CN111019969A - 一种通过优化供体dna模板来提高基因精确替换效率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通过优化供体DNA模板来提高基因精确替换效率的方法。该方法包括如下步骤：将esgRNA、Cas9切刻酶、筛选剂抗性蛋白、供体DNA导入植物中；esgRNA靶向DNA片段甲靶点序列；DNA片段甲靶点序列位于植物基因组中的非转录链上；供体DNA的转录链依次由DNA片段甲靶点序列、DNA片段乙和DNA片段甲靶点序列组成；DNA片段乙为将DNA片段甲突变后得到的DNA分子；在esgRNA引导下，Cas9切刻酶在植物基因组的转录链上产生一个单链切刻，在供体DNA的非转录链上产生两个单链切刻，通过植物体内的修复机制将植物基因组中DNA片段甲替换为DNA片段乙，实现植物基因替换。

Description

一种通过优化供体DNA模板来提高基因精确替换效率的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种通过优化供体DNA模板来提高基因精确替换效率的方法。

背景技术

长链DNA模板介导的基因精确替换在细胞中的概率非常低，但是在待替换位点附近引入DNA双链断裂(dsDNA break，DSB)能够明显的增加替换的概率。CRISPR-Cas9技术已经成为强有力的基因组编辑手段，被广泛应用到很多组织和细胞中。CRISPR/Cas9protein-RNA复合物通过向导RNA(guide RNA)定位于靶点上，通过切割使DNA产生DSB，从而增加长链DNA模板介导的基因精确替换效率。在产生DSB后，生物体会本能的启动DNA修复机制。修复机制一般有两种，一种是非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)，此种修复所占的比例占大多数，修复DNA后一般会产生随机的indels(insertions ordeletions)。另一种是同源重组(homology-directed repair，HDR)，使用姐妹染色单体或外源DNA供体(donor)作为修复模板，实现基因的精确修复。在动物细胞中，修复的具体原理是：CtIP酶在DSB处起始末端切割，产生突出的3’端单链DNA(single-stranded DNA，ssDNA)尾巴，ssDNA会被重组酶Rad51识别，结合成复合物，侵入供体DNA模板，并与其同源的片段退火结合，以供体DNA作为模板，合成新的DNA链，完成修复。当供体DNA同源臂之间的序列带有外源突变时，此突变会在修复的过程中引入到DNA链中，从而实现精确定点替换。此种HDR修复起始于DSB的产生，由于NHEJ的修复概率远大于HDR，在发生了精确替换的样品中，会有较多的副产物，比如引入indels，造成DNA大片段缺失、移位等。

为了提高产物中精确HDR:非精确HDR的比例，人们尝试使用Cas9的一种失活突变体D10A，对DNA造成单链切刻。在动物中，相比于DSB而言，单链切刻起始的HDR的副产物较少，但同时在一定程度上降低了HDR的效率。在植物中，DSB诱发的HDR在不同的基因上能够实现精确替换，但是Cas9 D10A引发的切刻能否实现HDR精确替换，其效率是否比DSB诱导的HDR低，副产物是否减少，均无报道。

来源于病毒基因组的2A自切割寡肽(self-cleaving peptide 2A，P2A)，是一类长18-22个氨基酸的多肽，能够诱发重组蛋白的切割。自切割寡肽有多种类型，如：口蹄疫病毒(FMDV)(F2A)肽、马A型鼻炎病毒(ERAV)(E2A)肽、明脉扁刺蛾β四体病毒(Thosea asignavirus)(T2A)肽、猪捷申病毒-1(PTV-1)(P2A)肽、泰勒病毒2A肽以及脑心肌炎病毒2A肽。第一个被发现的P2A序列来源于口蹄疫病毒。当被转录的一条mRNA链上含有P2A时，核糖体在此处发生跳跃事件，将P2A序列前后的两个蛋白分别翻译成两个独立的蛋白。在动物中，使用P2A将目的蛋白与荧光蛋白连接在一起共同表达，能够保证两个蛋白同时空表达，并且能够很好的对目的蛋白进行细胞定位。但是在植物中，使用P2A将目的蛋白与其它标记蛋白偶连在一起的报道非常少。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物基因替换的方法。

本发明提供的植物基因替换的方法包括如下步骤：将esgRNA、Cas9切刻酶(Cas9n)或其变体、筛选剂抗性蛋白、供体DNA导入目的植物中；

所述esgRNA靶向DNA片段甲靶点序列；所述DNA片段甲靶点序列位于目的植物基因组中的非转录链上；

所述Cas9切刻酶或其变体与所述筛选剂抗性蛋白通过依次由启动子、所述Cas9切刻酶或其变体的编码基因、自切割寡肽的编码基因、所述筛选剂抗性蛋白的编码基因和终止子组成的表达盒或通过依次由启动子、所述筛选剂抗性蛋白的编码基因、自切割寡肽的编码基因、所述Cas9切刻酶或其变体的编码基因和终止子组成的表达盒导入目的植物中；

所述供体DNA的转录链依次包括所述DNA片段甲靶点序列、DNA片段乙和所述DNA片段甲靶点序列；

所述DNA片段乙为将所述DNA片段甲经过一个或几个碱基突变后得到的DNA分子；

在所述esgRNA引导下，所述Cas9切刻酶或其变体在目的植物基因组中的DNA片段甲靶点序列的转录链上产生一个单链DNA切刻，在所述供体DNA中的DNA片段甲靶点序列的非转录链上产生两个单链DNA切刻，并通过目的植物体内的修复机制将目的植物基因组中的所述DNA片段甲替换为所述DNA片段乙，实现植物基因替换。

上述方法中，所述DNA片段甲可为目的植物基因组上的任意片段，将DNA片段甲上的某一个或某几个碱基突变后获得DNA片段乙，所述DNA片段乙为供体DNA上的片段。所述碱基突变可为碱基替换和/或碱基插入和/或碱基缺失。

在实际应用中，将esgRNA/Cas9n系统和两端添加有靶点对应的靶点序列的DNA片段乙即供体DNA导入目的植物后，可实现将目的植物基因组中的DNA片段甲替换为DNA片段乙，进而实现基因替换。此处基因替换可实现将基因突变位点引入目的植物基因组中，进而实现目的植物基因组上的基因突变(如碱基替换、碱基插入或碱基缺失)，从而使目的植物中表达的相应蛋白质的氨基酸功能位点和/或种类和/或活性和/或含量等发生改变，获得具有某一功能或性状的植物突变体。在本发明的具体实施例中，所述碱基突变具体可为碱基替换。

进一步的，所述DNA片段甲和所述DNA片段乙的大小均可为200-2000bp或200-1500bp或200-1000bp。

更进一步的，所述DNA片段甲和所述DNA片段乙的大小均为694bp。

所述DNA片段甲为序列5第1300-1993位所示的DNA分子。

所述DNA片段乙为序列1第8513-9206位所示的DNA分子。

在本发明的具体实施例中，所述DNA片段甲依次由大小为636bp的ALS基因片段和其下游大小为58bp的片段组成。所述DNA片段乙为将DNA片段甲第344位由碱基G突变为碱基T，且将第581位由碱基G突变为碱基T，且将第336位由碱基G突变为碱基C，且将第339位由碱基G突变为碱基C，且将第342位由碱基A突变为碱基G，且将第396位由碱基G突变为碱基C后得到的DNA分子。将水稻基因组中的DNA片段甲替换为DNA片段乙后，由于水稻基因组中的DNA片段甲第344位由碱基G突变为碱基T，且第581位由碱基G突变为碱基T，水稻中表达的ALS蛋白氨基酸序列第548位的氨基酸由酪氨酸(Try)突变为亮氨酸(Leu)，第627位的氨基酸由丝氨酸(Ser)突变为异亮氨酸(Ile)，从而产生具有除草剂抗性的精确编辑植株。

上述方法中，所述esgRNA结构如下：tRNA-所述DNA片段甲靶点序列转录的RNA-esgRNA骨架；

所述tRNA为a1)或a2)或a3)：

a1)将序列1第474-550位中的T替换为U得到的RNA分子；

a2)将a1)所示的RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA分子；

a3)与a1)或a2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的RNA分子；

所述esgRNA骨架为b1)或b2)或b3)：

b1)将序列1第571-656位中的T替换为U得到的RNA分子；

b2)将b1)所示的RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA分子；

b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的RNA分子。

上述方法中，所述供体DNA的转录链依次由所述DNA片段甲靶点序列、PAM序列、DNA片段乙和所述DNA片段甲靶点序列和PAM序列组成。所述DNA片段甲靶点序列为序列1第551-570位或序列9；所述供体DNA的转录链的序列为序列1第8490-9229位的反向互补序列或P565-TS/dNTS重组表达载体序列第8490-9229位的反向互补序列。

上述方法中，所述Cas9切刻酶可为Cas9 D10A切刻酶或Cas9 H840A切刻酶；

所述Cas9切刻酶变体包括来源于细菌的Cas9(如SaCas9、SaCas9-KKH等)，识别不同PAM的Cas9变体(如xCas9、Cas9-NG、Cas9-VQR、Cas9-VRER等)，Cas9高保真酶变体(如HypaCas9、eSpCas9(1.1)、Cas9-HF1等)等。

