CN110922384A - 松香烷型二萜类化合物及其制备方法、具有抗血小板活性的药物组合物及其应用 - Google Patents

松香烷型二萜类化合物及其制备方法、具有抗血小板活性的药物组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了松香烷型二萜类化合物及其制备方法、具有抗血小板活性的药物组合物及其应用，属于药物技术领域。本发明提供的松香烷型二萜类化合物对花生四烯酸诱导的兔血小板聚集具有显著的抑制活性，且具有显著的体内抗血栓活性，以所述抗血小板化合物为有效成分的药物组合物可用于制备预防和/或治疗血栓性疾病药物，具有潜在临床应用价值。

Description

松香烷型二萜类化合物及其制备方法、具有抗血小板活性的 药物组合物及其应用
技术领域
本发明涉及药物技术领域，尤其涉及松香烷型二萜类化合物及其制备方法、具有抗血小板活性的药物组合物及其应用。
背景技术
鼠尾草属(Salvia)植物是著名的药用植物类群之一，在我国共有82种，其中横断山区为其全球三大分布中心之一，资源极为丰富。除了在《神农本草经》被列为上品的丹参(S.miltiorhiza)之外，尚有云南鼠尾草、红根草、紫丹参等20多种该属植物在各地民间入药，多具有活血祛瘀、凉血止血等功效。鼠尾草属植物中主要含有二萜类成分和多酚类成分，其中二萜类成分结构多变、活性显著，一直是国际研究热点。然而，近年来对鼠尾草属植物中二萜类成分的药理活性研究主要集中于抗肿瘤和抗菌领域。
花生四烯酸代谢途径是血小板活化过程重要的放大机制，且其代谢产物血栓烷素A2(TXA2)是血小板聚集的强诱导剂。TXA2作用于血小板血栓烷素受体可促进其活化聚集，作用于内皮细胞血栓烷素受体可促进其表达粘附分子，作用于血管平滑肌细胞可增加血管张力等(Giannarelli C,Zafar MU and Badimon JJ.Prostanoid and TP-receptors inatherothrombosis:is there a role for their antagonism？Thromb haemost.,2010；10,949-954)。研究发现，在多种血栓性疾病(如心肌梗塞、非稳定性心绞痛和动脉粥样硬化)的病理过程中TXA2的水平上调，且TXA2介导的血小板聚集在血栓形成的病理生理过程中具有重要作用(Crescente M,Menke L,Chan MV,Armstrong PC and WarnerTD.Eicosanoids in platelets and the effect of their modulation by aspirin inthe cardiovascular system(and beyond).Br J Pharmacol.,2019；176,988-999)。因此，花生四烯酸代谢途径是血小板聚集过程中的重要环节，也是抗血小板类抗血栓药物研发的重要靶点(Coccheri S.Antiplatelet drugs–do we need new options？with areappraisal of direct thromboxane inhibitors.Drugs.2010；70,887-908)。
目前，临床上的抗血小板类抗血栓药物主要有COX-1抑制剂(如阿司匹林)、GPIIbIIIa受体拮抗剂(如替罗非班)和P2Y12受体拮抗剂(如氯吡格雷和普拉格雷)三类(FanP,Gao Y,Zheng M,T X,Schoenhagen P and Jin Z.Recent progress and marketanalysis of anticoagulant drugs.J Thorac Dis.,2018；10,2011-2025)。由于药物疗效个体差异较大、高剂量时具有出血倾向，现有抗血小板类抗血栓药物存在安全窗窄的缺点，且可能产生药物抵抗(McFadyen JD,Schaff M and Peter K.Current and futureantiplatelet therapies:emphasis on preserving haemostasis.Nat RevCardiol.2018；15,181-191)。例如，使用阿司匹林仍不能完全避免缺血性事件，其在COX-2大量表达的炎症状态下血栓抑制效果较差，且使用该药可能出现阿司匹林抵抗、过敏和胃肠道出血等副作用。噻吩并吡啶类P2Y12受体拮抗剂如氯吡格雷和普拉格雷需经过体内代谢产生活性分子，其药代动力学和药效动力学个体差异较大，且可能导致治疗性血小板高反应性。因此，寻找有效防治血栓形成、低出血风险的抗血小板类抗血栓药物仍然迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的在于提供松香烷型二萜类化合物及其制备方法、具有抗血小板活性的药物组合物及其应用，本发明提供的松香烷型二萜类化合物具有显著而强效的抗血小板活性和体内抗血栓活性，可以用于制备预防和/或治疗血栓性疾病的药物。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了松香烷型二萜类化合物，为具有式1～式7所示结构化合物中的任意一种：
Figure BDA0002272901000000021
本发明提供了上述技术方案所述松香烷型二萜类化合物的制备方法，包括以下步骤：
采用丙酮对康定鼠尾草进行提取，所得提取液经减压蒸馏得到浸膏；
将所述浸膏进行硅胶柱层析，所用洗脱剂为氯仿，之后将所得氯仿部分在梯度洗脱条件下进行硅胶柱层析，所用洗脱剂为石油醚/氯仿/乙酸乙酯混合液，依次收集得到7个组分，记为A～G组分；
将B组分用聚酰胺拌样，在梯度洗脱条件下过MCI柱，所用流动相为甲醇/水混合液，依次收集得到8个组分，记为B1～B8组分；
