CN110938550A - 一种促进褐色喜热裂孢菌降解农业废弃物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种促进褐色喜热裂孢菌对含有木聚糖的底物进行利用的方法，所述褐色喜热裂孢菌产生木聚糖酶从而分解木聚糖产生木寡糖和木糖，所述方法包括控制反应体系中木寡糖的含量的步骤。另一方面，本发明还提供了一种提高褐色喜热裂孢菌对含有木聚糖的底物的利用效率的方法，所述方法包括利用含有木聚糖的底物对褐色喜热裂孢菌进行培养的步骤，所述褐色喜热裂孢菌可以产生木聚糖酶和纤维素酶，所述方法还包括在所述培养过程中加入疏棉状嗜热丝孢菌的步骤。

Description

一种促进褐色喜热裂孢菌降解农业废弃物的方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种促进褐色喜热裂孢菌生长的方法，尤其涉及一种促进褐色喜热裂孢菌降解木质纤维素以及促进褐色喜热裂孢菌对农业废弃物利用的方法。
背景技术
木质纤维素生物质是地球上主要的光合作用固定的碳，已经证明高效的木质纤维素降解是维持全球碳循环和生物工业发展的关键。小麦、玉米、水稻等作为主要的粮食作物，每年大概会产生约22亿吨以上的农业废弃物，这些农业废弃物的合理利用既能减少焚烧等带来的污染，又能变废为宝，作为可再生能源物质。因此，生物降解农业废弃物生物质是一种绿色有潜力的农业废弃物处理方式。
木质纤维素的降解首先需要半纤维素酶来降解木聚糖等半纤维素，然后需要纤维素酶来降解暴露出的纤维素。木质纤维素降解微生物分泌的酶在木质纤维素的降解过程中起着重要的作用。许多微生物已被证明是优秀的木质纤维素降解酶的生产者，如里氏木霉和草酸青霉在工业生产中表现出高效的木质纤维素降解能力，烟曲霉可在玉米秸秆/麦麸(CSWB)培养基上分泌241种木质纤维素降解酶。然而，在工业中，微生物和酶常常面临严峻的条件，如高温和极端的pH。嗜热微生物和耐热酶在工业生产中表现出明显的优势，例如，加速木质纤维素的分解和降低污染风险。虽然许多性能优良的耐热酶已经被克隆，但是单酶不可能完成木质纤维素的降解，而一系列酶的异源表达亦会增加成本。因此，寻找和研究能共同降解木质纤维素的微生物群体成为一个热点。
在本发明中，我们研究了疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌分别单独培养和共培养时的分泌组和底物利用的差异，目的是构建有效的微生物菌剂和酶制剂，为木质纤维素生物质的开发利用提供新的思路。
发明内容
一方面，本发明提供了一种促进褐色喜热裂孢菌对含有木聚糖的底物进行利用的方法，所述褐色喜热裂孢菌产生木聚糖酶从而分解木聚糖产生木寡糖和木糖，其特征在于，所述方法包括控制反应体系中木寡糖的重量体积(质量/体积)含量不高于0.7％；优选的，不高于0.6％，更优选，不高于0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％。
本发明中，所述木寡糖包括木二糖、木三糖、木四糖、木五糖。
进一步的，所述方法还包括控制反应体系中木糖的重量体积(质量/体积)含量不高于0.7％；优选的，不高于0.6％，更优选，不高于0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％。
上述含有木聚糖的底物可以是溶液相的底物，也可以是固体相的底物。上述褐色喜热裂孢菌在对所述底物进行利用时，褐色喜热裂孢菌产生木聚糖酶从而分解木聚糖产生木寡糖和木糖，基于此，形成了反应体系。
上述反应体系中木寡糖或木糖的含量，包含了由褐色喜热裂孢菌分解木聚糖产生的木寡糖和木糖，也包含了底物中本身所含有的木寡糖和木糖。
在一个实施方式中，所述促进褐色喜热裂孢菌对含有木聚糖的底物进行利用体现在提高褐色喜热裂孢菌的生物量或者提高褐色喜热裂孢菌对所述底物的降解程度。
在一个实施方式中，所述控制木聚糖或木糖的含量的方法包括从反应体系中移出木聚糖或木糖的步骤；在其他的实施方式中，所述控制木聚糖或木糖的含量的方法包括引入能够利用木聚糖或木糖的微生物或酶的步骤；优选的，所述能够利用木聚糖或木糖的微生物包括疏棉状嗜热丝孢菌。
