(E1→4)e C((E1→4)a(E1→6)b Cl3AcD)y-All；((E1→4)a(E1→6)b Cl3AcD)x(E1→3)c A(E1→3)d B(E1→4)e AcC((E1→4)a(E1→6)b Cl3AcD)y-All；
((E1→4)a(E1→6)b Cl3AcD)x(E1→3)c A(E1→3)d B(E1→4)e AcC((E1→4)a(E1→6)b Cl3AcD)y；
((E1→4)a(E1→6)b Cl3AcD)x(E1→3)c A(E1→3)d B(E1→4)e ClAcC((E1→4)a(E1→6)b Cl3AcD)y；((E1→4)a(E1→6)b Cl3AcD)x(E1→3)c A(E1→3)d B(E1→4)e C((E1→4)a(E1→6)b Cl3AcD)y；
ABClAcC(E1→6)Cl3AcD-All；
ABC(E1→6)Cl3AcD-All；
ABAcC(E1→6)Cl3AcD-All；
ABAcC(E1→6)Cl3AcD；
ABClAcC(E1→6)Cl3AcD；
ABC(E1→6)Cl3AcD；
(E1→3)ABClAcCCl3AcD-All；
(E1→3)ABCCl3AcD-All；
(E1→3)ABAcCCl3AcD-All；
(E1→3)ABAcCCl3AcD；
(E1→3)ABClAcCCl3AcD；
(E1→3)ABCCl3AcD；
(E1→4)ABClAcCCl3AcD-All；
(E1→4)ABCCl3AcD-All；
(E1→4)ABAcCCl3AcD-All；
(E1→4)ABAcCCl3AcD；
(E1→4)ABClAcCCl3AcD；
(E1→4)ABCCl3AcD；
A(E1→4)BClAcCCl3AcD-All；
A(E1→4)BCCl3AcD-All；
A(E1→4)BAcCCl3AcD-All；
A(E1→4)BAcCCl3AcD；
A(E1→4)BClAcCCl3AcD；
A(E1→4)BCCl3AcD。
在另一个方面，本发明涉及酶，所述酶选自如上面所定义的酶BRS-D-2 M6、BRS-D-2 M14、BRS-D-2 M18、BRS-D-2 M21、BRS-D-2 M23、BRS-D-2 M28、BRS-D-2 M30、BRS-D-2M31、BRS-D-2 M34、BRS-D-2 M35、BRS-D-2 M40、BRS-D-2 M41及其变体。
合成
可以根据如下所示的[3+1]策略获得式I化合物。例如，将ABClAcC鼠李三糖基(rhamnotriosyl)供体与D受体反应，所述供体包含与烯丙基醚(All)、N-三氯乙酰基(Cl3Ac)和氯乙酰基部分(ClAc)正交的保护基。两步脱保护过程得到ABClAcCCl3AcD-All受体。保护和脱保护技术例如由P.G.M.Wuts和T.W.Greene所描述(Greene's Protective Groupsin Organic Synthesis,第四版,Wiley-Interscience,2006；或Greene's ProtectiveGroups in Organic Synthesis,第五版；Wiley-Interscience,2014)。
有利地，鼠李糖A、B和C特别地由单一前体构建。
合适的合成路线可以为如下：
定义
本文包含的以下术语和表述定义如下：
如本文所使用，“x-y”或“x至y”或“x到y”形式的值的范围包括整数x、y及其之间的整数。例如，短语“1-6”或“1至6”或“1到6”旨在包括整数1、2、3、4、5和6。优选的实施方案包括范围内的每个单独的整数，以及整数的任何子组合。例如，“1-6”的优选整数可以包括1、2、3、4、5、6、1-2、1-3、1-4、1-5、2-3、2-4、2-5、2-6等。
如本文所使用，术语(E)是指术语(E)后的糖带有α-D-Glcp-残基。例如，A(E)B是指B带有α-D-Glcp-残基。此外，(E1→6)AcD是指AcD残基带有连接于其伯羟基(6D-OH位置)上的α-D-Glcp-残基。
如本文所使用，术语“供体”更特别地是指在异头位置带有离去基的单糖、寡糖或多糖。
如本文所使用，术语“受体”更特别地是指单糖、寡糖或多糖，其通常除了异头羟基以外具有至少一个游离羟基，优选至少对应于增长链的延长位点的游离羟基。
通过在酶序列的特定位置引入突变(缺失、插入和/或取代)，同时保留所述酶催化α-D-葡萄糖基化的能力，由GH13或GH70家族的酶(如GH13家族的淀粉蔗糖酶，和GH70家族的分支糖蔗糖酶和葡聚糖蔗糖酶)获得变体。
特别地，所述变体的氨基酸序列与相应的GH13或GH70家族的酶的氨基酸序列具有至少50％的同一性，或者以增加优选的顺序至少40％、42％、45％、47％、50％、52％、55％、57％、60％、62％、65％、70％、72％、75％、77％、80％、82％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
氨基酸序列同一性百分比被定义为在比对序列并在必要时引入缺口(gaps)以实现最大的序列同一性后，比较序列(Compared Sequence)中与参比序列(ReferenceSequence)相同的氨基酸残基的百分比。然后，根据以下公式确定同一性百分比：同一性百分比＝100x[1-(C/R)]，其中C为参比序列与比较序列在参比序列的整个长度上的差异数，其中(i)没有对应的在比较序列中的比对氨基酸的参比序列中的每个氨基酸，(ii)参比序列中的每个缺口，和(iii)与比较序列氨基酸不同的参比序列中的每个比对氨基酸，构成一个差异；以及R为在与比较序列的比对长度上参比序列中氨基酸的数目，其中在参比序列中产生的任何缺口也被计为一个氨基酸。
除非另有说明，从BLAST结果计算本文提及的两个蛋白质序列间的同一性百分比，在NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)或GRYC(http://gryc.inra.fr/)网站，使用如Altschul等人(1997)所描述的具有默认的BLOSUM62参数的BlastP程序获得所述BLAST结果。
“ABC-三糖基”是指ABC鼠李三糖基，即ABC三糖基团。
附图说明
图1A显示对应于五糖1的HSQC光谱。
图1B显示对应于五糖1的HMBC光谱。
具体实施方式
实施例1：式(I)化合物的合成
A、B和C残基的共同前体(1)的合成
烯丙基4-O-(2-萘甲基)-α-L-鼠李吡喃糖苷(1)
在0℃，将乙酰氯(50mL，0.70mol，2.5当量)滴加到烯丙醇(610mL)中，将溶液搅拌25min，然后加入L-鼠李糖一水合物(50g，277mmol)。将混合物在70℃加热2.5h，然后在40℃加热15h。TLC(DCM/MeOH 8:2)追踪表明，起始半缩醛(Rf 0.2)完全转化为极性较小的产物(Rf 0.7)。将浴温冷却至0℃，并通过加入NaHCO3(102.5g)将溶液中和。将混悬液经垫过滤，蒸发溶剂，并与甲苯共蒸发3次。
将棕色油状残余物溶解在无水丙酮(300mL)中，然后依次加入2,2-二甲氧基丙烷(100mL，0.81mol，3.0当量)和PTSA(3.04g，16mmol，0.05当量)。将混合物在rt搅拌3h。TLC(DCM/MeOH 9:1)追踪表明，中间体烯丙基糖苷(Rf0.3)完全转化为极性较小的产物(Rf0.6)。通过加入Et3N(4mL)中和溶液，减压蒸发溶剂。将残余物溶解于DCM(600mL)中，并用H2O(3×300mL)和盐水(200mL)洗涤。将有机层通过相分离器过滤器干燥，并浓缩至干。
在Ar下将残余物溶解于DMF(800mL)中，将浴温冷却至-5℃，并将NaH(60％油分散体，29.1g，0.73mol，2.4当量)分批加入到该混悬液中。将混合物在rt搅拌2h，然后在-5℃分批加入2-溴甲基萘(73.5g，0.33mol，1.2当量)，并将反应混合物在rt搅拌2h。TLC(环己烷/EtOAc 7:3)追踪表明，中间体醇(Rf0.3)完全转化为极性较小的产物(Rf 0.67)。通过在0℃加入MeOH(50mL)淬灭反应。减压去除溶剂，并将挥发物与甲苯共蒸发。将残余物溶解在EtOAc(400mL)中，并用H2O(3×300mL)和盐水(150mL)洗涤。将有机相经无水Na2SO4干燥，过滤，并浓缩至干。
将残余物溶解于80％aq.AcOH(500mL)中，并将溶液在80℃搅拌6h，然后在rt搅拌过周末，并在80℃继续加热5h。TLC(环己烷/EtOAc 5:5)追踪表明，中间体缩醛(Rf 1.0)完全转化为极性较大的产物(Rf 0.2)。在真空下去除溶剂，并通过与甲苯(3x 400mL)共蒸发去除痕量的AcOH，得到棕色固体。
在二氧化硅垫上过滤(先后用cHex/EtOAc的4:1混合物和环己烷/EtOAc的1:1混合物洗脱)，然后在热的环己烷中重结晶，得到作为浅棕色固体的期望的二醇(65.5g，69％)。通过快速柱色谱法(环己烷/EtOAc 100:0至50:50)进一步纯化母液，得到额外量的期望的二醇(11.6g)。在四个步骤中，二醇1的总收率为81％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.87–7.78(m,4H,HArNap),7.52–7.44(m,3H,HArNap),5.89(dddd,1H,J＝17.2,10.4,6.0,5.2Hz,CH＝CH2),5.28(dqapp,1H,J＝17.2,1.5Hz,CH＝CH2),5.19(dqapp,1H,J＝10.4,1.5Hz,CH＝CH2),4.95–4.86(m,2H,HArNap),4.81(d,J＝1.4Hz,1H,H-1),4.17(ddt,1H,J＝12.9,5.1,1.5Hz,1H,HAll),4.02–3.93(m,3H,HAll,H-2,H-3),3.79(dq,1H,J＝9.2,6.3Hz,H-5),3.41(tapp,1H,J＝9.2Hz,H-4),2.45(brs,2H,OH),1.38(d,3H,J＝6.3Hz,H-6)。