在梯度洗脱条件下将B5组分进行硅胶柱层析，所用洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯混合液，依次收集得到8个组分，记为B5-1～B5-8组分；在等度洗脱条件下将B5-2组分进行硅胶柱层析，所用洗脱剂为石油醚/丙酮混合液，依次收集得到6个组分，记为B5-2-1～B5-2-6组分；B5-2-3组分经过高效液相色谱分离，依次得到式3和式6所示结构的化合物；
在梯度洗脱条件下将B6组分进行硅胶柱层析，所用洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯混合液，依次收集得到6个组分，记为B6-1～B6-6组分；在等度洗脱条件下将B6-4组分进行硅胶柱层析，所用洗脱剂为石油醚/丙酮混合液，依次收集得到6个组分，记为B6-4-1～B6-4-6组分；B6-4-5组分经过高效液相色谱分离，依次得到式2、式4和式1所示结构的化合物；
将C组分用聚酰胺拌样，在梯度洗脱条件下过MCI柱，所用流动相为甲醇/水混合液，依次收集得到7个组分，记为C1-C7组分；在梯度洗脱条件下将C3组分进行硅胶柱层析，所用洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯混合液，依次收集得到8个组分，记为C3-1～C3-8组分；在等度洗脱条件下将C-3-3组分进行硅胶柱层析，所用洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯混合液，依次收集得到7个组分，记为C3-3-1～C3-3-7组分；C3-3-4组分经过高效液相色谱分离，依次得到式5和式7所示结构的化合物。
本发明提供了一种具有抗血小板活性的药物组合物，由活性成分和药学上可接受的辅料组成，所述活性成分为上述技术方案所述松香烷型二萜类化合物中的至少一种或上述技术方案所述制备方法制备得到的松香烷型二萜类化合物中的至少一种。
优选地，所述药学上可接受的辅料包括药物载体、表面活性剂、缓冲物质、崩解剂、粘合剂、填充剂、润滑剂、赋形剂、增溶剂、香味剂和着色剂中的一种或几种。
优选地，所述活性成分的含量为0.05～99wt.％。
优选地，所述活性成分的含量为0.5～90wt.％。
本发明提供了上述技术方案所述药物组合物在制备预防和/或治疗血栓性疾病的药物中的应用。
优选地，所述血栓性疾病包括冠心病、缺血性脑血管病和外周血管病中的一种或几种。
优选地，所述冠心病包括心绞痛和/或心肌梗塞；所述缺血性脑血管病包括脑卒中和/或脑梗死；所述外周血管病包括动脉粥样硬化血栓形成性疾病。
优选地，所述预防和/或治疗血栓性疾病的药物的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、口服液制剂、注射剂或冻干粉针剂。
本发明提供的松香烷型二萜类化合物对花生四烯酸(arachidonicacid,AA)诱导的兔血小板聚集具有显著的抑制活性，且具有显著的体内抗血栓活性，以所述抗血小板化合物为有效成分的药物组合物可用于制备预防和/或治疗血栓性疾病药物，具有潜在临床应用价值。
本发明提供的松香烷型二萜类化合物的制备方法，康定鼠尾草经丙酮提取后利用硅胶柱层析、MCI柱分离以及高效液相色谱分离技术，能够得到具有显著而强效抗血小板活性和体内抗血栓活性的目标化合物，操作方便。
附图说明
图1为化合物1的氢谱(600MHz,acetone-d6)；
图2为化合物1的碳谱(150MHz,acetone-d6)；
图3为化合物1的高分辨质谱图；
图4为化合物2的氢谱(600MHz,acetone-d6)；
图5为化合物2的碳谱(150MHz,acetone-d6)；
图6为化合物2的高分辨质谱图；
图7为化合物3的氢谱(600MHz,CDCl3)；
图8为化合物3的碳谱(150MHz,CDCl3)；
图9为化合物3的高分辨质谱图；
图10为化合物4的氢谱(600MHz,acetone-d6)；
图11为化合物4的碳谱(150MHz,acetone-d6)；
图12为化合物4的高分辨质谱图；
图13为化合物5的氢谱(600MHz,acetone-d6)；
图14为化合物5的碳谱(150MHz,acetone-d6)；
图15为化合物5的高分辨质谱图；
图16为化合物6的氢谱(600MHz,acetone-d6)；
图17为化合物6的碳谱(150MHz,acetone-d6)；
图18为化合物6的高分辨质谱图；
图19为化合物7的氢谱(600MHz,acetone-d6)；
图20为化合物7的碳谱(150MHz,acetone-d6)；
图21为化合物7的高分辨质谱图；
图22化合物1在不同浓度条件下对花生四烯酸诱导兔血小板聚集的聚集率影响曲线；
图23为化合物2、3、5和阿司匹林对花生四烯酸诱导兔血小板聚集的聚集率影响曲线；
图24为化合物4、6、7和阿司匹林对花生四烯酸诱导兔血小板聚集的聚集率影响曲线；
图25为实施例1所述化合物和阿司匹林浓度依赖性地抑制花生四烯酸诱导的兔洗涤血小板聚集曲线；
图26为不同化合物对FeCl3诱导损伤后大鼠颈动脉阻塞时间的影响图。
具体实施方式
本发明提供了松香烷型二萜类化合物，为具有式1～式7所示结构化合物中的任意一种：
Figure BDA0002272901000000041
在本发明中，式1～式7所示结构化合物称为化合物1～7，松香烷型二萜类化合物结构与其简称的对应关系具体如下：
Figure BDA0002272901000000051
本发明提供了上述技术方案所述松香烷型二萜类化合物的制备方法，包括以下步骤：
采用丙酮对康定鼠尾草进行提取，所得提取液经减压蒸馏得到浸膏；