进一步的，所述Cas9 D10A切刻酶为SpCas9n蛋白质；

所述SpCas9n蛋白质为C1)或C2)：

C1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；

C2)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

更进一步的，所述SpCas9n蛋白质的编码基因为c1)或c2)或c3)：

c1)序列表中序列1第2887-6987位所示的cDNA分子或DNA分子；

c2)与c1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述SpCas9n的cDNA分子或DNA分子；

c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述SpCas9n的cDNA分子或DNA分子。

上述方法中，所述Cas9切刻酶或其变体带有核定位信号。所述核定位信号可为BPNLS、VirD2 NLS或SV40 NLS。所述核定位信号的个数可为1个或2个或多个。

进一步的，所述核定位信号为SV40 NLS。所述SV40 NLS的氨基酸序列为序列2。所述核定位信号的个数为8个。

更进一步的，所述SV40 NLS的编码序列为序列1第2752-2772位。所述Cas9切刻酶或其变体两端分别带有4个SV40 NLS。

上述方法中，所述自切割寡肽可为来源于病毒基因组的2A自切割寡肽，如口蹄疫病毒(FMDV)(F2A)肽、马A型鼻炎病毒(ERAV)(E2A)肽、明脉扁刺蛾β四体病毒(Thoseaasigna virus)(T2A)肽、猪捷申病毒-1(PTV-1)(P2A)肽、泰勒病毒2A肽以及脑心肌炎病毒2A肽。

进一步的，所述自切割寡肽为来源于猪捷申病毒-1(PTV-1)的2A自切割寡肽。所述来源于猪捷申病毒-1(PTV-1)的2A自切割寡肽的氨基酸序列为序列4。

更进一步的，所述来源于猪捷申病毒-1(PTV-1)的2A自切割寡肽的编码序列为序列1第7138-7194位。

上述方法中，所述筛选剂抗性蛋白为潮霉素磷酸转移酶。

进一步的，所述潮霉素磷酸转移酶为D1)或D2)：

D1)氨基酸序列是序列5所示的蛋白质；

D2)将序列表中序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

更进一步的，所述潮霉素磷酸转移酶的编码基因为d1)或d2)或d3)：

d1)序列表中序列1第7195-8220位所示的cDNA分子或DNA分子；

d2)与d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述潮霉素磷酸转移酶的cDNA分子或DNA分子；

d3)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述潮霉素磷酸转移酶的cDNA分子或DNA分子。

上述方法中，所述将esgRNA、Cas9切刻酶或其变体、筛选剂抗性蛋白、供体DNA导入植物中的方法包括如下步骤：将转录esgRNA的DNA分子、Cas9切刻酶或其变体的编码基因、筛选剂抗性蛋白的编码基因和供体DNA导入目的植物中。

上述方法中，所述esgRNA为tRNA-esgRNA，转录所述tRNA-esgRNA的DNA分子转录后得到的所述tRNA-esgRNA为不成熟的RNA前体，该RNA前体中的tRNA会被两种酶(RNase P和RNase Z)切割掉后得到成熟的RNA。一个重组表达载体中有多少个靶点，就会得到多少个独立的成熟的RNA，每个成熟的RNA依次由所述靶点序列转录的RNA和所述esgRNA骨架组成，或依次由所述靶点序列转录的RNA、所述esgRNA骨架和所述tRNA残留的个别碱基组成。在本发明的具体实施例中，所述重组表达载体中含有一个靶点。

进一步的，所述转录esgRNA的DNA分子、所述Cas9切刻酶或其变体的编码基因、所述筛选剂抗性蛋白的编码基因和所述供体DNA通过重组表达载体导入目的植物中。所述转录esgRNA的DNA分子、所述Cas9切刻酶或其变体的编码基因、所述筛选剂抗性蛋白的编码基因和所述供体DNA可通过同一个重组表达载体导入目的植物中，也可通过两个或者多个重组表达载体共同导入目的植物中。

在本发明的具体实施例中，所述转录esgRNA的DNA分子、所述Cas9切刻酶或其变体的编码基因、所述筛选剂抗性蛋白的编码基因和所述供体DNA通过同一个重组表达载体导入目的植物中。所述重组表达载体包括依次由启动子、所述转录esgRNA的DNA分子和终止子组成的表达盒和依次由启动子、所述Cas9切刻酶或其变体的编码基因、自切割寡肽的编码基因、筛选剂抗性蛋白的编码基因和终止子组成的表达盒。

更进一步的，所述重组表达载体为W548-TS/dNTS重组表达载体或P565-TS/dNTS重组表达载体。

所述W548-TS/dNTS重组表达载体的核苷酸序列为将序列1中的第8490-8512位、第9207-9229位均替换为序列6所示的AST215靶点靶序列，且保持其他序列不变后得到的序列。

所述P565-TS/dNTS重组表达载体的核苷酸序列为将序列1中的第551-570位替换为序列9所示的ST319靶点序列，且将序列1中的第8490-8512位、第9207-9229位均替换为序列11所示的AST319靶点靶序列，且保持其他序列不变后得到的序列。

上述方法在植物基因编辑或制备植物突变体或提高植物基因替换效率或减少植物基因替换产生的副产物中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明最后还提供了方法一或方法二或方法三或方法四：

所述方法一为一种植物基因编辑的方法；所述植物基因编辑的方法包括如下步骤：按照上述方法对植物基因组中的目的基因片段进行替换，从而实现植物基因编辑。所述编辑具体可为碱基替换。

所述方法二为一种制备植物突变体的方法；所述制备植物突变体的方法包括如下步骤：按照上述方法对植物基因组中的目的基因片段进行替换，获得植物突变体。所述植物突变体具体可为抗除草剂突变体。

所述方法三为一种提高植物基因替换效率的方法；所述提高植物基因替换效率的方法包括如下步骤：按照上述方法对植物基因组中的目的基因片段进行替换。所述替换效率具体可为HDR替换效率。

所述方法四为一种减少植物基因替换产生的副产物的方法；所述减少植物基因替换产生的副产物的方法包括如下步骤：按照上述方法对植物基因组中的目的基因片段进行替换。所述减少植物基因替换产生的副产物具体体现在按照上述方法对植物基因组中的目的基因片段进行替换得到的产物没有额外的Indels产生。

上述方法或应用中，所述植物为如下m1)-m3)中的任一种：

m1)单子叶植物或双子叶植物；

m2)禾本科植物；

m3)水稻(如日本晴)。

本发明提供的植物基因替换方法的原理如下：Cas9 D10A切刻酶(Cas9n)的编码基因通过P2A与筛选标记抗性基因潮霉素磷酸转移酶基因(Hpt)偶连在一起，在同一个启动子的驱动下转录，然后翻译成独立的蛋白。在靶点的引导下，Cas9n/esgRNA复合物在基因组ALS靶位点引发单链DNA切刻。当靶点对应的靶序列位于基因组中的非转录链(non-transcribed strand，NTS)时，Cas9n/esgRNA复合物会在基因组的转录链(transcribedstrand，TS)上产生切刻；当靶点对应的靶序列位于基因组中的TS时，Cas9n/esgRNA复合物会在基因组的NTS上产生切刻。载体上的供体DNA含有具有除草剂抗性的突变位点，同时供体DNA 5’端和3’端各含有1个靶点对应的靶序列。当此靶序列同时位于DNA双链中的NTS，此时会在TS上产生2个切刻；当此靶序列同时位于DNA双链中的TS，此时会在NTS上产生2个切刻。在水稻内源ALS基因组的不同位点、不同DNA链上形成切刻，在供体DNA上不同DNA链形成切刻，发现组合二(基因组-TS，donor-NTS)比组合一(基因组-TS，donor-TS)的精确替换效率高，组合三(基因组-NTS，donor-NTS)与组合二的精确替换效率高，从而能够提高获得除草剂抗性的精确编辑植株的效率。

本发明具有以下优点：

1、效率高：T0苗中，组合二(基因组-TS，donor-NTS)的精确替换效率是组合一(基因组-TS，donor-TS)的1.4-1.7倍，组合三(基因组-NTS，donor-NTS)的精确替换效率是组合一的1.9-2.7倍。

2、副产物少：所有组合产生的精确替换植株，均不含有随机的Indels。

3、成本低：此方法仅需要载体中含有Cas9n相关元件，以及对应的供体DNA，通过农杆菌侵染的方法即可实现精确替换。

本发明提供了一种植物基因替换的方法，该方法不产生DNA双链断裂。通过实验证明：本发明提供的植物基因替换的方法在水稻中实现了对内源的乙酰乳酸合酶ALS基因的精确替换，获得具有除草剂抗性的精确编辑植株。

附图说明

图1为精确替换载体构建示意图。

图2为针对W548位点的不同组合切刻方式在基因组和donor上的切刻分布示意图。

图3为针对P565位点的不同组合切刻方式在基因组和donor上的切刻分布示意图。

图4为针对W548位点的不同组合且刻方式获得的转基因植株的特异引物扩增检测结果。

图5为针对P565位点的不同组合且刻方式获得的转基因植株的特异引物扩增检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

