CN110917364A - 微泡制备方法 - Google Patents

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CN110917364A CN201911277091.2A CN201911277091A CN110917364A CN 110917364 A CN110917364 A CN 110917364A CN 201911277091 A CN201911277091 A CN 201911277091A CN 110917364 A CN110917364 A CN 110917364A
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Abstract

本发明涉及一种微泡制备方法，包括以下步骤：向反应容器提供成膜材料；向所述反应容器充入形成微泡所需的气体并控制充入气体的体积；用预设方法生成由所述成膜材料包裹所述气体的微泡，改善了现有制备方法微泡浓度值一致性不佳的问题，从而带来微泡浓度值一致性更好的有益效果。

Description

微泡制备方法
技术领域
本发明涉及制备工艺领域，尤其是一种微泡的制备方法。
背景技术
封闭的微米级含气微泡，常用于医学超声成像，作为增强医学超声成像信号的诊断试剂——超声造影剂。
医学超声成像以组织内各细微结构作为超声波的散射体，当超声束遇到小于发射波长的截面时发生散射现象，散射波存在于任何方向，其中与探头发射方向相反的散射称为背向散射，超声诊断仪探头接收背向散射信号，实现组织成像。
超声造影剂是由大量分散在液体中的微泡组成的混悬液，通过静脉注射的方式进入血液循环系统，其中的每一个微泡都是一个声波散射体，能够提高背向散射强度从而实现医学超声成像。市售的超声造影剂产品主要有Optison，Definity，Sonovue等(Pereraet.(2015)Wiley Interdisciplinary Reviews:Nanomedicine and Nanobiotechnology,7(4),593-608)。
背向散射强度是超声造影剂最重要的性能指标，背向散射强度可以由以下公式给出(假定在一个特定的区域内，散射体直径远小于波长，并且呈松散分布)：
Figure BDA0002315847950000011
其中Is为背向散射强度(W/m2)；I为入射波的强度(W/m2)；N为散射体粒子的数目，即微泡浓度；V为微泡体积(m3)；∑为单个微泡的有效散射面积(scattering cross-section)，即：在理想状态下，超声造影剂的背向散射强度受到微泡浓度、微泡体积等因素的综合影响。
微泡浓度是影响背向散射强度的主要因素之一，当微泡浓度值出现波动时，背向散射强度会随之改变(Lampaskis&Averkiou(2010).Ultrasound in medicine&biology,36(2),306-312)，另外，随着超声探测仪的发展，微泡浓度值的轻微变化都会反馈到超声检测结果中，若要保证背向散射强度的一致性，需尽可能的保证微泡浓度值的一致性。
除超声造影剂以外，微泡还广泛应用于靶向递送药物、溶栓、基因靶向输送等用途，主要原因是微泡在超声辐照下会产生空化作用，因此微泡联合超声可进行局部控释药物从而产生局部治疗和期望的生理效应。
当微泡用于靶向递送药物时，微泡的浓度是影响给药剂量的因素之一，为了保证准确一致的给药剂量，应尽可能地减小微泡浓度值的差异，以确保给药剂量的准确性和一致性，以免达不到有效治疗浓度而失效、或是超过最高耐受浓度而出现毒副作用(Kaya&Dayton(2009)Ultrasound in medicine&biology,35(10),1748-1755)。
已知的微泡制备方法，通常以全氟化碳、六氟化硫等作为内核气体，以白蛋白、磷脂等作为壳膜材料，将壳膜材料的溶液储存在反应容器以后，采用自由充气、过量充气等未对充气体积加以控制的充气方式向反应容器充入内核气体，最后通过超声空化法、冷冻干燥法、机械均化法等方式生成微泡，以下专利详细披露了几种典型的微泡的制备过程。
CN104519989B公开了一种机械均化法制备超声造影剂的方法，该方法以全氟丙烷作为气核，以白蛋白溶液作为包膜溶液，向白蛋白溶液充入全氟丙烷气体形成气液混合物后，经机械剪切力作用将全氟丙烷气体分散到白蛋白溶液中以形成由白蛋白包裹气体的微泡。
CN101528268B公开了一种通过冷冻干燥法制备超声造影剂的方法，该方法以六氟化硫作为气核，以磷脂作为成膜材料，先将磷脂冻干，然后使其暴露于六氟化硫中并重构形成含有微泡的混悬液。
CN101926821B公开了一种通过超声空化法制备载药微泡的方法，该方法以全氟丙烷作为气核，以白蛋白溶液作为包膜溶液，将白蛋白溶液置入容器中，再向白蛋白溶液中充入全氟丙烷，声振一定时间后可制备形成全氟丙烷白蛋白微球混悬液。
上述微泡制备方法存在的不足之处在于：难以保证微泡浓度的一致性，制备得到的微泡浓度值不均一。经过反复的微泡制备发现，瓶与瓶之间微泡的浓度值或多或少有些差异，对于扩大规模后的工业化批量生产，各批次间微泡的浓度值也存在差异；由于瓶与瓶之间或各批次之间微泡浓度值存在差异，存在微泡浓度的一致性不佳的问题，不仅会影响微泡的背向散射强度或药物剂量等产品参数的一致性，也难以满足大规模工业化批量生产对产品质量安全性或可控性的要求，目前没有文献报道如何从根本上解决这一问题。
发明内容
本发明旨在提供一种能够提升微泡浓度一致性的微泡制备方法。发明人在研究中发现：在微泡的制备过程中，充入气体的体积能够影响微泡的浓度。因此，本发明提供一种微泡制备方法，包括以下步骤：(1)向反应容器提供成膜材料；(2)向所述反应容器充入形成微泡所需的气体并控制充入气体的体积；(3)用预设方法生成由所述成膜材料包裹所述气体的微泡。
优选的，步骤(3)中的所述预设方法选自：吸附法、机械均化法、超声空化法、冷冻干燥法、薄膜-水化法、复乳-溶剂蒸发法、氟碳化合物气化法。
优选的，所述形成微泡所需的气体包括氟化气体。
优选的，所述氟化气体包括全氟丙烷、全氟丁烷或六氟化硫。
优选的，所述成膜材料包括棕榈酸、磷脂、白蛋白、多聚体或丙烯酸酯。
优选的，所述白蛋白是人血白蛋白稀释液。
优选的，所述成膜材料包括磷脂，所述形成微泡所需的气体包括六氟化硫，所述预设方法为冷冻干燥法，所述冷冻干燥法具体包括以下步骤：在所述步骤(1)中，在反应容器中将成膜材料冷冻干燥得到粉末产物；在所述步骤(2)中，在反应容器中将所述冷冻干燥所获得的粉末产物与所述形成微泡所需的气体混合；在所述步骤(3)中，用生理学可接受的水载体重构从而生成所述微泡。
优选的，所述成膜材料包括白蛋白溶液，所述形成微泡所需的气体包括全氟丙烷或全氟丁烷，所述预设方法为超声空化法，所述超声空化法具体包括以下步骤：在步骤(2)中，在反应容器中将所述全氟丙烷或所述全氟丁烷与所述成膜材料混合；在步骤(3)中，向所述全氟丙烷或所述全氟丁烷与所述成膜材料的混合物施加超声声振，通过该超声声振生成由所述成膜材料包裹所述全氟丙烷或所述全氟丁烷的微泡。
优选的，所述成膜材料由浓度为4wt.％-6wt.％的白蛋白溶液和浓度为4wt.％-6wt.％的葡萄糖溶液均匀混合形成，所述白蛋白溶液与所述葡萄糖溶液的体积比为1:(2-4)。
优选的，所述成膜材料包括白蛋白溶液，所述形成微泡所需的气体包括全氟丙烷或全氟丁烷，所述预设方法为机械均化法，所述机械均化法具体包括以下步骤：
在所述步骤(2)中，在反应容器中将所述全氟丙烷或所述全氟丁烷与所述成膜材料混合；
在所述步骤(3)中，向所述全氟丙烷或全氟丁烷与所述成膜材料的交界处施加机械剪切或机械搅拌，通过该机械剪切或机械搅拌生成由所述成膜材料包裹所述全氟丙烷或所述全氟丁烷的微泡。
优选的，所述成膜材料由浓度为4wt.％-6wt.％的白蛋白溶液和浓度为4wt.％-6wt.％的葡萄糖溶液均匀混合形成，所述白蛋白溶液与所述葡萄糖溶液的体积比为1:(2-4)。
优选的，所述制备方法生成微泡的平均粒径小于10μm。
优选的，所述制备方法生成的微泡浓度值为1×107个/mL-1×1010个/mL。
优选的，所述制备方法用于制备超声造影剂。
优选的，所述制备方法用于制备靶向递送微泡，所述靶向递送微泡结合有药物，基因或微量元素。
优选的，所述微量元素包括铜、锌、硒、铁中的任意一种或一种以上的任意组合。
优选的，在所述步骤(2)中，通过控制充气体积值控制充入气体的体积。
