CN110923174A - 玉米秸秆基质化的快速腐熟菌剂及应用 - Google Patents

玉米秸秆基质化的快速腐熟菌剂及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种玉米秸秆基质化的快速腐熟菌剂及应用，快速腐熟菌剂的活性成分为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、绿色木霉(Trichoderma viride)、解纤维素木聚糖单胞菌(Xylanimonas cellulosilytica)、嗜热球形脲芽孢杆菌(Ureibacillus thermosphaericus)。以上五种菌的集落形成单位数目之比分别为15‑20:20‑30:15‑20:10‑15:20‑30，所述菌剂的有效活菌数为109个/mL以上。本发明还提供所述快速腐熟菌剂在玉米秸秆基质化的腐熟发酵中的应用。本发明的快速腐熟菌剂对玉米秸秆的降解率高，在进行大规模熟化发酵时，20天内可分解秸秆的40‑70％，为玉米秸秆基质化提供了重要技术手段，在有机栽培基质生产领域具有广阔的应用前景。

Description

玉米秸秆基质化的快速腐熟菌剂及应用
技术领域
本发明涉及农业废弃物的资源化利用领域，具体地说，涉及玉米秸秆基质化的快速腐熟菌剂及应用。
背景技术
近年来，随着工厂化育苗技术和无土栽培技术的迅速发展，对于栽培基质的需求量日益激增，常见的育苗栽培基质如草炭、蛭石等资源有限，且短时间不可再生，岩棉等使用后较难处理，易对环境造成污染，迫切需要开发新型的替代栽培基质。我国是农业大国，每年产生大量的农作物秸秆，尤其玉米秸秆的产量巨大，如果将这些玉米秸秆进行高温熟化发酵，实现无害化处理，可以生产大量的商品栽培基质，真正实现农业废弃物的资源化利用。
玉米秸秆含有大量的木质纤维素成分，分解难且速度慢；作为基质物理性状粗糙，密度小，孔隙大；作为栽培基质烧根严重，抑制农作物生长。利用玉米秸秆生产有机栽培基质必须进行高温熟化发酵，旨在分解大分子物质(木质纤维素、糖类、淀粉、脂肪、蛋白)，降低碳氮比，消灭杂草、病原菌，以适应作物生长。熟化发酵是在微生物的作用下，将可分解的有机物全部分解，进入安全使用状态，部分元素矿化成植物养分的过程。在熟化过程中，首先是糖类、淀粉、脂肪、蛋白等物质易分解物分解产热的升温阶段，伴随纤维素、半纤维素分解而持续产热的高温发酵阶段。其中纤维素和半纤维素的分解快慢和分解程度决定着熟化的程度。
秸秆的熟化需要多种菌的协同作用，才能保证有机物的高效分解。微生物产酶，酶分解底物产生代谢产物，代谢产物的积累会反作用于酶。有研究表明，纤维二糖在较高的浓度下对纤维素酶的合成发生阻遏作用。所以，只是靠外源添加一种或复配几种微生物，很难达到高效的分解水平。因此，需要创建特定分解微生物种群，模拟堆肥化过程中的条件去驯化,使菌株间达到良好的共生状态。并且经驯化后，不同的微生物能够满足熟化过程中不同阶段的分解任务。在此条件下再使用此接菌剂,将会得到积极的效果。
近年来，菌剂在发酵过程中的应用研究较多，但是针对栽培基质熟化的菌剂并不多，尤其是玉米秸秆基质化的快速快速腐熟菌剂方面的报道更是凤毛麟角。
发明内容
本发明的目的是提供一种协同共生的玉米秸秆基质化的快速腐熟菌剂。
本发明的另一目的是提供所述快速腐熟菌剂在玉米秸秆基质化的腐熟发酵中的应用。
本发明为解决上述技术问题，采用以下技术方案来实现：
一种玉米秸秆基质化的快速腐熟菌剂，活性成分含有：
解淀粉芽孢杆菌、热纤梭菌、绿色木霉、解纤维素木聚糖单胞菌、嗜热球形脲芽孢杆菌，相对应的菌落形成单位数目为15-20:20-30:15-20:10-15:20-30，快速腐熟菌剂的有效活菌数为109个/mL以上，转接菌种时必须保证酶活达到的最低要求：淀粉酶活为80IU/ml，蛋白酶活为106IU/ml，纤维素酶活为60IU/ml，纤维二糖酶活为45IU/ml，半纤维素酶活为155IU/ml，才可以保证菌剂的腐熟效果达到最佳。
其活性成分保藏号ACCCNo.19746的解淀粉芽孢杆菌、保藏号DSMNo.1237的热纤梭菌、保藏号CICCNo.13038的绿色木霉、保藏号DSMNo.15894的解纤维素木聚糖单胞菌、保藏号CGMCCNo.1.7266的嗜热球形脲芽孢杆菌。