进一步的，所述含有木聚糖的底物还含有纤维素；在一个实施方式中，所述底物选自生物质纤维素，所述生物质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素组成；在优选的实施方式中，所述生物质纤维素包括硬木、软木和禾本科植物等。在一个实施方式中，上述底物可以来源于农业废弃物，例如玉米秸秆、小麦秸秆、小麦麸皮、稻壳等。
另一方面，本发明提供了一种提高褐色喜热裂孢菌对含有木聚糖的底物的利用效率的方法，所述方法包括利用含有木聚糖的底物对褐色喜热裂孢菌进行培养的步骤，所述褐色喜热裂孢菌可以产生木聚糖酶和纤维素酶，其特征在于，所述方法还包括在所述培养过程中加入疏棉状嗜热丝孢菌。
上述提高褐色喜热裂孢菌对含有木聚糖的底物的利用效率体现在提高褐色喜热裂孢菌的生物量或者提高褐色喜热裂孢菌对所述底物的降解程度或者提高褐色喜热裂孢菌所产生的纤维素酶的量。
在一个实施方式中，所述纤维素酶包括内切纤维素酶，外切纤维素酶和裂解多糖单加氧酶。
进一步的，所述疏棉状嗜热丝孢菌与褐色喜热裂孢菌的用量比例为1:100-100:1，优选，1:10-10:1，更优选，1:1。
上述含有木聚糖的底物可以是溶液相的底物，也可以是固体相的底物。上述褐色喜热裂孢菌在对所述底物进行利用时，褐色喜热裂孢菌产生木聚糖酶从而分解木聚糖产生木寡糖和木糖，基于此，形成了反应体系。
进一步的，所述含有木聚糖的底物还含有纤维素；在一个实施方式中，所述底物选自生物质纤维素，所述生物质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素组成；在优选的实施方式中，所述生物质纤维素包括硬木、软木和禾本科植物等。在一个实施方式中，上述底物可以来源于农业废弃物，例如玉米秸秆、小麦秸秆、小麦麸皮、稻壳等。
进一步的，上述培养的温度为30℃-70℃，优选，40℃-65℃，更优选，50℃-60℃。
本发明中，发明人发现了褐色喜热裂孢菌在以生物质纤维素为底物进行生长时，必须与疏棉状嗜热丝孢菌共培养才能生长。分泌组表明，木聚糖主要诱导褐色喜热裂孢菌分泌一系列木聚糖酶将木聚糖降解成木寡糖和木糖，然而，高浓度的(>0.5％，质量/体积)的木寡糖和木糖会抑制褐色喜热裂孢菌的生长。当疏棉状嗜热丝孢菌将外侧的木聚糖降解，暴露出的纤维素可以特异性诱导褐色喜热裂孢菌共表达一个带CBM2的GH10家族木聚糖酶(Q47KR6，5.03±1.33％)和丰富的纤维素酶。因此，疏棉状嗜热丝孢菌可以利用木聚糖在前期阶段快速生长，而褐色喜热裂孢菌主要利用纤维素在后期成为优势菌。另外，疏棉状嗜热丝孢菌的存在可以促进褐色喜热裂孢菌分泌更多的纤维素酶(提高了19-25％)。拥有嗜热的木聚糖和纤维素降解体系的褐色喜热裂孢菌不能独自在生物质纤维素上生长，可能是由于缺乏对木聚糖降解产物的有效利用能力。木聚糖的降解产物可以调节疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌的生长。疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌的生长底物利用能力的互补性表明它们可能用来生产可以在55℃生长的嗜热微生物菌剂以及可以耐受60℃高温的酶制剂。
附图说明
图1.疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌在玉米秸秆固体培养基(A)和液体培养基(B-G)上单独培养和共培养10天。A、疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌在玉米秸秆固体培养基上生长表征。B、当疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌单独培养或共培养在玉米秸秆液体培养基上时的木聚糖酶酶活测定。C、当疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌单独培养或共培养在玉米秸秆液体培养基上时的内切纤维素酶酶活测定。D-F、木聚糖酶活性酶谱表征了在玉米秸秆液体培养基中培养的疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌分泌的木聚糖酶。G、ITS和16S rDNA的相对基因含量分别代表了在玉米秸秆液培养基中生长的疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌的相对生物量。M1和M2分别代表疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌的阳性对照。1代表疏棉状嗜热丝孢菌分泌的木聚糖酶的条带。2-5为褐色喜热裂孢菌分泌的木聚糖酶条带。