优选的，所述控制充气体积值具体包括以下步骤：设定所述充气体积值；按照所设定的所述充气体积值向所述反应容器充入所述形成微泡所需的气体。
优选的，所述设定所述充气体积值的步骤包括：设定微泡浓度值；根据微泡浓度值与充气体积值之间的映射关系，确定与所述微泡浓度值所对应的所述充气体积值。
优选的，所述控制充气体积值的步骤是将所述充气体积值控制在容许偏差范围以内。
优选的，确定所述充气体积值的容许偏差范围的步骤包括：设定所述微泡浓度值的容许偏差范围；根据所述微泡浓度值与所述充气体积值之间的映射关系，确定满足所述微泡浓度值的容许偏差范围所对应的所述充气体积值的容许偏差范围。
优选的，在所述步骤(2)中，通过控制充气时长值控制充入气体的体积。
优选的，所述控制充气时长值的步骤包括：设定所述充气时长值；按照所设定的充气时长值向所述反应容器充入所述形成微泡所需的气体。
优选的，所述设定充气时长值的步骤包括：设定微泡浓度值；根据微泡浓度值与充气时长值之间的映射关系，确定与所述微泡浓度值所对应的所述充气时长值。
优选的，所述设定充气时长值的步骤包括：设定充气体积值；根据充气体积值与充气时长值之间的映射关系，确定与所述充气体积值对应的所述充气时长值。
优选的，所述控制充气时长值的步骤是将所述充气时长值控制在容许偏差范围以内。
优选的，确定所述充气时长值的容许偏差范围的步骤包括：设定所述微泡浓度值的容许偏差范围；根据所述微泡浓度值与所述充气时长值之间的映射关系，确定满足所述微泡浓度值的容许偏差范围所对应的所述充气时长值的容许偏差范围。
优选的，在控制充气时长值的步骤中，还包括维持充气流量的步骤。
优选的，在控制充气时长值的步骤中，还包括维持充气压力值的步骤。
优选的，在所述步骤(2)中，通过控制充气压力值控制充入气体的体积。
优选的，所述控制充气压力值的步骤包括：设定所述充气压力值；按照所设定的充气压力值向所述反应容器充入所述形成微泡所需的气体。
优选的，所述控制充气压力值的步骤包括：设定微泡浓度值；根据微泡浓度值与充气压力值之间的映射关系，确定与所述微泡浓度值所对应的所述充气压力值；按照所确定的所述充气压力值，向反应容器充入形成微泡所需的气体。
优选的，所述控制充气压力值的步骤包括：设定充气体积值；根据充气体积值与充气压力值之间的映射关系，确定与所述充气体积值对应的所述充气压力值；按照所确定的所述充气压力值向所述反应容器充入所述形成微泡所需的气体。
优选的，所述控制充气压力值的步骤是将所述充气压力值控制在容许偏差范围以内。
优选的，确定所述充气压力值的容许偏差范围的步骤包括：设定所述微泡浓度值的容许偏差范围；根据所述微泡浓度值与所述充气压力值之间的映射关系，确定满足所述微泡浓度值的容许偏差范围所对应的所述充气压力值的容许偏差范围。
优选的，还包括在充气期间维持充气时长值的步骤。
优选的，所述步骤(2)通过定量充气的充气方式控制充入气体的体积。
优选的，还包括在充气期间使所述成膜材料的量保持一致的步骤。
优选的，还包括在充入气体之前密闭所述反应容器的步骤。
优选的，还包括在充入气体之前将所述反应容器真空化的步骤。
优选的，还包括在充气期间维持环境温度的步骤。
本发明还提供一种批量制备微泡的方法，包括进行至少两次上述微泡制备方法，并控制各次微泡制备方法之间充入气体的体积的差异在容许偏差范围以内。
本发明还提供了一种微泡制备装置的供气系统，包括：气源，用以提供形成微泡所需的气体；气路，所述气路的一端与所述气源连接，所述气路的另一端连接反应容器的气体入口；充气体积控制部件，所述充气体积控制部件能够控制向反应容器充入气体的体积。
优选的，所述充气体积控制部件设置于所述气路上，所述充气体积控制部件通过控制该气路的开闭从而控制向反应容器充入气体的体积。
优选的，所述充气体积控制部件通过充气体积值控制向反应容器充入气体的体积。进一步的，所述充气体积控制部件包括阀门和控制器，所述控制器根据输入的充气体积值，控制所述阀门在该充气体积值内处于打开状态。
优选的，所述充气体积控制部件通过充气时长值控制向反应容器充入气体的体积。进一步的，所述充气体积控制部件包括阀门和控制器，所述控制器根据输入的充气时长值，控制所述阀门在该充气时长值内处于打开状态。
优选的，所述充气体积控制部件设置于所述气路上，所述充气体积控制部件通过充气压力值控制向反应容器充入气体的体积。进一步的，所述充气体积控制部件包括压力调节阀。
优选的，上述微泡制备装置的供气系统还包括真空控制组件，所述真空控制组件能够调节或维持所述气路和/或反应容器的真空压力。进一步的，所述真空控制组件包括真空泵和继电器，所述继电器与真空泵的电源连接以控制所述真空泵启闭时间。
优选的，上述微泡制备装置的供气系统还包括温度控制装置，所述温度控制装置用于调节或维持所述气路和反应容器所处环境的温度。
优选的，上述微泡制备装置的供气系统还包括流量检测装置，所述流量检测装置用于实时地检测和显示供气系统中的气体流量值。进一步的，所述流量监测装置为流量计，所述气体流量计设置于所述充气体积控制部件与所述反应容器之间。
本发明还提供一种微泡制备装置，包括上述供气系统。
本发明的有益效果是：基于充入气体的体积影响微泡浓度的发现，本发明向反应容器充入形成微泡所需的气体并控制充入气体的体积，相比于传统制备方法中采用自由充气等不加以控制地充入气体的方式，能够有效地提升微泡浓度的一致性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为充气体积值与微泡浓度值之间的线性关系；
图2为充气时长值与微泡浓度值之间的线性关系；
图3为充气体积值与充气时长值之间的线性关系；
图4为充气压力值与微泡浓度值之间的线性关系；
图5为充气体积值与充气压力值之间的线性关系；
图6为本发明微泡制备装置及其供气系统的示意图；
图7为充气压力值对微泡浓度值的影响；
图8为非真空或真空条件下，充气压力值对微泡浓度值的影响；
图9为充气时长值对微泡浓度值的影响；
图10为充气时长值对微泡粒径值的影响；
图11为充气体积值对微泡浓度值的影响；
图12为充气体积值对微泡粒径的影响；
图13为充气压力值对微泡浓度值的影响；
图14为充气时长值对背向散射强度影响；
图15为充气时长值对白蛋白超声造影剂造影增强效果的影响及时间-强度曲线。
具体实施方式
微泡
术语“微泡”是指由成膜材料包裹气体形成的微米级结构，本领域常称为气体填充微泡、微球体、微球或微胶囊等，微泡通常大量地分散在液体中、以微泡混悬液的形式存在。
常见的微泡有：白蛋白含气微泡和磷脂含气微泡，它们分别采用白蛋白溶液或磷脂作为成膜材料、采用全氟丙烷或六氟化硫作为内核气体。
本文中微泡制备主要包括以下几个步骤：向反应容器加入成膜材料，向反应容器充入形成微泡所需的气体并控制充入气体的体积，再经预设方法生成由所述成膜材料包裹所述气体的微泡。其中，预设方法选自本领域熟知的生成微泡方法，包括：吸附法、机械均化法、超声空化法、冷冻干燥法、薄膜-水化法、复乳-溶剂蒸发法、氟碳化合物气化法等，上述方法能够生成平均粒径小于10μm、浓度为1×107个/mL-1×1010个/mL的微泡，上述方法制备获得的微泡的用途包括：超声造影剂和靶向递送载体。
超声造影剂
超声造影剂是一类能够显著增强医学超声成像信号的诊断试剂，微泡在超声造影剂显影时作为散射体，当声波经过微泡时，微泡与声波产生共振使散射信号大大增强，从而显著提高组织血管的散射信号。
本领域已知的，制备用作超声造影剂微泡的主要步骤包括：向一定浓度的成膜材料中自由通入形成微泡所需的气体，再采用预设的生成微泡的方法制备得到超声造影剂，以白蛋白超声造影剂为例，其主要步骤包括：向一定浓度的白蛋白溶液中自由通入全氟丙烷，经超声声振或机械剪切一定时间，即可形成白蛋白微泡超声造影剂。
发明人在研究中发现，超声造影剂中微泡的浓度与其背向散射性能相关，为了确保超声造影剂背向散射强度的一致性，需要对超声造影剂中微泡浓度的一致性进行控制，通过对超声造影剂中微泡浓度值一致性的控制，能够有助于解决背向散射强度一致性不佳的问题。
不仅如此，发明人在研究中进一步发现，在超声造影剂中，当微泡的浓度较低时：背向散射强度与微泡的浓度呈正相关；当微泡浓度值较高时：背向散射强度随微泡浓度值的升高而衰减，即：当达到一定浓度以后，微泡浓度值的升高反会减弱超声造影剂背向散射强度，此时微泡的衰减性能发挥主要作用，使超声造影图像逐渐模糊，分辨率降低。可见，通过对超声造影剂中微泡浓度值准确的控制，能够有助于制备出背向散射强度更加准确、适宜或更佳的超声造影剂。
靶向递送微泡