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ133.8(CH＝CH2),128.4(CIVAr),128.0(CIVAr),127.7(CIVAr),126.7-125.8(7C,CAr),117.4(CH＝CH2),98.5(C-1 1JC,H＝170.1Hz),75.1(CH2Nap),71.6,71.3(2C,C-2,C-3),68.0(CAll),67.3(C-5),18.1(C-6)。
HRMS(ESI+):m/z 362.1985(计算C16H22O5Na[M+NH4]+m/z 362.1967)；m/z 367.1576(计算C43H51ClO12Na[M+Na]+m/z 367.1521)。
用作残基A和B的前体的鼠李吡喃糖基(rhamnopyranosyl)供体(5和5a)的合成
TES衍生物
烯丙基4-O-(2-萘甲基)-3-O-三乙基甲硅烷基-α-L-鼠李吡喃糖苷(2)
向在0℃搅拌的烯丙基4-O-(2-萘甲基)-α-L-鼠李吡喃糖苷(二醇1)(5.0g，14.5mmol)在无水乙腈(MeCN，200mL)中的溶液中依次滴加氯三乙基硅烷(TESCl99％，2.9mL，17.4mmol，1.2equiv)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA 99.5％，3.8mL，21.8mmol，1.5equiv)。在室温搅拌反应混合物2h后，TLC(环己烷/EtOAc 8:2)显示原料(Rf＝0.13)完全消耗且存在主要产物(Rf＝0.70)。加入甲醇(1.2mL，29.0mmol，0.5equiv)，将混合物搅拌15min，并减压蒸发挥发物。加入甲苯，并出现沉淀。过滤混悬液，并将滤液在真空下浓缩至干。通过色谱法(从经Et3N处理的硅胶柱上洗脱(甲苯/乙酸乙酯95:5))纯化残余物，得到作为黄色油状物的化合物2(4.9g，74％)。
烯丙基2-O-乙酰丙酰基-4-O-(2-萘甲基)-3-O-三乙基甲硅烷基-α-L-鼠李吡喃糖苷(3)
路线1：向在室温搅拌的烯丙基4-O-(2-萘甲基)-3-O-三乙基甲硅烷基-α-L-鼠李吡喃糖苷(醇2)(5.0g，10.9mmol)在无水二氯甲烷(DCM，65mL)中的溶液中依次加入1,3-二环己基碳二亚胺(DCC 99％，7.65g，37.1mmol，3.4equiv)、4-二甲基氨基吡啶(DMAP，1.07g，8.73mmol，0.8equiv)和乙酰丙酸(LevOH 98％，4.69mL，45.8mmol，4.2equiv)。在室温搅拌反应混合物2h后，TLC(环己烷/EtOAc 7:3)显示原料(Rf＝0.60)完全消耗且存在极性较大的化合物(Rf＝0.53)。减压浓缩反应混合物。将粗品溶解于EtOAc(50mL)中，并在垫上过滤所得的混悬液。将水(30mL)加入滤液中，并依次用10％硫酸铜(II)水溶液(30mL)、水(30mL)、饱和碳酸氢钠水溶液(30mL)和盐水(30mL)洗涤有机层。将有机层经无水硫酸钠搅拌干燥，过滤并真空浓缩。通过从经Et3N处理的硅胶柱上洗脱(环己烷/EtOAc 9:1至5:5)纯化残余物，得到作为黄色油状物的完全保护的3(4.5g，74％)。
路线2：向在0℃搅拌的烯丙基4-O-(2-萘甲基)-α-L-鼠李吡喃糖苷(二醇1)(20.0g，58.1mmol)在无水MeCN(800mL)中的溶液中依次滴加TESCl(11.70mL，69.7mmol，1.2equiv)和DIPEA(15.2mL，87.1mmol，1.5equiv)。在室温搅拌反应混合物2h后，TLC(环己烷/EtOAc 8:2)显示原料(Rf＝0.13)完全消耗且存在主要产物(Rf＝0.70)。加入甲醇(1.2mL，29.0mmol，0.5equiv)，将混合物搅拌15min，并减压蒸发挥发物。加入甲苯，并出现沉淀。过滤混悬液，并将滤液在真空下浓缩至干。
向在室温搅拌的粗醇2在无水DCM(200mL)中的溶液中依次加入DCC(40.74g，197.4mmol，3.4equiv)、DMAP(5.7g，46.5mmol，0.8equiv)和乙酰丙酸(23.8mL，232.3mmol，4.0equiv)。在室温搅拌反应混合物2h后，TLC(环己烷/EtOAc7:3)显示原料(Rf＝0.60)完全消耗且存在极性较大的产物(Rf＝0.53)。减压浓缩反应混合物。将粗品溶解于EtOAc(50mL)中，并在垫上过滤所得的混悬液。将水(30mL)加入滤液中，并依次用10％硫酸铜(II)水溶液(30mL)、水(30mL)、饱和碳酸氢钠水溶液(30mL)和盐水(30mL)洗涤有机层。将有机层经无水硫酸钠搅拌干燥，过滤并真空浓缩。通过从经Et3N处理的硅胶柱上洗脱(环己烷/乙酸乙酯9:1至5:5)纯化残余物，得到作为黄色油状物的完全保护的3(30.7g，95％)。
2-O-乙酰丙酰基-4-O-(2-萘甲基)-3-O-三乙基甲硅烷基-α/β-L-鼠李吡喃糖(4)
向在室温搅拌的烯丙基2-O-乙酰丙酰基-4-O-(2-萘甲基)-3-O-三乙基甲硅烷基-α-L-鼠李吡喃糖苷(烯丙基糖苷3)(2.5g，4.49mmol)在无水THF(60mL)中的溶液中加入氢活化的1,5-环辛二烯双-(甲基二苯基膦)铱(I)六氟磷酸盐(76.0mg，90μmol，0.02equiv)。在室温搅拌反应混合物2小时后，TLC(环己烷/EtOAc 7:3)显示起始原料(Rf＝0.53)完全转化为极性较小的产物(Rf＝0.56)。将在1:5水/THF(30mL)中的N-碘代琥珀酰亚胺(NIS 95％，1.21g，5.39mmol，1.2equiv)和蒸馏水(40mL)先后加入到在0℃搅拌的混合物中。在该温度搅拌反应混合物2h后，TLC(环己烷/EtOAc 7:3)显示中间体(Rf＝0.56)完全转化为极性较大的产物(Rf＝0.26)。加入10％焦亚硫酸钠水溶液(50mL)。减压蒸发THF，并加入DCM(50mL)。将水层用DCM(30mL)萃取两次，并先后用饱和碳酸氢钠水溶液(30mL)和盐水(30mL)洗涤合并的有机相。将有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。通过色谱法(从经Et3N处理的硅胶柱上洗脱(环己烷/EtOAc 8:2至6:4))纯化残余物，得到作为黄色油状物的半缩醛4(2.1g，89％，α/β8:2)。
2-O-乙酰丙酰基-4-O-(2-萘甲基)-3-O-三乙基甲硅烷基-α/β-L-鼠李吡喃糖三氯乙酰亚胺酯(5)
路线1：向在室温搅拌的2-O-乙酰丙酰基-4-O-(2-萘甲基)-3-O-三乙基甲硅烷基-L-鼠李吡喃糖(半缩醛4)(2.00g，3.87mmol)在无水1,2-二氯乙烷(DCE，30mL)中的溶液中依次加入三氯乙腈(Cl3CCN 98％，1.16mL，11.6mmol，3.0equiv)和1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU 98％，289μL，1.94mmol，0.5equiv)。在室温搅拌反应混合物2h后，TLC(环己烷/乙酸乙酯7:3)显示原料(Rf＝0.26)完全消耗，产生极性较小的产物(Rf＝0.53)。减压蒸发挥发物。通过色谱法(从经三乙胺处理的硅胶柱上洗脱(环己烷/乙酸乙酯9:1至5:5))纯化残余物，得到作为白色结晶固体的供体5(2.3g，90％，α/β95:5)。
路线2：向在室温搅拌的烯丙基2-O-乙酰丙酰基-4-O-(2-萘甲基)-3-O-三乙基甲硅烷基-α-L-鼠李吡喃糖苷(烯丙基糖苷3)(15.0g，26.9mmol)在无水THF(300mL)中的溶液中加入氢活化的1,5-环辛二烯双-(甲基二苯基膦)铱(I)六氟磷酸盐([Ir]，456mg，540μmol，0.02EtOAc 7:3)显示起始原料(Rf＝0.53)完全转化为极性较小的产物(Rf＝0.56)。将在1:5水/THF(150mL)中的NIS(7.27g，32.3mmol，1.2equiv)和蒸馏水(250mL)先后加入到在0℃搅拌的混合物中。在该温度搅拌反应混合物2h后，TLC(环己烷/EtOAc 7:3)显示中间体(Rf＝0.56)完全转化为极性较大的产物(Rf＝0.26)。加入10％焦亚硫酸钠水溶液(100mL)。减压蒸发THF，并加入DCM(500mL)。将水层用DCM(300mL)萃取两次，并先后用饱和碳酸氢钠水溶液(200mL)和盐水(200mL)洗涤合并的有机相。将有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩(m:14.3g)。
向在室温搅拌的粗品(13.9g)在无水DCE(210mL)中的溶液中依次加入Cl3CCN(8.1mL，80.8mmol，3.0equiv)和DBU(2.01mL，13.5mmol，0.5equiv)。在室温搅拌反应混合物2h 50后，TLC(环己烷/EtOAc 7:3)显示原料(Rf＝0.26)完全消耗，产生极性较小的产物(Rf＝0.53)。减压蒸发挥发物。通过色谱法(从经Et3N处理的硅胶柱上洗脱(环己烷/EtOAc 9:1至5:5))纯化残余物，得到作为白色结晶固体的供体5(15.04g，84％，α/β95:5)。
BDA衍生物
烯丙基3,4-O-(2’,3’-二甲氧基丁-2’,3’-二基)-α-L-鼠李吡喃糖苷(2a)
在0℃，将乙酰氯(34mL，475mmol，2.5equiv)滴加到烯丙醇(420mL)中。将溶液搅拌25min，并加入L-鼠李糖一水合物(34.3g，190mmol)。将混合物在70℃加热2.5h，然后在40℃加热15h。TLC(DCM/MeOH 8:2)追踪表明，L-鼠李糖(Rf＝0.2)完全转化为极性较小的产物(Rf 0.7)。将浴温冷却至0℃，并通过加入固体NaHCO3(102.5g)将溶液中和。将混悬液经垫过滤，蒸发溶剂，并与甲苯共蒸发3次。
向在室温搅拌的粗烯丙基鼠李糖苷(190mmol)在无水甲醇(1.0L)中的溶液中依次加入丁2,3-二酮(18.3mL，0.21mol，1.1equiv)、原甲酸三甲酯(83mL，0.76mol，4.0equiv)和三氟化硼醚化物(11.7mL，95mmol，0.5equiv)。将反应混合物在回流下搅拌1.5h后，TLC追踪(DCM/MeOH 95:5)显示原料(Rf＝0.3)完全消耗，且存在主要产物(Rf＝0.5)。在0℃将Et3N缓慢加入到反应混合物中直到中和，并减压蒸发挥发物。通过色谱法(从硅胶柱上洗脱(环己烷/EtOAc 8:2至6:4))纯化残余物，得到作为棕色油状物的化合物2a(57.8g，96％，2个异构体9:1)。