将所述浸膏进行硅胶柱层析，所用洗脱剂为氯仿，之后将所得氯仿部分在梯度洗脱条件下进行硅胶柱层析，所用洗脱剂为石油醚/氯仿/乙酸乙酯混合液，依次收集得到7个组分，记为A～G组分；
将B组分用聚酰胺拌样，在梯度洗脱条件下过MCI柱，所用流动相为甲醇/水混合液，依次收集得到8个组分，记为B1～B8组分；
在梯度洗脱条件下将B5组分进行硅胶柱层析，所用洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯混合液，依次收集得到8个组分，记为B5-1～B5-8组分；在等度洗脱条件下将B5-2组分进行硅胶柱层析，所用洗脱剂为石油醚/丙酮混合液，依次收集得到6个组分，记为B5-2-1～B5-2-6组分；B5-2-3组分经过高效液相色谱分离，依次得到式3和式6所示结构的化合物；
在梯度洗脱条件下将B6组分进行硅胶柱层析，所用洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯混合液，依次收集得到6个组分，记为B6-1～B6-6组分；在等度洗脱条件下将B6-4组分进行硅胶柱层析，所用洗脱剂为石油醚/丙酮混合液，依次收集得到6个组分，记为B6-4-1～B6-4-6组分；B6-4-5组分经过高效液相色谱分离，依次得到式2、式4和式1所示结构的化合物；
将C组分用聚酰胺拌样，在梯度洗脱条件下过MCI柱，所用流动相为甲醇/水混合液，依次收集得到7个组分，记为C1-C7组分；在梯度洗脱条件下将C3组分进行硅胶柱层析，所用洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯混合液，依次收集得到8个组分，记为C3-1～C3-8组分；在等度洗脱条件下将C-3-3组分进行硅胶柱层析，所用洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯混合液，依次收集得到7个组分，记为C3-3-1～C3-3-7组分；C3-3-4组分经过高效液相色谱分离，依次得到式5和式7所示结构的化合物。
本发明采用丙酮对康定鼠尾草进行提取，所得提取液经减压蒸馏得到浸膏。本发明优选对康定鼠尾草全草进行提取，在提取前优选将所述康定鼠尾草全草进行干燥和粉碎，本发明对于所述干燥和粉碎的具体操作方式没有特殊的限定，常规操作方式即可。在本发明中，所述提取优选在室温条件下进行，提取的次数优选为3～4次，每次提取的时间优选为45～50h；具体是将康定鼠尾草浸没在丙酮中进行提取，本发明对每次提取过程中丙酮的用量不作特殊限定，能够将康定鼠尾草完全浸没即可。本发明对于所述减压蒸馏没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的方式即可。
得到浸膏后，本发明将所述浸膏进行硅胶柱层析，所用洗脱剂为氯仿，之后将所得氯仿部分在梯度洗脱条件下进行硅胶柱层析，所用洗脱剂为石油醚/氯仿/乙酸乙酯混合液，依次收集得到7个组分，记为A～G组分。在本发明中，利用所述石油醚/氯仿/乙酸乙酯混合液进行梯度洗脱时，石油醚、氯仿和乙酸乙酯体积比优选依次为50:1:1、20:1:1、10:1:1、5:1:1、1:1:1。
得到B组分后，本发明将所述B组分用聚酰胺拌样，在梯度洗脱条件下过MCI柱，所用流动相为甲醇/水混合液，依次收集得到8个组分，记为B1～B8组分。在本发明中，利用所述甲醇/水混合液进行梯度洗脱时，甲醇和水的体积比优选依次为70:30、75:25、80:20、85:15、90:10、95:5、100:0(即仅采用甲醇)。
经上述方法得到B5组分后，本发明在梯度洗脱条件下将B5组分进行硅胶柱层析，所用洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯混合液，依次收集得到8个组分，记为B5-1～B5-8组分；在等度洗脱条件下将B5-2组分进行硅胶柱层析，所用洗脱剂为石油醚/丙酮混合液，依次收集得到6个组分，记为B5-2-1～B5-2-6组分；B5-2-3组分经过高效液相色谱分离，依次得到式3和式6所示结构的化合物，即化合物3和6。在本发明中，利用所述石油醚/乙酸乙酯混合液进行梯度洗脱时，石油醚和乙酸乙酯的体积比优选依次为200:1、100:1、50:1、20:1；利用石油醚/丙酮混合液进行等度洗脱时，所述石油醚和丙酮的体积比优选为200:1；进行高效液相色谱分离时，优选采用乙腈/水混合液作为流动相，所述乙腈和水的体积比优选为85:15。
经上述方法得到B6组分后，本发明在梯度洗脱条件下将B6组分进行硅胶柱层析，所用洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯混合液，依次收集得到6个组分，记为B6-1～B6-6组分；在等度洗脱条件下将B6-4组分进行硅胶柱层析，所用洗脱剂为石油醚/丙酮混合液，依次收集得到6个组分，记为B6-4-1～B6-4-6组分；B6-4-5组分经过高效液相色谱分离，依次得到式2、式4和式1所示结构的化合物，即化合物2、4和1。在本发明中，利用石油醚/乙酸乙酯混合液进行梯度洗脱时，石油醚和乙酸乙酯的体积比优选依次为150:1、100:1、30:1、10:1；利用石油醚/丙酮混合液进行等度洗脱时，所述石油醚和丙酮的体积比优选为150:1；进行高效液相色谱分离时，优选采用乙腈/水混合液作为流动相，所述乙腈和水的体积比优选为80:20。