靶向递送微泡是指将药物、基因或微量元素通过化学作用或物理作用与微泡结合，其能够经静脉注射入人体内，达到局部释放药物、基因或微量元素的目的，常采用超声波对治疗部位进行辐照的方式，借助微泡与超声波的相互作用，起到靶向释放的效果，以解决药物、基因或微量元素难以达到其治疗浓度和生物生理效果的问题，尤其适用于受损伤组织在病理状态下难以靶向的、高效获取微量元素的情况。
本领域已知的，常规的微泡制备方法可以制备用作靶向递送的微泡，主要步骤包括：先将药物、基因或微量元素离子与成膜材料溶于水或有机溶剂中，使药物、基因或微量元素离子通过物理或化学作用与成膜材料结合形成复合膜材，再通过预设的生成微泡的方法将之前得到的复合膜材制备成微泡。
由于药物或微量元素的毒性和药用性剂量需要准确把握，而药物或微量元素的含量又与靶向递送微泡的浓度密切相关，因此，为了确保药物或微量元素的含量的一致性和准确性，需要在制备过程中控制微泡浓度值的一致性和准确性。
成膜材料
本文所述的成膜材料，又常称为：包膜材料、稳定化材料或壳材等，其主要作用是参与并形成微泡的稳定化外壳。
本文所述的成膜材料可以选自棕榈酸、磷脂、白蛋白、多聚体、丙烯酸酯或包含前述化合物的任意混合物，还可以包含表面活性剂等本领域所常用的其他材料，在此就不再赘述。
作为一种优选实施方式，成膜材料为人血白蛋白稀释液，由于人血白蛋白是人体外周血中最主要的金属离子结合蛋白，选用人血白蛋白稀释液作为成膜材料能够有利于非特异性输送至任何器官、有利于与金属离子有效结合。
作为一种优选实施方式，成膜材料为磷脂。一方面磷脂易于与化学药物、蛋白、基因等进行配位或共价结合，另一方面磷脂含气微泡即使在流速低时也不易被声场破坏；另外，选用磷脂作为靶向递送药物的成膜材料，一方面能够有利于递送抗原、抗体蛋白或治疗基因至任何器官，另一方面能够靶向于肿瘤内低流速的小血管，从而使微泡所携带的抗癌药物靶向性的发挥作用。
形成微泡所需的气体
本文所述的形成微泡所需的气体，又常称为：内核气体、气体核心等，其主要作用是填充微泡。
本文所述的形成微泡所需的气体选自本领域所常用的气体，作为一种优选实施方式，形成微泡所需的气体包括氟化气体。作为优选实施方式，形成微泡所需气体选用的氟化气体包括全氟丙烷(C3F8)、全氟丁烷(C4F10)六氟化硫(SF6)、以及上述气体任选其一或者混合物，以此能够延长微泡在血液循环中的时间，提高微泡在体内的稳定性的效果。
微量元素
本文所述的微量元素是指维持机体正常生命活动不可缺少的必需微量元素。本实施例中的微量元素选自本领域所常用的微量元素，包括：铁、铜、锌、钴、锰、铬、硒、碘、镍、氟、钼、钒、锡、硅、锶、硼、铷或砷离子中的一种或一种以上的任意组合。最优选的，微量元素选自：铜、锌、硒、铁中一种或一种以上的任意组合。
控制充入气体的体积
为了解决微泡浓度的一致性不佳的问题，发明人在研究中发现：在微泡的制备过程中，充入气体的体积能够直接影响微泡的浓度，基于上述发现，本发明提出一种微泡制备方法，包括以下步骤：(1)向反应容器提供成膜材料；(2)向所述反应容器充入形成微泡所需的气体并控制充入气体的体积；(3)用预设方法生成由所述成膜材料包裹所述气体的微泡。本发明中控制充入气体的体积亦可表述为：对充入气体的体积施加控制。
术语“控制”的含义是防止任意地波动或超出预定的范围，相比于传统微泡制备方法采用自由充气等不加以控制的充气方式，本发明通过对充入气体的体积施加控制，即：防止充入气体的体积任意地波动或超出预定的范围，能够有效减小充入气体体积的偏差或波动，更为重要的是，根据本发明对于微泡制备过程中充入气体的体积会影响微泡浓度的发现，相比于传统的自由充气或将气体与成膜材料混合等不加以控制地充入气体的方式，本发明在微泡制备过程中采用控制充入气体的体积的充气方法，能够有效减小充入气体的体积波动或偏差，达到显著提升微泡浓度的一致性的效果。
作为一种优选实施方式，本发明向所述反应容器充入形成微泡所需的气体并控制充入气体的体积的步骤是通过定量充气的方式、通过控制充气体积值、通过控制充气时长值或通过控制充气压力值的方式加以实施，上述手段均可以有效减小充气体积的偏差和波动，将上述任一手段用于本发明的微泡制备方法中均能够起到显著提升微泡浓度的一致性的作用。
通过定量充气的方式控制微泡浓度值
由于充入气体的方式一定程度上决定了每一次充入气体的体积，选择合适的充气方式有助于控制充气体积的偏差，因此，作为一种优选实施方式，本发明的步骤(2)通过定量充气的充气方式控制充入气体的体积，进而控制微泡浓度值，相比于传统自由充气、不加以控制地将气体与成膜材料混合等不定量地充入气体的方式，采用定量充气的方式能够将充入气体的体积控制在一定的偏差范围内，能够有效减小充入气体体积的偏差或波动，更为重要的是，根据本发明对于微泡制备过程中充入气体的体积会影响微泡浓度的发现，相比于传统的自由充气或将气体与成膜材料混合等不定量充入气体的方式，本发明在微泡制备过程中通过定量充气的充气方式控制充入气体的体积，能够有效减小充入气体的体积波动或偏差，达到显著提升微泡浓度的一致性的效果。
通过控制充气体积值控制微泡浓度值
由于控制充气体积值能够直接有效地控制充入气体的体积，因此，作为一种优选实施方式，在所述步骤(2)中，通过控制充气体积值控制充入气体的体积，即：步骤(2)包括控制充气体积值的步骤，进而控制微泡浓度值。其中，控制充气体积值的步骤具体包括：设定充气体积值，再按照所设定的充气体积值向反应容器充入形成微泡所需的气体。本实施方式通过控制充气体积值控制充入气体的体积，不仅有助于确保充入气体的体积的一致性，还能够有助于控制充入气体的体积的准确性；较好的一致性体现在每一次实际充入到反应容器中的气体体积都很接近，即各次充气都具有相同或大致相同的实际充气体积，较好的准确性体现在实际充入到反应容器中的气体体积值趋近于预期值，也就是使实际的充气体积值更靠近所期望的充气体积值。通过控制充气体积值控制充入气体的体积，能够有效减小充入气体的体积的波动，从而显著地提升微泡浓度的一致性，也有助于有效地控制微泡浓度，以获得所期望的微泡浓度值。以下提供一种示例性的在微泡制备方法中控制充气体积值的方法：精确量取1mL超纯水，使用精密天平称量1mL水的质量，重复该步骤10次；通过水的质量和体积计算水的密度；使用通过充气时长值控制的供气系统，在系统末端出气口处连接一个注射器；设定一个充气时长值，向注射器内充气，充气结束、等待注射器活塞停止运动后，在注射器外壁活塞头端对应的位置做一个标记；在该充气时长值下重复该步骤5次，并做好标记；使用精密天平称量空注射器后，进行去皮操作，然后使用注射器吸取已计算出密度的超纯水至标记处，称量水的质量；通过水的质量及密度，计算该充气时长值所对应的充气体积值；设定五个充气时长值，统计分析充气时长值与充气体积值之间的相关性及映射关系以进行相互换算。
为了获得接近预期的微泡浓度值，作为一种优选实施方式，还包括以下步骤：设置微泡浓度值；根据微泡浓度值与充气体积值的映射关系，确定与该微泡浓度值所对应的充气体积值；按照上述步骤确定的充气体积值，向反应容器充入形成微泡所需的气体。作为一种优选实施方式，微泡浓度值与充气体积值的映射关系是微泡浓度值与充气体积值之间的线性关系。以下提供一种示例性的获取微泡浓度值与充气体积值的线性关系的具体步骤：采用定量充气的方式，通过控制充气体积值控制充入气体的体积，分别向人血白蛋白稀释液中充入11.523mL,40.195mL,115.23mL的全氟丙烷气体；超声声振处理白蛋白稀释液与全氟丙烷气体的混合物，合成白蛋白-全氟丙烷微泡；将制作完成的白蛋白-全氟丙烷微泡转移至已用全氟丙烷吹洗过的西林瓶中，静置于4℃冰箱中，过夜后使用库尔特仪进行微泡浓度值检测；重复以上实验至少四次后进行线性分析，通过Linear regression分析其直线斜率和截距，并通过线性相关系数对线性关系进行评价。如图1所示，作为一种优选实施方式，充气体积值与微泡浓度值的线性关系是：Y＝0.005795X+0.3883，其中X为充气体积值，Y为微泡浓度值，线性相关系数R2＝0.9648，说明充气体积值与微泡浓度值之间有较好的线性关系。
由于在实际制备过程中，微泡浓度值在一定范围内偏差通常是可以被接受的，同时，在大批量规模化生产中，微泡的浓度等参数需满足药典、产品质量控制或其他规定中关于均一性或含量均匀度的要求，因此，需要将微泡浓度值控制在容许偏差范围以内。例如：若微泡产品标示的微泡浓度值为1.0×108个/mL，需满足的微泡浓度值的容许偏差范围为5％，则需要将实际微泡浓度值维持在标示量的95％-105％的范围以内，或将实际微泡浓度值维持在0.95-1.05×108个微泡/mL的范围以内，因此，需要将微泡浓度值控制在容许偏差范围以内的微泡制备方法。