其中，所述的解淀粉芽孢杆菌可同时产生淀粉酶和蛋白酶，主要在前期蛋白质和碳水化合物的分解起作用；解纤维素木聚糖单胞菌为好养细菌，主要作用于发酵中期的半纤维素成分的分解；热纤梭菌具有的很强的结晶纤维素分解活性，来自菌体表层的由多种纤维素酶组成的一个复杂而稳定的多酶体系-纤维小体，可快速分解农业废弃物中的纤维素；嗜热球形脲芽孢杆菌产生的纤维素酶可以分解纤维素；绿色木霉能产生纤维二糖水解酶，利用纤维二糖产生乙酸、乳酸，减少纤维二糖对纤维素酶合成的阻遏作用。
这五种菌分别重点作用于不同的阶段，与发酵过程中的成分分解和温度变化想匹配。保证在整个秸秆熟化过程中持续分解产酶，而且降低了底物阻遏作用，可以缩短熟化时间，对秸秆熟化效果好。
进一步优选的技术方案，所述解淀粉芽孢杆菌、热纤梭菌、绿色木霉、解纤维素木聚糖单胞菌、嗜热球形脲芽孢杆菌的CFU之比分别为3：5：2：3：5。
进一步优选的技术方案，还包括吸附载体，所述活性成份与吸附载体的比例关系为1CFU：(1×10-6～1×10-5)g吸附载体。
进一步优选的技术方案，所述活性成份与吸附载体的比例关系优选1CFU：5×10-6g吸附载体。
进一步优选的技术方案，所述吸附载体由40-60目麦饭石和玉米秸秆粉按2-4:6-8的重量比组成。
利用上述快速腐熟菌剂制备的栽培基质，制备方法如下：将玉米秸秆、尿素和碳酸钙按98：1：0.1的质量比混合，向其中添加玉米秸秆、尿素和碳酸钙总重55-60％的水，所得熟化发酵原料与快速腐熟菌剂按100：0.5-1的质量比混匀，堆成宽1-3m、高1-2.5m、长2-100m的长方体进行腐熟发酵，发酵周期为20天，发酵过程中当堆体温度超过50℃时，每天翻堆一次，直至发酵完成。
本发明还提供上述栽培基质在水稻育苗中的应用。
本发明还提供所述快速腐熟菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)种子液的制备：
所述培养基为经优化的Mandels培养基，其配方为：(NH4)2SO42g/L；MgSO4·7H2O0.5g/L；KH2PO46g/L；蛋白胨1.5g/L；CaCO33g/L；FeSO4·7H2O6mg/L；MnSO43.6mg/L；ZnCl25mg/L；CoCl21mg/L；pH7.0，溶解在1L水中，灭菌即得；同时添加玉米秸秆为唯一碳源，玉米秸秆粉碎过2mm筛，添加量为培养基总质量的2％；
所述发酵培养条件为35-40℃，培养2天；
(2)菌种的扩大培养：
将步骤(1)中所得各种子液分别接种于经优化的Mandels培养基中，在培养温度为37℃的发酵罐中逐级扩大培养，扩大过程按5％～10％的体积比转接，当发酵液中的有效活菌数达到109个/mL时终止培养；
(3)快速腐熟菌剂的制备：
将步骤(2)中所得各发酵液按比例混合，然后向其中添加吸附载体混匀，即得快速腐熟菌剂。
本发明还提供所述快速腐熟菌剂在纤维素及半纤维素分解中的应用。
本发明还提供所述快速腐熟菌剂在玉米秸秆基质化的腐熟发酵中的应用。
本发明的有益效果是：
(一)本发明提供的玉米秸秆基质化的快速腐熟菌剂，淀粉酶、蛋白酶、纤维素和半纤维素酶活高，可在玉米秸秆熟化发酵的初期有效分解蛋白质和淀粉，加快进入高温熟化期。在熟化中后期通过嗜热或耐热的菌株产复合酶，在减少纤维二糖阻遏作用的前提下，更为高效的分解半纤维素和纤维素成分，快速破坏坚硬的木质纤维素结构，达到松散秸秆结构的作用。从而进入纤维素、半纤维素的同步高效熟化阶段，加快秸秆的熟化进程。
(二)本发明的快速腐熟菌剂为细菌真菌共生的复合微生物，该复合微生物同时含有好氧菌和厌氧菌，可在微好氧的熟化发酵过程中，相对好氧的菌株解淀粉芽孢杆菌、解纤维素木聚糖单胞菌、绿色木霉及嗜热球形脲芽孢杆菌在分解底物的同时消耗局部氧气，创造局部厌氧环境，为厌氧纤维素分解菌-热纤梭菌创造分解环境，进一步加快纤维素和半纤维素的分解，促进原料整体的熟化进度。
(三)本发明的快速腐熟菌剂对玉米秸秆的降解率高，在进行大规模熟化发酵时，20天内可分解秸秆的40-70％。