经上述方法得到C组分后，本发明将C组分用聚酰胺拌样，在梯度洗脱条件下过MCI柱，所用流动相为甲醇/水混合液，依次收集得到7个组分，记为C1-C7组分；在梯度洗脱条件下将C3组分进行硅胶柱层析，所用洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯混合液，依次收集得到8个组分，记为C3-1～C3-8组分；在等度洗脱条件下将C-3-3组分进行硅胶柱层析，所用洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯混合液，依次收集得到7个组分，记为C3-3-1～C3-3-7组分；C3-3-4组分经过高效液相色谱分离，依次得到式5和式7所示结构的化合物，即化合物5和7。在本发明中，利用甲醇/水混合液进行梯度洗脱时，甲醇和水的体积比优选依次为60:40、65:35、70:30、75:25、80:20、85:15、90:10、95:5、100:0(即仅采用甲醇)；利用石油醚/乙酸乙酯混合液进行梯度洗脱时，石油醚和乙酸乙酯的体积比优选依次为300:1、150:1、50:1、20:1、5:1；利用石油醚/乙酸乙酯混合液进行等度洗脱时，石油醚和乙酸乙酯的体积比优选为300:1；进行高效液相色谱分离时，优选采用乙腈/水混合液作为流动相，所述乙腈和水的体积比优选为75:25。
在本发明中，上述硅胶柱层析以及MCI柱分离的过程中，所用洗脱剂的体积没有特殊限定，根据实际需要进行选择即可。
在本发明中，上述进行硅胶柱层析和过MCI柱分离的过程中，优选采用薄层色谱法检视分段收集得到多个相应组分(即A～G组分、B1～B8组分、B5-1～B5-8组分、B5-2-1～B5-2-6组分、B6-1～B6-6组分、B6-4-1～B6-4-6组分、C1-C7组分、C3-1～C3-8组分、C3-3-1～C3-3-7组分)。
本发明提供了一种具有抗血小板活性的药物组合物，由活性成分和药学上可接受的辅料组成，所述活性成分为上述技术方案所述松香烷型二萜类化合物中的至少一种或上述技术方案所述制备方法得到的松香烷型二萜类化合物中的至少一种。
本发明对于所述药学上可接受的辅料没有特殊的限定，具体的，所述药学上可接受的辅料优选包括药物载体、表面活性剂、缓冲物质、崩解剂、粘合剂、填充剂、润滑剂、赋形剂、增溶剂、香味剂和着色剂中的一种或几种。本发明对于上述辅料中的具体种类没有特殊的限定，根据实际需要选择即可。
在本发明中，所述药物组合物中活性成分的含量优选为0.05～99wt.％，更优选为0.5～90wt.％。
本发明提供了上述技术方案所述药物组合物在制备预防和/或治疗血栓性疾病的药物中的应用。
在本发明中，所述血栓性疾病优选包括冠心病、缺血性脑血管病和外周血管病中的一种或几种；其中，所述冠心病优选包括心绞痛和/或心肌梗塞；所述缺血性脑血管病优选包括脑卒中和/或脑梗死；所述外周血管病优选包括动脉粥样硬化血栓形成性疾病。
本发明对于所述预防和/或治疗血栓性疾病的药物的剂型没有特殊的限定，根据实际需要选择即可，具体可以为片剂、胶囊剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、口服液制剂、注射剂或冻干粉针剂。本发明对于不同剂型药物的制备方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的方法即可。
在本发明中，所述预防和/或治疗血栓性疾病的药物所给予的剂量将随着所使用的化合物、给予方式、所希望的治疗和所指示的障碍而变化。例如，口服给药，所述松香烷型二萜类化合物或其药学上可接受的盐的每日剂量可以在0.01微克/千克体重(μg/kg)至100毫克/千克体重(mg/kg)的范围内。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
化合物1～7的制备方法，包括以下步骤：
取干燥的康定鼠尾草全草，粉碎后用丙酮在室温条件下冷浸提取3次(48h/次)，合并所得提取液，减压蒸馏得到浸膏；
将浸膏经硅胶柱层析，用氯仿洗脱；将所得氯仿部分(667g)进行硅胶柱层析，并用石油醚/氯仿/乙酸乙酯混合液梯度洗脱(石油醚、氯仿和乙酸乙酯体积比依次为50:1:1、20:1:1、10:1:1、5:1:1、1:1:1)，用薄层色谱法检视分段收集得到7个组分，记为A～G组分；
其中B组分(223g)用聚酰胺拌样，过MCI柱，以甲醇/水混合液为流动相梯度洗脱(甲醇和水的体积比依次为70:30、75:25、80:20、85:15、90:10、95:5、100:0)，用薄层色谱法检视分段收集得到8个组分，记为B1～B8组分；
B5组分(79g)通过硅胶柱层析，用石油醚/乙酸乙酯混合液梯度洗脱(石油醚和乙酸乙酯体积比依次为200:1、100:1、50:1、20:1)，用薄层色谱法检视分段收集得到8个组分，记为B5-1～B5-8组分；B5-2组分(3.5g)经过硅胶柱层析，用石油醚/丙酮混合液等度洗脱(石油醚和丙酮的体积比为200:1)，用薄层色谱法检视分段收集得到6个组分，记为B5-2-1～B5-2-6组分；B5-2-3组分(40mg)经过高效液相色谱分离，选用乙腈/水混合液等度洗脱(乙腈和水的体积比为85:15)，依次得到化合物3(6mg)和6(3mg)；
B6组分(22g)经过硅胶柱层析，用石油醚/乙酸乙酯混合液梯度洗脱(石油醚和乙酸乙酯体积比依次为150:1、100:1、30:1、10:1)，用薄层色谱法检视分段收集得到6个组分，记为B6-1～B6-6组分；B6-4组分(2.2g)经硅胶柱层析，用石油醚/丙酮等度洗脱(石油醚和丙酮体积比为150:1)，用薄层色谱法检视分段收集得到6个组分，记为B6-4-1～B6-4-6组分，B6-4-5组分(80mg)经过高效液相色谱分离，选用乙腈/水混合液等度洗脱(乙腈和水的体积比为80:20)，依次得到化合物2(5mg)、4(3mg)和1(20mg)；