确定充气体积值的容许偏差范围的步骤包括：设定微泡浓度值的容许偏差范围；根据充气体积值与微泡浓度值之间的映射关系，确定满足该微泡浓度值的容许偏差范围所对应的充气体积值的容许偏差范围。作为一种优选实施方式，上述微泡制备方法获得的微泡浓度值的容许偏差范围小于13％，且更优选的，该容许偏差范围小于9％。作为一种优选实施方式，上述微泡制备方法所获得的微泡浓度值的容许偏差范围是0.05-0.09×108个微泡/毫升；因此，满足微泡浓度值容许偏差范围要求的方法通过本发明实现。
作为一种优选实施方式，通过控制充气体积值控制充入气体的体积是将充气体积值控制在容许偏差范围以内，具体实施步骤包括：设定充气体积值的容许偏差范围；向反应容器充入所述形成微泡所需的气体，在充气过程中，维持充气体积值在该容许偏差范围以内。作为一种优选实施方式，上述微泡制备方法获得的充气体积值的容许偏差范围小于9％，最优选的，充气体积值的容许偏差范围小于3％。作为一种优选实施方式，上述微泡制备方法中充气体积值的容许偏差范围是5-12mL。
为了进一步改善上述充气体积值与微泡浓度值之间的线性关系以及微泡浓度值的准确性，发明人在研究中进一步发现，采用如全氟丙烷(C3F8)、全氟丁烷(C4F10)六氟化硫(SF6)等氟化气体作为形成微泡所需的气体时，上述气体具有低弥散性、低饱和度的特性，适用于理想气体状态方程PV＝nRT，其中，P为气体的压力，单位为帕斯卡(PA)；V为气体的体积，单位为立方米(m3)；n为气体的物质的量，单位为摩尔(moles)；R为理想气体通用常数，等于8.314JK-1mol-1；T为气体的温度，单位为卡尔文(K)。因此，在控制充气体积值的同时，维持至少一个与充气体积值相关的参数，能够有效地减小微泡浓度值与充气体积值之间线性关系的偏差，进而能够使充气体积值与微泡浓度值呈现偏差极小的正相关线性关系，有利于更好地提升微泡浓度值的准确性。因此，作为一种最优的实施方式，在控制充气体积值的步骤中，还包括：在充气期间维持环境温度的步骤和在充气期间维持充气压力值的步骤，采用上述步骤有利于减少线性关系的偏差或获得更为准确的微泡浓度值。
作为一种优选实施方式，在控制充气体积值的步骤中还包括在充入气体之前密闭反应容器的步骤、在充入气体之前将反应容器真空化的步骤、在充气期间使成膜材料的量保持一致的步骤之一或全部，上述步骤均有利于准确地控制充入气体的量或减少线性关系的偏差。作为最优选的实施方式，在控制充气时长值的步骤中同时包括以下几个步骤：在充入气体之前密闭反应容器的步骤、在充入气体之前将反应容器真空化的步骤、在充气期间维持环境温度、在充气期间维持充气压力值的步骤和在充气期间使成膜材料的量保持一致的步骤，同时采用上述步骤有利于减少线性关系的偏差或获得更为准确的微泡浓度值。
充气体积值的确定方式，可以采用上述实施方式进行确定，也可以采用其他方式确定，例如，在微泡制备装置或供气系统初次设定充气体积值时，可以根据期望获得的微泡浓度值或其容许偏差范围，通过上述步骤或线性关系确定充气体积值或其容许偏差范围；若该微泡制备装置或供气系统已经进行过多次微泡制备，则可不必通过上述线性关系的方式获取与微泡浓度值所对应的充气体积值，可以采用其他方式获取所需充气体积值，例如：通过微泡浓度值或其容许偏差范围与充气体积值或其容许偏差范围之间的历史数据作为映射关系，选择出最为适宜的充气体积值或其容许偏差范围。
通过控制充气时长值控制微泡浓度值
由于气体体积值具有难以准确衡量和施加控制的特性，在实际制备过程中，通过控制充气体积值控制充入气体体积的方式对于控制设备有较高的精度要求，该方式在一些场景下存在难以施用的情形，仍然需要更多控制微泡浓度值的手段。
发明人在研究中发现，充气时长值对微泡浓度值有显著影响，在微泡制备过程中，对充气时长值进行控制能够有效地减少充气体积值的偏差、从而提升微泡浓度值的一致性。因此，作为一种优选的实施方式，在步骤(2)中通过控制充气时长值控制充入气体的体积，亦可描述为：步骤(2)包括控制充气时长值的步骤用以控制充入气体的体积，进而控制微泡浓度值。通过控制充气时长值控制充入气体的体积的具体步骤包括：设定充气时长值，再按照所设定的充气时长值向反应容器充入所述形成微泡所需的气体。本实施例通过充气时长值以控制充入气体的体积，进而控制微泡浓度值，适用于通过充气体积值控制充入气体的体积难以施用的情形，尤其适用于微泡制备这种需要对微量的气体进行控制的方法，解决了由于气体体积值具有难以准确衡量和施加控制的特性所导致的对控制设备精度要求高、操作复杂等难以有效实施的问题，具有能够准确、便捷、快速地实现控制充入气体的体积，其适用范围广、易于实施、操作简便、成本低的有益效果。
作为一种优选实施方式，为了获得接近预期的微泡浓度值，控制充气时长值的步骤还包括根据所需微泡浓度值确定对应充气时长值的步骤，具体包括：设定微泡浓度值；根据微泡浓度值与充气时长值之间的映射关系，确定与微泡浓度值所对应的充气时长值；按照所确定的充气时长值，向反应容器充入形成微泡所需的气体。采用这样的方式，在充气体积值难以准确衡量或控制的情况下，通过获取微泡浓度值与充气时长值之间的映射关系和上述方法，仍能提供一种满足微泡浓度值控制要求的有效手段。作为一种优选实施方式，微泡浓度值与充气时长值的映射关系是线性关系。以下提供一种示例性的获取微泡浓度值与充气时长值之间的线性关系的具体步骤：采用定量充气的方式，通过控制充气时长值控制充入气体的体积，向人血白蛋白稀释液中充入100ms,500ms,1000ms的全氟丙烷气体。超声声振处理白蛋白稀释液与全氟丙烷气体的混合物，合成白蛋白-全氟丙烷微泡。将制作完成的白蛋白-全氟丙烷微泡转移至已用全氟丙烷吹洗过的西林瓶中，静置于4℃冰箱中，过夜后使用库尔特仪进行微泡浓度值检测。重复以上实验至少四次后进行线性分析，通过Linear regression分析的方法确定其直线斜率和截距，并分析线性相关系数。如图2所示，作为一种优选实施方式，充气时长值与微泡浓度值之间的线性关系是：Y＝0.0007007X+0.3371，其中X为充气时长值，Y为微泡浓度值，上述线性关系通过Linear regression分析的方法确定线性相关系数R2＝1，说明微泡浓度值与充气时长值之间有良好的线性关系。
在其他实施方式中，也可以采用其他方式确定充气时长值，例如：在能够直接确定微泡浓度值所对应的充气体积值的情况下，还可以采用直接通过充气体积值与充气时长值的映射关系确定充气时长值。具体步骤包括：设定充气体积值；根据预设的充气体积值与充气时长值的映射关系，确定该充气体积值所对应的充气时长值；按照该充气时长值向反应容器充入所述形成微泡所需的气体，以此提供一种获得趋近于预期的微泡浓度值的有效控制方式，从而带来微泡浓度值准确性更好的有益效果。作为一种优选实施方式，充气体积值与充气时长值的映射关系是线性关系。以下提供一种示例性的获取充气时长值与充气体积值之间的线性关系的具体步骤：精确量取1mL超纯水，使用精密天平称量1mL水的质量，重复该步骤10次；通过水的质量和体积计算水的密度；使用通过充气时长值控制的供气系统，分别通气10ms，20ms，30ms，40ms，50ms，75ms，100ms；在系统末端出气口处连接一个注射器；设定一个充气时长值，向注射器内充气，充气结束、等待注射器活塞停止运动后，在注射器外壁活塞头端对应的位置做一个标记；在该充气时长值下重复该步骤5次，并做好标记；使用精密天平称量空注射器后，进行去皮操作，然后使用注射器吸取已计算出密度的超纯水至标记处，称量水的质量；通过水的质量及密度，计算该充气时长值所对应的充气体积值；通过Linear regression分析的方法确定其直线斜率和截距，并分析线性相关系数，统计分析充气时长值与充气体积值之间的相关性及映射关系以进行相互换算。如图3所示，作为一种优选实施方式，充气体积值与充气时长值之间的线性关系式：Y＝0.07168X+4.355，其中Y为充气体积值，X为充气时长值，上述线性关系通过Linear regression分析的方法确定线性相关系数R2＝0.9987，说明充气时长值与充气体积值之间有较好的线性关系。
