CN110960517A - 针对Fyn-CD147信号通路靶点的抗肿瘤化合物的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种针对Fyn‑CD147信号通路靶点的抗肿瘤化合物的制备方法和应用，所述抗肿瘤化合物具有如下结构式I表示的结构。本发明中所述的抗肿瘤化合物通过3‑羟基苯乙酮和3,4,5‑三甲氧基苯甲醛，在醇和醇钠的催化下反应生成。该抗肿瘤化合物可有效地抑制皮肤肿瘤细胞、结肠癌细胞、肝癌细胞及肺癌细胞的增殖，其中对于人皮肤恶性黑色素瘤细胞SK‑Mel‑5和SK‑Mel‑28的半抑制浓度分别为1.189μM和0.9476μM，说明该抗肿瘤化合物抑制肿瘤的生长和增殖、诱导肿瘤细胞凋亡的能力较强，可应用于制备抗肿瘤药物。

Description

针对Fyn-CD147信号通路靶点的抗肿瘤化合物的制备方法和 应用

技术领域

本发明涉及药物领域，特别是涉及一种针对Fyn-CD147信号通路靶点的抗肿瘤化合物的制备方法和应用。

背景技术

肿瘤是一种细胞增生性疾病，肿瘤细胞有三个显著的基本特征即：不死性，迁移性和失去接触抑制。从细胞水平上看，癌的发生是极偶然的事件。从遗传上看，癌都是由一个细胞发展而来，由一个失去了增殖控制的细胞发展而来。人体有百万兆的细胞，每天都有几十亿个细胞进行分裂，理论上几乎任何一个细胞都有可能由遗传成份的改变而癌变，但实际上并非如此。细胞的恶性转化需要发生多个遗传改变，即一个细胞发生多次遗传突变。因此肿瘤发生是一个渐进式的过程，涉及多级反应和突变的积累。在此过程中，癌变的细胞系越来越不受体内调节机制的控制，并逐渐向正常组织侵染。在细胞发生恶性转变之后，癌细胞继续积累突变，赋予突变细胞新的特性，使癌细胞更具危险性。目前，抗肿瘤的药物仍然较少，价格昂贵，需要进一步探寻其他抗肿瘤化合物。

发明内容

基于此，有必要提供一种针对Fyn-CD147信号通路靶点的抗肿瘤化合物的应用及其制备方法。

一种针对Fyn-CD147信号通路靶点的抗肿瘤化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述抗肿瘤化合物具有如下结构式I表示的结构：