引物对P1由引物HDR-F:5’-gcgcccgattctctatgtc-3’和引物HDR-R：5’-acctatcctccaactggacg-3’组成，用于检测植株是否发生精确替换。

引物对P2由引物gALS-F：5’-atcccagttacaaccactctg-3’和引物gALS-R：5’-cacttaactcagagctattgcatag-3’组成，用于扩增基因组ALS序列并测序。

转录链是指在基因组DNA中，被RNA聚合酶II用来做模板，起始转录过程的DNA链，转录出来的mRNA与模板链互补，与DNA的另外一条链(非转录链)序列一致。下述实施例中提供的载体序列均为非转录链序列。

HDR苗是指在获得的T₀苗中，含有donor带入的对应突变位点的植株。

T₀苗HDR替换效率＝T₀苗中发生了精确替换的苗数/获得的T₀苗总数

基于愈伤数量的HDR替换效率＝T₀苗中发生了精确替换的苗数/起始侵染的愈伤总数

HDR中的indels效率＝精确替换的T₀苗中发生了indels的苗数/精确替换的T₀苗总数

日本晴水稻：参考文献：梁卫红,王高华,杜京尧,等.硝普钠及其光解产物对日本晴水稻幼苗生长和5种激素标记基因表达的影响[J].河南师范大学学报(自然版),2017(2):48-52.；公众可以从北京市农林科学院获得。

恢复培养基：含有200mg/L特美汀的N6固体培养基。

筛选培养基1：含有50mg/L潮霉素的N6固体培养基。

筛选培养基2：含有0.4uM/L双草醚的N6固体培养基。

分化培养基：含有2mg/L KT、0.2mg/L NAA、0.5g/L谷氨酸、0.5g/L脯氨酸的N6固体培养基。

生根培养基：含有0.2mg/L NAA、0.5g/L谷氨酸、0.5g/L脯氨酸、0.28uM/L双草醚的N6固体培养基。

下述实施例中ALS蛋白的氨基酸序列如序列表中序列15所示，其编码基因序列如序列表中序列14第1-1935位所示。

实施例1、TS/dTS、TS/dNTS和NTS/dNTS对应载体的构建及其在水稻基因替换中的应用

一、重组表达载体的构建及替换原理说明

1、重组表达载体的构建

人工合成如下重组表达载体，各载体均为环状质粒：

对于W548位点，含有三个载体，分别为W548-TS/dTS，W548-TS/dNTS，W548-NTS/dNTS。

对于P565位点，含有三个载体，分别为P565-TS/dTS，P565-TS/dNTS，P565-NTS/dNTS。

重组表达载体骨架结构示意图如图1所示。具体结构描述如下：

W548-TS/dTS重组表达载体的序列为序列表中的序列1。序列1的第131-467位为OsU3启动子序列，第474-550位为tRNA序列，第551-570位为ST215靶点序列，第571-656位为esgRNA骨架序列，第657-947位为OsU3终止子序列。序列1的第954-2667位为OsUbq3启动子序列，第2752-2772位、第2782-2802位、第2812-2832位、第2842-2862位、第7006-7026位、第7036-7056位、第7066-7086位、第7096-7116位均为SV40核定位序列(编码序列2所示的核定位信号SV40)，第2887-6987位为SpCas9n蛋白质的编码序列(编码序列3所示的SpCas9n蛋白质)，第7138-7194位为自切割寡肽P2A的编码序列(编码序列4所示的自切割寡肽P2A)，第7195-8220位为潮霉素磷酸转移酶的核苷酸序列(编码序列5所示的潮霉素磷酸转移酶)，第8227-8481位为Nos终止子的核苷酸序列。第8490-8512位、第9207-9229位均为ST215靶点靶序列(由ST215靶点序列和PAM序列组成)；第8513-9206位为ALS供体DNA序列。

W548-TS/dNTS重组表达载体的序列为将序列1中的第8490-8512位、第9207-9229位均替换为序列6所示的AST215靶点靶序列，且保持其他序列不变后得到的序列。

W548-NTS/dNTS重组表达载体的序列为将序列1中的第551-570位替换为序列7所示的AST339靶点序列，且将序列1中的第8490-8512位、第9207-9229位均替换为序列8所示的AST339靶点靶序列，且保持其他序列不变后得到的序列。

P565-TS/dTS重组表达载体的序列为将序列1中的第551-570位替换为序列9所示的ST319靶点序列，且将序列1中的第8490-8512位、第9207-9229位均替换为序列10所示的ST319靶点靶序列，且保持其他序列不变后得到的序列。

P565-TS/dNTS重组表达载体的序列为将序列1中的第551-570位替换为序列9所示的ST319靶点序列，且将序列1中的第8490-8512位、第9207-9229位均替换为序列11所示的AST319靶点靶序列，且保持其他序列不变后得到的序列。

P565-NTS/dNTS重组表达载体的序列为将序列1中的第551-570位替换为序列12所示的AST340靶点序列，且将序列1中的第8490-8512位、第9207-9229位均替换为序列13所示的AST340靶点靶序列，且保持其他序列不变后得到的序列。

2、重组表达载体的精确替换原理

1)W548位点重组表达载体的精确替换原理

W548位点重组表达载体是基于单链切刻(Nick)引导的精确替换，原理示意图如图2所示。

W548位点重组表达载体包括如下元件：esgRNA、Cas9n、供体DNA。

esgRNA靶向靶点靶序列。靶点为ST215或AST339。

供体DNA(donor DNA)：供体DNA依次由靶点靶序列、ALS供体DNA序列和靶点靶序列组成。

ALS供体DNA序列(序列1第8513-9206位)是将DNA片段甲(DNA片段甲为序列14第1300-1993位所示的大小为694bp的片段，其依次由大小为636bp的ALS基因片段和其下游大小为58bp的片段组成。DNA片段甲为水稻基因组上的片段。)进行突变后得到的DNA分子。突变包括功能位点突变和同义位点突变。

功能位点突变：将DNA片段甲第344位由碱基G突变为碱基T(此处碱基突变可使水稻中的ALS蛋白氨基酸序列第548位的酪氨酸(Try)突变为亮氨酸(Leu))，且将第581位由碱基G突变为碱基T(此处碱基突变可使水稻中的ALS蛋白氨基酸序列第627位的丝氨酸(Ser)突变为异亮氨酸(Ile))。水稻中的ALS蛋白氨基酸序列第548位的酪氨酸(Try)突变为亮氨酸(Leu)，且第627位的丝氨酸(Ser)突变为异亮氨酸(Ile)后能够抗双草醚除草剂，将水稻ALS蛋白氨基酸序列第548位记作W548L功能突变位点，将水稻ALS蛋白氨基酸序列第627位记作S627I功能突变位点。

同义位点突变：为了方便后期设计特异检测引物检测精确替换突变体，将DNA片段甲第336位由碱基G突变为碱基C(此处碱基突变对应水稻ALS蛋白氨基酸序列第545位)，且将第339位由碱基G突变为碱基C(此处碱基突变对应水稻ALS蛋白氨基酸序列第546位)，且将第342位由碱基A突变为碱基G(此处碱基突变对应水稻ALS蛋白氨基酸序列第547位)，且将第396位由碱基G突变为碱基C(此处碱基突变对应水稻ALS蛋白氨基酸序列第565位)。此处碱基突变不改变水稻ALS蛋白氨基酸序列上的相应氨基酸位点所对应的氨基酸，将水稻ALS蛋白氨基酸序列第545位记作545同义突变位点，将水稻ALS蛋白氨基酸序列第546位记作546同义突变位点，将水稻ALS蛋白氨基酸序列第547位记作547同义突变位点，将水稻ALS蛋白氨基酸序列第565位记作P565同义突变位点。

基因组靶点选择说明：ST215靶点位于水稻ALS基因上的W548位点对应的密码子附近的非转录链上，AST339靶点位于水稻ALS基因上的W548位点对应的密码子附近的转录链上。

Cas9n/esgRNA复合物在相应靶点的引导下，在载体中供体donor上的靶序列产生两个单链切刻位点，同时在水稻基因组ALS基因序列上的靶序列产生一个单链切刻位点，在水稻体内的修复机制下，供体DNA在水稻基因组上的切刻位点处发生精确替换(水稻基因组上的DNA片段甲替换为ALS供体DNA)，使ALS供体DNA上的突变位点引入到水稻基因组中，获得基因替换后的植株，该基因替换后的植株具有除草剂抗性。

W548-TS/dTS重组表达载体中，ST215靶点对应的靶序列位于水稻基因组ALS基因的非转录链上和供体DNA的非转录链上，Cas9n/esgRNA复合物会在水稻基因组ALS基因的转录链上和供体DNA的转录链上产生切刻。