由于在实际制备过程中，微泡浓度值在一定范围内偏差通常是可以被接受的，因此，确定充气时长值的容许偏差范围的步骤包括：设定微泡浓度值的容许偏差范围；根据充气时长值与微泡浓度值之间的映射关系，确定满足该微泡浓度值的容许偏差范围所对应的充气时长值的容许偏差范围。作为一种优选实施方式，上述微泡制备方法获得的微泡浓度值的容许偏差范围小于13％，且更优选的，该容许偏差范围小于9％。作为一种优选实施方式，上述微泡制备方法所获得的微泡浓度值的容许偏差范围是0.05-0.09×108个微泡/毫升；因此，满足微泡浓度值容许偏差范围要求的方法通过本发明实现。
作为一种优选实施方式，通过控制充气时长值控制充入气体的体积是将充气时长值控制在充气时长值的容许偏差范围以内。作为一种优选实施方式，充气时长值的容许偏差范围为0.40-1.20ms；以百分数给出，充气时长值的容许偏差范围小于6％，最优选的，充气时长值的容许偏差范围小于1％。满足充气时长值容许偏差范围要求的方法通过本发明实现，由于满足上述充气时长值容许偏差范围的控制设备较为常见并易于获得，因此，通过上述充气时长值控制充入气体体积的方式具有易于实施的有益效果。
类似的，上述充气时长值是根据与微泡浓度值相对应的充气体积值进行确定的，因此，确定充气时长值的具体步骤还包括：根据微泡浓度值与充气体积值之间的映射关系，确定与设定的微泡浓度值对应的所述充气体积值；根据充气体积值与充气时长值之间的映射关系，确定与该充气体积值所对应的充气时长值。
发明人在研究中进一步发现，当采用氟化气体作为形成微泡所需的气体，例如：全氟丙烷(C3F8)、全氟丁烷(C4F10)或六氟化硫(SF6)等，上述气体具有低弥散性、低饱和度气体的特性，适用于理想气体状态方程PV＝nRT，其中，P为气体的压力，单位为帕斯卡(PA)；V为气体的体积，单位为立方米(m3)；n为气体的物质的量，单位为摩尔(moles)；R为理想气体通用常数，等于8.314JK-1mol-1；T为气体的温度，单位为卡尔文(K)，因此，在控制充气时长值的同时，维持至少一个与充气体积值相关的参数，能够减小微泡浓度值或充气体积值与充气时长值之间线性关系的偏差，进而能够使微泡浓度值或充气体积值与充气时长值具有偏差极小的正相关线性关系，有利于更好地提升充气体积值及微泡浓度值的准确性。为了进一步提升上述充气时长值与微泡浓度值之间的线性关系以及微泡浓度值的准确性，作为一种最优的实施方式，在通过控制充气时长值控制充入气体的体积的步骤中，还包括：在充气期间维持环境温度或维持充气压力值的步骤，发明人还发现，在控制充气时长值的步骤中同时包括维持环境温度的步骤和维持充气压力值的步骤，还能够起到有效维持充气流量，进而起到提升微泡浓度值控制准确性的有益效果。在其他实施方式中，为了进一步提升微泡浓度值的一致性和准确性，在控制充气时长值的步骤中还包括控制充气流量的步骤。作为优选实施方式，在控制充气时长值的步骤中，在充入气体之前，还包括密闭反应容器的步骤、将反应容器真空化的步骤或使成膜材料的量保持一致的步骤之一，作为最优选的实施方式，包括密闭反应容器的步骤和将反应容器真空化的步骤并使成膜材料的量保持一致，上述步骤均有利于准确地控制充入气体的量或减少线性关系的偏差。
充气时长值的确定方式，可以采用上述实施方式进行确定，也可以采用其他方式确定，例如，当微泡制备装置或供气系统在初次设定充气时长值时，可以根据与微泡浓度值所对应的充气体积值，通过上述步骤或充气体积值与充气时长值的线性关系确定充气时长值；若该微泡制备装置或供气系统已经进行过多次微泡制备，还可以采用其他方式确定充气时长值，例如：通过微泡浓度值与充气时长值之间的历史数据作为映射关系，或是通过充气体积值与充气时长值之间的历史数据作为映射关系，选择出最为适宜的充气时长值。
通过控制充气压力值控制微泡浓度值
由于气体体积值具有难以准确衡量和施加控制的特性，在实际制备过程中，通过控制充气体积值控制充入气体体积的方式对于控制设备有较高的精度要求，该方式在一些场景下存在难以施用的情形，仍然需要更多控制微泡浓度值的手段。
发明人在研究中发现，充气压力值对微泡浓度值有显著影响，在微泡制备过程中，对充气压力值进行控制能够有效地减少充气体积值的偏差、从而提升微泡浓度值的一致性。因此，作为一种优选的实施方式，在步骤(2)中通过控制充气压力值控制充入气体的体积，亦可表述为：步骤(2)包括控制充气压力值的步骤用以控制充入气体的体积，其具体步骤包括：设定充气压力值，再按照所设定的充气压力值向反应容器充入所述形成微泡所需的气体。通过控制充气压力值控制充入气体的体积，进而通过控制微泡浓度值，适用于通过充气体积值控制充入气体的体积难以施用的情形，尤其适用于微泡制备这种需要对微量的气体进行控制的方法，解决了由于气体体积值具有难以准确衡量和施加控制的特性所导致的对控制设备精度要求高、操作复杂等难以有效实施的问题，能够准确、便捷、快速地实现控制充入气体的体积，具有适用范围广、易于实施、操作简便、成本低的有益效果。
作为一种优选实施方式，为了获得接近预期微泡浓度值，控制充气压力值的步骤还包括根据所需微泡浓度值确定对应的确定充气压力值的步骤，具体包括：设定微泡浓度值；根据微泡浓度值与充气压力值之间的映射关系，确定与微泡浓度值所对应的充气压力值；按照所确定的充气压力值，向反应容器充入形成微泡所需的气体。采用这样的方式，通过获取微泡浓度值与充气压力值之间的映射关系和上述方法，在充气体积值难以准确衡量或控制的情况下，仍能够提供一种满足微泡浓度值控制要求的有效手段。作为一种优选实施方式，微泡浓度值与充气压力值之间的映射关系是线性关系。以下提供一种示例性的获取微泡浓度值与充气压力值之间的线性关系的具体步骤包括：分别在气体压力为0.03MPa，0.08MPa和0.13MPa时向人血白蛋白稀释液中充入全氟丙烷气体，充气时长值固定为100ms。超声声振处理白蛋白稀释液与全氟丙烷气体的混合物，合成白蛋白-全氟丙烷微泡。将制作完成的白蛋白-全氟丙烷微泡转移至已用全氟丙烷吹洗过的西林瓶中，静置于4℃冰箱中，过夜后使用库尔特仪进行微泡浓度值检测。重复以上实验至少四次后进行线性分析，通过Linear regression分析的方法确定直线斜率和截距，并分析线性相关系数。如图4所示，作为一种优选实施方式，充气压力值与微泡浓度值之间的线性关系式：Y＝4.245X+0.198，其中Y为微泡浓度值，X为充气压力值，上述线性关系通过Linear regression分析的方法线性相关系数R2＝0.9985，说明微泡浓度值与充气压力值之间有较好的线性关系，也说明在微泡制备过程中，通过控制充气压力值能够有效地控制充入气体的体积，从而实现对充入气体的体积的控制并影响微泡浓度的一致性。
在其他实施方式中，也可以采用其他方式确定充气压力值，例如：在能够直接确定微泡浓度值所对应的充气体积值的情况下，还可以通过该充气体积值与充气压力值的映射关系确定充气压力值。具体步骤包括：设定充气体积值；根据预设的充气体积值与充气压力值的映射关系，确定该充气体积值所对应的充气压力值；按照该充气压力值向反应容器充入所述形成微泡所需的气体。以此提供一种获得趋近于预期的微泡浓度值的有效控制方式，从而带来微泡浓度准确性更好的有益效果。作为一种实施方式，确定充气压力值的具体步骤包括：根据微泡浓度值与充气体积值之间的映射关系，确定与设定的微泡浓度值对应的所述充气体积值；根据充气体积值与充气压力值之间的映射关系，确定与设定的充气体积值所对应的充气压力值。在其他实施方式中，上述微泡浓度值与充气压力值的映射关系也可以通过微泡浓度值与充气体积值、充气体积值与充气压力值之间的映射关系进行确定。作为一种优选实施方式，充气体积值与充气压力值的映射关系是线性关系，获取充气体积值与充气压力值的线性关系的具体步骤包括：通过水的质量和体积计算水的密度；使用通过充气压力值控制的供气系统，在系统末端出气口处连接一个注射器；分别设定气体压力为0.05MPa，0.07MPa，0.09MPa，0.11MPa和0.13MPa，向注射器内充气，充气时长值固定为100ms，充气结束等待注射器活塞停止运动后，在注射器外壁活塞头端对应的位置做一个标记；在该充气压力值下重复该步骤5次，并做好标记；使用精密天平称量空注射器后，进行去皮操作，然后使用注射器吸取已计算出密度的超纯水至标记处，称量水的质量；通过水的质量及已知水的密度，计算该充气压力值所对应的充气体积值；统计分析充气压力值与充气体积值之间的相关性及映射关系以进行相互换算，通过Linear regression分析的方法确定其直线斜率和截距，并分析线性相关系数。如图5所示，作为一种优选实施方式，充气体积值与充气压力值之间的线性关系是：Y＝80.27X-1.718，其中Y为充气体积值，X为充气压力值。其线性相关系数R2＝0.9940，说明充气体积值与充气压力值之间有较好的线性关系。也说明在微泡制备过程中，通过控制充气压力值能够有效地控制充入气体的体积，从而实现对充入气体的体积的控制并影响微泡浓度的一致性。
