CN110931077A

CN110931077A - 一种利用蛋白质互作网络构建自闭症动物模型的方法

Info

Publication number: CN110931077A
Application number: CN201911106432.XA
Authority: CN
Inventors: 杨新平; 范翠霞; 高玥; 梁关梅; 黄浪; 王静; 杨小雪; 迟雅丽
Original assignee: Southern Hospital Southern Medical University
Current assignee: Southern Hospital Southern Medical University
Priority date: 2019-11-13
Filing date: 2019-11-13
Publication date: 2020-03-27
Anticipated expiration: 2039-11-13
Also published as: CN110931077B

Abstract

本发明公开了一种利用蛋白质互作网络构建自闭症动物模型的方法，包括以下步骤：构建自闭症蛋白相互作用网络；从上述网络中筛选与自闭症相关的网络模块；从筛选得到的网络模块中找到与自闭症相关的关键节点；利用基因编辑技术获得关键节点基因敲除型自闭症动物模型。本发明构建方法与传统模型构建方法相比，更系统科学，构建的敲除鼠经行为学检测表现出社交新异性受损、刻板的重复行为，满足自闭症临床症状，可用于自闭症发病的分子机理研究和治疗药物的开发。

Description

一种利用蛋白质互作网络构建自闭症动物模型的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用蛋白质互作网络构建自闭症动物模型的方法。

背景技术

自闭症谱系障碍(Autism Spectrum Disorder，ASD)是常见的神经系统发育失调导致的神经发育障碍，ASD患者往往表现为受损的社交，语言障碍(从语言滞后到言语缺失)，重复和/或强迫性行为和言语模仿症，多动症，记忆缺陷、学习、运动技能或其他神经功能异常兴奋，超低敏感的感官刺激、焦虑，适应新的环境和习惯困难。

目前，研究自闭症主要是通过在啮齿类动物或非人灵长类动物中敲除某一热点基因，通过评估基因敲除后，动物表型特征的改变进而研究其发病机理。如在中国专利CN106172238B一种miR-124基因敲除小鼠动物模型中，发明人采用CRISPR技术构建了miR-124基因敲除鼠，该敲除鼠表现出明显的自主活动降低、学习记忆力下降、可溶性β淀粉样蛋白增多等神经系统疾病状态，为神经系统疾病病理研究、神经想通疾病药物的筛选提供了简单、可靠、经济的动物模型。如在中国专利CN109706184A自闭症模型犬的建立方法中，发明人采用CRISPR技术构建了Shank 3基因敲除犬，该敲除犬弥补了小鼠及灵长类自闭症模型动物的缺陷，同时在基因缺陷模式上与人类具有较高的相似性，可用于人类自闭症治疗新技术的研究，新药开发及发病机制的研究。

上述以及现有的自闭症敲除鼠，针对的都是已知的Shank3、NLGN3、NLGN4、CNTNAP2、NRXN1、NRXN2、PCD9等基因。但是自闭症基因包括少数的主效基因和许多的微效基因，上述的这些致病基因仅仅是在少数患者中发生突变的主效基因，单一基因突变就可以致病。此外，大多数自闭症患者的发病可能由多个微效基因和环境因素共同引起，每一微效基因突变都增加个体发病的易感性。因此，单一研究某一个基因对自闭症的影响不足以阐明其复杂的遗传异质性及其发病机制。

发明内容

本发明旨在提供一种利用蛋白质互作网络构建自闭症动物模型的方法，所述方法科学合理，可靠性高，为自闭症及相关疾病的发明机制，药物筛选等研究提供了重要的参考。

为了实现上述发明目的，本发明的技术解决方案是：一种利用蛋白质互作网络构建自闭症动物模型的方法，包括以下步骤：

步骤①：构建自闭症蛋白相互作用网络；

步骤②：从上述网络中筛选与自闭症相关的网络模块；

步骤③：从筛选得到的网络模块中找到与自闭症相关的关键节点；

步骤④：利用基因编辑技术获得关键节点基因敲除型自闭症动物模型。

进一步地，所述步骤①具体方法为：：从数据库中获得自闭症候选基因，针对自闭症候选基因克隆转录剪接本；用转录剪接本编码的蛋白质与基因编码的蛋白质进行两两酵母双杂交，测试蛋白质相互作用，除去假阳性，验证，得到自闭症蛋白相互作用网络。