在其中一个实施例中，所述肿瘤为皮肤恶性黑色素瘤、结肠癌、肝癌或肺癌。

本发明还提供了一种针对Fyn-CD147信号通路靶点的抗肿瘤药物，包含上述抗肿瘤化合物，所述抗肿瘤化合物在所述抗肿瘤药物中的质量百分比不大于99％。

在其中一个实施例中，所述抗肿瘤药物的剂型为注射剂、片剂、膏剂或栓剂。

本发明还提供了一种上述抗肿瘤化合物的制备方法，包括以下步骤：

将醇钠溶于甲醇，然后加入3-羟基苯乙酮和3,4,5-三甲氧基苯甲醛反应40～60小时，调节pH值至1～2后萃取，得到所述抗肿瘤化合物。

在其中一个实施例中，所述3-羟基苯乙酮与所述3,4,5-三甲氧基苯甲醛的摩尔比为(0.8～1.2):1。

在其中一个实施例中，所述醇钠的质量与所述醇的体积的比为(52～56)mg:1mL。

在其中一个实施例中，还包括以下步骤：在所述调节pH值之前，加入2～4mL水并用乙醚洗涤多次。

在其中一个实施例中，还包括以下步骤：用乙醇和水的混合液对所述抗肿瘤化合物进行重结晶。

在其中一个实施例中，所述萃取具体包括以下步骤：用8～12mL乙酸乙酯萃取多次并合并有机相。

本发明的抗肿瘤化合物通过3-羟基苯乙酮和3,4,5-三甲氧基苯甲醛，在醇和醇钠的催化下反应生成，化学反应式如下所示：

该抗肿瘤化合物可有效地抑制皮肤肿瘤细胞、结肠癌细胞、肝癌细胞及肺癌细胞的增殖，其中对于人皮肤恶性黑色素瘤细胞SK-Mel-5和SK-Mel-28的半抑制浓度分别为1.189μM和0.9476μM，对结肠癌细胞的半抑制浓度为6.2μM，对肝癌细胞的半抑制浓度为5.8μM，对肺癌细胞的半抑制浓度为6.45μM，说明该抗肿瘤化合物抑制肿瘤的生长和增殖、诱导肿瘤细胞凋亡的能力较强。且该抗肿瘤化合物能够减弱FYN激酶对CD147酪氨酸的磷酸化，是针对Fyn-CD147信号通路靶点的抗肿瘤化合物，不仅可应用于制备抗肿瘤药物，也为肿瘤的预防和治疗提供了新的理论和实验基础，还可作为工具分子在肿瘤相关的研究中广泛使用。

附图说明

图1为实施例1的抗肿瘤化合物在不同浓度下对人皮肤恶性黑色素瘤细胞SK-Mel-5的CCK-8实验结果图；

图2为实施例1的抗肿瘤化合物在不同浓度下对人皮肤恶性黑色素瘤细胞SK-Mel-28的CCK-8实验结果图；

图3为实施例1的抗肿瘤化合物在不同浓度下对结肠癌细胞HT29的CCK-8实验结果图；

图4为实施例1的抗肿瘤化合物在不同浓度下对肝癌细胞HepG2的CCK-8实验结果图；

图5为实施例1的抗肿瘤化合物在不同浓度下对肺癌细胞A549的CCK-8实验结果图；

图6为查尔酮在不同浓度下对人皮肤恶性黑色素瘤细胞SK-Mel-5的CCK-8实验结果图；

图7为查尔酮在不同浓度下对人皮肤恶性黑色素瘤细胞SK-Mel-28的CCK-8实验结果图；

图8为结构式II的化合物在不同浓度下对人皮肤恶性黑色素瘤细胞SK-Mel-28的CCK-8实验结果图；

图9为结构式III的化合物在不同浓度下对人皮肤恶性黑色素瘤细胞SK-Mel-28的CCK-8实验结果图；

图10为FYN激酶与原核表达纯化的CD147进行体外磷酸化反应，检测抗肿瘤化合物对CD147磷酸化的抑制作用实验结果图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明一实施例的针对Fyn-CD147信号通路靶点的抗肿瘤化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其抗肿瘤化合物具有如下结构式I表示的结构：

在一个具体示例中，上述肿瘤为皮肤恶性黑色素瘤、结肠癌、肝癌或肺癌。可以理解，肿瘤类型不限于此，试验检测该抗肿瘤化合物对其他的肿瘤如基底细胞癌、鳞状细胞癌也有抑制效果。

本发明一实施例的针对Fyn-CD147信号通路靶点的抗肿瘤药物，包含上述抗肿瘤化合物，该抗肿瘤化合物在抗肿瘤药物中的质量百分比不大于99％。可选地，抗肿瘤药物的剂型为注射剂、片剂、膏剂或栓剂等。

在一个具体示例中，上述抗肿瘤药物还包含硬化剂和止痛剂。可选地，硬化剂为乙醇、丙二醇、丙三醇、异丙醇和聚乙二醇中的一种或多种。可选地，止痛剂为阿司匹林、布洛芬、消炎痛、扑热息痛、保泰松、罗非昔布和塞来昔布中的一种或多种。

在一个具体示例中，上述抗肿瘤药物还包含崩解剂和吸收剂。可选地，崩解剂为羟甲基淀粉钠、泡腾崩解剂和交联聚维酮中的一种或多种。可选地，吸收剂为硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙和轻质氧化镁中的一种或多种。