由于在实际制备过程中微泡浓度值在一定范围内偏差通常是可以被接受的，因此，作为一种优选实施方式，确定充气压力值的容许偏差范围的步骤包括：设定微泡浓度值的容许偏差范围；根据充气压力值与微泡浓度值之间的映射关系，确定满足该微泡浓度值的容许偏差范围所对应的充气压力值的容许偏差范围。
作为一种优选实施方式，上述微泡制备方法获得的微泡浓度值的容许偏差范围小于13％，且更优选的，该容许偏差范围小于9％。作为一种优选实施方式，上述微泡制备方法所获得的微泡浓度值的容许偏差范围是0.05-0.09×108个微泡/毫升；因此，满足微泡浓度值容许偏差范围要求的方法通过本发明实现。
作为一种优选实施方式，通过控制充气压力值控制充入气体的体积是将充气压力值控制在充气压力值的容许偏差范围以内，作为一种优选实施方式，充气压力值的容许偏差范围为0.0003-0.0009MPa；以百分数给出，充气压力值的容许偏差范围小于7％，最优选的，充气压力值的容许偏差范围小于3％。因此，满足充气压力值容许偏差范围要求的方法通过本发明实现，由于满足上述充气压力值容许偏差范围的控制设备较为常见并易于获得，因此，通过上述充气压力值控制充入气体体积的方式具有易于实施的有益效果。
发明人在研究中进一步发现，当采用氟化气体作为形成微泡所需的气体，例如：全氟丙烷(C3F8)、全氟丁烷(C4F10)或六氟化硫(SF6)等，上述气体具有低弥散性、低饱和度气体的特性，适用于理想气体状态方程PV＝nRT，其中，P为气体的压力，单位为帕斯卡(PA)；V为气体的体积，单位为立方米(m3)；n为气体的物质的量，单位为摩尔(moles)；R为理想气体通用常数，等于8.314JK-1mol-1；T为气体的温度，单位为卡尔文(K)，在控制充气压力值的同时，维持至少一个与充气压力值相关的参数，能够减小微泡浓度值或充气体积值与充气压力值之间线性关系的偏差，进而能够使微泡浓度值或充气体积值与充气压力值具有偏差极小的正相关线性关系，有利于提升充气体积值及微泡浓度值的准确性，为了进一步提升上述充气压力值与微泡浓度值之间的线性关系以及微泡浓度值的准确性，作为一种最优的实施方式，在控制充气压力值的步骤中，还包括：在充气期间维持环境温度的步骤或维持充气时长值的步骤之一或全部。
作为优选实施方式，在控制充气压力值的步骤中，在充入气体之前，还包括密闭反应容器的步骤、将反应容器真空化的步骤或使成膜材料的量保持一致的步骤之一，作为最优选的实施方式，包括密闭反应容器的步骤和将反应容器真空化的步骤并使成膜材料的量保持一致，上述步骤均有利于准确地控制充入气体的量或减少线性关系的偏差。
在实施过程中，可以采用上述步骤和方法确定充气压力值，例如在初次设定充气压力值时，可以根据与微泡浓度值所对应的充气体积值，通过上述步骤或充气体积值与充气压力值之间的线性关系确定充气压力值；若该微泡制备装置或供气系统已经进行过多次微泡制备，也可以采用其他方式确定充气压力值，例如：通过微泡浓度值与充气压力值之间的历史数据作为映射关系，或是通过充气体积值与充气压力值之间的历史数据作为映射关系，选择出最为适宜的充气压力值。
控制充入气体的体积对微泡粒径的影响
发明人在研究中发现，采用上述方式控制充入气体的体积对于微泡粒径的控制和微泡粒径分布的控制并没有明显的效果，实验方法和检测结果详见后文。
批量制备微泡的方法
为满足大规模生产的可控性要求，作为一种优选实施方式，一种批量制备微泡的方法，包括进行至少两次前述任一实施方式的微泡制备方法并控制各次微泡制备方法之间充入气体的体积的差异，作为一种优选实施方式，通过控制充气体积值、充气时长值或充气压力值来控制充入气体的体积的差异，具体步骤包括：设定所述充气体积值、所述充气时长值或所述充气压力值对应的容许偏差范围；各次微泡制备方法均向反应容器充入所述形成微泡所需的气体，并在各次微泡制备方法之间维持所述充气体积值、所述充气时长值或所述充气压力值在容许偏差范围以内。为了保证更好的控制效果，作为一种优选实施方式，在各次微泡制备方法中，保持其他操作条件一致，本实施例中的保持其他操作条件一致是指：使成膜材料的量保持一致并维持环境温度。
微泡的粒径分布与浓度检测
库尔特颗粒计数仪(Multisizer 4e)配备30μm小孔管，可对直径在0.6-18μm之间的微泡进行粒径分布与浓度分析，具体步骤如下：
(1)校准小孔管；
(2)校准完成后即可对混悬液中微泡的粒径分布与浓度进行检测，移液管吸取100mL IsotonⅡ缓冲液至100mL烧杯中，同向轻轻摇晃微泡混悬液使其呈均匀悬液状，使之均匀地分散在IsotonⅡ缓冲液中；
(3)将烧杯置于库尔特计数仪的杯架上，缓慢升高杯架使小孔管的进样孔完全没入在IsotonⅡ缓冲液中，并保证小孔管的进样孔不触碰到烧杯的四壁和底部；
(4)点击库尔特计数仪软件的预览按钮，观察容量杯中微泡的浓度是否在库尔特计数仪可检测的敏感区间内，若符合检测要求则点击开始按钮进行检测；
(5)库尔特计数仪的软件可对检测结果进行统计分析，分析数据并导出。其中微泡粒径分布相关数据可直接由导出数据获得；对导出的数据进行换算即可得出每毫升微泡混悬液中所含微泡的数量。
超声造影用微泡的背向散射强度评价
作为一种优选实施方式，将上述制备方法获得的微泡用作超声造影剂，对其背向散射强度进行评价的步骤如下：
(1)采用氯胺酮(10mg/kg)和咪达唑仑(0.2mg/kg)对恒河猴进行基础麻醉，麻醉完全后在恒河猴左臂建立静脉通道，剃除恒河猴右侧上腹部及胸部的毛；
(2)在恒河猴右侧上腹部涂抹适量超声耦合剂，使用飞利浦iU22超声诊断仪，选择C9-3探头，寻找并准确定位肝门静脉；
(3)保持肝门静脉影像清晰，通过静脉通道迅速推入0.3mL白蛋白超声造影剂，并迅速推入1mL生理盐水，然后记录1分钟白蛋白超声造影剂的视频影像；
(4)1分钟后手动对肝门静脉内白蛋白超声造影剂进行高声强爆破，待其回声完全消失后再进行下一个样品的检测。
(5)选取感兴趣区域，对白蛋白超声造影剂视频影像进行分析，绘制出每个白蛋白超声造影剂在恒河猴肝门静脉造影时的时间-强度曲线；
(6)对比分析每个白蛋白超声造影剂样品的曲线峰强度(Peak Intensity)和曲线下面积(Area Under the Curve)。
靶向载药用微泡的治疗效果评价
(1)制备15mL螯合有10mg铜离子的全氟丙烷-白蛋白微泡。
(2)在麻醉状态下，开胸游离并结扎兔心左前降支冠脉，制备兔左心心梗模型，稳定4周后，行耳缘静脉连续以1mL/min的速度推注螯合铜离子的白蛋白微泡，以超声波(GEvivid 7，MI 1.2)连续辐照左心前区，由心底向心尖做来回连续扇形扫查，超声波输出能量调至最大并启用彩色多普勒模式。
(3)每2周重复一次注射和辐照，每次剂量相同，至4周后，处死实验兔，观察实验兔大体心脏形态和心梗病理切片，对比分析对照组的心梗疤痕组织内血管再生和活化情况。
统计方法
本文采用SPSS18.0(PASW,Chicago,IL)软件进行统计学分析处理，各检测结果中，数值变量采用均数±标准差
Figure BDA0002315847950000151
表示，两组之间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析法。以p<0.05表示差异具有统计学意义。
超声空化法生成微泡
(1)将20％人血白蛋白注射液用0.1M、pH＝7.4的PBS缓冲液配制成浓度为5％的人血白蛋白稀释液，配制好后静置于4℃冰箱中，过夜。
(2)量取16mL 5％的人血白蛋白稀释液加入反应容器中，量取4mL 5％葡萄糖溶液加入反应容器中，混合均匀形成成膜材料，将反应容器密封。
(3)向反应容器充入全氟丙烷气体，在充气过程中，通过供气系统控制充入气体的体积，采用的充气方式是定量充气，并在充气过程中维持恒温条件。供气系统的详细结构及工作方式详见实施例1，该供气系统设置在储气罐与反应容器的气体入口之间，并能够控制向反应容器充入全氟丙烷气体的体积。
(4)全氟丙烷充入完成后，打开反应容器的密封盖，采用超声波破碎仪通过超声空化法所产生的超声声振及乳化作用在人血白蛋白稀释液中生成微泡，具体如下：