其中C组分(210g)用聚酰胺拌样，过MCI柱，以甲醇/水为流动相进行梯度洗脱(甲醇和水的体积比依次为60:40、65:35、70:30、75:25、80:20、85:15、90:10、95:5、100:0)，经薄层色谱法检视分段收集得到7个组分，记为C1-C7组分；C3组分(14g)经过硅胶柱层析，用石油醚/乙酸乙酯混合液梯度洗脱(石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为300:1、150:1、50:1、20:1、5:1)，经薄层色谱法检视分段收集得到8个组分，记为C3-1～C3-8组分；C-3-3组分(1.1g)经过硅胶柱层析，用石油醚/乙酸乙酯混合液等度洗脱(石油醚和乙酸乙酯的体积比为300:1)，用薄层色谱法检视分段收集得到7个组分，记为C3-3-1～C3-3-7组分；C3-3-4组分(72mg)经过高效液相色谱分离，选用乙腈/水混合液等度洗脱(乙腈和水的体积比为75:25)，依次得到化合物5(10mg)和7(5mg)。
化合物1～7的结构解析(各化合物的表征图如图1～21所示)具体如下：
化合物1，红色粉末。EI-MS谱显示分子离子峰为m/z330[M]+，结合HREI-MS(m/z[M]+330.1822,calcd 330.1831)及13C NMR和DEPT谱图提供的信息，确定其分子式为C20H26O4。分析其13C NMR和DEPT数据，共有20个碳信号，包括5个甲基、3个亚甲基、3个次甲基以及9个季碳。仔细对比化合物1和松香烷二萜taxodion的核磁数据，推测化合物1是taxodion的衍生物，C-5位上氢被羟基取代。HMBC谱中，OH-5与C-4/5/6/10之间的相关信号证实了这一推测。ROESY谱中，OH-5与Me-20的相关信号，确定了OH-5位为β朝向。进一步分析其HSQC、HMBC、1H-1H COSY和ROESY谱，最终确定了化合物1的结构，其1H和13CNMR数据如表1所示。
表1 化合物1的1H-NMR和13C-NMR数据(acetone-d6)
Figure BDA0002272901000000091
化合物2，无色油状液体。EI-MS显示分子离子峰m/z 270[M]+，结合其13C NMR以及DEPT谱，推测出分子式为C18H22O2，HREI-MS数据(m/z 270.1612[M]+,calcd 270.1620)进一步证实其分子式。1H、13C NMR和DEPT图谱数据显示出18个碳信号，包括4个甲基、3个亚甲基、4个次甲基以及7个季碳(其中1个为酯基(δC 161.1)信号)，符合C环内酯环C-11/C-12降碳的松香烷二萜结构特征。HMBC谱中，δH 3.02(sept,7.0,H-15)和δH 7.69(s,H-14)与δC161.1的相关信号说明δC161.1位于C-12位，证实了上述推测。仔细分析化合物2的HSQC、HMBC和1H-1H COSY谱，最终确定了化合物2的结构，其1H和13C NMR数据如表2所示。
表2 化合物2的1H-NMR和13C-NMR数据(acetone-d6)
Figure BDA0002272901000000101
化合物3，无色油状液体。HREI-MS显示分子离子峰(m/z 284.1770[M]+,calcd284.1776)，由此确定其分子式为C19H24O2，计算不饱和度为7。分析其13C NMR和DEPT数据，共有19个碳信号，包括5个甲基、3个亚甲基、3个次甲基以及8个季碳。仔细分析化合物3的HSQC、HMBC、和1H-1H COSY谱，最终确定了化合物3的结构，其1H和13C NMR数据如表3所示。
表3 化合物3的1H-NMR和13C-NMR数据(CDCl3)
Figure BDA0002272901000000102
化合物4，无色油状液体。根据HREI-MS(m/z 270.1614，calcd 270.1620)，结合13CNMR和DEPT图谱数据，推断其分子式为C18H22O2，不饱和度为8。对比分析化合物4与化合物3的NMR数据，发现化合物4比化合物3少了一个苯环上的甲基信号，其它NMR数据都一致。仔细分析化合物4的HSQC、HMBC和1H-1HCOSY谱，最终确定了化合物4的结构，其1H和13C NMR数据如表4所示。
表4 化合物4的1H-NMR和13C-NMR数据(acetone-d6)
Figure BDA0002272901000000111
化合物5，无色油状液体。EI-MS谱显示分子离子峰为m/z 342[M]+，结合HREI-MS(m/z[M]+ 342.1829,calcd 342.1831)及13C NMR和DEPT谱图提供的信息，确定其分子式为C21H26O4。分析其13C NMR和DEPT数据，共有21个碳信号，包括6个甲基(其中1个为甲氧基)、1个亚甲基、6个次甲基以及8个季碳。仔细分析化合物5的HSQC、HMBC、1H-1H COSY谱，最终确定了化合物5的结构，其1H和13C NMR数据如表5所示。
表5 化合物5的1H-NMR和13C-NMR数据(acetone-d6)
Figure BDA0002272901000000112
化合物6，无色油状液体。EI-MS显示分子离子峰m/z 294[M]+，结合13C NMR以及DEPT谱，推测出分子式为C20H22O2，HREI-MS(m/z 294.1635[M]+,calcd 294.1620)进一步证实其分子式。分析其13C NMR和DEPT数据，显示出20个碳信号，包括5个甲基、2个亚甲基、3个次甲基以及10个季碳。对比分析化合物6与化合物salvilenone的NMR数据，发现化合物6比化合物salvilenone多出2个亚甲基，少了2个次甲基，其它NMR数据很相似，推测化合物6与化合物salvilenone的差异在C-1/2是否成双键。仔细分析化合物6的HSQC、HMBC、1H-1H COSY谱，最终确定了化合物6的结构，其1H和13C NMR数据如表6所示。