进一步地，所述网络模块为神经突触传递模块和神经元胞内运输模块。

进一步地，所述步骤③具体方法为：利用Jaccard index计算进行模块分析，挑选边最多的基因作为关键节点。

进一步地，所述关键节点为Gabra4、Gabrb1或Htr3a。

进一步地，所述关键节点为Gabra4。

进一步地，所述步骤④主要包括以下步骤：根据NCBI数据库上的Gabra4基因序列在第一外显子区域确定TALEN靶点；按照TALEN设计原则，设计得到TALEN识别序列；构建TALEN质粒，细菌转化；挑单克隆细菌培养，抽提质粒进行鉴定和测序验证；体外转录生成mRNA；将上述获得的mRNA注射到受精卵中；将受精卵注射到动物中；通过PCR和DNA测序分析对产生的F0代小鼠和F1代小鼠进行基因型鉴定。

进一步地，所述确定TALEN靶点是指对第一外显子区域中的序列进行删除、插入、置换或添加修饰。

进一步地，所述确定TALEN靶点是指对第一外显子区域中的序列进行删除。

进一步地，所述删除的序列为：GCCTGGCG，如SEQ ID NO:1所示。

进一步地，所述TALEN识别序列包括左臂识别序列和右臂识别序列，其中左臂识别序列为：TCGCCCTCCTGCACTTCC，如SEQ ID NO:2所示；所述右臂识别序列为：TCCCCACCGAACTCACCA，如SEQ ID NO:3所示。

进一步地，所述测序中采用的测序正向引物序列为：5’-CGAGAGGCTGGAAACGTGAACA-3’，如SEQ ID NO:4所示；反向引物序列为：5’-CTGAGTCTACTCGGTCAAAGGAAAGC-3’，如SEQ ID NO:5所示。

进一步地，所述动物为鼠。

本发明另一目的在于提供上述方法构建得到的动物模型在研究自闭症发病机理中的用途。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明以自闭症蛋白相互作用网络为基础，筛选与自闭症相关的网络模块，通过分析得到模块中的关键节点，进一步对节点中的关键基因采用TALEN技术进行敲除得到相应的自闭症关键基因敲除鼠。与传统模型构建方法相比，该方法更系统科学，构建的敲除鼠经行为学检测表现出社交新异性受损、更强的认知能力、更好的空间记忆能力及明显的抗癫痫行为表型，对阐明自闭症发病的分子机理，为自闭症的诊断和治疗提供重要的理论依据。

附图说明

图1为本发明自闭症动物模型构建流程图；

图2为DNA测序结果；

图3为三厢社交行为测试实验结果；

图4为自我修饰实验结果；

图5为Y迷宫实验结果；

图6为Morris水迷宫实验结果；

图7为PTZ易感实验结果。

具体实施例方式

以下通过实施例形式的具体实施方法，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。

实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法,所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例自闭症小鼠模型构建

本实施例的自闭症小鼠模型构建流程如图1所示，具体包括以下步骤：

一、构建自闭症蛋白相互作用网络

从数据库中获得191个自闭症候选基因(基因列表如下表1所示)，针对上述191个自闭症候选基因从胎儿和成人脑组织中克隆了约422个各种转录剪接本(spliceisoform)；用上述422个转录剪接本编码的蛋白质与13000基因编码的蛋白质进行两两酵母双杂交，测试蛋白质相互作用。对初步测试结果，重复四次以除去假阳性，然后用哺乳动物蛋白-蛋白相互作用捕获技术(Mammalian PPI trap assay,MAPPIT)进行验证，得到高质量的自闭症蛋白相互作用网络(具体可参见Protein interaction network ofalternatively spliced isoforms from brain links genetic risk factors forautism，Nature Communications，公开日2014年4月11日)。