本发明一实施例的上述抗肿瘤化合物的制备方法，包括以下步骤：将醇钠溶于醇，然后加入3-羟基苯乙酮和3,4,5-三甲氧基苯甲醛反应40～60小时，调节pH值至1～2后萃取，得到上述抗肿瘤化合物。

在一个具体示例中，3-羟基苯乙酮与3,4,5-三甲氧基苯甲醛的摩尔比为(0.8～1.2):1。

在一个具体示例中，醇钠的质量与醇的体积的比为(52～56)mg:1mL。

在一个具体示例中，还包括以下步骤：在上述调节pH值之前，加入2～4mL水并用乙醚洗涤多次，可除去部分杂质，提高产品纯度。

在一个具体示例中，还包括以下步骤：用乙醇和水的混合液对上述抗肿瘤化合物进行重结晶，可以进一步提高其纯度。

在一个具体示例中，上述萃取具体包括以下步骤：用8～12mL乙酸乙酯萃取多次并合并有机相。

本发明的抗肿瘤化合物通过3-羟基苯乙酮和3,4,5-三甲氧基苯甲醛，在醇和醇钠的催化下反应生成，化学反应式如下所示：

该抗肿瘤化合物可有效地抑制皮肤肿瘤细胞、结肠癌细胞、肝癌细胞及肺癌细胞的增殖，其中对于人皮肤恶性黑色素瘤细胞SK-Mel-5和SK-Mel-28的半抑制浓度分别为1.189μM和0.9476μM，对结肠癌细胞的半抑制浓度为6.2μM，对肝癌细胞的半抑制浓度为5.8μM，对肺癌细胞的半抑制浓度为6.45μM，说明该抗肿瘤化合物抑制肿瘤的生长和增殖、诱导肿瘤细胞凋亡的能力较强。且该抗肿瘤化合物能够减弱FYN激酶对CD147酪氨酸的磷酸化，是针对Fyn-CD147信号通路靶点的抗肿瘤化合物，不仅可应用于制备抗肿瘤药物，也为肿瘤的预防和治疗提供了新的理论和实验基础，还可作为工具分子在肿瘤相关的研究中广泛使用。

以下为具体实施例。

实施例1

将216mg甲醇钠溶于4mL无水甲醇中，冷却至零度。然后加入3-羟基苯乙酮(139mg，1mmol)和3,4,5-三甲氧基苯甲醛(200mg，1mmol)，升至室温并搅拌48小时。浓缩后加入3mL水，用1mL乙醚洗涤三次，再用浓盐酸调节pH值到1，用乙酸乙酯10mL萃取三次，合并有机相，浓缩后用乙醇和水的混合液重结晶得到呈淡黄色晶体的目标产物236mg，根据实际产量除以理论产量得产率75％。核磁共振谱为：¹H NMR(500MHz,DMSO)δ9.82(s,1H),7.83(d,J＝15.6Hz,1H),7.72-7.60(m,2H),7.48-7.46(m,1H),7.39(t,J＝7.9Hz,1H),7.23(s,2H),7.07(dd,J＝8.1,1.3Hz,1H),3.87(s,6H),3.72(s,3H)；¹³C NMR(125MHz,DMSO)δ189.6,158.2,153.6,144.8,140.2,139.6,130.7,130.2,121.9,120.7,120.1,115.1,107.0,60.6,56.6.。

实施例2

将180mg甲醇钠溶于4mL无水甲醇中，冷却至零度。然后加入3-羟基苯乙酮(139mg，1mmol)和3,4,5-三甲氧基苯甲醛(200mg，1mmol)，升至室温并搅拌24小时。浓缩后加入3mL水，用1mL乙醚洗涤三次，再用浓盐酸调节pH值到1，用乙酸乙酯10mL萃取三次，合并有机相，浓缩后用乙醇和水的混合液重结晶得到呈淡黄色晶体的目标产物198mg。