表6 化合物6的1H-NMR和13C-NMR数据(acetone-d6)
Figure BDA0002272901000000121
化合物7，无色小针晶。根据HREI-MS(m/z 326.1883，calcd 326.1882)，结合13CNMR和DEPT图谱数据，确定其分子式为C21H26O3。核磁谱中显示出21个碳信号，包括5个甲基(其中一个为甲氧基)，3个亚甲基、4个次甲基和9个季碳(其中一个为共轭羰基碳(δC 194.7))。仔细分析这些数据表明化合物7为意烯萜烷型二萜，分析化合物7的HSQC、HMBC、1H-1H COSY谱，最终确定了化合物7的结构，其1H和13CNMR数据如表7所示。
表7 化合物7的1H-NMR和13C-NMR数据(acetone-d6)
Figure BDA0002272901000000122
Figure BDA0002272901000000131
化合物1～7的理化性质及结构数据：
化合物1:C20H26O4；红色粉末；
Figure BDA0002272901000000132
UV(MeOH):λmax(logε)196(3.01),264(1.98),326(3.11),336(3.12),385(2.15)nm；IR(KBr)νmax3490,3330,2961,2927,1661,1641,1617,1365,1260,1096cm-1。
化合物2:C18H22O2；无色油状物；UV(MeOH):λmax(logε)204(4.63),293(4.25)nm；IR(KBr)νmax2961,2931,2870,1717,1609,1462,1426,1385,1191,1147,1026,784cm-1。
化合物3:C19H24O2；无色油状物；UV(MeOH):λmax(logε)204(4.59),300(4.16)nm；IR(KBr)νmax2961,2931,2870,1720,1604,1465,1420,1260,1156,1019,785cm-1。
化合物4:C18H22O2；无色油状物；UV(MeOH):λmax(logε)204(4.51),217(4.28),288(4.04),320(3.94)nm；IR(KBr)νmax2960,2931,2870,1726,1713,1629,1618,1566,1465,1385,1243,1193,1137,1014cm-1。
化合物5:C21H26O4；无色油状物；
Figure BDA0002272901000000133
UV(MeOH):λmax(logε)206(2.91),254(2.53),258(2.53)nm；IR(KBr)νmax 2964,2926,1758,1722,1414，1250,1033cm-1。
化合物6:C20H22O2；无色油状物；UV(MeOH):λmax(logε)204(4.54),226(4.39),265(3.96),294(4.05),357(3.98),471(2.33)nm；IR(KBr)νmax2961,2926,1635,1606,1563,1287,1200,1136,1072cm-1。
化合物7:C21H26O3；无色晶体；UV(MeOH):λmax(logε)203(4.33),296(3.81),318(3.78)nm；IR(KBr)νmax3441,3431,2968,2925,1738,1720,1629,1566,1551,1450,1228,1113cm-1。
实施例2
实施例1中所述化合物对花生四烯酸(AA)诱导的兔血小板聚集的影响：
1.溶液的配制
AA溶液：按说明书方法加入标注体积的纯水，充分溶解配制浓度为15mM的AA溶液，分装后冷藏(-20℃)备用；
受试样品(实施例1中所述化合物)溶液或对照品(阿司匹林)溶液：用二甲基亚砜(DMSO)配制浓度为10mg/mL的受试样品母液或对照品母液，再用DMSO进行稀释配制所需浓度的受试样品溶液或对照品溶液；
无Ca2+台氏液(Ca2+ free Tyrode’s buffer)：含NaCl 137mM、KCl 2.68mM，MgSO4·7H2O 0.2mM、NaH2PO4·2H2O 0.42mM、NaHCO3 11.9mM、葡萄糖5.05mM、EGTA 0.2mM，pH值为6.5；
含0.25％牛血清白蛋白(BSA)的台氏液(Tyrode’s buffer,0.25％BSA)：台氏液含NaCl 137mM、KCl 2.68mM、MgSO4·7H2O 1.05mM、NaH2PO4·2H2O 0.42mM、NaHCO3 11.9mM、葡萄糖5.05mM、CaCl2 1.8mM，pH值为7.35，实验前取适量台氏液加入牛血清白蛋白，配制得到含0.25％(W/V)牛血清白蛋白的台氏液。
2.PRP、PPP和WP的制备
实验兔耳中央用乙醇消毒液擦拭后，用医用一次性采血针经耳中央动脉采血至枸橼酸钠真空抗凝采血管(抗凝剂为3.2％(W/V)枸橼酸钠，全血:抗凝剂＝9:1(V:V))，轻轻颠倒采血管数次使血液和抗凝剂混合均匀。
将所得抗凝血离心(180×g,10min,20℃)，收集上清液为富血小板血浆(plateletrich plasma,PRP)。将剩余血液再次离心(2400×g,20min,20℃)，收集上清液为贫血小板血浆((platelet poor plasma,PPP)；将PRP离心(600×g,10min,20℃)，得到血小板块状沉淀，用无Ca2+台氏液对血小板块状沉淀进行洗涤(具体是重悬后离心)，重复2次，再用含0.25％牛血清白蛋白(BSA)的台氏液重悬血小板，制备得到洗涤血小板悬液(washedplatelet,WP)。