表1 191个自闭症候选基因列表

二、筛选与自闭症相关的网络模块和自闭症相关的关键节点

利用Jaccard index计算进行模块分析，得到与自闭症相关的神经突触传递模块和神经元胞内运输模块，挑选边最多的Gabra4基因作为关键节点。

三、利用TALEN获得关键节点基因敲除型自闭症动物模型

(1)从NCBI数据库上下载Gabra4基因序列，在第一外显子区域确定TALEN打靶目标，目标序列为：GCCTGGCG(SEQ ID NO:1)，靶点序列为：CAGCCTCGCCCTCCTGCACTTCCTGTGCCTGGCGGCTTGGTGAGTTVGGTGGGGAGGTGGGGGG(SEQ ID NO:6，其中划横线部分显示了要删除的目标序列SEQ ID NO:1)。

(2)按照TALEN设计原则，利用online TALEN序列设计软件设计得到相应的TALEN左臂识别序列1条，TALEN右臂识别序列1条，如下表1所示：

序列名称	序列
		Gabra4-L(SEQ ID NO:2)	TCGCCCTCCTGCACTTCC
Gabra4-R(SEQ ID NO:3)	TCCCCACCGAACTCACCA

(3)根据上述识别序列组装得到一对TALEN质粒，分别命名为pGabra4-L-TALEN质粒和pGabra4-R-TALEN质粒。

(4)细菌转化，挑取单克隆细菌培养，小抽提质粒进行酶切鉴定获得正确的质粒，测序验证；

(5)体外转录生成mRNA，将上述获得的mRNA注射到受精卵中，将受精卵注射到小鼠中；

(6)对原始鼠采用PCR方法进行基因型鉴定，

PCR分型采用的引物和条件如下：

正向引物序列为：5’-CGAGAGGCTGGAAACGTGAACA-3’(SEQ ID NO:4)；反向引物序列为：5’-CTGAGTCTACTCGGTCAAAGGAAAGC-3(SEQ ID NO:5)，退火温度59℃，产物条带311bp,对所得DNA进行测序和基因型鉴定，扩增子纯化后送DNA测序分析；

(7)DNA测序分析

DNA测序引物：5’-CTGAGTCTACTCGGTCAAAGGAAAGC-3’，测序结果如图2所示，从图2可看出，构建的小鼠成功敲除Gabra4第一外显子区域中的8个碱基。

四、自闭症小鼠行为学验证

1、三厢社交行为测试实验

1.1实验方法：实验过程分为三个阶段：首先是适应阶段(Habituation)，将实验小鼠放入中间的箱室，让其在三个箱室中自由通行探索10分钟；第二个阶段是社交阶段(Sociability)，在其中一侧箱室中放入陌生小鼠(年龄、性别与实验鼠匹配)并用小金属盒将陌生鼠固定置于一侧箱室中，让实验小鼠在三个箱室自由进行探索10分钟。第三个阶段是社交新异(Social Novelty)阶段，一只新的陌生小鼠被放入另一侧的小金属笼中，让实验小鼠自由探索10分钟。

1.2实验结果：结果如图3所示，在第一和第二阶段，野生型小鼠(WT)和敲除小鼠(KO)都表现出正常的社交行为；在第三阶段，和野生型小鼠相比，敲除小鼠不能区分熟悉的小鼠和陌生的小鼠，表现出社交新异性受损。

2、自我修饰实验

将野生型小鼠和敲除小鼠分别单独放置在没有垫料的干净的空笼子里，在笼子里自由活动10分钟，采用摄像头拍摄，人工记录老鼠10分钟内的理毛行为行为。结果如图4所示，敲除小鼠(KO)的理毛时间比野生型小鼠(WT)长，存在刻板样行为。

3、Y迷宫实验

Y形迷宫带有三个白色不透明塑料臂，彼此成120°角。将用于野生型小鼠和敲除小鼠放置在迷宫的中心并允许自由探索三个臂，当所有四肢都在手臂内时，认为进入。记录臂条目的数量和三元组的数量以计算交替的百分比，结果如图5所示，敲除小鼠(KO)认知功能强于野生型小鼠(WT)。

