CN111024654B - 一种光纤传感器制备方法及在细菌检测中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种Ω形的光纤检测探针，将这种形状的光纤探针与生物传感相结合，得到了一种用于病原菌检测的新型传感器。这种新型Ω形的光纤是采用火焰高温加工而成，加工过程简单。通过光纤表面修饰，连接纳米金，制成光纤表面等离子共振(FOLSPR)，在FOLSPR的表面连接适配体DNA，组装成为FOLSPR探针，采用连续光谱，从而实现对于生物样品的实时检测。通过对其性能的研究，说明光纤探针折光灵敏度的优势并深层次的探究造成其灵敏度升高的机制，最后成功的应用到病原菌的检测中。该新型Ω形光纤传感器具有操作简便，灵敏度高，稳定性好并且能够实时检测生物结合的优点。

Description

一种光纤传感器制备方法及在细菌检测中的应用
技术领域
本发明涉及一种光纤传感器制备方法及在细菌检测中的应用。
背景技术
作为人类和动物中普遍报道的胃肠道感染细菌，沙门氏菌经常与食源性疾病爆发相关。鼠伤寒沙门氏菌通过食物传播，死亡率很高。此外，它在外部环境中具有很强的抵抗力，并能在常温下快速繁殖。因此，开发一种灵敏、准确的检测分析方法对于公共健康和食品安全具有重要意义。
光纤局域表面等离子体共振(fiber optic Localized Surface PlasmonResonance，FOLSPR)具有无损信号、长距离传输，低成本，无标签，实时检测以及简单安装等优点。然而，与传统的光纤表面等离子体共振(FOSPR)相比，FOLSPR表现出相对较低的灵敏度，这阻碍该技术的进一步发展。改变几何形状可以改变FOLSPR的折光(RT)灵敏度。但是，目前使用的D型光纤，S型光纤，锥形光纤都面临着加工困难的问题，还存在着对样品量要求大，样品池制作难等问题，不是很利于应用在传感器的研究中。而U型光纤由于其加工简单，灵敏度相对较高，样品需求较小，常被应用在传感器的研究中。
在此，我们描述了一种新型FOLSPR传感器，其加工简单，样品量小，样品池简单，最重要的特征是折光灵敏度明显高于U型光纤。同时探究了造成这种新型FOLSPR传感器折光灵敏度高的原因，且实现了对于病原菌的实时，无标记，高灵敏度且特异性的检测，这种方法对公共健康和食品安全具有重要意义。
发明内容
本发明提供了一种新型光纤表面等离子体共振传感器的制备方法，并将所制备的新型光纤表面等离子体共振传感器应用到病原菌的高灵敏，高特异性，实时，免标记的检测。实现了对于病原菌的高灵敏，高特异性，实时，免标记的检测。
本发明实现其发明目的所采用的技术方案是：
本发明提供了一种光纤，其结构如下：包括裸露部分1和含有包层的部分2，裸露部分1包括大于半圆的圆弧段3和两个直线段4，两个直线段4的一端分别连接圆弧段3的两端，直线段4与圆弧段3的连接部倒圆，两个直线段4之间的距离从与圆弧段3连接的一端到另一端逐渐增大，直线段4的另一端连接含有包层的部分2；优选地，所述光纤的芯径600μm，长度10～50cm。
裸露部分：仅有光纤的芯的部分，不含有包层；
含有包层的部分：含有光纤的芯以及包围在其表面的包层。
本发明还提供了一种前述的光纤的制备方法，它包括以下步骤：取光纤，将两端打磨到光滑平整的状态，将需要裸露部分在火焰高温条件下烧除包层，加工成型。
本发明还提供了前述的光纤在制备光纤表面等离子共振探针中的应用。
本发明还提供了一种光纤表面等离子共振探针，在前述的光纤的裸露部分表面连接用于检测的适配体；优选地，所述适配体是巯基修饰的适配体；更优选地，所述巯基修饰的适配体为：SH-C6-TATGGCGGCGTCACCCGACGGGGACTTGACATTATGACAG。
本发明还提供了一种前述的光纤表面等离子共振探针的制备方法，它包括以下步骤：
1)将光纤裸露部分浸入30％H2O2和浓H2SO4的混合液中，超声水洗，烘干；
2)然后将光纤裸露部分浸入3-APTMS溶液中，清洗，烘干；
3)再将光纤裸露部分浸入纳米金溶液，修饰10-40分钟，优选15分钟，烘干；