W548-TS/dNTS重组表达载体中，ST215靶点对应的靶序列位于水稻基因组ALS基因的非转录链上和供体DNA的转录链上，Cas9n/esgRNA复合物会在水稻基因组ALS基因的转录链上和供体DNA的非转录链上产生切刻。

W548-NTS/dNTS重组表达载体中，AST339靶点对应的靶序列位于水稻基因组ALS基因的转录链上和供体DNA的转录链上，Cas9n/esgRNA复合物会在水稻基因组ALS基因的非转录链上和供体DNA的非转录链上产生切刻。

2)P565位点重组表达载体的精确替换原理

P565位点重组表达载体是基于单链切刻Nick引导的精确替换，原理示意图如图3所示。

P565位点重组表达载体包括如下元件：esgRNA、Cas9n、供体DNA。

esgRNA靶向靶点靶序列。靶点为ST319或AST340。

供体DNA(donor DNA)：供体DNA依次由靶点靶序列、ALS供体DNA序列和靶点靶序列组成。

ALS供体DNA序列(序列1第8513-9206位)是将DNA片段甲(DNA片段甲为序列5第1300-1993位所示的大小为694bp的片段，其依次由大小为636bp的ALS基因片段和其下游大小为58bp的片段组成。DNA片段甲为水稻基因组上的片段)进行突变后得到的DNA分子。突变包括功能位点突变和同义位点突变。

功能位点突变：将DNA片段甲第344位由碱基G突变为碱基T(此处碱基突变可使水稻中的ALS蛋白氨基酸序列第548位的酪氨酸(Try)突变为亮氨酸(Leu))，且将第581位由碱基G突变为碱基T(此处碱基突变可使水稻中的ALS蛋白氨基酸序列第627位的丝氨酸(Ser)突变为异亮氨酸(Ile))。水稻中的ALS蛋白氨基酸序列第548位的酪氨酸(Try)突变为亮氨酸(Leu)，且第627位的丝氨酸(Ser)突变为异亮氨酸(Ile)后能够抗双草醚除草剂，将水稻ALS蛋白氨基酸序列第548位记作W548L功能突变位点，将水稻ALS蛋白氨基酸序列第627位记作S627I功能突变位点。

同义位点突变：为了方便后期设计特异检测引物检测精确替换突变体，将DNA片段甲第336位由碱基G突变为碱基C(此处碱基突变对应水稻ALS蛋白氨基酸序列第545位)，且将第339位由碱基G突变为碱基C(此处碱基突变对应水稻ALS蛋白氨基酸序列第546位)，且将第342位由碱基A突变为碱基G(此处碱基突变对应水稻ALS蛋白氨基酸序列第547位)，且将第396位由碱基G突变为碱基C(此处碱基突变对应水稻ALS蛋白氨基酸序列第565位)。此处碱基突变不改变水稻ALS蛋白氨基酸序列上的相应氨基酸位点所对应的氨基酸，将水稻ALS蛋白氨基酸序列第545位记作545同义突变位点，将水稻ALS蛋白氨基酸序列第546位记作546同义突变位点，将水稻ALS蛋白氨基酸序列第547位记作547同义突变位点，将水稻ALS蛋白氨基酸序列第565位记作P565同义突变位点。

基因组靶点选择说明：ST319靶点位于水稻ALS基因上的P565位点对应的密码子附近的非转录链上，AST340靶点位于水稻ALS基因上的P565位点对应的密码子附近的转录链上。

Cas9n/esgRNA复合物在相应靶点的引导下，在载体中供体donor上的靶序列产生两个单链切刻位点，同时在水稻基因组ALS基因序列上的靶序列产生一个单链切刻位点，在水稻体内的修复机制下，供体DNA在水稻基因组上的切刻位点处发生精确替换(水稻基因组上的DNA片段甲替换为ALS供体DNA)，使ALS供体DNA上的突变位点引入到水稻基因组中，获得基因替换后的植株，该基因替换后的植株具有除草剂抗性。

P565-TS/dTS重组表达载体中，ST319靶点对应的靶序列位于水稻基因组ALS基因的非转录链上和供体DNA的非转录链上，Cas9n/esgRNA复合物会在水稻基因组ALS基因的转录链上和供体DNA的转录链上产生切刻。

P565-TS/dNTS重组表达载体中，ST319靶点对应的靶序列位于水稻基因组ALS基因的非转录链上和供体DNA的转录链上，Cas9n/esgRNA复合物会在水稻基因组ALS基因的转录链上和供体DNA的非转录链上产生切刻。

P565-NTS/dNTS重组表达载体中，AST340靶点对应的靶序列位于水稻基因组ALS基因的转录链上和供体DNA的转录链上，Cas9n/esgRNA复合物会在水稻基因组ALS基因的非转录链上和供体DNA的非转录链上产生切刻。

二、水稻阳性抗性愈伤的获得

将步骤一获得的W548-TS/dTS、W548-TS/dNTS、W548-NTS/dNTS、P565-TS/dTS、P565-TS/dNTS、P565-NTS/dNTS重组表达载体分别按照如下步骤1-7进行操作：

1、将载体导入农杆菌EHA105(上海唯地生物技术有限公司的产品，CAT#:AC1010)，得到重组农杆菌。

2、采用培养基(含50μg/ml卡那霉素和25μg/ml利福平的YEP培养基)培养重组农杆菌，28℃，150rpm震荡培养至OD₆₀₀为1.0-2.0，室温条件下，10000rpm离心1min，用侵染液(将N6液体培养基中的糖替换为葡萄糖和蔗糖，葡萄糖和蔗糖在侵染液中的浓度分别为10g/L和20g/L)重悬菌体并稀释至OD₆₀₀为0.2，得到农杆菌侵染液。

3、水稻品种日本晴成熟种子去壳脱粒，置于100mL三角瓶中，加入70％(v/v)乙醇水溶液浸泡30sec，再置于25％(v/v)次氯酸钠水溶液中，120rpm震荡灭菌30min，无菌水冲洗3次，用滤纸吸干水分，然后将种子胚朝下置于N6固体培养基上，28℃暗培养4-6周，得到水稻愈伤。

4、完成步骤3后，将水稻愈伤浸泡置于农杆菌侵染液甲(农杆菌侵染液甲为向农杆菌侵染液中加入乙酰丁香酮得到的液体，乙酰丁香酮的添加量满足乙酰丁香酮与农杆菌侵染液的体积比为25μl：50ml)中浸泡10min，然后，放在铺有两层灭菌滤纸的培养皿(内含约200ml不含农杆菌的侵染液)上，21℃暗培养1天。

5、取步骤4得到的水稻愈伤放入恢复培养基上，25-28℃暗培养3天。

6、取步骤5得到的水稻愈伤，置于筛选培养基1上，28℃暗培养2周。

7、取步骤6得到的水稻愈伤，转移至筛选培养基2上，28℃暗培养4周，得到水稻抗性愈伤。

三、水稻T0苗的获得

1、取步骤1得到的水稻抗性愈伤放入分化培养基上，25℃光照培养1个月左右。

2、将分化出来的小苗移至生根培养基上，25℃光照培养2周，获取抗除草剂的水稻T0苗。

四、精确替换植株鉴定

1、经过含有除草剂的生根培养基筛选后，存活下来的水稻T0苗，分别提取基因组DNA并以其作为模板，采用引物HDR-F(5’-gcgcccgattctctatgtc-3’)和引物HDR-R(5’-acctatcctccaactggacg-3’)组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；将该PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行如下判断：如果PCR扩增产物中含有约833bp的DNA片段，则相应的水稻T0苗为发生了精确替换的阳性T0苗；如果PCR扩增产物中不含有约833bp的DNA片段，则相应的水稻T0苗为未发生精确替换的T0苗。

2、使用引物gALS-F(5’-atcccagttacaaccactctg-3’)和引物gALS-R(5’-cacttaactcagagctattgcatag-3’)组成的引物对，对上述步骤1筛选出的精确替换的阳性T0苗的基因组ALS基因序列进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；将该PCR扩增产物进行一代测序，分析对应位点是否确实发生了精确替换。

五、结果分析

1、水稻T0苗中引物初筛获得的精确替换植株

W548-TS/dTS载体，共获得55棵转基因阳性苗(独立转化事件)，经过含有除草剂的生根培养基筛选后，24棵苗存活。经过HDR-F和HDR-R引物筛选后，有12棵转基因苗为精确替换植株，PCR检测结果如图4所示。

W548-TS/dNTS载体，共获得40棵转基因阳性苗(独立转化事件)，经过含有除草剂的生根培养基筛选后，24棵苗存活。经过HDR-F和HDR-R引物筛选后，有15棵转基因苗为精确替换植株，PCR检测结果如图4所示。

W548-NTS/dNTS载体，共获得38棵转基因阳性苗(独立转化事件)，经过含有除草剂的生根培养基筛选后，24棵苗存活。经过HDR-F和HDR-R引物筛选后，有23棵转基因苗为精确替换植株，PCR检测结果如图4所示。

P565-TS/dTS载体，共获得26棵转基因阳性苗(独立转化事件)，经过含有除草剂的生根培养基筛选后，16棵苗存活。经过HDR-F和HDR-R引物筛选后，有9棵转基因苗为精确替换植株，PCR检测结果如图5所示。