烯丙基2-O-乙酰丙酰基-3,4-O-(2’,3’-二甲氧基丁-2’,3’-二基)-α-L-鼠李吡喃糖苷(3a)
向在rt搅拌的醇2a(27.0g，84.8mmol)在无水二氯甲烷(650mL)中的溶液中依次加入DCC(59.5g，0.29mol，3.4当量)、DMAP(8.29g，67.9mmol，0.8当量)和乙酰丙酸(36.5mL，0.36mol，4.2当量)。将反应混合物在室温搅拌2h后，TLC追踪(DCM/MeOH 98:2)显示原料(Rf＝0.25)完全消耗，且存在两种极性较小的化合物(Rf＝0.6、0.65)。减压浓缩反应混合物。将饱和NaHCO3水溶液(300mL)加入到反应混合物中。将水层用DCM(300mL)萃取一次，并将合并的有机相用盐水(150mL)洗涤两次。将有机层经无水硫酸钠搅拌干燥，过滤并真空浓缩。通过色谱法(从硅胶柱上洗脱(DCM/MeOH 1:0至9:1))纯化残余物，得到作为棕色油状物的完全保护的3a(37.5g，95％，2个异构体9:1)。
2-O-乙酰丙酰基-3,4-O-(2’,3’-二甲氧基丁-2’,3’-二基)-α-L-鼠李吡喃糖三氯乙酰亚胺酯(5a)
向在rt搅拌的鼠李糖苷3a(37.5g，90.0mmol)在无水四氢呋喃(THF，500mL)中的溶液中加入氢活化的1,5-环辛二烯双(甲基二苯基膦)铱(I)六氟磷酸盐(1.5g，1.80mmol，0.02当量)。在室温搅拌反应混合物2h后，TLC(环己烷/EtOAc5:5)显示起始原料(Rf＝0.8、0.85)完全转化成两种紧密洗脱的产物(Rf＝0.8、0.9)。将在水/THF(1:5，250mL)中的N-碘代琥珀酰亚胺(NIS，24.3g，108mmol，1.2当量)和另外的水(370mL)先后加入到在0℃搅拌的混合物中。在该温度搅拌反应混合物2h后，TLC(环己烷/EtOAc 5:5)显示中间体完全转化成另外两种极性产物(Rf＝0.45、0.5)。先后加入饱和焦亚硫酸钠水溶液(500mL)和乙酸乙酯(500mL)。将水层用乙酸乙酯(300mL)萃取两次，并先后用饱和NaHCO3水溶液(300mL)和盐水(300mL)洗涤合并的有机相。将有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。
向在rt搅拌的粗半缩醛4a(90.0mmol)在无水DCE(500mL)中的溶液中依次加入三氯乙腈(27.1mL，0.27mol，3.0当量)和DCC(6.7mL，45.0mmol，0.5当量)。在室温搅拌反应混合物2.5h后，TLC(环己烷/EtOAc 7:3)显示原料(Rf＝0.45、0.5)完全消耗，产生两个极性较小的产物(Rf＝0.75、0.5)。减压蒸发挥发物。通过色谱法(从经Et3N处理的硅胶柱上洗脱(环己烷/EtOAc 8:2至6:4))纯化残余物，得到作为黄色至棕黄色油状物的供体5a(38.6g，82％，仅α，2个异构体9:1)。
氨基葡萄糖D受体的合成
按照以下程序，通过路线A或改进的路线B获得已知的氨基葡萄糖D受体(Carbohydrate Chemistry:Proven Synthetic Methods,P.Murphy和C.Vogel编,2017,第4卷,第39章,出版中)。
氨基葡萄糖D供体的合成。
如公开所描述(Tetrahedron Lett.(2008)49,5339–42)获得已知的氨基葡萄糖D供体12。可替代地，可以根据描述的将醇10转化成供体12的程序，由D受体9获得供体12的类似物，所述类似物带有4,6-O-苯亚甲基缩醛而不是4,6-O-异亚丙基缩醛。
值得注意的是，醇10也可以在式(Ia)化合物的合成中用作合适的受体。
下面举例说明供体12a的合成，所述供体12a分别包含4,6-O-苯亚甲基缩醛和TBS醚代替4,6-O-异亚丙基缩醛和Lev基团。
烯丙基4,6-O-苯亚甲基-3-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2-脱氧-2-三氯乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷(11a)
向在-78℃搅拌的烯丙基4,6-O-苯亚甲基-2-脱氧-2-三氯乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷(10)(2.0g，4.42mmol)在无水二氯甲烷(40mL)中的溶液中依次加入2,6-二甲基吡啶(2.06mL，17.7mmol，4.0equiv)和叔丁基二甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯(2.54mL，11.05mmol，2.5equiv)。在室温搅拌反应混合物过夜后，TLC追踪(甲苯/乙酸乙酯8:2)显示原料(Rf＝0.25)完全消耗，且存在极性较小的产物(Rf＝0.7)。加入蒸馏水(50mL)和乙酸乙酯(200mL)。将水层用乙酸乙酯(100mL)萃取，并先后用水(50mL)、10％柠檬酸水溶液(50mL)和水(50mL)洗涤合并的有机相。将有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。通过色谱法(从硅胶柱上洗脱(甲苯/乙酸乙酯95:5至9:1))纯化残余物，得到作为白色粉末的完全保护的11a(2.32g，92％)。
4,6-O-苯亚甲基-3-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2-脱氧-2-三氯乙酰氨基-α/β-D-吡喃葡萄糖N-(苯基)三氟乙酰亚胺酯(12a)
向在室温搅拌的氨基葡萄糖苷11a(2.27g，4.0mmol)在无水THF(200mL)中的溶液中加入氢活化的1,5-环辛二烯双(甲基二苯基膦)铱(I)六氟磷酸盐(170mg，0.20mmol，0.05equiv)。在室温搅拌反应混合物4小时后，TLC追踪(甲苯/乙酸乙酯9:1)显示原料(Rf＝0.6)完全转化为极性较小的产物(Rf＝0.6)。然后，将在1:5水/THF(56mL)中的N-碘代琥珀酰亚胺(1.35g，6.0mmol，1.5equiv)加入到在室温搅拌的混合物中。在该温度搅拌2h后，TLC追踪(甲苯/EtOAc 9:1)显示中间体完全转化为极性较大的产物(Rf＝0.2)。先后加入饱和焦亚硫酸钠水溶液(200mL)和乙酸乙酯(500mL)。将水层用乙酸乙酯(250mL)萃取两次，并先后用饱和NaHCO3水溶液(200mL)和盐水(200mL)洗涤合并的有机相。将有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。
向在室温搅拌的粗半缩醛(4.42mmol)在无水丙酮(36mL)中的溶液中依次加入N-(苯基)三氟乙酰亚氨基氯(1.80mL，6.63mmol，1.5equiv)和碳酸钾(1.53g，11.05mmol，2.5equiv)。在室温搅拌反应混合物3小时后，TLC(甲苯/EtOAc8:2)显示原料(Rf＝0.2)完全消耗，且存在极性较小的产物的混合物(Rf＝0.75和0.8)。将混合物经垫过滤，并将滤液减压浓缩。通过色谱法(从硅胶柱上洗脱(甲苯/EtOAc 95:5至9:1))纯化残余物，得到作为棕色油状物的N-(苯基)三氟乙酰亚氨酯供体12a和噁唑啉12b的2:1混合物(2.57g，两步65％)。
ABClAcC-Z’的合成
选定的实施例
烯丙基2-O-氯乙酰基-4-O-(2-萘基甲基)-α-L-鼠李吡喃糖苷(13)
将二醇1(2.0g，6.0mmol)溶解于无水MeCN(5.0mL)中。向溶液中加入氯代原乙酸三甲酯(trimethylchloroorthoacetate，2.35mL，3.0当量)和PTSA(90mg，0.08当量)。将溶液在室温搅拌1小时(反应经TLC甲苯/EtOAc 7:3追踪)。向冷却至0℃的反应介质中加入90％TFA水溶液(3.0mL)，并将反应混合物在室温搅拌15min。加入水(20mL)。用DCM(2×40mL)萃取产物。用饱和NaHCO3水溶液(2×25mL)和盐水(25mL)洗涤有机相。用DCM(2×25mL)萃取水相。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤，蒸发，最后与甲苯共蒸发，得到粗醇13(区域异构体的92:8混合物)。
烯丙基2-O-乙酰丙酰基-4-O-(2-萘甲基)-3-O-三乙基甲硅烷基-α-L-鼠李吡喃糖基-(1→3)-2-O-氯乙酰基-4-O-(2-萘甲基)-α-L-鼠李吡喃糖苷(14)
将三氯乙酰亚胺酯5(5.84g，8.83mmol)和粗受体13(4.09g，1.1当量)在含有的甲苯(88mL)中的溶液在室温搅拌15min，然后在-60℃搅拌15min。将叔丁基二甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯(TBSOTf，100μL，0.05当量)加入到在-60℃搅拌的反应混合物中，并使浴槽达到-40℃。在搅拌1h后，在-35℃将Et3N加入到混悬液中，将混合物经垫过滤，并将滤液浓缩至干。将残余物经硅胶快速过滤，并在EtOAc/戊烷5:1(400mL)中结晶，得到完全保护的14(3.83g，72％)。
烯丙基2-O-乙酰丙酰基-4-O-(2-萘甲基)-3-O-三乙基甲硅烷基-α-L-鼠李吡喃糖基-(1→2)-4-O-(2-萘甲基)-3-O-三乙基甲硅烷基-α-L-鼠李吡喃糖基-(1→3)-2-O-氯乙酰基-4-O-(2-萘甲基)-α-L-鼠李吡喃糖苷(16)