图2.木聚糖酶(A-C)和纤维素酶(D-F)的活性酶谱图显示了在玉米秸秆固体培养基上生长的疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌分泌木聚糖酶和纤维素酶的情况。在玉米秸秆固体培养基上单独培养时，褐色喜热裂孢菌不能分泌木聚糖酶和纤维素酶，但与疏棉状嗜热丝孢菌共培养时能分泌四条木聚糖酶和四条内切纤维素酶条带。M1和M2分别代表疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌阳性对照。1代表疏棉状嗜热丝孢菌分泌的木聚糖酶条带。2-5为褐色喜热裂孢菌分泌的木聚糖酶条带。6-9为褐色喜热裂孢菌分泌的的内切纤维素酶条带。
图3.在不同的碳源上单独培养疏棉状嗜热丝孢菌或褐色喜热裂孢菌5天时其细胞内蛋白和细胞外还原糖以及酶活性的检测。A、疏棉状嗜热丝孢菌或褐色喜热裂孢菌在1％(质量/体积)碳源上生长特征。B.细胞内总蛋白产量代表疏棉状嗜热丝孢菌或褐色喜热裂孢菌的生物量。C.第五天还原糖的相对量变化。D、疏棉状嗜热丝孢菌或褐色喜热裂孢菌分泌的粗酶液中木聚糖酶活性测定。E、疏棉状嗜热丝孢菌或褐色喜热裂孢菌分泌的粗酶液中内切纤维素酶活性测定。+++，显著生长；++,生长；+,少量生长；-,不生长。
图4.浓度为0.1％-1％(质量/体积)的木寡糖或木糖对疏棉状嗜热丝孢菌或褐色喜热裂孢菌生长状态的影响。高浓度的木寡糖或木糖促进了疏棉状嗜热丝孢菌的生长，抑制了褐色喜热裂孢菌的生长。
图5.活性酶谱分析褐色喜热裂孢菌在不同碳源生长5天时分泌的木聚糖酶和内切纤维素酶差异。A、木聚糖酶活性酶谱分析由不同碳源诱导褐色喜热裂孢菌分泌的木聚糖酶。木聚糖主要诱导褐色喜热裂孢菌分泌条带4和5的木聚糖酶，而褐色喜热裂孢菌在纤维素培养基上生长时，主要分泌条带2和3木聚糖酶。B、羧甲基纤维素钠活性酶谱分析不同碳源诱导褐色喜热裂孢菌分泌的内切纤维素酶。纤维素诱导褐色喜热裂孢菌分泌最多内切纤维素酶。高浓度的木寡糖和木糖抑制了褐色喜热裂孢菌分泌木聚糖酶和纤维素酶。2-5为褐色喜热裂孢菌分泌的木聚糖酶的条带。6-9为褐色喜热裂孢菌分泌的内切纤维素酶的条带。
图6.荧光辅助糖电泳定量检测胞外还原糖含量变化。A-E代表疏棉状嗜热丝孢菌在0.1％-1％(质量/体积)木寡糖浓度下生长时的胞外还原糖条带变化。F-J代表褐色喜热裂孢菌在0.1％-1％(质量/体积)木寡糖浓度下生长时的胞外还原糖条带变化。K-O为褐色喜热裂孢菌在1％纤维素与0.1％-1％(质量/体积)木寡糖混合物上生长时的胞外还原糖条带变化。M代表木糖标准物。X1-X5分别代表木糖、木二糖、木三糖、木四糖和木五糖。
图7.用荧光辅助糖电泳定量检测木聚糖水解产物变化。褐色喜热裂孢菌分泌的木聚糖酶可在2分钟内迅速将木聚糖降解为大量的木寡糖。Lane M代表木糖标准物。X1-X4分别代表木糖、木二糖、木三糖和木四糖。
图8.木聚糖酶活性酶谱表征疏棉状嗜热丝孢菌或褐色喜热裂孢菌在纤维素与不同浓度的木寡糖或木糖混合物上生长时的木聚糖酶分泌情况。M1和M2分别代表疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌阳性对照。1代表疏棉状嗜热丝孢菌分泌的木聚糖酶条带。2-5为褐色喜热裂孢菌分泌的木聚糖酶条带。
实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例一、材料与方法
1、材料和菌株
纤维素、纤维二糖、葡萄糖、木寡糖、木糖和NaCNBH3均购自上海生工生物科技有限公司(Ltd.Shanghai,China)。木聚糖、7-氨基-1,3-萘二磺酸一水合物、三氯乙酸、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺和胰蛋白酶购自Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO,USA)。所用的所有其他化学品都是分析纯。
疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosus)可以采用本领域常规的疏棉状嗜热丝孢菌，例如专利申请号：201810018260.X的中国发明专利中的疏棉状嗜热丝孢菌。褐色喜热裂孢菌(Thermobifidafusca)DSM10635是从德国菌种保藏中心购买得到。
2、固态发酵和蛋白质提取
将疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌分别在PDA和察氏培养基中55℃培养2天作为菌种。以1:4(质量/体积)的比例将玉米秸秆粉与察氏培养基(不含蔗糖)混合，进行固态发酵培养疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌，最终培养基含水量约为80％(质量/体积)。在300毫升锥形瓶中加入50g培养基，115℃灭菌30分钟,500μL菌种接种于培养基中，55℃培养10d。每两天取一次样品。取样后,立即加50毫升蒸馏水到培养基中,在4℃摇床上200转摇1h。使用8层纱布过滤分离培养基和菌丝体,离心机8000g离20分钟得到粗酶液样品。样品保存在4℃直到进一步使用。
3、液体发酵和蛋白质提取
疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌按照上述方法活化。共培养时,1.5毫升疏棉状嗜热丝孢菌和1.5毫升褐色喜热裂孢菌作为菌种接种到300毫升察氏培养基，包含1％(质量/体积)玉米秸秆粉或纤维素(纤维素)与浓度梯度木寡糖(包括木二糖、木三糖、木四糖、木五糖)或木糖的混合物(1％纤维素+1％木寡糖,1％纤维素+0.7％木寡糖,1％纤维素+0.5％木寡糖,1％纤维素+0.3％木寡糖,1％纤维素+0.1％木寡糖,1％纤维素+1％木糖,1％纤维素+0.7％木糖,1％纤维素+0.5％木糖,1％纤维素+0.3％木糖,1％纤维素+0.1％木糖,质量/体积)作为碳源。纯培养时,1.5毫升疏棉状嗜热丝孢菌或1.5毫升褐色喜热裂孢菌接种到300毫升包含不同碳源(1％木糖,1％木寡糖,1％木聚糖,1％葡萄糖,1％纤维二糖,1％纤维素,0.1％木寡糖,0.3％木寡糖,0.5％木寡糖,0.7％木寡糖,1％木寡糖,1％纤维素+0.1％木寡糖,1％纤维素+0.3％木寡糖,1％纤维素+0.5％木寡糖,1％纤维素+0.7％木寡糖,1％纤维素+1％木寡糖,质量/体积)的察氏培养基。在55℃以200转培养5天。每天取10毫升培养基。培养基和菌丝体通过在4℃10000转离心5分钟去除。上层清液进一步通过0.22微米膜(鼎国,北京)过滤。上清置于4℃保存，作为粗酶液用于后续实验。每个碳源进行了三次独立的重复。
4、利用活性酶谱分析蛋白质
采用活性酶谱法检测不同条件下木聚糖酶和内切纤维素酶活性条带的差异。以pH为6.0的磷酸氢二钠/柠檬酸缓冲液，分别加入木聚糖或羧甲基纤维素钠(2％，质量/体积)为底物。分离胶的浓度是10％(质量/体积)，每孔上样量为15微升。电泳后，凝胶在木聚糖或羧甲基纤维素钠溶液中60℃浸泡30分钟，然后用0.5％(质量/体积)刚果红将凝胶染色，用1m NaCl脱色。最后，使用扫描仪7550R对凝胶进行扫描。
5、生物量和酶活分析
取5毫升培养液，10000g离心5分钟，用新鲜培养基洗涤1次。然后,沉积物溶解在1毫升50mMTris–HCl缓冲液(pH6.8)，其中包含0.1M二硫苏糖醇和50％甘油,然后用70％的强度超声破碎30分钟。在10000g离心5分钟,用考马斯亮蓝测定上层清液中蛋白质含量。细胞干重(DCW)与细胞质蛋白含量成比例相关。采用二硝基水杨酸法定量测定粗酶中还原糖浓度、木聚糖酶活性、内切纤维素酶活性。用1mg/毫升木糖或葡萄糖制备标准曲线。以XY或羧甲基纤维素钠(1％，质量/体积)溶于磷酸氢钠/柠檬酸缓冲液(pH 6.0)中作为底物，测定木聚糖酶或内切纤维素酶活性。400微升酶与600微升的底物在60℃反应30分钟,然后立即加800微升DNS终止反应，紧接着煮沸10分钟，加入8.2毫升水，然后用紫外分光光度计(上海普源仪器有限公司)在550nm处测定混合物的吸光度。酶活性被定义为1IU即在最适温度和最适pH值条件下1分钟内从木聚糖或羧甲基纤维素钠释放1微米木糖或葡萄糖。
6、荧光辅助糖电泳(FACE)