4)最后在光纤裸露部分的表面连接巯基修饰的适配体，得光纤表面等离子共振探针；
优选地，
步骤1)中，30％H2O2与浓H2SO4的体积比为3∶7，浸泡温度为90℃，浸泡时间为30分钟；
步骤2)中，3-APTMS溶液的制备方法是将3-APTMS溶解在体积比为5∶2的乙醇和乙酸混合物中，3-APTMS溶液的浓度为1％(v/v)；
步骤2)中，在3-APTMS溶液中室温，10-20min，优选15min，清洗的条件为95％乙醇超声清洗15分钟，水洗10分钟；
步骤3)中，纳米金的合成方法为将烧瓶中的50mL HAuCl4·3H2O水溶液加热至沸腾，然后向烧瓶中加入柠檬酸三钠溶液，当葡萄酒红色稳定时，将混合物继续煮沸15分钟并在搅拌下冷却至室温；其中，HAuCl4·3H2O浓度为0.1mg/mL，柠檬酸三钠溶液浓度为1％(w/v)；
步骤3)中，在纳米金溶液中浸泡的条件为：室温，10-40min优选15min，之后不需要清洗，直接烘干。
本发明还提供了前述的光纤表面等离子共振探针在制备光纤表面等离子共振探针传感器中的应用。
本发明还提供了一种光纤表面等离子共振探针传感器，它包括前述的光纤表面等离子共振探针、钨灯光源、光纤光谱仪。
本发明还提供了前述的光纤表面等离子共振探针传感器在病原菌检测方面的应用。
进一步地，所述病原菌为鼠伤寒沙门氏菌，金黄色葡萄球菌，志贺氏菌，大肠杆菌，肠炎沙门氏菌；优选地，所述鼠伤寒沙门氏菌浓度变化为5×102到1×108CFU/mL，金黄色葡萄球菌，志贺氏菌，大肠杆菌，肠炎沙门氏菌，作为特异性识别的对照，浓度为106CFU/mL。
进一步地，所述病原菌和适配体结合时间为1h-3h，优选1.5小时；
和/或，所述病原菌培养条件为：LB培养基，200rpm/min，37℃过夜，病原菌和适配体结合的温度为37℃。
本发明提供的新型Ω形FOLSPR探针传感器，其工艺特征包括以下步骤：
1.Ω形FOLSPR探针传感器的制备方法，步骤如下：
1)光纤的准备；采用芯径600μm的通讯光纤，长度10-50cm，优选20cm。光纤两端打磨到光滑平整的状态，在火焰高温条件下烧除包层，加工成Ω的形状。
2)光纤的功能化；对光纤进行表面修饰以达到检测目的。光纤去除包层的部分浸入H2O2和H2SO4混合液。超声水洗，烘干，然后将其浸入3-APTMS溶液中，清洗，烘干。浸入纳米金(AuNPs)溶液，制成FOLSPR。
步骤2)中所述30％H2O2与浓H2SO4的体积比为3∶7，反应温度为90℃。
步骤2)中所述3-APTMS溶液浓度为1％(v/v)，是将3-APTMS溶解在乙醇和乙酸体积比5∶2的混合物中制备的。
步骤2)中所述3-APTMS溶液浸泡以后，清洗的条件为95％乙醇超声清洗15分钟，水洗10分钟。
3)步骤2)所述AuNPs合成方法：将烧瓶中的50mL HAuCl4·3H2O水溶液加热至沸腾，然后向烧瓶中加入柠檬酸三钠溶液。当葡萄酒红色稳定时，将混合物继续煮沸15分钟并在搅拌下冷却至室温。
4)步骤3)所述HAuCl4·3H2O浓度为0.1mg/mL，柠檬酸三钠溶液浓度为1％(w/v)。
5)在FOLSPR的表面连接巯基修饰的适配体，功能化成为FOLSPR探针。
6)步骤5)中所述所用适配体浓度为1μM。适配体DNA溶解在缓冲溶液中，将FOLSPR浸入其中，进行修饰。
7)步骤6)中所述缓冲溶液成分为：10mM Tris-HCl PH 7.4，5mM KCl，100 mMNaCl，1mM MgCl2
2.Ω形FOLSPR探针传感器的在细菌检测中的应用。
1)用功能化的Ω形FOLSPR探针对细菌进行检测，从而分析FOLSPR传感器的灵敏度，选择性和应用范围。
2)步骤1)中所述适配体和细菌是特异性识别的。
3)步骤2)中所述适配体，是鼠伤寒特异性识别的，序列为：SH-C6-TATGGCGGCGTCACCCGACGGGGACTTGACATTATGACAG。所涉及到的细菌为：鼠伤寒沙门氏菌，金黄色葡萄球菌，志贺氏菌，大肠杆菌，肠炎沙门氏菌。
4)步骤3)中所述鼠伤寒沙门氏菌浓度变化为5×102到1×108CFU/mL。其他细菌作为特异性识别的对照，浓度为106CFU/mL。