将三氯乙酰亚胺酯5(1.04g，1.24当量)和醇15(1.0g，1.22mmol)在含有的甲苯(30mL)中的溶液在室温搅拌15min，然后在-20℃搅拌15min。将TMSOTf(11μL，0.05当量)加入到在-20℃搅拌的反应混合物中，并使浴槽达到-10℃。在该温度搅拌1h后，搅拌1h同时使浴槽缓慢达到室温。将Et3N加入到混悬液中，将混合物经垫过滤，并将滤液浓缩至干。通过柱色谱法获得完全保护的ABClAcC三糖16(1.36g，85％)。
HRMS(ESI+)：m/z 1336.6191(计算值C73H99Cl4NO16Si2[M+NH4]+)测定值m/z1336.6171。
2-O-乙酰丙酰基-4-O-(2-萘甲基)-3-O-三乙基甲硅烷基-α-L-鼠李吡喃糖基-(1→2)-4-O-(2-萘甲基)-3-O-三乙基甲硅烷基-α-L-鼠李吡喃糖基-(1→3)-2-O-氯乙酰基-4-O-(2-萘甲基)-α/β-L-鼠李吡喃糖(17)
向在室温搅拌的完全保护的ABClAcC(1.04g，7.6mmol)在无水THF(35mL)中的溶液中加入氢活化的[Ir](13.0mg，0.02当量)。在室温搅拌反应混合物45min后，TLC(甲苯/EtOAc 9:1)显示原料完全转化为极性较小的产物。将反应混合物冷却至0℃，先后将在1:5水/THF(17.5mL)中的NIS(205mg，1.2当量)和蒸馏水(25mL)加入到在0℃搅拌的混合物中。在该温度搅拌反应混合物1.5h后，TLC(甲苯/乙酸乙酯9:1)显示中间体完全转化为极性较大的产物。加入10％焦亚硫酸钠水溶液(50mL)。减压蒸发THF，并加入DCM(100mL)。将水层用DCM(50mL)萃取两次，并先后用饱和碳酸氢钠水溶液(50mL)和盐水(50mL)洗涤合并的有机相。将有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。通过色谱法(从经Et3N处理的硅胶柱上洗脱(甲苯/乙酸乙酯85:15至0:100))纯化残余物，得到半缩醛17(825mg，85％)。
HRMS(ESI+):m/z 1296.5878(计算值C70H95Cl4NO16Si2[M+NH4]+)测定值m/z1296.5922。
2-O-乙酰丙酰基-4-O-(2-萘甲基)-3-O-三乙基甲硅烷基-α-L-鼠李吡喃糖基-(1→2)-4-O-(2-萘甲基)-3-O-三乙基甲硅烷基-α-L-鼠李吡喃糖基-(1→3)-2-O-氯乙酰基-4-O-(2-萘甲基)-α/β-L-鼠李吡喃糖三氯乙酰亚胺酯(18)
向在室温搅拌的ABClAcC三糖17(700mg，550μmol)在无水DCE(5.0mL)中的溶液中依次加入Cl3CCN(165μL，3.0当量)和DBU(40μL，0.5当量)。将反应混合物在室温搅拌45min后，加入相同量的CCl3CN和DBU，并将反应在室温搅拌1h。减压蒸发挥发物。通过色谱法(从经Et3N处理的硅胶柱上洗脱(甲苯/EtOAc 8:2，含3‰Et3N))纯化残余物，得到供体18(830mg，84％)。
HRMS(ESI+):m/z 1439.4974(计算值C72H95Cl4N2O16Si2[M+NH4]+)测定值m/z1439.4912.
2-O-乙酰丙酰基-4-O-(2-萘甲基)-3-O-三乙基甲硅烷基-α-L-鼠李吡喃糖基-(1→2)-4-O-(2-萘甲基)-3-O-三乙基甲硅烷基-α-L-鼠李吡喃糖基-(1→3)-2-O-氯乙酰基-4-O-(2-萘甲基)-α/β-L-鼠李吡喃糖N-苯基三氟乙酰亚胺酯(19)
向在室温搅拌的ABClAcC三糖17(1.56g，1.22mmol)在丙酮(24.4mL)中的溶液中依次加入K2CO3(337mL，2.0当量)和N-苯基三氟乙酰亚氨基氯(PTFACl，290μL，1.5当量)。将反应混合物在室温搅拌过夜后，TLC(环己烷/EtOAc 2:8)表明原料17已转化为极性较小的产物。将混悬液经垫过滤，减压蒸发挥发物。通过柱色谱法纯化残余物，得到供体19(1.56g，88％)。
还可以通过下面定义的替代路线B获得ABClAcCCl3AcD-All，其中保护基与上面显示的不同，所述保护基为：R1＝Nap，R3、R4＝R6、R4＝BDA，R2＝ClAc，R5＝Lev，R8＝All，R9＝Cl3Ac)。
选定的实施例
烯丙基2-O-乙酰丙酰基-3,4-O-(2’,3’-二甲氧基丁-2’,3’-二基)-α-L-鼠李吡喃糖基-(1→3)-2-O-氯乙酰基-4-O-(2-萘甲基)-α-L-鼠李吡喃糖苷(14a)
向在rt搅拌的粗烯丙基2-O-氯乙酰基-4-O-(2-甲基萘基)-α-L-鼠李吡喃糖苷(5，6.91mmol，1.2当量)在无水乙醚(60mL)中的溶液中依次加入供体5a(3.0g，5.76mmol)和活化的分子筛(3.0g)。在rt搅拌15min后，将反应混合物冷却至-20℃，并在该温度再搅拌15min。然后，缓慢加入三甲基甲硅烷三氟甲磺酸酯(TMSOTf，0.18mL，1.15mmol，0.2当量)。将反应混合物在-20℃搅拌1h后，TLC(甲苯/乙酸乙酯7:3)显示供体5a(Rf＝0.4)完全消耗，且存在极性较小的产物(Rf＝0.6)。然后，加入三乙胺直至中和。将反应混合物在-20℃搅拌15min，然后经垫过滤。将滤液减压浓缩。通过色谱法(从硅胶柱上洗脱(环己烷/乙酸乙酯97:3至7:3))纯化残余物，得到作为黄色油状物的二糖14a(3.1g，69％)。
烯丙基3,4-O-(2’,3’-二甲氧基丁-2’,3’-二基)-α-L-鼠李吡喃糖基-(1→3)-2-O-氯乙酰基-4-O-(2-萘甲基)-α-L-鼠李吡喃糖苷(15a)
向在室温搅拌的二糖14a(1.0g，1.28mmol)在吡啶/乙酸(3:2，13mL)中的溶液中加入肼一水合物(125μL，2.57mmol，2.0当量)。将反应混合物在室温搅拌1h后，TLC追踪(甲苯/乙酸乙酯7:3)显示原料(Rf＝0.6)完全消耗，且存在紧密洗脱的产物(Rf＝0.6)。加入饱和NaHCO3水溶液(15mL)，将水层用二氯甲烷(15mL)萃取两次，将合并的有机相用盐水(15mL)洗涤一次。将有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。通过色谱法(从硅胶柱上洗脱(甲苯/乙酸乙酯9:1至7:3))纯化残余物，得到作为黄色油状物的二糖15a(0.63g，72％)。
烯丙基3,4-O-(2’,3’-二甲氧基丁-2’,3’-二基)-2-O-乙酰丙酰基-α-L-鼠李吡喃糖基-(1→2)-3,4-O-(2’,3’-二甲氧基丁-2’,3’-二基)-α-L-鼠李吡喃糖基-(1→3)-2-O-氯乙酰基-4-O-(2-萘甲基)-α-L-鼠李吡喃糖苷(16a)
向在rt搅拌的醇15a(300mg，0.44mmol)在无水乙醚(4.0mL)中的溶液中依次加入供体5(252mg，0.48mmol，1.1当量)和活化的MS(0.3g)。将反应混合物在rt搅拌15min后，将反应混合物冷却至-20℃，并在该温度再搅拌15min。然后，缓慢加入三甲基甲硅烷三氟甲磺酸酯(6.8μL，44μmol，0.1当量)。将反应混合物在-20℃搅拌2h后，TLC(甲苯/乙醚/乙酸乙酯5:4:1)显示二糖7(Rf＝0.65)完全消耗，且存在极性较小的产物(Rf＝0.7)。然后，加入三乙胺直至中和。将反应混合物在-20℃搅拌15分钟，然后经垫过滤。将滤液减压浓缩。通过色谱法(从硅胶柱上洗脱(甲苯/乙酸乙酯9:1至7:3))纯化残余物，得到作为黄色至棕色油状物的三糖16a(370mg，81％)。
ABClAcCCl3AcD-All的合成
按照以下定义的通用路线B(路线B的第一步至三糖基供体18特别地如上描述)获得ABClAcCCl3AcD-All(ABC’D’，21)。如下面更详细的方案所示，特别地用鼠李三糖基供体和单糖D受体9进行路线B的活化糖基化和最终的两步正交脱保护。在示例的合成中(R1＝R4＝Nap，R3＝R6＝TES，R2＝ClAc，R5＝Lev，R8＝All，R9＝Cl3Ac)。
还可以通过以下概述方案中定义的替代路线A获得ABClAcCCl3AcD-All。
还可以通过下面定义的替代路线B获得ABClAcCCl3AcD-All，其中保护基与上面显示的不同，所述保护基为：R1＝PMB，R3＝R4＝Nap，R6＝TES，R2＝ClAc，R5＝Lev，R8＝All，R9＝Cl3Ac。
选定的实施例
烯丙基2-O-乙酰丙酰基-4-O-(2-萘甲基)-3-O-三乙基甲硅烷基-α-L-鼠李吡喃糖基-(1→2)-4-O-(2-萘甲基)-3-O-三乙基甲硅烷基-α-L-鼠李吡喃糖基-(1→3)-2-O-氯乙酰基-4-O-(2-萘甲基)-α-L-鼠李吡喃糖基-(1→3)-4,6-O-苯亚甲基-2-脱氧-2-N-三氯乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷(20)
将含有的三糖基三氯乙酰亚胺酯18(924mg，649μmol)和D受体9(440mg，1.5当量)在甲苯/DCM(3:1，37mL)中的溶液在室温搅拌15min，然后在-15℃搅拌15min。将TBSOTf(22μL，0.15当量)加入到在-15℃搅拌的反应混合物中，并使浴槽在1.3h内达到-0℃。TLC(甲苯/EtOAc 9:1)追踪表明消耗了供体。将Et3N加入到混悬液中，将混合物经垫过滤，并将滤液浓缩至干。柱色谱法得到完全保护的ABClAcCCl3AcD四糖(20，932mg，84％)。
HRMS(ESI+):m/z 1729.6128(计算值C88H113Cl4N2O21Si2[M+NH4]+)测定值m/z1729.6161。
烯丙基α-L-鼠李吡喃糖基-(1→2)-α-L-鼠李吡喃糖基-(1→3)-2-O-氯乙酰基-α-L-鼠李吡喃糖基-(1→3)-2-脱氧-2-N-三氯乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷(21)
向在0℃搅拌的由完全保护的20的脱乙酰丙酰基化(delevulinylation)获得的醇(222mg，137μmol)在甲苯中的溶液中加入TFA，使TFA/甲苯比例达到9:1。将反应混合物搅拌过夜，此时TLC追踪表明起始四糖完全消耗，且存在主要的极性较大的产物。将挥发物与甲苯共蒸发两次，然后与乙腈共蒸发一次，最后与甲醇共蒸发一次。先后通过反相快速色谱法(H2O/MeCN 0→50％)和RP-HPLC(MeCN/H2O 20.5％)纯化粗品，冷冻干燥后得到目标ABClAcCCl3ACD-All 21(70mg，36％)。RP-HPLC(RP fusion(4.6x250mm，4.0μm，CH3CN在H2O中(30％持续4min，然后在7min内30→40％，1.0mL.min-1)，40℃，λ:220nm)＝7.6min。