实施例3

将216mg乙醇钠溶于4mL无水乙醇中，冷却至零度。然后加入3-羟基苯乙酮(139mg，1mmol)和3,4,5-三甲氧基苯甲醛(200mg，1mmol)，升至室温并搅拌48小时。浓缩后加入3mL水，用1mL乙醚洗涤三次，再用浓盐酸调节pH值到1，用乙酸乙酯10mL萃取三次，合并有机相，浓缩后用乙醇和水的混合液重结晶得到呈淡黄色晶体的目标产物129mg。

对比例1

在4mL无水甲醇中，加入3-羟基苯乙酮(139mg，1mmol)和3,4,5-三甲氧基苯甲醛(200mg，1mmol)，于室温搅拌48小时，无法得到目标产物。

使用实施例1得到的抗肿瘤化合物进行CCK-8测试：分别取人皮肤恶性黑色素瘤细胞SK-Mel-5和SK-Mel-28，用含10％胎小牛血清的培养基配成单细胞悬液，计数以每孔1000个细胞接种到96孔板，每孔体积100ul，贴壁后加入不同浓度的抗肿瘤化合物(50nM、100nM、500nM和1μM)，DMSO组加入最大药物相应体积，于0h、24h、48h、72h进行测定，在测定前加入10ul的CCK-8，孵育2小时后，在酶标仪上450nm波长测定各孔吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。结果如图1和图2所示，可见该抗肿瘤化合物对SK-Mel-5和SK-Mel-28均有较好的抑制效果，半抑制浓度分别为1.189μM和0.9476μM。分别取结肠癌细胞HT29、肝癌细胞HepG2和肺癌细胞A549，用含10％胎小牛血清的培养基配成单细胞悬液，计数以每孔1000个细胞接种到96孔板，每孔体积100ul，贴壁后加入不同浓度的抗肿瘤化合物(1μM、5μM、10μM和20μM)，DMSO组加入最大药物相应体积，于0h、24h、48h、72h进行测定，在测定前加入10ul的CCK-8，孵育2小时后，在酶标仪上450nm波长测定各孔吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。结果分别如图3～5所示，可见该抗肿瘤化合物对结肠癌、肝癌和肺癌也有一定的抑制效果，半抑制浓度分别为6.2μM、5.8μM和6.45μM。

使用骨架化合物查尔酮进行CCK-8测试：分别取人皮肤恶性黑色素瘤细胞SK-Mel-5和SK-Mel-28，用含10％胎小牛血清的培养基配成单细胞悬液，计数以每孔1000个细胞接种到96孔板，每孔体积100ul，贴壁后加入不同浓度的查尔酮(1μM、5μM、10μM和20μM)，DMSO组加入最大药物相应体积，于0h、24h、48h、72h进行测定，在测定前加入10ul的CCK-8，孵育2小时后，在酶标仪上450nm波长测定各孔吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。结果如图6和图7所示，半抑制浓度分别为2.5μM和6.7μM，效果远远不如本发明的抗肿瘤化合物。

使用如下结构式II的化合物进行CCK-8测试：取人皮肤恶性黑色素瘤细胞SK-Mel-28，用含10％胎小牛血清的培养基配成单细胞悬液，计数以每孔1000个细胞接种到96孔板，每孔体积100ul，贴壁后加入不同浓度的上述化合物(1μM、5μM和20μM)，DMSO组加入最大药物相应体积，于0h、24h、48h、72h进行测定，在测定前加入10ul的CCK-8，孵育2小时后，在酶标仪上450nm波长测定各孔吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。结果如图8所示，半抑制浓度为20.1μM，效果很差，远远不如本发明的抗肿瘤化合物。