1)将超声波破碎仪的探头置于反应容器的液面以下，以30％振幅作用120s，每个循环周期为：超声声振10s间歇30s，共12个循环；该步骤主要利用超声波空化作用在液气混合物中形成大量微小空化核分散在液相中，此时还未完全形成稳定的膜包裹气核的形式；
2)将超声波破碎仪的探头置于反应容器的液面以上且非常接近液面的位置，以80％振幅作用30s，每个循环周期为：超声声振10s间歇30s，共3个循环；该步骤主要利用超声波乳化作用，让人血白蛋白缓慢变性，形成具有一定韧性的膜将气核包裹，即形成稳定的微泡。
步骤1)与步骤2)之间间隔1min，超声声振的过程中反应容器始终处于4℃的冰水浴中。步骤2)超声声振结束后形成白色乳状悬液，静置1min左右悬液分层：上层为乳状，下层为灰黄色，轻轻震荡又呈白色乳状悬液。
机械均化法生成微泡
通过转子定子混合制备全氟丙烷微泡分散体，将H-EPS(500.4mg)加到100mL含有5.4％(w/w)的丙二醇和甘油(3:10w/w)混合物的水中。将混合物振荡并加热到8℃保持5mins，待其冷却到室温，再次振荡，静置过夜后进行下一步操作。
将50mL所得溶液转移到锥颈圆底烧瓶中。将转子定子混合轴引入该溶液中，且为了避免气体泄露，在颈壁与混合轴之间装有用于调节气量和控制压力的金属密封接头。其中，气体出口与真空泵连接，溶液脱气1min后。供气系统控制充入气体的体积并由气体入口充入全氟丙烷气体。供气系统的详细结构及工作方式详见实施例1，该供气系统设置在储气罐与烧瓶的气体入口之间，用以向烧瓶充入全氟丙烷气体并控制充入气体的体积；
将该溶液在23000rpm下均质化10mins，得到白色乳状分散体，将其转移到可密封的容器中并用全氟丙烷冲洗。
随后将分散体转移到分液漏斗中，12000rpm 30mins离心后液体分层，上层为微泡乳状层和下层为混浊液。将下层混浊液移出并用水置换。随后重复离心两次，每次12000rpm15mins。在最后一步离心后，将上清液用10％(w/w)蔗糖置换，密封保存。
实施例1：微泡制备装置的供气系统
如图6所示，本实施例微泡制备装置的供气系统包括：气源1，用以提供形成微泡所需的气体；气路，气路的一端与气源1连接，气路的另一端连接反应容器8的气体入口；充气体积控制部件，充气体积控制部件能够控制向反应容器8充入气体的体积，本实施例中的气源1为高压气瓶，其储存有形成微泡所需的气体。例如：全氟丙烷、六氟化硫或全氟丁烷，高压气瓶具有气体出口，该气体出口与气路的一端连接。本实施例中的气路主要包括管道，作为优选，气路还包括与管道相连的、用以限定由气源1输出至反应容器8的气体供给路径的结构或部件，气源1的气体出口、反应容器8的气体入口或其他控制阀等部件也是气路的一部分，它们与管道相互连接并共同构成气路以限定由气源1输出至反应容器8的气体供给路径，气路的另一端与反应容器8的气体入口连接以将气体供给到反应容器8中。本实施例中的反应容器8包括试管、西林瓶、反应罐或反应釜，或者其他用于容纳成膜材料并接收由气源1充入的气体的结构，反应容器8具有气体入口，气源1输出的气体能够经气路和气体入口充入到反应容器8中。本实施例中的充气体积控制部件设置在向反应容器8通入气体的气路上，充气体积控制部件用于控制向反应容器8充入气体的体积并分配气体，优选的，充气体积控制部件设置在气路中更靠近于反应容器8的位置，以此获得更小的充气体积偏差或波动。
作为第一种实施方式，充气体积控制部件通过控制气路的开闭从而控制向反应容器8充入气体的体积。具体的，充气体积控制部件包括设置在气路中的阀门，阀门打开能导通气路从而使气源1供给的气体充入到反应容器8中，阀门关闭能切断气路从而停止充气。本实施例中阀门为常闭式电磁阀4，电磁阀4连接有控制器，电磁阀4与控制器之间是耦合或电连接，从而使控制器能够向阀门施加打开或关闭的控制信号，本实施例中通过控制器对阀门施加控制，使阀门按照期望的体积充入气体，从而实现控制向反应容器充入气体的体积。作为等同实施方式，上述充气体积控制部件也包括控制开启程度的实施方式，例如上述阀门可以是比例控制阀。
作为一种具体实施例，上述充气体积控制部件通过控制充气体积值控制向反应容器充入气体的体积，即：按照所设定的充气体积值向反应容器8充入气体。具体的，在供气系统中包括上述充气体积控制部件，充气体积控制部件包括：常闭式电磁阀4和控制器，本实施例中的控制器用于输入充气体积值，控制器根据输入的充气体积值控制阀门在该充气体积值内处于打开状态以使气路导通从而向反应容器8充入气体，当达到设定的充气体积值以后控制器使阀门关闭从而停止充气，以此实现通过充气体积值控制充入气体的体积并进行充气。在一些实施方式中，为了衡量准确的实际充气体积值，该控制器还包括能够检测充气体积值的检测部件，用以对充气体积值进行实时的检测，并与设定的充气体积值进行比较以判断关闭阀门的时机。通过在供气系统中采用上述通过充气体积值进行控制的充气体积控制部件，能够有效地减少充气体积值的偏差、从而提升微泡浓度值的一致性、并有助于提升充入气体体积的准确性。
发明人在研究中发现，充气时长值对微泡浓度值有显著影响，因此，作为一种具体实施例，充气体积控制部件根据设定的充气时长值控制阀门在该充气时长值内处于打开状态以使气路导通、从而控制充入气体的体积并向反应容器8充入气体，本实施例将对充入气体的体积的直接控制转化为对气路开放时间的控制，通过对充气时长值的控制来控制充入气体的体积，以此能够有效减少充入气体的体积的偏差、提升微泡浓度值的一致性，解决了由于气体体积值具有难以准确衡量和施加控制的特性所导致的对控制设备精度要求高、操作复杂等难以有效实施的问题，具有能够准确、便捷、快速地实现控制充入气体的体积，其适用范围广、易于实施、操作简便、成本低的有益效果。具体的，在供气系统中包括充气体积控制部件，该充气体积控制部件通过充气时长值控制向反应容器充入气体的体积，即：该充气体积控制部件按照所设定的充气时长值控制该气路的开启或关闭从而控制向反应容器8充入气体的体积。本实施例的充气体积控制部件具体包括阀门和控制器，阀门根据控制器的控制信号导通气路或切断气路，本实施例中的阀门为电磁阀4，具体采用常闭式电磁阀4，常闭式电磁阀4在未通电时阀门关闭，通电后阀门打开；控制器包括继电器，本实施例具体采用的继电器是第一延时继电器12，用于控制电磁阀4的通断电状态，第一延时继电器12能够向电磁阀4释放电流使电磁阀4通电并打开；控制器具有用于输入充气时长值的用户接口、模块或软件，用于设定或调节第一延时继电器12释放电流的时长，进而控制电磁阀4开放的时长，最终实现气路开放时长的控制。控制器还包括计算机13和控制程序，计算机13与第一延时继电器12经USB接口、COM通讯串口连接到窗口化操作软件，软件设定为自动控制模式，软件包含周期调节及开关控制面板，软件周期是指第一延时继电器12线圈充电时间，即电磁阀4阀门开放时间、或气路开放时间，对应本实施例中的充气时长值，控制精度为1ms。在本实施例中电磁阀4的开放时长(即：充气时长值)与充气体积值呈正比，通过充气时长值能够有效地控制充入气体的体积从而控制微泡浓度值，尤其是在恒温、恒压、真空的环境下，本实施例中电磁阀4开放的时间长度与充气体积值呈偏差极小的线性关系，可根据该线性关系和所需微泡浓度值按需设定充气时长值，确保微泡浓度的一致性和准确性。本实施例设置能够调节或控制充气时长值的控制器以及对应的电磁阀4的作用是控制充入气体的体积，即：通过控制充气时长值的部件直接地操控充入气体的体积，以此带来准确、便捷、快速地实现控制充入气体的体积的效果。在其它实施方式中，亦可以为了其他目的设置能够调节或控制充气时长值的控制器以及对应的电磁阀4，例如，在通过充气压力值控制充入气体的体积的实施方式中，为了减小充入气体的体积偏差而非直接控制充入气体的体积，设置能够设定充气时长值的控制器以及能够根据控制器施加的信号启闭的电磁阀4，其作用是维持环境参数、减小因充气时长值波动导致的充入气体的体积波动的问题，以进一步起到减小充入气体的体积偏差的作用。作为一种优选实施方式，本实施例的供气系统中，还包括温度控制装置、真空控制装置、压力控制装置或流量检测装置。温度控制装置用于调节或维持气路的环境温度，在一些优选实施方式中，温度控制装置的温控范围还可以覆盖到反应容器8，以此单独或共同控制反应容器8及气路的环境温度。压力控制装置包括设置在气路上的调压阀3，具体的，调压阀3能够接收由气源1供应的气体并向其后方气路按照所设定的充气压力值输出气体，作为一种实施方式，气罐的气体出口连接有减压阀2，减压阀2的另一端与调压阀3的一端相连，调压阀3的另一端与其后端的气路相连以按照所设定的充气压力值输出气体，本实施例中的调压阀3主要起到维持充气压力值的作用。以上实施例通过在供气系统中同时设置温度控制装置和压力控制装置，有助于稳定气路中的气体流量，从而在通过控制充气时长值来控制充入气体的体积的过程中，进一步提升充气体积值的一致性和准确性。在本实施例的供气系统中还设置有真空控制装置，真空控制装置用以调节或维持气路和/或反应容器8的真空压力。本实施例中，真空控制装置用于控制气路的真空化，由真空泵11、压力表10、第二延时继电器9组成，第二延时继电器9连接真空泵11电源以控制真空泵11工作时长，通电时间精确到1s，在其他实施方式中，真空泵11还能够与反应容器8接通，以实现对气路和反应容器8中真空压力的调节和维持。在本实施例的供气系统中还设置有流量检测装置，流量监测装置设置在气路上，用于实时地检测和显示气路中气体流量值的信息，以有助于确定实际充气体积值。具体的，流量检测装置为流量计6，为了减少偏差，该气体流量计6设置于充气体积控制部件与反应容器8之间的气路上。