1H NMR(800MHz,D2O),δ5.84(m,1H,-CH＝),5.25(m,1H,Jtrans＝17.3Hz,＝CH2),5.19(m,1H,Jcis＝10.5Hz,＝CH2),5.13(dd,1H,J2,3＝3.0Hz,J2,1＝1.9Hz,H-2C),5.11(d,1H,J1,2＝1.3Hz,H-1B),4.86(d,1H,J1,2＝1.6Hz,H-1C),4.86(d,1H,J1,2＝1.5Hz,H-1A),4.66(d,1H,J1,2＝8.0Hz,H-1D),4.28(m,1H,HAll),4.27(d,1H,Jgem＝15.4Hz,HClAc),4.23(d,1H,Jgem＝15.4Hz,HClAc),4.12(m,1H,HAll),4.05(m,1H,H-5C),3.99(dd,1H,J2,3＝3.3Hz,J2,1＝1.7Hz,H-2A),3.93(dd,1H,J3,4＝9.7Hz,J3,2＝3.1Hz,H-3C),3.89(dd,1H,J2,3＝4.7Hz,J2,1＝1.7Hz,H-2B),3.88(d,1H,J6,5＝2.1Hz,H-6bD),3.86(m,1H,H-2D),3.72(m,2H,H-3D,H-3A),3.71(d,1H,J6,5＝3.3Hz,H-6aD),3.69(m,1H,H-5B),3.63(dd,1H,J3,4＝9.9Hz,J3,2＝3.5Hz,H-3B),3.62(m,1H,H-5A),3.54(dd,1H,J4,5＝9.9Hz,J4,3＝9.9Hz,H-4D),3.52(dd,1H,J4,5＝9.8Hz,J4,3＝9.8Hz,H-4C),3.42(m,1H,H-5D),3.38(dd,1H,J4,5＝9.8Hz,J4,3＝9.8Hz,H-4B),3.37(dd,1H,J4,5＝9.8Hz,J4,3＝9.8Hz,H-4A),1.25(d,3H,J6,5＝6.2Hz,H-6B),1.20(d,3H,J6,5＝6.4Hz,H-6A),1.19(d,3H,J6,5＝6.4Hz,H-6C)。
13C NMR(800MHz,D2O),δ168.6(COClAc),133.0(CH＝All),118.7(＝CH2All),102.3(C-1A),100.5(C-1B),99.1(C-1D),98.5(C-1C),91.6(CCl3),81.7(C-3D),78.0(C-2B),76.1(C-5D),74.5(C-3C),73.4(C-2C),72.2(C-4C),72.0(2C,C-4B,C-4A),70.8(-CH2-All),70.0(2C,C-3A,C-2A),69.9(C-3B),69.5(C-5B),69.2(C-5C),69.1(C-5A),68.5(C-4D),60.7(C-6D),57.1(C-2D),40.7(-CH2-ClAc),16.7(C-6B),16.6(C-6A),16.2(C-6C)。
HRMS(ESI+):m/z 895.1840(计算值C31H47Cl4NO19NH4[M+NH4]+)测定值m/z895.1860。
烯丙基α-L-鼠李吡喃糖基-(1→2)-α-L-鼠李吡喃糖基-(1→3)-2-O-氯乙酰基-α-L-鼠李吡喃糖基-(1→3)-2-脱氧-2-N-三氯乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷(21a)
向轻度保护的(lightly protected)四糖ABClAcCCl3ACD-All(21，200mg，0.23mmol)在无水甲醇(31mL)中的溶液中加入MeONa(25％w/w在MeOH中，126μL，0.55mmol，2.4当量)。将反应混合物搅拌3h后，TLC追踪(环己烷/乙酸乙酯8:2)显示原料(Rf＝0.15)完全消耗。然后加入Dowex H+直至中和并滤出，减压蒸发挥发物。通过反相色谱法(从C18柱上洗脱(水/MeCN 1:0至6:4))纯化残余物，冻干后得到作为白色粉末的四糖ABCCl3ACD-All 21a(76mg，42％)。RP-HPLC(RP fusion(4.6x250mm，4.0μm，CH3CN在H2O中(30％持续4min，然后在7min内30→40％，1.0mL.min-1)，40℃，λ:220nm)＝3.8min。
HRMS(ESI+):m/z 819.2124(计算值C30H46Cl3NO18NH4[M+NH4]+)测定值m/z819.2745；m/z 824.1618(计算值C30H46Cl3NO18Na[M+Na]+)测定值m/z 824.2239.
替代的B供体(25)的合成
烯丙基3,4-二-O-(2-萘甲基)-α-L-鼠李吡喃糖苷(22)
将二丁基氧化锡(4.0g，1.1当量)加入到二醇1(5.0g，15.0mmol)在无水甲苯(100mL)中的溶液中。使用Dean-Stark装置将混合物在回流下搅拌2h。在冷却至rt后，依次加入干燥的CsF(2.2g，1.0当量)、干燥的碘化四丁基铵(6.97g，1.3当量)和2-萘基甲基溴(3.54g，1.1当量)。在60℃加热过夜后，TLC对照(甲苯/EtOAc 8:2)显示起始二醇1完全消耗。在冷却至0℃后，通过在垫上过滤去除盐，并减压蒸发溶剂。通过快速色谱法纯化粗产物，得到作为棕色油状物的醇22(5.02g，69％)。
1H NMR(CDCl3)δ7.81(m,8H,HArNap),7.50(m,6H,HArNap),5.93(m,1H,Jtrans＝17.1Hz,Jgem＝1.5Hz,CH＝CH2),5.31(m,1H,Jcis＝10.4Hz,CH＝CH2),5.22(m,1H,CH＝CH2),5.10(d,3H,J＝11.2Hz,CH2Nap),4.91(m,2H,CH2Nap,H-1),4.21(m,1H,HAll),4.16(m,1H,H-2),4.02(m,2H,HAll,H-3),3.85(m,1H,H-5),3.60(pt,1H,J3,4＝J4,5＝9.3Hz,H-4),2.58(bs,1H,J2,OH＝9.6Hz,OH),1.40(d,3H,J5,6＝6.3Hz,H-6)。
HRMS(ESI+):m/z 502.2608(计算值C31H36O5N[M+NH4]+m/z 502.2593)。
烯丙基2-O-乙酰丙酰基-3,4-二-O-(2-萘甲基)-α-L-鼠李吡喃糖苷(23)
向在室温搅拌的醇22(5.02g，9.0mmol)在无水DCM(42mL)中的溶液中依次加入DCC(3.16g，1.7当量)、DMAP(440mg，0.4当量)和乙酰丙酸(1.94mL，4.2当量)。将反应混合物在室温搅拌过夜后，TLC(甲苯/EtOAc 7:3)显示原料完全消耗。将反应混合物经垫过滤，并减压蒸发挥发物。将粗品溶解于乙酸乙酯(50mL)中，并将有机层用10％硫酸铜(II)水溶液(30mL)、水(30mL)、饱和碳酸氢钠水溶液(30mL)和盐水(30mL)洗涤三次。将有机层经无水硫酸钠搅拌干燥，过滤并真空浓缩。粗品原样用于下一步。
2-O-乙酰丙酰基-3,4-二-O-(2-萘甲基)-α-L-鼠李吡喃糖(24)
向在室温搅拌的完全保护的23(来自22，9.0mmol)在无水THF(50mL)中的溶液中加入在无水THF(10mL)中的氢活化的[Ir](152mg，0.02当量)。将反应混合物在室温搅拌2小时后，再加入0.02当量的氢活化的[Ir]，并将反应混合物在室温搅拌过夜。TLC(环己烷/EtOAc6:4)显示起始的烯丙基鼠李糖苷已被消耗。在水/THF(1:5，72mL)中的碘(2.74g，1.2当量)。将反应混合物在该温度搅拌1h后，TLC(环己烷/EtOAc 6:4)显示中间体完全转化为极性较大的产物。加入10％焦亚硫酸钠水溶液。减压蒸发THF，并加入DCM(50mL)。将水层用DCM(30mL)萃取两次，并先后用饱和碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤合并的有机相。将有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。粗品原样用于下一步。
2-O-乙酰丙酰基-3,4-二-O-(2-萘甲基)-α-L-鼠李吡喃糖三氯乙酰亚胺酯(25)
向在室温搅拌的半缩醛24(来自22，9.0mmol)在无水DCE(50mL)中的溶液中依次加入Cl3CCN(2.7mL，3.0当量)和DBU(670μL，0.5当量)。将反应混合物在室温搅拌2h后，TLC(甲苯/EtOAc 7:3)显示原料完全消耗。减压蒸发挥发物。通过色谱法(从经Et3N处理的硅胶柱上洗脱(甲苯/EtOAc 95:5至8:2，含有5‰Et3N))纯化残余物，得到作为棕色油状物的供体25(5.05g，三步88％)。
1H NMR(CDCl3)δ8.67(s,1H,NH),7.81(m,8H,HArNap),7.49(m,6H,HArNap),6.22(d,1H,H-1),5.56(dd,1H,J1,2＝2.1Hz,J2,3＝3.3Hz,H-2),5.14(d,1H,J＝11.1Hz,CH2Nap),4.92(d,1H,J＝11.4Hz,CH2Nap),4.87(d,1H,CH2Nap),4.77(d,1H,CH2Nap),4.10(dd,1H,H-3),4.00(m,1H,H-5),3.62(pt,1H,J3,4＝J4,5＝9.5Hz,H-4),2.78(m,4H,CH2Lev),2.18(s,3H,CH3Lev),1.40(d,3H,J5,6＝6.2Hz,H-6)。
13C NMR(CDCl3)δ206.0(COLev),171.9(CO2Lev),160.1(NHCO),135.6-133.2(6C,CIV),128.2-126.1(14C,CArNap),95.2(C-1,1JC-H＝179.5Hz),79.4(C-4),77.1(C-3),75.7(CNap),72.0(CNap),70.8(C-5),67.9(C-2),38.0(CH2Lev),29.8(CH3Lev),28.1(CH2Lev),18.1(C-6)。