4、Morris水迷宫实验

4.1实验方法：将实验小鼠放在120cm直径的圆形池中找到隐藏的圆形平台(直径10cm)，该池充满白色不透明水(22℃±1)。测试室里装满了许多额外的迷宫线索，连续6天进行训练，每天4次。将小鼠随机地放置在平台(SE，NE，SW，NW)的四个起始位置中的每一个中用于每日训练试验。对于每次试验，将小鼠保持在隐藏的圆形平台上15秒，直到它们找到隐藏的平台，在下轮训练开始前至少休息30秒。所有数据均由Water Maze视频跟踪软件(Digbehv，Jlecgonline，Shanghai)记录。计算四个试验中平均值的每日数据以及小鼠找到每条路径到平台的逃避潜伏期和速度(mm/s)。在第7天进行探针试验：首先，将小鼠放入与隐藏平台相对的象限中，并在平台上安装“旗帜”以测试游泳速度，然后移除隐藏的平台，将小鼠放入池中60秒，记录穿越训练平台位置的次数。

4.3实验结果：结果如下图6显示：基因敲除小鼠(KO)逃避潜伏期低于野生型小鼠，且穿越平台的次数高于野生型小鼠(WT)。这提示基因敲除小鼠表现出更好空间记忆能力。

5、PTZ易感实验

自闭症常伴发癫痫，因此，采用戊四唑(PTZ,SIGMA)癫痫模型检测小鼠的癫痫易感性。腹腔注射给小鼠(8-9周龄雄性；20g-27g体重)，每公斤体重注射60mg，总容积为0.2-0.25ml。录像，用来后期判断癫痫发作的程度。癫痫发作活动的行为指标如下:(i)第一次肌阵挛性抽搐，(ii)至少5秒的阵挛性惊厥，(iii)强直性后肢伸展，(iv)死亡。结果如图7所示，敲除小鼠(KO)表现出抗癫痫的行为表型。

可见，本发明构建的敲除鼠存在明显的社交新异性受损，刻板的重复行为，证明本发明构建的Gabra4基因敲除鼠满足作为自闭症小鼠模型的临床症状，可以用于自闭症发病机理研究及治疗药物的开发。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 南方医科大学南方医院

<120> 一种利用蛋白质互作网络构建自闭症动物模型的方法

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcctggcg 8

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcgccctcct gcacttcc 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tccccaccga actcacca 18

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 4

<400> 4

cgagaggctg gaaacgtgaa ca 22

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 5

<400> 5

ctgagtctac tcggtcaaag gaaagc 26

<210> 6

<211> 64

<212> DNA

<213> 6

<400> 6

cagcctcgcc ctcctgcact tcctgtgcct ggcggcttgg tgagttvggt ggggaggtgg 60

gggg 64

Claims

1.一种利用蛋白质互作网络构建自闭症动物模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤①：构建自闭症蛋白相互作用网络；

步骤②：从上述网络中筛选与自闭症相关的网络模块；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤①具体方法为：从数据库中获得自闭症候选基因，针对自闭症候选基因克隆转录剪接本；用转录剪接本编码的蛋白质与基因编码的蛋白质进行两两酵母双杂交，测试蛋白质相互作用，除去假阳性，验证，得到自闭症蛋白相互作用网络。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述网络模块为神经突触传递模块和神经元胞内运输模块。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤③具体方法为：利用Jaccard index计算进行模块分析，挑选边最多的基因作为关键节点。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述关键节点为Gabra4。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤④主要包括以下步骤：根据NCBI数据库上的Gabra4基因序列在第一外显子区域确定TALEN靶点；按照TALEN设计原则，设计得到TALEN识别序列；构建TALEN质粒，细菌转化；挑单克隆细菌培养，抽提质粒进行鉴定和测序验证；体外转录生成mRNA；将上述获得的mRNA注射到受精卵中；将受精卵注射到动物中；基因型鉴定。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述确定TALEN靶点是指对第一外显子区域中的序列进行删除，删除的序列为：GCCTGGCG，如SEQ ID NO:1所示。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述TALEN识别序列包括左臂识别序列和右臂识别序列，其中所述左臂识别序列为：TCGCCCTCCTGCACTTCC，如SEQ ID NO:2所示；所述右臂识别序列为：TCCCCACCGAACTCACCA，如SEQ ID NO:3所示。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，用于基因型鉴定的正向引物序列为：5’-CGAGAGGCTGGAAACGTGAACA-3’，如SEQ ID NO:4所示；反向引物序列为：5’-CTGAGTCTACTCGGTCAAAGGAAAGC-3’，如SEQ ID NO:5所示。

10.如权利要求1～9任一所述的方法构建得到的动物模型在研究自闭症发病机理中的用途。