利用FACE方法对聚糖水解产物的种类和浓度进行了鉴定和定量。每个样品或maker(5微升)与5微升0.2M的7-氨基-1,3-萘二磺酸一水合物15％醋酸溶液混合，黑暗孵化1h以标记样品。然后,加入5微升1M NaCNBH3,42℃过夜。每孔上样7微升,每板在7mA进行电泳。使用ChemiDoc MP系统(Bio-Rad)来扫描凝胶。以纤维糊精为葡萄糖maker。以木寡糖混合木糖为木糖maker。
实施例二、在玉米秸秆培养基上培养疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌
选择玉米秸秆模拟自然生境的碳源。在玉米秸秆固体培养基上单独培养疏棉状嗜热丝孢菌时，可以检测到白色菌丝体，而褐色喜热裂孢菌不能单独生长在玉米秸秆固体培养基上(图1A)。
当褐色喜热裂孢菌与疏棉状嗜热丝孢菌共同培养时，可以观察到更多的白色菌丝体和四条由褐色喜热裂孢菌分泌的木聚糖酶带(图2中条带2-5)和四条由褐色喜热裂孢菌分泌的纤维素酶条带(图2中条带6-9)；也就是说，当褐色喜热裂孢菌与疏棉状嗜热丝孢菌共同培养可以分泌大量的木聚糖酶和纤维素酶(图2)。
在玉米秸秆液体培养基中，疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌都可以分泌木聚糖酶，而与纯培养相比，二者共培养时木聚糖酶活性并未增加(图1B)。另外，褐色喜热裂孢菌可以分泌纤维素酶，疏棉状嗜热丝孢菌不分泌纤维素酶；但是，当与疏棉状嗜热丝孢菌共培养时，褐色喜热裂孢菌分泌的纤维素酶活性较纯培养时提高了19-25％(图1C)。
利用活性酶谱进一步展示了这两个菌株分泌的木聚糖酶和纤维素酶。疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌在玉米秸秆液体培养基上分别生长时，疏棉状嗜热丝孢菌主要分泌一条木聚糖酶条带(图1D)，褐色喜热裂孢菌主要分泌四条木聚糖酶条带(图1E)，它们共同培养时，检测到它们各自分泌的木聚糖酶，但是疏棉状嗜热丝孢菌分泌木聚糖酶的时间要早于褐色喜热裂孢菌(图1F)；与共培养相比，在纯培养条件下，褐色喜热裂孢菌分泌的木聚糖酶条带4和5更明显，说明单独培养时，褐色喜热裂孢菌分泌更多的木聚糖酶条带4和5(图1F)。利用内转录间隔子(ITS)和16S核糖体RNA(rRNA)测定疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌共培养过程中的相对生物量，与活性酶谱具有相似的规律。疏棉状嗜热丝孢菌在早期阶段(第4天之前)迅速生长为优势微生物，第4天的相对基因含量为70％。然而，从第5天开始，疏棉状嗜热丝孢菌很快被褐色喜热裂孢菌取代，其相对基因含量在第7天达到90％以上(图1G)。相对基因含量显示,疏棉状嗜热丝孢菌在第四天生长最好,然而,木聚糖酶酶谱表明,疏棉状嗜热丝孢菌最高的木聚糖酶条带强度在第二天出现，第四天已经开始逐渐退化,表明活性酶谱能更敏感地反映微生物演替(图1)。
实施例三、疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌单独培养时的生长和酶分泌特性
木聚糖和纤维素是木糖或葡萄糖的多聚物，是植物材料中含量最丰富的成分。以木聚糖和纤维素相关底物(1％木糖、1％木寡糖(木寡糖)、1％木聚糖、1％葡萄糖、1％纤维二糖和1％微晶纤维素(纤维素)，质量/体积)作为纯培养的碳源。疏棉状嗜热丝孢菌在所有底物上都能生长，但1％的木糖(质量/体积)和1％的木寡糖(质量/体积)抑制了褐色喜热裂孢菌的生长(图3A)。
利用浓度梯度的木寡糖以及其与纤维素的混合物分别培养疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌。对于纯培养的疏棉状嗜热丝孢菌来说，随着木寡糖浓度从0.1％增加到1％(质量/体积)，代表生物量的胞内蛋白产量从0.16±0.01微克/毫升持续增加到1.25±0.12微克/毫升，说明较高的木寡糖浓度促进了疏棉状嗜热丝孢菌的生长。而褐色喜热裂孢菌单独培养时，随着木寡糖浓度从0.1％增加到1％(质量/体积)，细胞内蛋白产量从0.22±0.01微克/毫升下降到0微克/毫升左右，说明较高的木寡糖浓度抑制了褐色喜热裂孢菌的生长和利用纤维素的能力(图3B)。