HRMS(ESI+):m/z 703.1744(计算值C35H38Cl3NO7[M+NH4]+m/z 703.1749)。
替代的C受体(28)的合成
烯丙基4-O-对甲氧基苄基-α-L-鼠李吡喃糖苷(27)
在氩气中，将粗烯丙基2,3-O-异亚丙基-α-L-鼠李吡喃糖苷(26，来自L-鼠李糖，110mmol)溶解于DMF(320mL)中，将浴温冷却至-5℃，并将NaH(60％油分散体，10.6g，2.4当量)分批加入该混悬液中。将混合物在rt搅拌2h，然后在-5℃滴加对甲氧基苄基氯(17.9mL，1.2当量)，并将反应混合物在rt搅拌过夜。TLC追踪(甲苯/EtOAc 8:2)表明中间体醇完全转化为极性较小的产物。通过在0℃加入MeOH(20mL)淬灭反应。减压去除溶剂，并将挥发物与甲苯共蒸发。将残余物溶解在EtOAc(200mL)中，并用H2O(3×120mL)和盐水(120mL)洗涤。将有机相用无水Na2SO4干燥，过滤，并浓缩至干，得到完全保护的中间体。
将粗中间体溶解于80％AcOH水溶液(200mL)中，并将溶液在60℃搅拌3d。TLC追踪(甲苯/EtOAc 7:3)表明中间体缩醛完全转化为极性较大的产物。在真空下去除溶剂，并通过与环己烷(2x 100mL)共蒸发去除痕量的AcOH，得到棕色固体。用环己烷结晶，并将母液进行柱色谱法(用甲苯/EtOAc 8:2至6:4洗脱)，得到二醇28(27.9g，四步78％)，m.p.＝72℃(环己烷)。
1H NMR(CDCl3)δ7.30(m,2H,HArPMB),6.91(m,2H,HArPMB),5.89(m,1H,CH＝CH2),5.29(m,1H,Jtrans＝17,2Hz,Jgem＝1.6Hz,CH＝CH2),5.20(m,1H,Jtrans＝10.4Hz,CH＝CH2),4.81(d,1H,J1,2＝1.1Hz,H-1),4.69(m,2H,CH2PMB),4.17(m,1H,HAll),3.97(m,3H,H-All,H-2,H-3),3.82(s,3H,CH3PMB),3.75(m,1H,H-5),3.35(pt,1H,J3,4＝J4,5＝9.2Hz,H-4),2.45(bs,2H,OH),1.36(d,3H,J5,6＝6.3Hz,H-6)。
烯丙基2-O-氯乙酰基-4-O-对甲氧基苄基-α-L-鼠李吡喃糖苷(28)
将二醇27(1.0g，3.0mmol)溶解在无水乙腈(MeCN，5mL)中。向溶液中加入氯代原乙酸三甲酯(1.39mL，3.0当量)和APTS(59mg，0.1当量)。将溶液在室温搅拌1小时(反应经TLC甲苯/EtOAc 7:3追踪)。向冷却至0℃的反应介质中加入90％TFA水溶液(2.0mL)，并将反应混合物在室温搅拌10min。加入水直至混合物完全浑浊。用DCM(2×25mL)萃取产物。用饱和NaHCO3水溶液(2×25mL)和盐水(25mL)洗涤有机相。用DCM(2×12.5mL)萃取水相。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤，蒸发，最后与甲苯共蒸发，得到作为区域异构体混合物的醇28。粗品原样用于下一步。
Cl3AcDABClAcC-All的合成
按照下面定义的路线B’获得Cl3AcDABClAcC-All。
特别地，其可以由供体12或其4,6-O-苯亚甲基类似物和在完全保护的前体16的2A位置处常规脱乙酰丙酰基化后的ABC三糖苷受体29获得。以下方案突出显示了合成，其中R1＝R4＝Nap，R3＝R6＝TES，R2＝ClAc，R5＝Lev，R7＝TBS，R8＝All，R9＝Cl3Ac。
烯丙基4,6-O-苯亚甲基-3-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2-脱氧-2-三氯乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-4-O-(2-萘甲基)-α-L-鼠李吡喃糖基-(1→2)-4-O-(2-萘甲基)-α-L-鼠李吡喃糖基-(1→3)-2-O-氯乙酰基-4-O-(2-萘甲基)-α-L-鼠李吡喃糖苷(32)和烯丙基4,6-O-苯亚甲基-2-脱氧-2-三氯乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-4-O-(2-萘甲基)-α-L-鼠李吡喃糖基-(1→2)-4-O-(2-萘甲基)-α-L-鼠李吡喃糖基-(1→3)-2-O-氯乙酰基-4-O-(2-萘甲基)-α-L-鼠李吡喃糖苷(31)
向粗四糖30(1.48mmol)在THF/AcOH(4:1，74mL)中的溶液中缓慢加入在THF中的1MTBAF(14.8mL，14.8mmol，10.0当量)。将反应混合物在rt搅拌过夜后，加入TBAF(1M的THF溶液，14.8mL，14.8mmol，10.0当量)和AcOH(14.8mL)。将反应混合物在rt搅拌2天后，TLC追踪(环己烷/乙酸乙酯7:3)显示存在产物的复杂混合物(Rf＝0.05、0.25、0.35、0.45和0.55)。加入蒸馏水(20mL)和甲苯(50mL)。用饱和NaHCO3水溶液(20mL)和盐水(20mL)洗涤有机层。将有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，并在真空下与甲苯共蒸发。通过色谱法(从硅胶柱上洗脱(甲苯/乙酸乙酯95:5至4:6))纯化残余物，以洗脱顺序得到二醇32(820mg，37％)和三醇31(334mg，16％)。
烯丙基2-脱氧-2-三氯乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-α-L-鼠李吡喃糖基-(1→2)-α-L-鼠李吡喃糖基-(1→3)-2-O-氯乙酰基-α-L-鼠李吡喃糖苷(33)
将四糖31(334mg，0.24mmol)在三氟乙酸/1,1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(9:1，3.0mL)中的溶液在rt搅拌2h。加入甲苯(10mL)，蒸发挥发物，并在减压下与甲苯共蒸发(五次)。将残余物溶解于水(10mL)和二氯甲烷(5mL)中。用水(10mL)洗涤有机相，并将水相冷冻干燥并冻干。通过反相色谱法(从C18柱上洗脱(H2O/MeCN 0→40％))纯化残余物，得到作为白色粉末的轻度保护的四糖D’ABC’-All(33)(74mg，35％)。RP-HPLC(RP fusion(4.6x250mm，4.0μm，CH3CN在H2O中(30％持续4min，然后在7min内30→40％，1.0mL.min-1)，40℃，λ:220nm)＝10.2min。
HRMS(ESI+):m/z 900.1394(计算值C31H47Cl4NO19Na[M+Na]+)测定值m/z 900.1246。
实施例2：用支链蔗糖酶的式(I)化合物的酶促α-D-葡萄糖基化酶
表1显示在本发明的上下文中使用的一些酶。
*突变是相对于GBD-CD2野生型的序列给出的。
所述酶的序列如下：
SEQ ID NO:1(BRS-E)
SEQ ID NO:2(BRS-A)
SEQ ID NO:3(BRS-B-D1)
SEQ ID NO:4(BRS-B-D2)
SEQ ID NO:5(BRS-C)
SEQ ID NO:6(BRS-D)
SEQ ID NO:7(GBD-CD2)。
表2显示在本发明的上下文中使用的BRS-B-D2的一些突变体。
brsE基因的分离
通过对GH70α-转葡糖基酶编码基因数据库进行核苷酸BLAST，在肠系膜明串珠菌KFRI-MG基因组(NCBI参考序列：CP000574)中鉴定brsE基因。以GenBank登录号AHF19404.1保藏BRS-E的蛋白质序列。
BRS-E在大肠杆菌(E.coli)中的重组表达
为了优化在大肠杆菌(Biomatik，Cambridge，ON，加拿大)中的表达，设计了合成的brsE基因，并将其克隆在pET28b载体中。
然后，使用正向引物5’-atgggctacaaggccgg-3’和反向引物5’-accataataatacaccttattatcggc-3’，由pET28b/BrsE质粒DNA模板通过PCR扩增基因。然后，将PCR产物插入pENTR/D-TOPO载体(Life Technologies)中。用pET-55-DEST目的载体(Merck Millipore)由阳性入门克隆进行LR重组(Gateway LR Clonase II酶混合物，LifeTechnologies)。在补充有100μg ml-1氨苄青霉素的LB琼脂平板上选择表达克隆。然后，使用GenElute HP质粒Miniprep试剂盒(Sigma-Aldrich)提取质粒，通过限制性分析验证并测序(GATC Biotech)。使用大肠杆菌TOP10感受态细胞(Life Technologies)用于所有克隆实验。
对于酶生成，通过55/brsE新鲜转化大肠杆菌BL21*DE3细胞。向补充有氨苄青霉素(100μg mL-1)的20毫升LB介质中接种100μL转化混合物，并在搅拌(200rpm)下在37℃孵育过夜。然后，将含有改良的ZYM5052介质和100μgmL氨苄青霉素、0.1％乳糖、0％葡萄糖和1％甘油的爱伦美氏烧瓶培养物在0.05的OD600nm下接种起始培养物。在搅拌(150rpm)下于21℃孵育培养物。孵育26小时后，通过离心收集细胞，以80的最终OD600nm分散在50mM乙酸钠缓冲液(pH 5.75)中，并通过超声破碎。将粗细胞提取物离心(11,000g，30min，8℃)后，在可溶性级分中回收重组酶。
酶生成
先前描述了在用于大肠杆菌细胞中异源表达的可诱导载体(pET53、pET55或pBAD49，Life Technologies)中克隆分支蔗糖酶基因(Vuillemin等人,J Biol Chem.2016；291(14):7687-702)。分别通过pET53-55/brsBΔ2、brsC、brsD、brsE和pBAD49/brsA新鲜转化大肠杆菌BL21*DE3和大肠杆菌BL21 AI细胞。向补充有氨苄青霉素(100μg mL-1)的20毫升LB介质中接种100μL转化混合物，并在搅拌(200rpm)下在37℃孵育过夜。