5)步骤4)中所述细菌和适配体结合时间为1h-3h，优选1.5小时。
6)步骤5)中所述细菌培养条件为：LB培养基，200rpm/min，37℃过夜。FOLSPR的结合条件：37℃。
7)上述检测结果表明，在5×102到1×108CFU/mL范围内吸光值与菌的对数变化成线性关系，并且对于其他细菌均不结合。展现了一个很宽的检测范围和高特异性结合。
本发明的上述FOLSPR传感器可通过下述检测装置来实施。
本发明的上述FOLSPR传感器的实施装置，其特征在于，收集的光谱为连续光谱，可以实时监控反应进程。以FOLSPR探针为中心，FOLPSR探针的输入端连接到钨灯光源，输出端连接到光纤光谱仪，将信号输出到电脑上。反应温度由金属浴控制，FOLSPR的上下移动由位移台控制。
本发明提供的Ω形的FOLSPR传感器，与现有的FOLSPR技术相比，具有以下十分突出的有益技术效果与优点：
1.由于本发明的Ω形光纤加工简单，相比于许多其他形状的光纤，例如D型，S型光纤等，它的制作更加简单，样品量小，样品池简单。只需要酒精喷灯高温灼烧便可去除包层，加工为所需形状。样品池为普通离心管，成本较低，不用特殊加工。由于光纤探针体积较小，最小的样品测量可以在200μL离心管中进行。
2.本发明的Ω形光纤具有独特的形状，相比与最常用的U型光纤，Ω形的光纤具有更多的弯曲区域。U型光纤只有近半圆的弯曲区域，Ω形的光纤具有近整圆的弯曲区域，所以具有更高的折光灵敏度。
3.弯曲区域对于FOLSPR的折光灵敏度的增强有决定性的影响，而折光灵敏度越高，FOLSPR探针的检测灵敏度也会升高。所以，弯曲区域对于FOLSPR的性能影响很大。但并不是弯曲区域越多越好，例如“8”字型和“螺旋”型，相比与Ω型具有更多的弯曲区域，但是通过监测他们信号变化的时间曲线发现，信号上下波动，难以收集数据。Ω型FOLSPR具有更好的检测稳定性。
4.本发明采用的检测原理采用的是适配体与细菌的特异性识别，所以对待测样品具有很高的亲和力和特异性。
5.本发明采用的测量方法是局域表面等离子体共振，光源为普通白光，采集到的信号是连续光谱，所以所有反应过程都可以被实时监控，并且反应过程中不会对任何反应物进行标记。实现了对反应的无标记、实时监控。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为本发明中的Ω型光纤的结构示意图。
图2为本发明中的Ω型FOLSPR传感器实施装置结构示意图：5-光源，6-位移台，7-光谱仪，8-电脑，9-金属浴，插入图片为FOLSPR探针检测细菌的原理图。
图3为本发明中的Ω型FOLSPR灵敏度检测结果。
图4为采用本发明方法测量鸡肉样本中细菌的时间曲线图。
具体实施方式
下面结合附图说明，给出本发明的实施例，并通过实施例对本发明作进一步的说明，以便于人们对本发明的理解。
实施例1
一种新型的Ω形FOLSPR探针传感器的制备方法，步骤如下：
1)光纤的准备；采用芯径600μm的通讯光纤，长度20cm。光纤两端打磨到光滑平整的状态，在火焰高温条件下烧除包层，加工成Ω形。
2)光纤的功能化；对光纤进行表面修饰以达到检测目的。光纤去除包层的部分浸入30％H2O2和H2SO4混合液。超声水洗，烘干，然后将其浸入3-APTMS溶液中室温浸泡15min，清洗，烘干。浸入纳米金(AuNPs)溶液，修饰15分钟，烘干，制成FOLSPR。
步骤2)中所用30％H2O2与浓H2SO4的体积比为3∶7，反应温度为90℃，浸泡时间为30分钟。
步骤2)中1％体积比的3-APTMS溶液，是将3-APTMS溶解在乙醇和乙酸体积比5∶2的混合物中制备的。
步骤2)中3-APTMS溶液浸泡以后，清洗的条件为95％乙醇超声清洗15分钟，水洗10分钟。
3)AuNPs合成方法：将烧瓶中的50ml HAuCl4·3H2O水溶液加热至沸腾，然后向烧瓶中加入柠檬酸三钠溶液。当葡萄酒红色稳定时，将混合物继续煮沸15分钟并在搅拌下冷却至室温。HAuCl4·3H2O浓度为0.1mg/mL，柠檬酸三钠溶液浓度为1％(w/v)。