木糖是木寡糖的降解产物，木糖对疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌的生长展示出与木寡糖相似的影响(图4)。在木寡糖浓度梯度(0.1％-1％，质量/体积)条件下，疏棉状嗜热丝孢菌在5天的培养中几乎吸收了培养基中所有的还原糖。而当木寡糖浓度高于0.5％(质量/体积)时，褐色喜热裂孢菌在培养5天后培养基中还原糖含量几乎没有下降，说明褐色喜热裂孢菌不能吸收高浓度的木寡糖(图3C)。
对于疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌，最高的的木聚糖酶活性(10.88±0.06IU/毫升)和(10.75±0.54IU/毫升)均出现在以木聚糖为诱导物的条件下(图3D)，木聚糖酶活性酶谱也表明在以木聚糖为诱导物的条件下木聚糖酶条带亮度最强。但是，木聚糖和纤维素诱导的木聚糖酶条带有显著差异；木聚糖主要诱导褐色喜热裂孢菌分泌木聚糖酶谱带4和5，而纤维素主要诱导分泌木聚糖酶谱带2和3(图5)。另外，并没有检测到疏棉状嗜热丝孢菌分泌的纤维素酶活性(图3E)。在纤维素上培养褐色喜热裂孢菌时，检测到其分泌的内切纤维素酶活性最高(7.35±0.16IU/毫升)(图3E)。高浓度的木寡糖(>0.5％，质量/体积)抑制褐色喜热裂孢菌分泌木聚糖酶和纤维素酶(图3D,3E)。
褐色喜热裂孢菌在木聚糖上培养时木聚糖酶分泌最多，而木聚糖的降解产物木寡糖和木糖可以抑制褐色喜热裂孢菌的生长和酶分泌。说明在长期的木质纤维素降解过程中，疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌可能存在一定的协同机制。
实施例四、基于荧光辅助糖电泳表征疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌对底物的降解和利用动态变化
进一步用荧光辅助糖电泳(FACE)的方法检测和定量了疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌在单独培养过程中寡糖种类和浓度的变化(图6)。
对于疏棉状嗜热丝孢菌而言，与图1B中观测到的还原糖含量降低相一致,所有浓度梯度(0.1％-1％,质量/体积)木寡糖条带的强度从第1天开始明显减弱，并且在第二天后几乎完全消失了，表明疏棉状嗜热丝孢菌对木寡糖的快速利用(图6A-E)。
对于褐色喜热裂孢菌,尽管当它生长在0.1％木寡糖时,寡糖条带在第一天就大幅消失(图6F),然而如果较高浓度木寡糖(>0.5％,质量/体积)用作底物，还原糖条带基本不变(图6H-J),进一步说明,这一菌株不能利用高浓度木寡糖。直到木寡糖浓度降低到0.1％(质量/体积)，褐色喜热裂孢菌才能恢复利用纤维素的能力(图6K-O)。而褐色喜热裂孢菌粗酶液水解木聚糖可以在2分钟内迅速积累大量的木寡糖条带(图7),这意味着褐色喜热裂孢菌分泌的木聚糖酶降解木聚糖在玉米秸秆固体环境中很容易导致木寡糖的积累,这可能是为什么褐色喜热裂孢菌不能独自生长在玉米秸秆固体培养基上的原因。
实施例五、用LC-MS/MS法检测疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌分泌组中的木质纤维素降解酶
进一步用液相色谱-质谱/质谱分析(LC-MS/MS)方法来检测不同碳源诱导疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌分泌的蛋白差异(表1-2)。疏棉状嗜热丝孢菌分泌组中只检测到一个GH11木聚糖酶(g4601.t1)(表1),表明活性酶谱中的木聚糖酶条带1是疏棉状嗜热丝孢菌分泌的木聚糖酶g4601.t1(图1,4)，木聚糖诱导疏棉状嗜热丝孢菌分泌最多的木聚糖酶(g4601)(表1)，与木聚糖酶活性检测结果一致(图2D)。木寡糖浓度越高，诱导疏棉状嗜热丝孢菌分泌更多的木聚糖酶(表1)。
对于褐色喜热裂孢菌，当其在木聚糖上生长时，GH11家族的木聚糖酶(W8GGR4,6.5±0.08％)是最丰富的蛋白，而当纤维素作为底物时，褐色喜热裂孢菌主要分泌GH10木聚糖酶(Q47KR6,5.03±1.33％)(表2)。木聚糖酶活性酶谱中的木聚糖酶条带4和5为W8GGR4，条带2和3为Q47KR6(图5A)。同一木聚糖酶表现出不同的电泳迁移率可能与其构象有关。Q47KR6是一种包含CBM2的GH10木聚糖酶，GH10木聚糖酶对侧链残基的耐受性大于GH11木聚糖酶，而CBM2主要结合结晶纤维素，因此我们推测Q47KR6可能结合纤维素并清除取代的木聚糖残基以暴露更多的纤维素。