在具有改良ZYM5052介质的爱伦美氏烧瓶中进行酶生成，所述介质含有：i)对于BRS-A生成，0％乳糖、0％葡萄糖、0.5％甘油和0.01％L-阿拉伯糖，ii)对于BRS-B-Δ2、BRS-C、BRS-D、BRS-E生成，0.1％乳糖、0％葡萄糖和1％甘油或者iii)对于GBD-CD2(野生型和突变体)生成，0.75％乳糖、0.05％葡萄糖和1.5％甘油。所有培养介质均补充有氨苄西林(100μg mL-1)，并在OD600nm为0.05时接种相应的起始培养物。将培养物在搅拌(150rpm)下于21℃或23℃孵育。孵育26小时后，通过离心收集细胞，在最终OD600nm为80时(对于BRS-A、BRS-B-Δ2、BRS-C、BRS-D、BRS-E)或在OD600nm为30时(对于GBD-CD2和突变体)将其分散在50mM乙酸钠缓冲液(pH 5.75)中。将细胞通过超声破碎。将粗细胞提取物离心(11,000g，30min，8℃)后，在可溶性级分中回收重组酶。
通过亲和色谱法纯化酶
产生的重组酶是与6xHis标签融合的，其允许通过亲和色谱法纯化。为了该目的，将细胞离心，并在最终OD600nm为200时(对于BRS-B生成)或在最终OD600nm为30时(对于GBD-CD2和突变体生成)重悬结合缓冲液(20mM磷酸钠缓冲液，pH 7.4，500mM NaCl，20mM咪唑，2.5％(v/v)甘油)中。在通过超声破碎，离心(18,000g，30min，4℃)并通过0.22μm滤芯过滤后，使用AKTAXpress系统(GE Healthcare)，将裂解液在10℃应用到已用结合缓冲液平衡的1ml HisTrap柱上。在25分钟内用10至500mM的咪唑梯度洗脱蛋白质。将3mL洗脱液级分用具有100mM NaCl的pH 5.75的50mM乙酸钠缓冲液在10-DG柱(Biorad，Hercules，CA，美国)上脱盐，或者通过在Superose12树脂上的凝胶过滤进行第二轮纯化。
酶活性分析
一单位分支蔗糖酶(野生型和突变体)被定义为在30℃，在50mM乙酸钠缓冲液中，在pH 5.1或pH 5.75(取决于酶)，由292mM蔗糖每分钟催化产生一微摩尔果糖的酶的量。通过使用二硝基水杨酸(DNS)方法测量还原糖的量来确定酶的活性(G.L.Miller,Anal.Chem.1959,31,426–428)。
使用分支蔗糖酶的四糖的葡萄糖基化
在20至37℃的温度，在50mM乙酸钠缓冲液(pH 5.0至6.0)中进行转葡萄糖基化分析，所述缓冲液补充有0.05至5U.mL-1酶、50mM至1M蔗糖和10mM至100mM式(Ia)的四糖，特别是ABClAcCCl3AcD-All(也被称为ABC’D’)。将反应在玻璃管中孵育8至24h。
具体地，在以下条件下产生五糖：
特别地通过BRS-B-Δ2在500μL规模的反应中产生五糖1(P1)，使用200μL ABC’D’受体制剂(110g.L-1)，206μL蔗糖(830g.L-1)，50μL乙酸钠缓冲液(500mM，pH 5.1)，9.62μL纯化酶BRS-B-Δ2(52U/mL)和H2O(至500μL)。
特别地通过GBD-CD2 F2163G在2mL规模的反应中产生五糖2(P2)和2’(2’)，使用800μL ABC’D’受体制剂(110g.L-1)，823μL蔗糖(830g.L-1)，200μL乙酸钠缓冲液(500mM，pH5.1)，130.7μL纯化酶GBD-CD2 F2163G(15.3U/mL)和H2O(至2mL)。
特别地通过GBD-CD2 W2135S-F2136L或GBD-CD2 W2135I-F2136C在2mL规模的反应中产生五糖3(P3)，使用800μL ABC’D’受体制剂(110g.L-1)，823μL蔗糖(830g.L-1)，200μL乙酸钠缓冲液(500mM，pH 5.1)，130.7μL纯化酶(15.3U/mL)和H2O(至2mL)。
分离、检测和纯化感兴趣的化合物的方法：
通过HPLC-MS(高效液相色谱与质谱联用)，使用C18RP Fusion(4μm,250x4.6mm)分析柱测定残余ABC’D’受体和葡萄糖基化产物(五糖P1和P2、P2’和P3)的存在，所述分析柱置于40℃的烘箱中，并以1mL.min-1的流速，用70:30至60:40的20分钟H2O/乙腈梯度洗脱。将反应介质在H2O/乙腈(70:30，v/v)+0.08％三氟乙酸(TFA)中稀释10倍，然后进样20μL样品。在220nm波长进行UV检测。通过质谱，在正负模式下用0.5s的全扫描(m/z 200-1950)测定不同化合物的质量。将针设置为3.5kV，锥体(cone)设置为60V，并且探针温度保持在450℃。
在20min的分离过程中，通过在Agilent 1260 Infinity HPLC上自动分级来纯化五糖P1、P2、P2’和P3(与上述方法相同)。如果需要，进行多轮纯化。收集通过UV-RI峰检测到的产物，并通过HPLC重新分析。合并含有单峰产物的级分，使用SpeedVac浓缩至干，然后在D2O中交换以用于NMR分析。
用于五糖结构阐明的NMR分析：
将样品溶解于pH 4.9的含DC1的D2O中。对于NMR研究，将样品冻干三次，并溶解在180μL的99.9％含DC1的D2O中。
在Bruker Avance光谱仪上记录所有NMR谱，其中质子频率为950MHz，碳频率为238MHz，具有5-mm梯度间接冷冻探针。用Topspin软件(Bruker)处理和分析所有光谱。
在30℃时累加1H和13C 1D NMR光谱，分别通过32和2048次扫描获得65536个数据点用于质子和碳实验。
在30℃时进行1H-13C HSQC(异核单量子相干光谱法)、HMBC(异核单量子相干光谱法)和双量子滤波相关光谱法Y(QDF COSY)实验。在以下实验条件下记录同核和异核光谱：通过累加16次扫描获得2048个复点(complex point)的512个增量(increment)。对于质子尺寸，光谱宽度为16025Hz，对于碳尺寸，光谱宽度为44267Hz。
结果
通过NMR光谱法(950MHz)确定五糖P1的结构，揭示了D’的α-1,6葡萄糖基化，其为弗氏志贺菌血清型4a的特征。
通过NMR光谱法(950MHz)确定五糖P2的结构，揭示了A的α-1,3葡萄糖基化，其为弗氏志贺菌血清型3a的特征。
通过NMR光谱法(950MHz)确定五糖P2’和P3的结构，分别揭示了残基A的α-1,4葡萄糖基化和残基B的α-1,4葡萄糖基化。
Claims (21)
1.一种下式(I)化合物：
(Cl3AcD)xABZC(Cl3AcD)y-All(I)
其中：
x和y为0或1，条件是x+y＝1；
A为2)-α-L-Rhap-(1→；
B为2)-α-L-Rhap-(1→；
C为3)-α-L-Rhap-(1→；
D为3)-α-D-GlcpN-(1→或3)-β-D-GlcpN-(1→；
Z为ClAc、BrAc、Ac或
All为烯丙基；
Cl3Ac为Cl3C-C(O)-；
ClAc为ClCH2-C(O)-；
BrAc为BrCH2-C(O)-。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中：
-Cl3Ac位于2D位置，
-Z位于2C位置，和/或
-当x＝1时，All位于1C位置，或当y＝1时，All位于1D位置。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中x为0且y为1，其对应于下式(Ia)：
ABZCCl3AcD-All(Ia)。
4.根据权利要求1所述的化合物，其为下式：
5.根据权利要求1所述的化合物，其中x为1且y为0，其对应于下式(Ib)：
Cl3AcDABZC-All(Ib)。
6.根据权利要求1所述的化合物，其为下式：
7.一种制备根据权利要求1所述的化合物的方法，其包括以下步骤：
(i)将受保护的ABZC-三糖基供体与受保护的TD-R受体接触以获得受保护的ABZCTD-R化合物的步骤；
(ii)将在步骤(i)中获得的受保护的化合物脱保护以获得式ABZCTD-R的化合物的一个或多个步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，其中ABZC-三糖基供体为式ABZC-Z’，其中Z’为PTFA或TCA，PTFA表示N-苯基三氟乙酰亚氨基，TCA表示三氯乙酰亚氨基。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中受保护的ABZC-三糖基供体为下式之一：
其中：
TES为三乙基甲硅烷基；
Lev为乙酰丙酰基；
Nap为2-萘甲基；
PMB为对甲氧基苄基；
至少一个TES基团或每个TES基团任选独立地被选自TBS(叔丁基二甲基甲硅烷基)、TIPS(三异丙基甲硅烷基)、PMB、Nap和Lev的基团替代；
至少一个Nap基团或每个Nap基团任选独立地被选自TBS、TIPS和PMB的基团替代。
10.根据权利要求7所述的方法，其中受保护的Cl3AcD-All受体为下式：
11.根据权利要求7所述的方法，其中受保护的ABZCCl3AcD-All化合物为下式之一：
至少一个TES基团或每个TES基团任选独立地被选自TBS、TIPS、PMB和Nap的基团替代；
至少一个Nap基团或每个Nap基团任选独立地被选自TBS、TIPS和PMB的基团替代。
12.一种制备根据权利要求1所述的化合物的方法，其包括以下步骤：
(i)将受保护的ABZC-R受体与受保护的TD供体接触以获得受保护的TDABZC-R化合物的步骤；
(ii)将在步骤(i)中获得的受保护的化合物脱保护以获得式TDABZC-R的化合物的一个或多个步骤。
13.根据权利要求12所述的方法，其中ABZC-All受体为下式之一：
其中：
TES为三乙基甲硅烷基；
PMB为对甲氧基苄基；
至少一个TES基团或每个TES基团任选独立地被选自TBS、TIPS、PMB和Nap的基团替代；