3.受试样品对AA诱导兔PRP中血小板聚集的影响
将带搅拌子的比色杯与不带搅拌子的比色杯分别置于血小板聚集仪预温孔，37℃预温10min。加入500μL PPP于不带搅拌子的比色杯中，并将其置于PPP测试位；向预温的带搅拌子的比色杯中加入250μL PRP，并加入2.5μL受试样品溶液/对照品溶液(终浓度为实验浓度1/100，即100μg/mL)，继续预温5min后，将其放入PRP测试位；校正记录曲线的基线，加入2.5μL诱导剂(AA溶液,0.15mM)至PRP中，记录血小板聚集曲线，计算最大聚集率。以相同体积溶媒(DMSO)代替受试样品溶液/对照品溶液，检测得到溶剂对照最大聚集率，用于计算受试样品对AA诱导兔血小板聚集的抑制率，公式具体如下：
Figure BDA0002272901000000141
4.受试样品对AA诱导兔洗涤血小板聚集的影响
将带搅拌子的比色杯与不带搅拌子的比色杯分别置于血小板聚集仪预温孔，37℃预温10min。加入500μL含0.25％牛血清白蛋白(BSA)的台氏液于不带搅拌子的比色杯中，并将其置于PPP测试位；向预温的带搅拌子的比色杯中加入250μL WP，并加入2.5μL受试样品溶液/对照品溶液(终浓度为实验浓度1/100，即100μg/mL)，继续预温5min后，将其放入PRP测试位；校正记录曲线的基线，加入5μL诱导剂(AA溶液，0.3mM)至WP中，记录血小板聚集曲线，计算最大聚集率。以相同体积溶媒(DMSO)代替受试样品溶液/对照品溶液，检测得到溶剂对照最大聚集率，用于计算受试样品对AA诱导兔血小板聚集的抑制率。使用不同实验兔来源的WP重复检测3次或以上。
5.实验结果
各受试样品/对照品(100μg/mL)存在下AA(花生四烯酸，终浓度为0.15mM)诱导的兔血小板最大聚集率以及受试样品/对照品的抑制率如表8所示。
表8 兔PRP中各受试样品/对照品对AA(0.15mM)诱导血小板聚集的影响数据
Figure BDA0002272901000000151
a实验结果表示为均值±SD(n≥3)。
IC50值：通过prism6软件对各受试样品浓度-血小板最大聚集率进行非线性拟合分析。将浓度转换为对数值后，选择log(inhibitor)vs.response--Variable slope(fourparameters)进行四参数拟合(Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*HillSlope)))，计算IC50值。各受试样品/对照品对AA(花生四烯酸，终浓度为0.3mM)诱导的兔洗涤血小板聚集的抑制活性如表9、图22～25(其中，图22～24为血小板聚集仪检测记录图)所示。
表9 各受试样品/对照品对AA(0.3mM)诱导兔洗涤血小板聚集的抑制作用数据
Figure BDA0002272901000000152
a实验结果表示为均值±SD(n≥3)。
由表8～9和图22～25可见：在PRP或WP检测体系中，所述化合物1～7对AA诱导的兔血小板聚集均具有显著的抑制作用；各化合物抑制兔洗涤血小板聚集的IC50值均小于阳性对照阿司匹林(aspirin)。这说明所述化合物具有显著的抗血小板活性，可作为活性成分用于制备抗血小板类抗血栓药物，具有潜在临床应用价值。
实施例3
实施例1中所述化合物对FeCl3诱导的大鼠颈动脉血栓形成的抑制作用：
1.溶液配制
50％FeCl3溶液：用生理盐水溶解三氯化铁固体，配制浓度为50％(W/V)的FeCl3溶液；
配药溶媒：将2.5％CMC-Na(W/V)和0.25％Tween80(V/V)溶于生理盐水；
药物溶液：用DMSO分别将实施例1中所述化合物充分溶解后，使用上述配药溶媒稀释10倍；
2.FeCl3诱导大鼠颈动脉血栓实验
仪器操作：将Transonic超声血流量仪打开后，调零，定标，完成单位转换(V----mL/min)；
动物模型：大鼠腹腔注射10％水合氯醛麻醉(350mg/kg),固定，仰卧固定，沿颈部正中剪出切口，分离出右颈动脉约1.5cm，在动脉下方垫约1cm宽的硫酸纸条(防止FeCl3诱导血栓时损伤其它组织)，超声血流探头涂好润滑剂后夹在分离出的颈动脉(远心端)上，开始连续检测颈动脉血流量。血流量检测稳定后(至少2min)，将吸有50％FeCl3溶液的1cm×1cm的滤纸覆盖在暴露的颈动脉上(靠近流量探头的近心端)。以FeCl3诱导损伤为起点，以血流量记录曲线平稳位于0mL/min处为终点，计算颈动脉阻塞时间(min)。
给药方式：上述配制好的药物溶液在给药前用生理盐水稀释2倍后用于动物实验，给药体积为2mL/kg。大鼠腹腔注射(i.p.)给药约5min后麻醉，给药20min后开始FeCl3诱导损伤；或大鼠麻醉后股静脉注射(i.v.)给药，给药后5min开始FeCl3诱导损伤。
3.数据处理
使用LabChart软件处理实验结果，计算阻塞时间，用Excel和prism6软件分别进行统计和作图(结果见表10和图26)。各动物处理组阻塞时间的结果以“均值±SD”表示，FTEST检验方差齐性，TTEST检验显著性差异(对于每个处理组，与相应对照组相比，*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001)。
4.实验结果
如表10和图26所示，FeCl3诱导大鼠颈动脉损伤模型中，化合物1在2mg/kg剂量下，腹腔注射给药可显著延长阻塞时间。10mg/kg剂量下，阳性对照阿司匹林腹腔注射对大鼠颈动脉阻塞时间无显著影响，静脉注射给药则可显著延长阻塞时间。
表10 各受试样品/对照品对FeCl3诱导损伤后颈动脉阻塞时间的影响数据
Figure BDA0002272901000000161