4)在FOLSPR的表面连接巯基修饰的适配体，功能化成为FOLSPR探针。巯基修饰的适配体序列为：
SH-C6-TATGGCGGCGTCACCCGACGGGGACTTGACATTATGACAG的寡核苷酸片段，用于检测鼠伤寒沙门氏菌，金黄色葡萄球菌，志贺氏菌，大肠杆菌，肠炎沙门氏菌。
实施例2
本实施例中，用于检测的Ω型FOLSPR探针如图1所示，传感器检测装置如图2所示。检测装置的结构主要包括1-光源，2-位移台，3-光谱仪，4-电脑，5-金属浴。光源发出的光经过光纤传输到FOLSPR探针，在检测部分，入射光子与光纤表面的自由电子发生共振作用，产生局域表面等离子体共振，造成光的吸收，剩余的光会通过光纤传入光谱仪，再由光谱仪把产生的光吸收信号传入电脑，进行实时监控和定性定量分析。
测量过程如下：
Ω型的FOLSPR折光灵敏度的检测
1)Ω型的FOLSPR的RI灵敏度分析。将FOLSPR分别浸入0-20％蔗糖溶液中，测量吸光值，将吸光值的变化与蔗糖折光率的变化线性拟合，得到的斜率为折光灵敏度。为了评价Ω形FOLSPR的RI大小，将其与U型FOLSPR作比较，结果是Ω形FOLSPR的RI是U型FOLSPR的2.5倍，结果如图3所示。
2)探究1)中Ω形FOLSPR的RI灵敏度高于U型FOLSPR的原因。
3)步骤2)中具体实验过程：将FOLSPR接触到液面所产生的信号记为第一个点，之后每下降0.5mm记录为下一个点，每个点分别再0-20％的蔗糖溶液中，测量一个吸光值，按1)中的方法，计算出每个点的RI灵敏度，作出随浸入深度的改变，RI灵敏度的变化曲线。比较Ω形FOLSPR与U型FOLSPR的RI灵敏度，得出Ω形FOLSPR的RI灵敏度更高的原因是具有更多的弯曲区域。
实施例3
鸡肉样品中细菌的检测
取40g鸡肉，弄碎，泡在200mL缓冲溶液(10mM Tris-HCl PH 7.4，5mM KCl，100mMNaCl，1mM MgCl2)中，1h。取上清液，加入不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌，测量FOLSPR吸光值信号。取吸收峰值处的吸光值，作时间曲线，可以实时的反应细菌和适配体的结合情况。实现了对鸡肉样品的实时，免标记检测。图4为采用本发明方法测量鸡肉样本中细菌的时间曲线图。
综上，本发明公开了一种Ω形的光纤检测探针，将这种形状的光纤探针与生物传感相结合，得到了一种用于病原菌检测的新型传感器。这种新型Ω形的光纤是采用火焰高温加工而成，加工过程简单。通过光纤表面修饰，连接纳米金，制成光纤表面等离子共振(FOLSPR)，在FOLSPR的表面连接适配体DNA，组装成为FOLSPR探针，采用连续光谱，从而实现对于生物样品的实时检测。通过对其性能的研究，说明光纤探针折光灵敏度的优势并深层次的探究造成其灵敏度升高的机制，最后成功的应用到病原菌的检测中。该新型Ω形光纤传感器具有操作简便，灵敏度高，稳定性好并且能够实时检测生物结合的优点。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学
<120> 一种光纤传感器制备方法及在细菌检测中的应用
<130> GYKH1486-2019P018092CCZ
<150> 2018111748777
<151> 2019-10-09
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 巯基修饰的适配体
<400> 1
tatggcggcg tcacccgacg gggacttgac attatgacag 40

Claims (18)

1.一种光纤，其特征在于：其结构如下：包括裸露部分1和含有包层的部分2，裸露部分1包括大于半圆的圆弧段3和两个直线段4，两个直线段4的一端分别连接圆弧段3的两端，直线段4与圆弧段3的连接部倒圆，两个直线段4之间的距离从与圆弧段3连接的一端到另一端逐渐增大，直线段4的另一端连接含有包层的部分2。
2.根据权利要求1所述的光纤，其特征在于：所述光纤的芯径600μm，长度10～50cm。