褐色喜热裂孢菌分泌较多的其他木质纤维素降解酶为纤维素酶，该菌株主要分泌2种-1,4-外切纤维素酶(Q9KH72,Q9XCD4)和4种-1,4-内切纤维素酶(Q08166,P26221,P26222,Q01786)对结晶纤维素进行有效降解(表2)。所有这些纤维素酶都含有至少一种类型的A型CBM(主要是CBM2和CBM3)，可以帮助这些纤维素酶快速结合结晶纤维素进行水解。除了丰富的纤维素酶外，纤维素上培养的褐色喜热裂孢菌还检测到AA10 LPMO(Q47QG3)的分泌，其相对含量为3.25±2.44％，它是纤维素降解的辅助蛋白(表2)。
此外，纤维素诱导褐色喜热裂孢菌同时表达Q47KR6和纤维素酶(Q9KH72、Q9XCD4、Q08166、P26221、P26222、Q01786)，说明它们是共表达的(表2)。
表1不同碳源培养疏棉状嗜热丝孢菌时分泌组中木聚糖和纤维素降解酶的相对含量。
Figure BDA0002330910120000131
ND，该蛋白没有在分泌组中检测到。
表2不同碳源培养褐色喜热裂孢菌时分泌组中木聚糖和纤维素降解酶的相对含量。
Figure BDA0002330910120000132
Figure BDA0002330910120000141
ND，该蛋白没有在分泌组中检测到。
实施例六、木寡糖的浓度梯度可以精确地调控疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌的共培养
所有浓度梯度(0.1％-1％，质量/体积)的木寡糖均可支持疏棉状嗜热丝孢菌的生长和木聚糖酶的分泌(图3B)。相比之下，高浓度(>0.5％，质量/体积)木寡糖明显抑制了褐色喜热裂孢菌的生长(图3B)。因此，我们推测木寡糖和木糖浓度可以调节疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌的生长。为了更好地理解在木质纤维素降解过程中疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌的调控机制,利用纤维素和浓度梯度的木寡糖或木糖的混合物作为碳源来共培养疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌(图8)。
在所有的浓度梯度木寡糖或木糖条件,首先发现疏棉状嗜热丝孢菌分泌的的木聚糖酶带(图8)。随着木寡糖浓度在培养基中的浓度从1％下降到0.1％(质量/体积)，褐色喜热裂孢菌开始大量分泌木聚糖酶的时间点逐渐从第四天提前到第二天(图8A-E)。浓度梯度木糖也可以调节疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌分泌木聚糖酶的时间点(图8F-J)。结果表明，木寡糖和木糖浓度可以准确地调控疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌的生长和产酶。
植物细胞壁结构层次和化学成分决定了微生物的生长顺序。微生物相互作用可能与其功能和生态位有关，功能冗余和生态位重叠容易在同一系统中引起竞争。在木质纤维素降解过程中，疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌占据了不同的生态位。疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌的生长顺序与木质纤维素结构层次一致。褐色喜热裂孢菌可以分泌木聚糖酶和纤维素酶，然而，由于累积的木寡糖和木糖，褐色喜热裂孢菌不能单独在木质纤维素上生长。疏棉状嗜热丝孢菌可以帮助褐色喜热裂孢菌消除木寡糖和木糖抑制，促进褐色喜热裂孢菌分泌更多的纤维素酶。因此，在工业上可以利用疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌的共培养体系作为降解木质纤维素的耐热微生物菌剂。此外,疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌可以在55℃很好地生长且其酶可以忍耐至少60℃,它们的高温特性在生物产业中有利于降低成本。