a对照组以相同给药方式给予等体积溶媒(10％DMSO+90％配药溶媒)；
b实验结果表示为均值±SD(n＝6)；
c *P≤0.05,**P≤0.01,***P≤0.001(双尾T检验)vs对照组。
综上所述，本发明所述化合物1～7对花生四烯酸诱导的兔血小板聚集具有显著而强效的抑制活性。所述松香烷型二萜类化合物抑制花生四烯酸诱导的兔血小板聚集的IC50约在2.15～16.16μg/mL范围内(阳性对照品阿司匹林的IC50为27.69±8.10μg/mL)，其抗血小板活性均强于阿司匹林(以IC50值计，抑制活性强约2～20倍)。并且，所述松香烷型二萜类化合物具有显著的体内抗血栓活性，如，在FeCl3诱导损伤的大鼠颈动脉血栓模型中，松香烷型二萜类化合物可以显著的延长动脉阻塞时间，其活性强于阿司匹林。
值得注意的是，阿司匹林的抗血小板聚集机制是通过其乙酰基与环氧化酶(COX)活性位点的丝氨酸不可逆结合，使血小板的COX乙酰化，抑制COX功能，从而抑制前列腺素类化合物(PGG2/PGH2)和TXA2的生成，发挥抗血小板作用。本发明所涉及的松香烷型二萜类化合物则具有明显不同于阿司匹林的抗血小板聚集作用机制。鉴于血小板聚集是形成血栓性疾病(特别是动脉血栓形成)的重要的病理机制之一，本发明所述松香烷型二萜类化合物具有预防和/或治疗血栓性疾病的潜在临床应用价值。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.松香烷型二萜类化合物，其特征在于，为具有式1～式7所示结构化合物中的任意一种：
Figure FDA0002272900990000011
2.权利要求1所述松香烷型二萜类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
采用丙酮对康定鼠尾草进行提取，所得提取液经减压蒸馏得到浸膏；
将所述浸膏进行硅胶柱层析，所用洗脱剂为氯仿，之后将所得氯仿部分在梯度洗脱条件下进行硅胶柱层析，所用洗脱剂为石油醚/氯仿/乙酸乙酯混合液，依次收集得到7个组分，记为A～G组分；
将B组分用聚酰胺拌样，在梯度洗脱条件下过MCI柱，所用流动相为甲醇/水混合液，依次收集得到8个组分，记为B1～B8组分；
在梯度洗脱条件下将B5组分进行硅胶柱层析，所用洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯混合液，依次收集得到8个组分，记为B5-1～B5-8组分；在等度洗脱条件下将B5-2组分进行硅胶柱层析，所用洗脱剂为石油醚/丙酮混合液，依次收集得到6个组分，记为B5-2-1～B5-2-6组分；B5-2-3组分经过高效液相色谱分离，依次得到式3和式6所示结构的化合物；
在梯度洗脱条件下将B6组分进行硅胶柱层析，所用洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯混合液，依次收集得到6个组分，记为B6-1～B6-6组分；在等度洗脱条件下将B6-4组分进行硅胶柱层析，所用洗脱剂为石油醚/丙酮混合液，依次收集得到6个组分，记为B6-4-1～B6-4-6组分；B6-4-5组分经过高效液相色谱分离，依次得到式2、式4和式1所示结构的化合物；
将C组分用聚酰胺拌样，在梯度洗脱条件下过MCI柱，所用流动相为甲醇/水混合液，依次收集得到7个组分，记为C1-C7组分；在梯度洗脱条件下将C3组分进行硅胶柱层析，所用洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯混合液，依次收集得到8个组分，记为C3-1～C3-8组分；在等度洗脱条件下将C-3-3组分进行硅胶柱层析，所用洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯混合液，依次收集得到7个组分，记为C3-3-1～C3-3-7组分；C3-3-4组分经过高效液相色谱分离，依次得到式5和式7所示结构的化合物。
3.一种具有抗血小板活性的药物组合物，其特征在于，由活性成分和药学上可接受的辅料组成，所述活性成分为权利要求1所述松香烷型二萜类化合物中的至少一种或权利要求2所述制备方法制备得到的松香烷型二萜类化合物中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述药学上可接受的辅料包括药物载体、表面活性剂、缓冲物质、崩解剂、粘合剂、填充剂、润滑剂、赋形剂、增溶剂、香味剂和着色剂中的一种或几种。
5.根据权利要求3或4所述的药物组合物，其特征在于，所述活性成分的含量为0.05～99wt.％。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述活性成分的含量为0.5～90wt.％。
7.权利要求3～6任一项所述药物组合物在制备预防和/或治疗血栓性疾病的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述血栓性疾病包括冠心病、缺血性脑血管病和外周血管病中的一种或几种。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述冠心病包括心绞痛和/或心肌梗塞；所述缺血性脑血管病包括脑卒中和/或脑梗死；所述外周血管病包括动脉粥样硬化血栓形成性疾病。
10.根据权利要求7～9任一项所述的应用，其特征在于，所述预防和/或治疗血栓性疾病的药物的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、口服液制剂、注射剂或冻干粉针剂。
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