至少一个Nap基团或每个Nap基团任选独立地被选自TBS、TIPS和PMB的基团替代。
14.根据权利要求12所述的方法，其中Cl3AcD供体为式Cl3AcD-Z’，其中Z’为PTFA或TCA，PTFA表示N-苯基三氟乙酰亚氨基，TCA表示三氯乙酰亚氨基。
15.根据权利要求12所述的方法，其中受保护的Cl3AcD供体为下式之一或相应的噁唑啉：
16.一种制备糖的方法，其包括以下步骤：
(i)通过蔗糖活性酶将根据权利要求1所述的式(I)化合物α-D-葡萄糖基化以获得α-D-葡萄糖基化的(TD)xABZC(TD)y-R化合物的步骤，所述蔗糖活性酶选自GH13家族的酶、GH70家族的酶、其变体、所述酶或变体的肽片段，以及来源于所述酶、变体或片段的修饰的酶/肽；
(ii)任选地，并且特别地当y为1时，将3A位置和/或6D位置乙酰化以获得3A-和/或6D-O-乙酰化的化合物的步骤；
(iii)任选地，裂解由C所携带的ClAc或BrAc保护基以获得2C-羟基化的化合物的步骤；
(iv)任选地，(a)将C所携带的ClAc或BrAc保护基转化为乙酰基(Ac)，(b)将D所携带的Cl3Ac掩蔽基团转化为乙酰基(Ac)，(c)将D所携带的烯丙基保护基转化为丙基(Pr)部分，然后如果需要，将2C位置脱-O-酰化，以获得2C-酰化的或2C-羟基化的化合物的步骤；
(v)任选地，由如上面所定义的式(I)化合物的酶促α-D-葡萄糖基化产生的化合物的一个或两个末端的链延长的步骤。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述糖为来自弗氏志贺菌的O-抗原的片段，特别是血清型1a、1b、2a、2b、3a、X、4a、4b、5a、5b、7a或7b。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述糖包含以下片段之一：
-[((E1→2)a’(E1→4)a(M)b AcD)x(L)c(E1→4)c’A(E1→3)d(E1→4)d’B(E1→4)e(Ac)zC((E1→2)a’(E1→4)a(M)b AcD)y]n-
-[((E1→2)a’(E1→4)a(M)b AcD)x(L)c(E1→4)c’A(E1→3)d(E1→4)d’B(E1→4)e(Ac)zC((E1→2)a’(E1→4)a(M)b AcD)y]n-All
-[((E1→2)a’(E1→4)a(M)b AcD)x(L)c(E1→4)c’A(E1→3)d(E1→4)d’B(E1→4)e(Ac)zC((E1→2)a’(E1→4)a(M)b AcD)y]n-Pr
其中：
L为E1→3或在3A位置的Ac；
M为E1→6或在6D位置的Ac；
a为0或1；
a’为：
-当a为1时，0或1；
-当a为0时，0；
e为0或1；
c’为0或1；
d和d’为0或1，条件是d+d’＝0或1；
当L为Ac时，c在每次出现时独立地为0或1，特别地c在所有出现时均为0或1，条件是c+c’＝0或1；
当L为E1→3时，c为0或1，条件是c+c’＝0或1；
当M为Ac时，b在每次出现时独立地为0或1，特别地b在所有出现时均为0或1，条件是a+b＝0或1；
当M为E1→6时，b为0或1，条件是a+b＝0或1；
a、b、c、c’、d、d’和e特别地为例如a+b+c+c’+d+d’+e＝1、2或3；
z在每次出现时独立地为0或1，特别地z在所有出现时均为0或1；
E表示α-D-Glcp-残基；
n为大于或等于1的整数，特别地为1至10；
All为烯丙基；
Pr为丙基。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述糖包含以下片段：
-[AB(Ac)zC(E1→6)AcD]n-，或
-[(E1→3)AB(Ac)zCAcD]n-，或
-[(E1→4)AB(Ac)zCAcD]n-，或
-[A(E1→4)B(Ac)zCAcD]n-。
20.一种下式之一的化合物：
((E1→2)a’(E1→4)a(E1→6)bCl3AcD)x(E1→3)c(E1→4)c’A(E1→3)d(E1→4)d’B(E1→4)eClAcC((E1→2)a’(E1→4)a(E1→6b)Cl3AcD)y-All；
((E1→2)a’(E1→4)a(E1→6)bCl3AcD)x(E1→3)c(E1→4)c’A(E1→3)d(E1→4)d’B(E1→4)eC((E1→2)a’(E1→4)a(E1→6)b Cl3AcD)y-All；
((E1→2)a’(E1→4)a(E1→6)bCl3AcD)x(E1→3)c(E1→4)c’A(E1→3)d(E1→4)d’B(E1→4)eAcC((E1→2)a’(E1→4)a(E1→6)b Cl3AcD)y-All；
((E1→2)a’(E1→4)a(E1→6)bCl3AcD)x(E1→3)c(E1→4)c’A(E1→3)d(E1→4)d’B(E1→4)eAcC((E1→2)a’(E1→4)a(E1→6)b Cl3AcD)y；
((E1→2)a’(E1→4)a(E1→6)bCl3AcD)x(E1→3)c(E1→4)c’A(E1→3)d(E1→4)d’B(E1→4)eClAcC((E1→2)a’(E1→4)a(E1→6)b Cl3AcD)y；
((E1→2)a’(E1→4)a(E1→6)bCl3AcD)x(E1→3)c(E1→4)c’A(E1→3)d(E1→4)d’B(E1→4)eC((E1→2)a’(E1→4)a(E1→6)b Cl3AcD)y；
((E1→4)a(E1→6)bCl3AcD)x(E1→3)c(E1→4)c’A(E1→3)d(E1→4)d’B(E1→4)eClAcC((E1→4)a(E1→6b)Cl3AcD)y-All；
((E1→4)a(E1→6)bCl3AcD)x(E1→3)c(E1→4)c’A(E1→3)d(E1→4)d’B(E1→4)eC((E1→4)a(E1→6)b Cl3AcD)y-All；
((E1→4)a(E1→6)bCl3AcD)x(E1→3)c(E1→4)c’A(E1→3)d(E1→4)d’B(E1→4)eAcC((E1→4)a(E1→6)b Cl3AcD)y-All；
((E1→4)a(E1→6)bCl3AcD)x(E1→3)c(E1→4)c’A(E1→3)d(E1→4)d’B(E1→4)eAcC((E1→4)a(E1→6)b Cl3AcD)y；
((E1→4)a(E1→6)bCl3AcD)x(E1→3)c(E1→4)c’A(E1→3)d(E1→4)d’B(E1→4)eClAcC((E1→4)a(E1→6)b Cl3AcD)y；
((E1→4)a(E1→6)bCl3AcD)x(E1→3)c(E1→4)c’A(E1→3)d(E1→4)d’B(E1→4)eC((E1→4)a(E1→6)b Cl3AcD)y；
((E1→4)a(E1→6)bCl3AcD)x(E1→3)c A(E1→3)d B(E1→4)eClAcC((E1→4)a(E1→6)bCl3AcD)y-All；
((E1→4)a(E1→6)bCl3AcD)x(E1→3)c A(E1→3)d B(E1→4)e C((E1→4)a(E1→6)bCl3AcD)y-All；
((E1→4)a(E1→6)bCl3AcD)x(E1→3)c A(E1→3)d B(E1→4)eAcC((E1→4)a(E1→6)bCl3AcD)y-All；
((E1→4)a(E1→6)bCl3AcD)x(E1→3)c A(E1→3)d B(E1→4)eAcC((E1→4)a(E1→6)bCl3AcD)y；
((E1→4)a(E1→6)bCl3AcD)x(E1→3)c A(E1→3)d B(E1→4)eClAcC((E1→4)a(E1→6)bCl3AcD)y；
((E1→4)a(E1→6)b Cl3AcD)x(E1→3)c A(E1→3)d B(E1→4)e C((E1→4)a(E1→6)b Cl3AcD)y；
ABClAcC(E1→6)Cl3AcD-All；
ABC(E1→6)Cl3AcD-All；
ABClAcC(E1→6)Cl3AcD；
ABAcC(E1→6)Cl3AcD-All；
ABAcC(E1→6)Cl3AcD；
ABC(E1→6)Cl3AcD；
(E1→3)ABClAcCCl3AcD-All；
(E1→3)ABCCl3AcD-All；
(E1→3)ABAcCCl3AcD-All；
(E1→3)ABAcCCl3AcD；
(E1→3)ABClAcCCl3AcD；
(E1→3)ABCCl3AcD；
(E1→4)ABClAcC Cl3AcD-All；
(E1→4)ABCCl3AcD-All；
(E1→4)ABAcCCl3AcD-All；
(E1→4)ABAcCCl3AcD；
(E1→4)ABClAcCCl3AcD；
(E1→4)ABCCl3AcD；
A(E1→4)BClAcCCl3AcD-All；
A(E1→4)BCCl3AcD-All；
A(E1→4)BAcCCl3AcD-All；
A(E1→4)BAcCCl3AcD；
A(E1→4)BClAcCCl3AcD；
A(E1→4)BCCl3AcD；
其中：
A为2)-α-L-Rhap-(1→；
B为2)-α-L-Rhap-(1→；
C为3)-α-L-Rhap-(1→；
D为3)-α-D-GlcpN-(1→or 3)-β-D-GlcpN-(1→；
All为烯丙基；
Cl3Ac为三氯乙酰基；
Ac为乙酰基；
a和b为0或1，条件是a+b＝0或1；
a’为：
-当a为1时，0或1；
-当a为0时，0；
c、d和e为0或1；
a、b、c、d和e特别地为例如a+b+c+d+e＝1或2；
x和y为0或1，条件是x+y＝1；
z在每次出现时独立地为0或1，特别地z在所有出现时均为0或1；E表示α-D-Glcp-残基；
n为大于或等于1的整数，特别地为1至10。
21.一种下式之一的化合物，其中Z为ClAc、BrAc或Ac：
尤其是
至少一个TES基团或每个TES基团任选独立地被选自TBS、TIPS、PMB和Nap的基团替代；
至少一个Nap基团或每个Nap基团任选独立地被选自TBS、TIPS和PMB的基团替代，
和
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