P565-TS/dNTS载体，共获得32棵转基因阳性苗(独立转化事件)，经过含有除草剂的生根培养基筛选后，16棵苗存活。经过HDR-F和HDR-R引物筛选后，有16棵转基因苗为精确替换植株，PCR检测结果如图5所示。

P565-NTS/dNTS载体，共获得40棵转基因阳性苗(独立转化事件)，经过含有除草剂的生根培养基筛选后，32棵苗存活。经过HDR-F和HDR-R引物筛选后，有27棵转基因苗为精确替换植株，PCR检测结果如图5所示。

2、水稻T0苗中测序确认的精确替换植株及对应效率

一代测序结果显示，PCR检测结果为阳性的植株均在对应位点上发生了精确替换，且无额外的Indels碱基发生。替换效率统计结果具体如表1所示，其中W548-TS/dTS、W548-TS/dNTS、W548-NTS/dNTS载体在T0苗中发生精确替换的概率分别是21.8％(12/55)、37.5％(15/40)、60.5％(23/38)；P565-TS/dTS、P565-TS/dNTS、P565-NTS/dNTS载体在T0苗中发生精确替换的概率分别是34.6％(9/26)、50％(16/32)、67.5％(27/40)。若从整体转化效率来看，以起始侵染的840块抗性愈伤为分母计算，W548-TS/dTS、W548-TS/dNTS、W548-NTS/dNTS载体在发生精确替换的概率分别是1.4％(12/840)、1.8％(15/840)、2.7％(23/840)。P565-TS/dTS、P565-TS/dNTS、P565-NTS/dNTS载体发生精确替换的概率分别是1.1％(9/840)、1.9％(16/840)、3.2％(27/840)。

综上所述，不论是W548位点还是P565位点，TS/dNTS方案在T0苗中的精确替换效率是TS/dTS方案的1.4-1.7倍，NTS/dNTS在T0苗中的精确替换效率是TS/dTS方案的1.9-2.7倍。说明TS/dNTS方案、NTS/dNTS方案对于水稻内源的精确替换效率均优于TS/dTS方案。