3.一种权利要求1所述的光纤的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：取光纤，将两端打磨到光滑平整的状态，将需要裸露部分在火焰高温条件下烧除包层，加工成型。
4.权利要求1所述的光纤在制备光纤表面等离子共振探针中的应用。
5.一种光纤表面等离子共振探针，其特征在于：在权利要求1所述的光纤的裸露部分表面连接用于检测的适配体。
6.根据权利要求5所述的光纤表面等离子共振探针，其特征在于：所述适配体是巯基修饰的适配体。
7.根据权利要求6所述的光纤表面等离子共振探针，其特征在于：所述巯基修饰的适配体为：SH-C6-TATGGCGGCGTCACCCGACGGGGACTTGACATTATGACAG。
8.一种权利要求5～7任一项所述的光纤表面等离子共振探针的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：
1)将光纤裸露部分浸入30％H2O2和浓H2SO4的混合液中，超声水洗，烘干；
2)然后将光纤裸露部分浸入3-APTMS溶液中，清洗，烘干；
3)再将光纤裸露部分浸入纳米金溶液，修饰10-40分钟，烘干；
4)最后在光纤裸露部分的表面连接巯基修饰的适配体，得光纤表面等离子共振探针。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：步骤3)中，所述修饰15分钟。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：
步骤1)中，30％H2O2与浓H2SO4的体积比为3:7，浸泡温度为90℃，浸泡时间为30分钟；
步骤2)中，3-APTMS溶液的制备方法是将3-APTMS溶解在体积比为5:2的乙醇和乙酸混合物中，3-APTMS溶液的浓度为1％v/v；
步骤2)中，在3-APTMS溶液中室温，10-20min，清洗的条件为95％乙醇超声清洗15分钟，水洗10分钟；
步骤3)中，纳米金的合成方法为将烧瓶中的50mL HAuCl4·3H2O水溶液加热至沸腾，然后向烧瓶中加入柠檬酸三钠溶液，当葡萄酒红色稳定时，将混合物继续煮沸15分钟并在搅拌下冷却至室温；其中，HAuCl4·3H2O浓度为0.1mg/mL，柠檬酸三钠溶液浓度为1％w/v；
步骤3)中，在纳米金溶液中浸泡的条件为：室温，10-40min，之后不需要清洗，直接烘干。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于：
步骤2)中，在3-APTMS溶液中室温15min；
步骤3)中，在纳米金溶液中浸泡的条件为：室温，15min。
12.权利要求5～7任一项所述的光纤表面等离子共振探针在制备光纤表面等离子共振探针传感器中的应用。
13.一种光纤表面等离子共振探针传感器，其特征在于：它包括权利要求5～7任一项所述的光纤表面等离子共振探针、钨灯光源、光纤光谱仪。
14.权利要求13所述的光纤表面等离子共振探针传感器在病原菌检测方面的应用。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于：所述病原菌为鼠伤寒沙门氏菌，金黄色葡萄球菌，志贺氏菌，大肠杆菌，肠炎沙门氏菌。
16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于：所述鼠伤寒沙门氏菌浓度变化为5×102到1×108CFU/mL，金黄色葡萄球菌，志贺氏菌，大肠杆菌，肠炎沙门氏菌，作为特异性识别的对照，浓度为106CFU/mL。
17.根据权利要求14～16任一项所述的应用，其特征在于：所述病原菌和适配体结合时间为1h-3h；
和/或，所述病原菌培养条件为：LB培养基，200rpm/min，37℃过夜，病原菌和适配体结合的温度为37℃。
18.根据权利要求17所述的应用，其特征在于：所述病原菌和适配体结合时间为1.5小时。
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