木寡糖和木糖是许多微生物生长和分泌酶的诱导物，而对于褐色喜热裂孢菌来说，高浓度的木寡糖和木糖反而是抑制剂。木寡糖和木糖浓度可以精确地调控疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌的生长，木寡糖或木糖浓度可能是它们生长的信号因子。褐色喜热裂孢菌拥有高效的木聚糖降解体系，但却不能有效利用木聚糖降解产物，而木聚糖产物可被疏棉状嗜热丝孢菌迅速消耗。疏棉状嗜热丝孢菌主要负责除去外侧的木聚糖。同时，疏棉状嗜热丝孢菌促进了褐色喜热裂孢菌分泌更多的纤维素酶来降解纤维素，因此，疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌可以联合作为嗜热微生物接种物在55℃生长，产生耐受60℃高温的热稳定性酶制剂，用于生物质木质纤维素的降解。
以上所述，仅为本申请的实施例而已，本申请的保护范围并不受这些具体实施例的限制，而是由本申请的权利要求书来确定。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的技术思想和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种促进褐色喜热裂孢菌对含有木聚糖的底物进行利用的方法，所述褐色喜热裂孢菌产生木聚糖酶从而分解木聚糖产生木寡糖和木糖，其特征在于，所述方法包括控制反应体系中木寡糖的重量体积(质量/体积)含量不高于0.7％。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，控制反应体系中木寡糖的重量体积(质量/体积)含量不高于0.6％，更优选，不高于0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、或0.1％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括控制反应体系中木糖的重量体积(质量/体积)含量不高于0.7％；优选的，不高于0.6％，更优选，不高于0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述促进褐色喜热裂孢菌对含有木聚糖的底物进行利用具体表现为：提高褐色喜热裂孢菌的生物量和/或提高褐色喜热裂孢菌对所述底物的降解程度。
5.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述控制木聚糖或木糖的含量通过以下任一所述方法实现：
I、从反应体系中移出木聚糖或木糖；
II、引入能够利用木聚糖或木糖的微生物或酶；优选的，所述能够利用木聚糖或木糖的微生物包括疏棉状嗜热丝孢菌。
6.一种提高褐色喜热裂孢菌对含有木聚糖的底物的利用效率的方法，所述方法包括利用含有木聚糖的底物对褐色喜热裂孢菌进行培养的步骤，所述褐色喜热裂孢菌可以产生木聚糖酶和纤维素酶，其特征在于，所述方法还包括在所述培养过程中加入疏棉状嗜热丝孢菌的步骤。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述提高褐色喜热裂孢菌对含有木聚糖的底物的利用效率具体表现为：
提高褐色喜热裂孢菌的生物量；
或者，提高褐色喜热裂孢菌对所述底物的降解程度；
或者，提高褐色喜热裂孢菌所产生的纤维素酶的量。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述疏棉状嗜热丝孢菌与褐色喜热裂孢菌的用量比例为1:100-100:1，优选，1:10-10:1，更优选，1:1。
9.根据权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于，所述含有木聚糖的底物还含有纤维素。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述底物选自生物质木质纤维素，更优选的，所述生物质纤维素包括硬木、软木和禾本科植物等；更优选的，所述底物来源于农业废弃物；更优选的，所述农业废弃物包括玉米秸秆、小麦秸秆或小麦麸皮。
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