表1

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>北京市农林科学院

<120>一种通过优化供体DNA模板来提高基因精确替换效率的方法

<160>15

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>9404

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>1

ggtggcagga tatattgtgg tgtaaacatg gcactagcct caccgtcttc gcagacgagg 60

ccgctaagtc gcagctacgc tctcaacggc actgactagg tagtttaaac gtgcacttaa 120

ttaaggtacc gaagcaactt aaagttatca ggcatgcatg gatcttggag gaatcagatg 180

tgcagtcagg gaccatagca caagacaggc gtcttctact ggtgctacca gcaaatgctg 240

gaagccggga acactgggta cgttggaaac cacgtgatgt gaagaagtaa gataaactgt 300

aggagaaaag catttcgtag tgggccatga agcctttcag gacatgtatt gcagtatggg 360

ccggcccatt acgcaattgg acgacaacaa agactagtat tagtaccacc tcggctatcc 420

acatagatca aagctgattt aaaagagttg tgcagatgat ccgtggcgga tccaacaaag 480

caccagtggt ctagtggtag aatagtaccc tgccacggta cagacccggg ttcgattccc 540

ggctggtgca atttgggtat ggtggtgcaa gtttcagagc tatgctggaa acagcatagc 600

aagttgaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt 660

ttttttcgtt ttgcattgag ttttctccgt cgcatgtttg cagttttatt ttccgttttg 720

cattgaaatt tctccgtctc atgtttgcag cgtgttcaaa aagtacgcag ctgtatttca 780

cttatttacg gcgccacatt ttcatgccgt ttgtgccaac tatcccgagc tagtgaatac 840

agcttggctt cacacaacac tggtgacccg ctgacctgct cgtacctcgt accgtcgtac 900

ggcacagcat ttggaattaa agggtgtgat cgatactgct tgctgctaag cttacaaatt 960

cgggtcaagg cggaagccag cgcgccaccc cacgtcagca aatacggagg cgcggggttg 1020

acggcgtcac ccggtcctaa cggcgaccaa caaaccagcc agaagaaatt acagtaaaaa 1080

aaaagtaaat tgcactttga tccacctttt attacctaag tctcaatttg gatcaccctt 1140

aaacctatct tttcaatttg ggccgggttg tggtttggac taccatgaac aacttttcgt 1200

catgtctaac ttccctttca gcaaacatat gaaccatata tagaggagat cggccgtata 1260

ctagagctga tgtgtttaag gtcgttgatt gcacgagaaa aaaaaatcca aatcgcaaca 1320

atagcaaatt tatctggttc aaagtgaaaa gatatgttta aaggtagtcc aaagtaaaac 1380

ttatagataa taaaatgtgg tccaaagcgt aattcactca aaaaaaatca acgagacgtg 1440

taccaaacgg agacaaacgg catcttctcg aaatttccca accgctcgct cgcccgcctc 1500

gtcttcccgg aaaccgcggt ggtttcagcg tggcggattc tccaagcaga cggagacgtc 1560

acggcacggg actcctccca ccacccaacc gccataaata ccagccccct catctcctct 1620

cctcgcatca gctccacccc cgaaaaattt ctccccaatc tcgcgaggct ctcgtcgtcg 1680

aatcgaatcc tctcgcgtcc tcaaggtacg ctgcttctcc tctcctcgct tcgtttcgat 1740

tcgatttcgg acgggtgagg ttgttttgtt gctagatccg attggtggtt agggttgtcg 1800

atgtgattat cgtgagatgt ttaggggttg tagatctgat ggttgtgatt tgggcacggt 1860

tggttcgata ggtggaatcg tggttaggtt ttgggattgg atgttggttc tgatgattgg 1920

ggggaatttt tacggttaga tgaattgttg gatgattcga ttggggaaat cggtgtagat 1980

ctgttgggga attgtggaac tagtcatgcc tgagtgattg gtgcgatttg tagcgtgttc 2040

catcttgtag gccttgttgc gagcatgttc agatctactg ttccgctctt gattgagtta 2100

ttggtgccat gggttggtgc aaacacaggc tttaatatgt tatatctgtt ttgtgtttga 2160

tgtagatctg tagggtagtt cttcttagac atggttcaat tatgtagctt gtgcgtttcg 2220

atttgatttc atatgttcac agattagata atgatgaact cttttaatta attgtcaatg 2280

gtaaatagga agtcttgtcg ctatatctgt cataatgatc tcatgttact atctgccagt 2340

aatttatgct aagaactata ttagaatatc atgttacaat ctgtagtaat atcatgttac 2400

aatctgtagt tcatctatat aatctattgt ggtaatttct ttttactatc tgtgtgaaga 2460

ttattgccac tagttcattc tacttatttc tgaagttcag gatacgtgtg ctgttactac 2520

ctatctgaat acatgtgtga tgtgcctgtt actatctttt tgaatacatg tatgttctgt 2580

tggaatatgt ttgctgtttg atccgttgtt gtgtccttaa tcttgtgcta gttcttaccc 2640

tatctgtttg gtgattattt cttgcagtac gtaagcatgg actacaagga ccacgacggg 2700

gattacaaag accacgacat agactacaag gatgacgatg acaaaatggc accgaagaaa 2760

aaaaggaagg tcggcggctc cccgaagaaa aaaaggaagg tcggcggctc cccgaagaaa 2820

aaaaggaagg tcggcggctc cccgaagaaa aaaaggaagg tcggaatcca tggcgttcca 2880

gctgccgaca agaagtactc catcggcctc gccatcggca ccaacagcgt cggctgggcg 2940

gtgatcaccg acgagtacaa ggtcccgtcc aagaagttca aggtcctggg caacaccgac 3000

cgccactcca tcaagaagaa cctcatcggc gccctcctct tcgactccgg cgagacggcg 3060

gaggcgaccc gcctcaagcg caccgcccgc cgccgctaca cccgccgcaa gaaccgcatc 3120

tgctacctcc aggagatctt ctccaacgag atggcgaagg tcgacgactc cttcttccac 3180

cgcctcgagg agtccttcct cgtggaggag gacaagaagc acgagcgcca ccccatcttc 3240

ggcaacatcg tcgacgaggt cgcctaccac gagaagtacc ccactatcta ccaccttcgt 3300

aagaagcttg ttgactctac tgataaggct gatcttcgtc tcatctacct tgctctcgct 3360

cacatgatca agttccgtgg tcacttcctt atcgagggtg accttaaccc tgataactcc 3420

gacgtggaca agctcttcat ccagctcgtc cagacctaca accagctctt cgaggagaac 3480

cctatcaacg cttccggtgt cgacgctaag gcgatccttt ccgctaggct ctccaagtcc 3540

aggcgtctcg agaacctcat cgcccagctc cctggtgaga agaagaacgg tcttttcggt 3600

aacctcatcg ctctctccct cggtctgacc cctaacttca agtccaactt cgacctcgct 3660

gaggacgcta agcttcagct ctccaaggat acctacgacg atgatctcga caacctcctc 3720

gctcagattg gagatcagta cgctgatctc ttccttgctg ctaagaacct ctccgatgct 3780

atcctccttt cggatatcct tagggttaac actgagatca ctaaggctcc tctttctgct 3840

tccatgatca agcgctacga cgagcaccac caggacctca ccctcctcaa ggctcttgtt 3900

cgtcagcagc tccccgagaa gtacaaggag atcttcttcg accagtccaa gaacggctac 3960

gccggttaca ttgacggtgg agctagccag gaggagttct acaagttcat caagccaatc 4020

cttgagaaga tggatggtac tgaggagctt ctcgttaagc ttaaccgtga ggacctcctt 4080

aggaagcaga ggactttcga taacggctct atccctcacc agatccacct tggtgagctt 4140

cacgccatcc ttcgtaggca ggaggacttc taccctttcc tcaaggacaa ccgtgagaag 4200

atcgagaaga tccttacttt ccgtattcct tactacgttg gtcctcttgc tcgtggtaac 4260

tcccgtttcg cttggatgac taggaagtcc gaggagacta tcaccccttg gaacttcgag 4320

gaggttgttg acaagggtgc ttccgcccag tccttcatcg agcgcatgac caacttcgac 4380

aagaacctcc ccaacgagaa ggtcctcccc aagcactccc tcctctacga gtacttcacg 4440

gtctacaacg agctcaccaa ggtcaagtac gtcaccgagg gtatgcgcaa gcctgccttc 4500

ctctccggcg agcagaagaa ggctatcgtt gacctcctct tcaagaccaa ccgcaaggtc 4560

accgtcaagc agctcaagga ggactacttc aagaagatcg agtgcttcga ctccgtcgag 4620

atcagcggcg ttgaggaccg tttcaacgct tctctcggta cctaccacga tctcctcaag 4680

atcatcaagg acaaggactt cctcgacaac gaggagaacg aggacatcct cgaggacatc 4740

gtcctcactc ttactctctt cgaggatagg gagatgatcg aggagaggct caagacttac 4800

gctcatctct tcgatgacaa ggttatgaag cagctcaagc gtcgccgtta caccggttgg 4860

ggtaggctct cccgcaagct catcaacggt atcagggata agcagagcgg caagactatc 4920

ctcgacttcc tcaagtctga tggtttcgct aacaggaact tcatgcagct catccacgat 4980

gactctctta ccttcaagga ggatattcag aaggctcagg tgtccggtca gggcgactct 5040

ctccacgagc acattgctaa ccttgctggt tcccctgcta tcaagaaggg catccttcag 5100

actgttaagg ttgtcgatga gcttgtcaag gttatgggtc gtcacaagcc tgagaacatc 5160

gtcatcgaga tggctcgtga gaaccagact acccagaagg gtcagaagaa ctcgagggag 5220

cgcatgaaga ggattgagga gggtatcaag gagcttggtt ctcagatcct taaggagcac 5280

cctgtcgaga acacccagct ccagaacgag aagctctacc tctactacct ccagaacggt 5340

agggatatgt acgttgacca ggagctcgac atcaacaggc tttctgacta cgacgtcgac 5400

cacattgttc ctcagtcttt ccttaaggat gactccatcg acaacaaggt cctcacgagg 5460

tccgacaaga acaggggtaa gtcggacaac gtcccttccg aggaggttgt caagaagatg 5520

aagaactact ggaggcagct tctcaacgct aagctcatta cccagaggaa gttcgacaac 5580

ctcacgaagg ctgagagggg tggcctttcc gagcttgaca aggctggttt catcaagagg 5640

cagcttgttg agacgaggca gattaccaag cacgttgctc agatcctcga ttctaggatg 5700

aacaccaagt acgacgagaa cgacaagctc atccgcgagg tcaaggtgat caccctcaag 5760

tccaagctcg tctccgactt ccgcaaggac ttccagttct acaaggtccg cgagatcaac 5820

aactaccacc acgctcacga tgcttacctt aacgctgtcg ttggtaccgc tcttatcaag 5880

aagtacccta agcttgagtc cgagttcgtc tacggtgact acaaggtcta cgacgttcgt 5940

aagatgatcg ccaagtccga gcaggagatc ggcaaggcca ccgccaagta cttcttctac 6000

tccaacatca tgaacttctt caagaccgag atcaccctcg ccaacggcga gatccgcaag 6060

cgccctctta tcgagacgaa cggtgagact ggtgagatcg tttgggacaa gggtcgcgac 6120

ttcgctactg ttcgcaaggt cctttctatg cctcaggtta acatcgtcaa gaagaccgag 6180

gtccagaccg gtggcttctc caaggagtct atccttccaa agagaaactc ggacaagctc 6240

atcgctagga agaaggattg ggaccctaag aagtacggtg gtttcgactc ccctactgtc 6300

gcctactccg tcctcgtggt cgccaaggtg gagaagggta agtcgaagaa gctcaagtcc 6360

gtcaaggagc tcctcggcat caccatcatg gagcgctcct ccttcgagaa gaacccgatc 6420

gacttcctcg aggccaaggg ctacaaggag gtcaagaagg acctcatcat caagctcccc 6480

aagtactctc ttttcgagct cgagaacggt cgtaagagga tgctggcttc cgctggtgag 6540

ctccagaagg gtaacgagct tgctcttcct tccaagtacg tgaacttcct ctacctcgcc 6600

tcccactacg agaagctcaa gggttcccct gaggataacg agcagaagca gctcttcgtg 6660

gagcagcaca agcactacct cgacgagatc atcgagcaga tctccgagtt ctccaagcgc 6720

gtcatcctcg ctgacgctaa cctcgacaag gtcctctccg cctacaacaa gcaccgcgac 6780

aagcccatcc gcgagcaggc cgagaacatc atccacctct tcacgctcac gaacctcggc 6840

gcccctgctg ctttcaagta cttcgacacc accatcgaca ggaagcgtta cacgtccacc 6900

aaggaggttc tcgacgctac tctcatccac cagtccatca ccggtcttta cgagactcgt 6960

atcgaccttt cccagcttgg tggtgatgac gatgacaaaa tggcaccgaa gaaaaaaagg 7020

aaggtcggcg gctccccgaa gaaaaaaagg aaggtcggcg gctccccgaa gaaaaaaagg 7080

aaggtcggcg gctccccgaa gaaaaaaagg aaggtcggaa tccatggcgg atcaggagcc 7140

accaacttct ccctcctcaa gcaggccggc gacgtggagg agaacccggg cccaatgaaa 7200

aagcctgaac tcaccgcgac gtctgtcgag aagtttctga tcgaaaagtt cgacagcgtc 7260

tccgacctga tgcagctctc ggagggcgaa gaatctcgtg ctttcagctt cgatgtagga 7320

gggcgtggat atgtcctgcg ggtaaatagc tgcgccgatg gtttctacaa agatcgttat 7380

gtttatcggc actttgcatc ggccgcgctc ccgattccgg aagtgcttga cattggggag 7440

tttagcgaga gcctgaccta ttgcatctcc cgccgttcac agggtgtcac gttgcaagac 7500

ctgcctgaaa ccgaactgcc cgctgttcta caaccggtcg cggaggctat ggatgcgatc 7560

gctgcggccg atcttagcca gacgagcggg ttcggcccat tcggaccgca aggaatcggt 7620

caatacacta catggcgtga tttcatatgc gcgattgctg atccccatgt gtatcactgg 7680

caaactgtga tggacgacac cgtcagtgcg tccgtcgcgc aggctctcga tgagctgatg 7740

ctttgggccg aggactgccc cgaagtccgg cacctcgtgc acgcggattt cggctccaac 7800

aatgtcctga cggacaatgg ccgcataaca gcggtcattg actggagcga ggcgatgttc 7860

ggggattccc aatacgaggt cgccaacatc ttcttctgga ggccgtggtt ggcttgtatg 7920

gagcagcaga cgcgctactt cgagcggagg catccggagc ttgcaggatc gccacgactc 7980

cgggcgtata tgctccgcat tggtcttgac caactctatc agagcttggt tgacggcaat 8040

ttcgatgatg cagcttgggc gcagggtcga tgcgacgcaa tcgtccgatc cggagccggg 8100

actgtcgggc gtacacaaat cgcccgcaga agcgcggccg tctggaccga tggctgtgta 8160

gaagtactcg ccgatagtgg aaaccgacgc cccagcactc gtccgagggc aaagaaatag 8220

actagttccc gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc 8280

cggtcttgcg atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa 8340

catgtaatgc atgacgttat ttatgaggtg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata 8400