使用如下结构式III的化合物进行CCK-8测试：取人皮肤恶性黑色素瘤细胞SK-Mel-28，用含10％胎小牛血清的培养基配成单细胞悬液，计数以每孔1000个细胞接种到96孔板，每孔体积100ul，贴壁后加入不同浓度的上述化合物(5μM、10μM和20μM)，DMSO组加入最大药物相应体积，于0h、24h、48h、72h进行测定，在测定前加入10ul的CCK-8，孵育2小时后，在酶标仪上450nm波长测定各孔吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。结果如图9所示，半抑制浓度为20.7μM，效果很差，远远不如本发明的抗肿瘤化合物。

体内实验：为进一步探究本发明的抗肿瘤化合物在体内的作用，以5-6周龄的裸鼠来建立异种移植物模型，选择增殖速度较快的黑色素瘤细胞SK-Mel-5作为接种细胞，选取生长状态良好，无污染，活力强的细胞扩增，对40只裸鼠进行皮下成瘤。接种后的7～10天，连续观察直至肿瘤体积大小达50mm³～100mm³，选取符合上述标准的裸鼠，随机将其分为3组：对照组、20mg/kg剂量组和40mg/kg剂量组，每组6只，分组后分笼饲养，连续腹腔注射本发明的抗肿瘤化合物治疗，隔日测量肿瘤体积大小，直至对照组肿瘤大小达1000mm³时终止实验，取下老鼠的瘤体做免疫组化，检测Ki67的表达。

实验结果：在治疗后，各组裸鼠均未出现死亡，体重均随治疗时间延长而有所增加。与对照组相比，20mg/kg剂量组肿瘤的生长受到明显的抑制，而40mg/kg剂量组较20mg/kg剂量组更明显。上述结果可以证明本发明的抗肿瘤化合物可在体内有效地抑制黑色素瘤的生长。

本发明进一步对该抗肿瘤化合物的作用机制进行了研究和筛查，发现该抗肿瘤化合物主要针对Fyn-CD147信号通路靶点起作用。通过将Fyn激酶与纯化的CD147反应，反应体系：Fyn 1uL(100ng)、CD147(5ul)、10×Kinase Buffer(2ul)、ATP(1mM 1ul)、抗肿瘤化合物(5μM 2μL)，30℃反应40分钟，然后进行Western Blot和考马斯染色。结果如图10所示(其中anti-p是酪氨酸磷酸化的抗体)，说明本发明的抗肿瘤化合物能够减弱FYN激酶对CD147酪氨酸的磷酸化，从而证明该抗肿瘤化合物是针对Fyn-CD147信号通路靶点的抗肿瘤化合物，为肿瘤的预防和治疗提供了新的理论和实验基础，还可作为工具分子在肿瘤相关的研究中广泛使用。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种针对Fyn-CD147信号通路靶点的抗肿瘤化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述抗肿瘤化合物具有如下结构式I表示的结构：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为皮肤恶性黑色素瘤、结肠癌、肝癌或肺癌。

3.一种针对Fyn-CD147信号通路靶点的抗肿瘤药物，其特征在于，包含权利要求1中所述的抗肿瘤化合物，所述抗肿瘤化合物在所述抗肿瘤药物中的质量百分比不大于99％。

4.根据权利要求3所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗肿瘤药物的剂型为注射剂、片剂、膏剂或栓剂。

5.一种权利要求1中所述的抗肿瘤化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将醇钠溶于醇，然后加入3-羟基苯乙酮和3,4,5-三甲氧基苯甲醛反应40～60小时，调节pH值至1～2后萃取，得到所述抗肿瘤化合物。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述3-羟基苯乙酮与所述3,4,5-三甲氧基苯甲醛的摩尔比为(0.8～1.2):1。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述醇钠的质量与所述醇的体积的比为(52～56)mg:1mL。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：在所述调节pH值之前，加入2～4mL水并用乙醚洗涤多次。

9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：用乙醇和水的混合液对所述抗肿瘤化合物进行重结晶。

10.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述萃取具体包括以下步骤：用8～12mL乙酸乙酯萃取多次并合并有机相。

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