(四)本发明的快速腐熟菌剂突破了由纯化单菌及其分解酶无法高效分解天然纤维素的局限，为玉米秸秆基质化提供了重要技术手段，在有机栽培基质生产领域具有广阔的应用前景。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中所用所述培养基为经优化的Mandels培养基，其配方如下：(NH4)2SO42g/L；MgSO4·7H2O0.5g/L；KH2PO46g/L；蛋白胨1.5g/L；CaCO33g/L；FeSO4·7H2O6mg/L；MnSO43.6mg/L；ZnCl25mg/L；CoCl21mg/L；pH7.0，溶解在1L水中，灭菌即得。同时添加玉米秸秆为唯一碳源，玉米秸秆粉碎过2mm筛，添加量为培养基总质量的2％。121℃蒸汽灭菌15分钟。
实施例1玉米秸秆基质化的快速腐熟菌剂的制备
实施例1中制备的快速腐熟菌剂，其活性成分保藏号ACCCNo.19746的解淀粉芽孢杆菌、保藏号DSMNo.1237的热纤梭菌、保藏号CICCNo.13038的绿色木霉、保藏号DSMNo.15894的解纤维素木聚糖单胞菌、保藏号CGMCCNo.1.7266的嗜热球形脲芽孢杆菌。
(1)种子液的制备：
所述培养基为经优化的Mandels培养基，其配方为：(NH4)2SO42g/L；MgSO4·7H2O0.5g/L；KH2PO46g/L；蛋白胨1.5g/L；CaCO33g/L；FeSO4·7H2O6mg/L；MnSO43.6mg/L；ZnCl25mg/L；CoCl21mg/L；pH7.0，溶解在1L水中，灭菌即得。同时添加玉米秸秆为唯一碳源，玉米秸秆粉碎过2mm筛，添加量为培养基总质量的2％。
所述发酵培养条件为35-40℃，培养2天。
(2)菌种的扩大培养：
将步骤(1)中所得各种子液分别接种于经优化的Mandels培养基中，在培养温度为37℃的发酵罐中逐级扩大培养，扩大过程按5％～10％的体积比转接，当发酵液中的有效活菌数达到109个/mL时终止培养；转接菌种时必须保证酶活达到的最低要求：淀粉酶活为80IU/ml，蛋白酶活为106IU/ml，纤维素酶活为60IU/ml，纤维二糖酶活为45IU/ml，半纤维素酶活为155IU/ml，才可以保证菌剂的腐熟效果达到最佳。
3、快速腐熟菌剂的制备：
将步骤2中所得的解淀粉芽孢杆菌、热纤梭菌、绿色木霉、解纤维素木聚糖单胞菌及嗜热球形脲芽孢杆菌按CFU之比3：5：2：3：5混合，然后向其中添加吸附载体混匀，即得快速腐熟菌剂。其中，活性成份与吸附载体的比例关系为1CFU：5×10-6g吸附载体。所述吸附载体由40目的麦饭石和玉米秸秆粉按2:8的重量比组成。
实施例2快速腐熟菌剂在玉米秸秆基质化的腐熟发酵中的应用
实验组1-实验组3：将玉米秸秆、尿素和碳酸钙按98：1：0.1的质量比混合，向其中添加玉米秸秆、尿素和碳酸钙总重60％的水，所得熟化发酵原料分别与实施例1-3(实施例1、实施例2和实施例3分别对应于实验组1、实验组2和实验组3)制备的快速腐熟菌剂按100：0.5的质量比混匀，堆成宽3m、高1.3m、长5m的长方体进行腐熟发酵，发酵周期为20天，发酵过程中当堆体温度超过50℃时，每天翻堆一次，直至发酵完成。
对照组：不添加实施例1-3制备的快速腐熟菌剂，直接将熟化发酵原料堆成宽3m、高1.3m、长5m的长方体进行腐熟发酵。发酵条件同上。
实验结果，在施用菌剂后第1天淀粉酶、蛋白酶活迅速升高至160IU/ml和188IU/ml以上，伴随着温度升高，说明玉米秸秆中的淀粉和蛋白质等物质正在快速分解；此时纤维素酶活为60IU/ml以上，纤维二糖酶活为45IU/ml以上，半纤维素酶活为155IU/ml以上。在施用菌剂的第2天开始，半纤维酶活迅速升高至243IU/ml以上；第5天半纤维素酶活达到310IU/ml以上，纤维素酶活达到110IU/ml以上，纤维二糖酶活达到100IU/ml以上，说明玉米秸秆中的半纤维素和纤维素成分正在快速分解。
施用菌剂后7天，玉米秸秆的纤维素分解率达到10.5％，半纤维素分解率达到13.0％，结构有松散迹象，之后进入纤维素和半纤维素的旺盛分解阶段。施用20天后，玉米秸秆的分解率达40％以上。
发酵20天后，实验组和对照组发酵产物主要参数比较结果见表1。
表1发酵产物主要参数比较结果