catttaatac gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc 8460

ggtgtcatct atgttactag aggcgcgcca tttgggtatg gtggtgcaac gggaagagat 8520

cccaccgcaa tatgccattc aggtgctgga tgagctgacg aaaggtgagg caatcatcgc 8580

tactggtgtt gggcagcacc agatgtgggc ggcacaatat tacacctaca agcggccacg 8640

gcagtggctg tcttcggctg gtctgggcgc aatgggattt gggctgcctg ctgcagctgg 8700

tgcttctgtg gctaacccag gtgtcacagt tgttgatatt gatggggatg gtagcttcct 8760

catgaacatt caggagctgg cattgatccg cattgagaac ctccctgtga aggtgatggt 8820

gttgaacaac caacatttgg gtatggtcgt ccagttggag gataggtttt acaaggcgaa 8880

tagggcgcat acatacttgg gcaaccccga atgtgagagc gagatatatc cagattttgt 8940

gactattgct aaggggttca atattcctgc agtccgtgta acaaagaaga gtgaagtccg 9000

tgccgccatc aagaagatgc tcgagactcc agggccatac ttgttggata tcatcgtccc 9060

gcaccaggag catgtgctgc ctatgatccc aattgggggc gcattcaagg acatgatcct 9120

ggatggtgat ggcaggactg tgtattaatc tataatctgt atgttggcaa agcaccagcc 9180

cggcctatgt ttgacctgaa tgacccattt gggtatggtg gtgcaacggc ctgcaggacg 9240

cgtttaatta agtgcacgcg gccgcctact tagtcaagag cctcgcacgc gactgtcacg 9300

cggccaggat cgcctcgtga gcctcgcaat ctgtacctag tgtttaaact atcagtgttt 9360

gacaggatat attggcgggt aaacctaaga gaaaagagcg ttta 9404

<210>2

<211>7

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<400>2

Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

1 5

<210>3

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<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<400>3

Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly

1 5 10 15

Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys

20 25 30

Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly

35 40 45

Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys

50 55 60

Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe

85 90 95

Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His

100 105 110

Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His

115 120 125

Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser

130 135 140

Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met

145 150 155 160

Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp

165 170 175

Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn

180 185 190

Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys

195 200 205

Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu

210 215 220

Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu

225 230 235 240

Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp

245 250 255

Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp

260 265 270

Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu

275 280 285

Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile

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Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met

305 310 315 320

Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala

325 330 335

Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp

340 345 350

Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln

355 360 365

Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly

370 375 380

Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys

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Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly

405 410 415

Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu

420 425 430

Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro

435 440 445

Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met

450 455 460

Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val

465 470 475 480

Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn

485 490 495

Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu

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Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr

515 520 525

Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys

530 535 540

Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val

545 550 555 560

Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser

565 570 575

Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr

580 585 590

Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn

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Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His

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Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr

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Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys

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Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala

675 680 685

Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys

690 695 700

Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His

705 710 715 720

Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile

725 730 735

Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg

740 745 750

His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr

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Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu

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Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln

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Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu

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Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp

835 840 845

Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly

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Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn

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Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe

885 890 895

Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys

900 905 910

Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys

915 920 925

His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu

930 935 940

Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys

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Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu

965 970 975

Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val

980 985 990

Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val

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Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys

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Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr

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Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn

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Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr

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Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg

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Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu

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Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg

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Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys

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Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser

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Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe

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Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu

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Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe

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Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu

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Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn

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Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro

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Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His

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Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg

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Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr

1280 1285 1290

Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile

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Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe

1310 1315 1320

Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr

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Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly

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Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp

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Met Lys Lys Pro Glu Leu Thr Ala Thr Ser Val Glu Lys Phe Leu Ile

1 5 10 15

Glu Lys Phe Asp Ser Val Ser Asp Leu Met Gln Leu Ser Glu Gly Glu

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Glu Ser Arg Ala Phe Ser Phe Asp Val Gly Gly Arg Gly Tyr Val Leu

35 40 45

Arg Val Asn Ser Cys Ala Asp Gly Phe Tyr Lys Asp Arg Tyr Val Tyr

50 55 60

Arg His Phe Ala Ser Ala Ala Leu Pro Ile Pro Glu Val Leu Asp Ile

65 70 75 80

Gly Glu Phe Ser Glu Ser Leu Thr Tyr Cys Ile Ser Arg Arg Ser Gln

85 90 95

Gly Val Thr Leu Gln Asp Leu Pro Glu Thr Glu Leu Pro Ala Val Leu

100 105 110

Gln Pro Val Ala Glu Ala Met Asp Ala Ile Ala Ala Ala Asp Leu Ser

115 120 125

Gln Thr Ser Gly Phe Gly Pro Phe Gly Pro Gln Gly Ile Gly Gln Tyr

130 135 140

Thr Thr Trp Arg Asp Phe Ile Cys Ala Ile Ala Asp Pro His Val Tyr

145 150 155 160

His Trp Gln Thr Val Met Asp Asp Thr Val Ser Ala Ser Val Ala Gln

165 170 175

Ala Leu Asp Glu Leu Met Leu Trp Ala Glu Asp Cys Pro Glu Val Arg

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Ser Gln Tyr Glu Val Ala Asn Ile Phe Phe Trp Arg Pro Trp Leu Ala

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Cys Met Glu Gln Gln Thr Arg Tyr Phe Glu Arg Arg His Pro Glu Leu

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Ala Gly Ser Pro Arg Leu Arg Ala Tyr Met Leu Arg Ile Gly Leu Asp

260 265 270

Gln Leu Tyr Gln Ser Leu Val Asp Gly Asn Phe Asp Asp Ala Ala Trp

275 280 285

Ala Gln Gly Arg Cys Asp Ala Ile Val Arg Ser Gly Ala Gly Thr Val

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Gly Arg Thr Gln Ile Ala Arg Arg Ser Ala Ala Val Trp Thr Asp Gly

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Cys Val Glu Val Leu Ala Asp Ser Gly Asn Arg Arg Pro Ser Thr Arg

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Pro Arg Ala Lys Lys

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<400>8

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<212>DNA

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cccggaatgt gagagcgaga tat 23

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ggccgtaaga accaccagcg acaccacgtc cttcccgctc gaggccgggt gggggcggcg 120

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ggtggtggct gctctgcatc tggtgacgaa ttgcgctggt ttgttgagct gactggtatc 900

ccagttacaa ccactctgat gggcctcggc aatttcccca gtgacgaccc gttgtccctg 960

cgcatgcttg ggatgcatgg cacggtgtac gcaaattatg ccgtggataa ggctgacctg 1020

ttgcttgcgt ttggtgtgcg gtttgatgat cgtgtgacag ggaaaattga ggcttttgca 1080

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ccacatgtgt caatttgcgc agatgttaag cttgctttac agggcttgaa tgctctgcta 1200

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gccattcagg tgctggatga gctgacgaaa ggtgaggcaa tcatcgctac tggtgttggg 1380

cagcaccaga tgtgggcggc acaatattac acctacaagc ggccacggca gtggctgtct 1440

tcggctggtc tgggcgcaat gggatttggg ctgcctgctg cagctggtgc ttctgtggct 1500

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gagctggcat tgatccgcat tgagaacctc cctgtgaagg tgatggtgtt gaacaaccaa 1620

catttgggta tggtggtgca atgggaggat aggttttaca aggcgaatag ggcgcataca 1680

tacttgggca acccggaatg tgagagcgag atatatccag attttgtgac tattgctaag 1740

gggttcaata ttcctgcagt ccgtgtaaca aagaagagtg aagtccgtgc cgccatcaag 1800

aagatgctcg agactccagg gccatacttg ttggatatca tcgtcccgca ccaggagcat 1860

gtgctgccta tgatcccaag tgggggcgca ttcaaggaca tgatcctgga tggtgatggc 1920

aggactgtgt attaatctat aatctgtatg ttggcaaagc accagcccgg cctatgtttg 1980

acctgaatga cccataaaga gtggtatgcc tatgatgttt gtatgtgctc tatcaataac 2040

taaggtgtca actatgaacc atatgctctt ctgttttact tgtttgatgt gcttggcatg 2100

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gcatcacaag atatcatgta agtttcttgt cctacatatc aataataaga gaataaagta 2220

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gattttgagt ttttgtttat actgtttgac cactcgtctt attcaaaaaa ttttagaatt 2640

attatttatt ttttttgtga cttactttat tatctaaagt actttaagca caattttcgt 2700

attttatatt tgcacaaatt ttttgaataa gacgaatggt caaacaatac aaataaaaat 2760

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atttgacatt ttttggatta tgcaattttg ctgtctatag tgctctaatc aattcgcaat 2880

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<212>PRT

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Met Ala Thr Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Ser Ala Ala Ala

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Thr Ala Lys Thr Gly Arg Lys Asn His Gln Arg His His Val Leu Pro

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Ala Arg Gly Arg Val Gly Ala Ala Ala Val Arg Cys Ser Ala Val Ser

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Pro Val Thr Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro Ala Thr Pro Leu Arg Pro

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Trp Gly Pro Ala Glu Pro Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala

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Leu Glu Arg Cys Gly Val Ser Asp Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala

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Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Pro Val Ile Thr Asn

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His Leu Phe Arg His Glu Gln Gly Glu Ala Phe Ala Ala Ser Gly Tyr

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Ala Arg Ala Ser Gly Arg Val Gly Val Cys Val Ala Thr Ser Gly Pro

130 135 140

Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Ala Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser

145 150 155 160

Val Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly

165 170 175

Thr Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile

180 185 190

Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val Glu Asp Ile Pro Arg Val

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Ile Gln Glu Ala Phe Phe Leu Ala Ser Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val

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Leu Val Asp Ile Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln Met Ala Val Pro Val

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Trp Asp Thr Ser Met Asn Leu Pro Gly Tyr Ile Ala Arg Leu Pro Lys

245 250 255

Pro Pro Ala Thr Glu Leu Leu Glu Gln Val Leu Arg Leu Val Gly Glu

260 265 270

Ser Arg Arg Pro Ile Leu Tyr Val Gly Gly Gly Cys Ser Ala Ser Gly

275 280 285

Asp Glu Leu Arg Trp Phe Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro Val Thr Thr

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Thr Leu Met Gly Leu Gly Asn Phe Pro Ser Asp Asp Pro Leu Ser Leu

305 310 315 320

Arg Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Asp

325 330 335

Lys Ala Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val

340 345 350

Thr Gly Lys Ile Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val His Ile

355 360 365

Asp Ile Asp Pro Ala Glu Ile Gly Lys Asn Lys Gln Pro His Val Ser

370 375 380

Ile Cys Ala Asp Val Lys Leu Ala Leu Gln Gly Leu Asn Ala Leu Leu

385 390 395 400

Gln Gln Ser Thr Thr Lys Thr Ser Ser Asp Phe Ser Ala Trp His Asn

405 410 415

Glu Leu Asp Gln Gln Lys Arg Glu Phe Pro Leu Gly Tyr Lys Thr Phe

420 425 430

Gly Glu Glu Ile Pro Pro Gln Tyr Ala Ile Gln Val Leu Asp Glu Leu

435 440 445

Thr Lys Gly Glu Ala Ile Ile Ala Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met

450 455 460

Trp Ala Ala Gln Tyr Tyr Thr Tyr Lys Arg Pro Arg Gln Trp Leu Ser

465 470 475 480

Ser Ala Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ala Gly

485 490 495

Ala Ser Val Ala Asn Pro Gly Val Thr Val Val Asp Ile Asp Gly Asp

500 505 510

Gly Ser Phe Leu Met Asn Ile Gln Glu Leu Ala Leu Ile Arg Ile Glu

515 520 525

Asn Leu Pro Val Lys Val Met Val Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met

530 535 540

Val Val Gln Trp Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr

545 550 555 560

Tyr Leu Gly Asn Pro Glu Cys Glu Ser Glu Ile Tyr Pro Asp Phe Val

565 570 575

Thr Ile Ala Lys Gly Phe Asn Ile Pro Ala Val Arg Val Thr Lys Lys

580 585 590

Ser Glu Val Arg Ala Ala Ile Lys Lys Met Leu Glu Thr Pro Gly Pro

595 600 605

Tyr Leu Leu Asp Ile Ile Val Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met

610 615 620

Ile Pro Ser Gly Gly Ala Phe Lys Asp Met Ile Leu Asp Gly Asp Gly

625 630 635 640

Arg Thr Val Tyr

Claims (10)

1.一种植物基因替换的方法，包括如下步骤：将esgRNA、Cas9切刻酶或其变体、筛选剂抗性蛋白、供体DNA导入目的植物中；

所述esgRNA靶向DNA片段甲靶点序列；所述DNA片段甲靶点序列位于目的植物基因组中的非转录链上；

所述Cas9切刻酶或其变体与所述筛选剂抗性蛋白通过依次由启动子、所述Cas9切刻酶或其变体的编码基因、自切割寡肽的编码基因、所述筛选剂抗性蛋白的编码基因和终止子组成的表达盒或通过依次由启动子、所述筛选剂抗性蛋白的编码基因、自切割寡肽的编码基因、所述Cas9切刻酶或其变体的编码基因和终止子组成的表达盒导入目的植物中；

所述供体DNA的转录链依次包括所述DNA片段甲靶点序列、DNA片段乙和所述DNA片段甲靶点序列；

所述DNA片段乙为将所述DNA片段甲经过一个或几个碱基突变后得到的DNA分子；

在所述esgRNA引导下，所述Cas9切刻酶或其变体在目的植物基因组中的DNA片段甲靶点序列的转录链上产生一个单链DNA切刻，在所述供体DNA中的DNA片段甲靶点序列的非转录链上产生两个单链DNA切刻，并通过目的植物体内的修复机制将目的植物基因组中的所述DNA片段甲替换为所述DNA片段乙，实现植物基因替换。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述DNA片段甲和所述DNA片段乙的大小均为200-2000bp；

和/或，所述DNA片段甲为序列5第1300-1993位所示的DNA分子；

和/或，所述DNA片段乙为序列1第8513-9206位所示的DNA分子。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述esgRNA结构如下：tRNA-所述DNA片段甲靶点序列转录的RNA-esgRNA骨架；

所述tRNA为a1)或a2)或a3)：

a1)将序列1第474-550位中的T替换为U得到的RNA分子；

a2)将a1)所示的RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA分子；

a3)与a1)或a2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的RNA分子；

所述esgRNA骨架为b1)或b2)或b3)：

b1)将序列1第571-656位中的T替换为U得到的RNA分子；

b2)将b1)所示的RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA分子；

b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的RNA分子。

4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：

所述Cas9切刻酶为Cas9 D10A切刻酶或Cas9 H840A切刻酶；

和/或，所述Cas9 D10A切刻酶为SpCas9n蛋白质；

和/或，所述SpCas9n蛋白质为C1)或C2)：

C1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；

C2)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

和/或，所述SpCas9n蛋白质的编码基因为c1)或c2)或c3)：

c1)序列表中序列1第2887-6987位所示的cDNA分子或DNA分子；

c2)与c1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述SpCas9n的cDNA分子或DNA分子；

c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述SpCas9n的cDNA分子或DNA分子。

5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：

所述Cas9切刻酶或其变体带有核定位信号；

和/或，所述核定位信号为BP NLS、VirD2 NLS或SV40 NLS；

和/或，所述核定位信号为SV40 NLS；

和/或，所述SV40 NLS的氨基酸序列为序列2；

和/或，所述自切割寡肽为来源于病毒基因组的2A自切割寡肽；

和/或，所述来源于病毒基因组的2A自切割寡肽为来源于猪捷申病毒-1的2A自切割寡肽；

和/或，所述来源于猪捷申病毒-1的2A自切割寡肽的氨基酸序列为序列4。

6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：所述筛选剂抗性蛋白为潮霉素磷酸转移酶；

和/或，所述潮霉素磷酸转移酶为D1)或D2)：

D1)氨基酸序列是序列5所示的蛋白质；

D2)将序列表中序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

和/或，所述潮霉素磷酸转移酶的编码基因为d1)或d2)或d3)：

d1)序列表中序列1第7195-8220位所示的cDNA分子或DNA分子；

d2)与d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述潮霉素磷酸转移酶的cDNA分子或DNA分子；

d3)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述潮霉素磷酸转移酶的cDNA分子或DNA分子。

7.根据权利要求1-6所述的方法，其特征在于：所述将esgRNA、Cas9切刻酶或其变体、筛选剂抗性蛋白、供体DNA导入植物中的方法包括如下步骤：将转录esgRNA的DNA分子、Cas9切刻酶或其变体的编码基因、筛选剂抗性蛋白的编码基因和供体DNA导入目的植物中；

和/或，所述转录esgRNA的DNA分子、所述Cas9切刻酶或其变体的编码基因、所述筛选剂抗性蛋白的编码基因和所述供体DNA通过重组表达载体导入目的植物中；

和/或，所述重组表达载体包括依次由启动子、所述转录esgRNA的DNA分子和终止子组成的表达盒和依次由启动子、所述Cas9切刻酶或其变体的编码基因、自切割寡肽的编码基因、筛选剂抗性蛋白的编码基因和终止子组成的表达盒。

8.权利要求1-7任一所述的方法在植物基因编辑中的应用；

或，权利要求1-7任一所述的方法在制备植物突变体中的应用；

或，权利要求1-7任一所述的方法在提高植物基因替换效率中的应用；

或，权利要求1-7任一所述的方法在减少植物基因替换产生的副产物中的应用。

9.一种植物基因编辑的方法，包括如下步骤：按照权利要求1-7任一所述的方法对植物基因组中的目的基因片段进行替换，从而实现植物基因编辑；

或，一种制备植物突变体的方法，包括如下步骤：按照权利要求1-7任一所述的方法对植物基因组中的目的基因片段进行替换，获得植物突变体；

或，一种提高植物基因替换效率的方法，包括如下步骤：按照权利要求1-7任一所述的方法对植物基因组中的目的基因片段进行替换；

或，一种减少植物基因替换产生的副产物的方法，包括如下步骤：按照权利要求1-7任一所述的方法对植物基因组中的目的基因片段进行替换。

10.根据权利要求1-7任一所述的方法或权利要求8所述的应用或权利要求9所述的方法，其特征在于：所述植物为如下m1)-m3)中的任一种：

m1)单子叶植物或双子叶植物；

m2)禾本科植物；

m3)水稻。

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