Figure BDA0002339150350000071
实施例3无土栽培基质在水稻育苗中的应用
将实施例4中获得的发酵产物作为无土栽培基质，用于水稻育苗。
实验组1-3：将实施例4中获得的实验组的基质，取总干重约300g，均匀铺于长宽高60×30×4cm的专用薄塑料盘中，基质厚度约3cm，轻度镇压后浇透pH5.5的硫酸水，每盘播种100g(干重计)发芽水稻种子，覆表土0.5cm厚，温室育苗30天，温度模拟东北春季条件，白天25℃，夜间10-15℃。实验设置3个重复，并于30天后测定水稻秧苗的生长状况。
对照组：参照上述实验组的操作方法，仅将基质替换成实施例4对照组中获得的基质。
实验组1-3和对照组水稻秧苗的生长状况见表2。
表2水稻秧苗的生长状况
Figure BDA0002339150350000072
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (8)

1.一种玉米秸秆基质化的快速腐熟菌剂，其特征在于，活性成分含有：
解淀粉芽孢杆菌、热纤梭菌、绿色木霉、解纤维素木聚糖单胞菌、嗜热球形脲芽孢杆菌，相对应的菌落形成单位数目为15-20:20-30:15-20:10-15:20-30，快速腐熟菌剂的有效活菌数为109个/mL以上，转接菌种时必须保证酶活达到的最低要求：淀粉酶活为80IU/ml，蛋白酶活为106IU/ml，纤维素酶活为60IU/ml，纤维二糖酶活为45IU/ml，半纤维素酶活为155IU/ml，才可以保证菌剂的腐熟效果达到最佳。
2.根据权利要求1所述的玉米秸秆基质化的快速腐熟菌剂，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌、热纤梭菌、绿色木霉、解纤维素木聚糖单胞菌、嗜热球形脲芽孢杆菌的CFU之比分别为3：5：2：3：5。
3.根据权利要求1所述的玉米秸秆基质化的快速腐熟菌剂，其特征在于：还包括吸附载体，所述活性成份与吸附载体的比例关系为1CFU：(1×10-6～1×10-5)g吸附载体。
4.根据权利要求3所述的玉米秸秆基质化的快速腐熟菌剂，其特征在于：所述活性成份与吸附载体的比例关系优选1CFU：5×10-6g吸附载体。
5.根据权利要求3或4所述的玉米秸秆基质化的快速腐熟菌剂，其特征在于：所述吸附载体由40-60目麦饭石和玉米秸秆粉按2-4:6-8的重量比组成。
6.权利要求1-5中任一项所述快速腐熟菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)种子液的制备：
所述培养基为经优化的Mandels培养基，其配方为：(NH4)2SO42 g/L；MgSO4·7H2O 0.5g/L；KH2PO46 g/L；蛋白胨1.5g/L；CaCO33 g/L；FeSO4·7H2O 6mg/L；MnSO43.6 mg/L；ZnCl25mg/L；CoCl21 mg/L；pH 7.0，溶解在1L水中，灭菌即得；同时添加玉米秸秆为唯一碳源，玉米秸秆粉碎过2mm筛，添加量为培养基总质量的2％；
所述发酵培养条件为35-40℃，培养2天；
(2)菌种的扩大培养：
将步骤(1)中所得各种子液分别接种于经优化的Mandels培养基中，在培养温度为37℃的发酵罐中逐级扩大培养，扩大过程按5％～10％的体积比转接，当发酵液中的有效活菌数达到109个/mL时终止培养；
(3)快速腐熟菌剂的制备：
将步骤(2)中所得各发酵液按比例混合，然后向其中添加吸附载体混匀，即得快速腐熟菌剂。
7.利用权利要求1-5中任一项所述快速腐熟菌剂制备的栽培基质，其特征在于，制备方法如下：将玉米秸秆、尿素和碳酸钙按98：1：0.1的质量比混合，向其中添加玉米秸秆、尿素和碳酸钙总重55-60％的水，所得熟化发酵原料与快速腐熟菌剂按100：0.5-1的质量比混匀，堆成宽1-3m、高1-2.5m、长2-100m的长方体进行腐熟发酵，发酵周期为20天，发酵过程中当堆体温度超过50℃时，每天翻堆一次，直至发酵完成。
8.权利要求7所述的栽培基质在水稻育苗中的应用。
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