通过上述供气系统由充气时长值控制充入气体的体积的操作步骤如下：
(1)通过温度控制装置控制供气系统所处的环境温度；
(2)调节气路气源1端压力；
(3)密闭气路，自气源1至电磁阀4进气侧密闭并充满形成微泡所需的气体；
(4)真空化气路，使电磁阀4出气侧至通气末端密闭并真空化；
(5)设置充气时长值；
(6)点击软件开关，使第一延时继电器12线圈通电，同时触发电磁阀4打开，从而使气路开放并向反应容器8充入气体；
(7)达到充气时长值后第一延时继电器12停止通电，电磁阀4关闭，从而使气路关闭并停止向反应容器8充气；
(8)记录气体流量计6数值，并通过气体流量计6的数值和充气时长值精确计算充气体积值。
由于发明人在研究中发现，控制充气压力值也有助于控制充入气体的体积并实现对微泡浓度值的控制，因此，作为另一种实施方式，充气体积控制部件包括压力控制装置，该充气体积控制部件通过控制充气压力值控制向反应容器充入气体的体积，即：该压力控制装置按照所设定的充气压力值向反应容器8充入气体。压力控制装置具体包括设置在气路上的调压阀3，调压阀3能够接收由气源1供应的气体并向其后方气路按照所设定的充气压力值输出气体，作为一种实施方式，气罐的气体出口连接有减压阀2，减压阀2的另一端与调压阀3的一端相连，调压阀3的另一端与其后端的气路相连以按照所设定的充气压力值输出气体。
为了控制充气压力值以维持或改变充入气体的体积，本实施例设置能够调节或控制充气压力值的调压阀3，以此对充入气体的体积进行直接操控，在本发明的其他实施方式中亦可为了其他目的设置调压阀3，例如，在前述通过充气体积值或充气时长值控制充入气体的体积的实施方式中，设置调压阀3的目的是为了减小充入气体的体积偏差而非直接控制充入气体的体积，即在其他实施方式中，调压阀3可用于维持环境参数、减小因充气压力值波动导致的充入气体的体积波动的问题，以进一步起到减小充入气体的体积偏差的作用，以提升充入气体体积的准确度。作为优选实施方式，供气系统中还包括前述实施方式中的用于控制气路开放时间的时间控制装置、温度控制装置、真空控制装置以及流量检测装置之一或全部，用以在充气体积控制部件按照所设定的充气压力值向反应容器8充入气体时，以进一步提升充入气体的体积的控制精度并减小体积偏差。
作为最优选的实施方式，本实施例微泡制备装置的供气系统如图6所示，具体连接方式如下：以盛装全氟丙烷气体的高压气瓶作为气源1，气源1的输出端经管件依次与减压阀2、调压阀3、电磁阀4连接，电磁阀4为常闭型电磁阀，电磁阀4的控制端连接有第一延时继电器12，第一延时继电器12连接有计算机13，计算机13配置有控制第一延时继电器12通电时间的控制软件，用于控制第一延时继电器12的线圈的充电周期，第一延时继电器12通电则与之连接的电磁阀4开放，第一延时继电器12的线圈充电某一周期时间长度后自动断电，即电磁阀4的阀门开放达到设定的充气时长值后自动关闭，第一延时继电器12的精度为1ms。电磁阀4的输出端通过气路依次与气体无菌过滤器5、流量计6、以及三通阀7的第一端连接，三通阀7的第二端经气路与反应容器8连接，三通阀7的第三端经气路与真空泵11连接，真空泵11上设有真空表10，第二延时继电器9与真空泵11连接，用于控制真空泵11处于工作或停止工作，第二延时继电器9的延时精度为1s。
实施例2：微泡制备装置
本实施例提供一种微泡制备装置，包括供气系统和微泡生成装置。上述微泡生成装置用于使气体和成膜材料在反应容器8中产生微泡，基于不同的预设生成微泡的方法，微泡生成装置可以是超声空化设备、高剪切分散机、高速匀浆机或冷冻干燥设备等，示例性的，本实施例中的微泡生成装置为超声空化设备，例如：超声波破碎仪的探头。本实施例中的微泡生成装置也可以是高速匀浆机，例如：PolytronT3000、探针直径为3cm的高速匀浆机。上述超声空化设备、高剪切分散机、高速匀浆机通常在液面附近的位置施加作用力从而生成微泡。
经发明人反复实验发现，在微泡制备过程中，反应容器的真空度并不会显著地影响通过控制充入气体的体积来控制微泡浓度值的效果。因此，本实施例中的反应容器未单独地设置真空泵以及真空表，进而取消设置在反应容器8入口处的三通阀7，采用直接连通的方式，本实施例仍然能够实现在充气时控制充入气体的体积，进而达到使微泡浓度一致性更佳的效果，本实施例中供气系统的详细结构请参照实施例1。
实施例3：通过充气压力值控制全氟丙烷-白蛋白微泡浓度值
本实施例中，利用实施例1提供的供气系统控制充入气体的体积并向反应容器中定量地充入全氟丙烷气体，采用超声空化法制备微泡，考察充气压力值对微泡浓度值的影响。
共设计3组实验，通过调压阀分别将3组实验中的充气压力值控制为0.03MPa、0.08MPa和0.13MPa，并使其他实验保持条件一致：包括将全氟丙烷的充气时长值保持为500ms、控制各组实验的环境温度一致，每组实验重复至少3次，步骤如下：
(1)将20％人血白蛋白注射液用0.1M、pH＝7.4的PBS缓冲液配制成浓度为5％的人血白蛋白溶液，配制好后静置于4℃冰箱中，过夜。
(2)量取16mL 5％的人血白蛋白溶液加入反应容器中，量取4mL 5％葡萄糖溶液加入反应容器中，混合均匀形成成膜材料，将反应容器密封。
(3)利用实施例1所述的供气系统对充气压力值进行定量地控制，从而通过控制充气压力值控制充入气体的体积并向反应容器充入全氟丙烷气体，供气系统的详细结构及工作方式详见本发明对应实施例，该供气系统设置在储气罐与反应容器的气体入口之间，并能够控制向反应容器充入全氟丙烷气体的体积。本实施例控制充气压力值的具体操作是通过减压阀使全氟丙烷的压力维持在0.4-0.8MPa，再用调压阀将充气压力值调整至0.03MPa、0.08MPa、0.13MPa，在实验过程中，利用实施例1所述供气系统的其他部件使其他实验条件保持一致，例如：通过第一延时继电器和计算机系统以及二通电磁阀的配合控制每次实验充入全氟丙烷的时间值均为500ms，维持恒温条件，并通过真空控制组件使反应容器在充气之前处于真空化状态。
(4)全氟丙烷充入完成后，打开反应容器的密封盖，采用超声波破碎仪通过超声空化法所产生的超声空化及乳化作用在人血白蛋白溶液中生成微泡，具体如下：
1)将超声波破碎仪的探头置于反应容器的液面以下，以30％振幅作用120s，每个循环周期为：声振10s间歇30s，共12个循环；该步骤主要利用超声波空化作用在液气混合物中形成大量微小空化核分散在液相中，此时还未完全形成稳定的膜包裹气核的形式；
2)将超声波破碎仪的探头置于反应容器的液面以上且非常接近液面的位置，以80％振幅作用30s，每个循环周期为：声振10s间歇30s，共3个循环；该步骤主要利用超声波乳化作用，让人血白蛋白缓慢变性，形成具有一定韧性的膜将气核包裹，即形成稳定的由白蛋白包裹全氟丙烷的微泡。
步骤1)与步骤2)之间间隔1min，声振的过程中反应容器始终处于4℃的冰水浴中。步骤2)声振结束后形成白色乳状悬液，静置1min左右悬液分层：上层为乳状，下层为灰黄色，轻轻震荡又呈白色乳状悬液。按照前述方法采用库尔特仪进行微泡浓度值及粒径检测，结果如图7所示。
上述实验说明了：随着充气压力值的增加，微泡浓度值是逐渐增加的，即：充气压力值与微泡浓度值是正相关的；通过每组实验的平行实验发现，控制充气压力值后，微泡浓度值也相应的控制在同一水平，以此说明通过控制充气压力值的手段能够有效地控制微泡浓度值。
实施例4：真空度对微泡浓度值的影响
本实施例采用实施例3的步骤生成微泡，本实施例与实施例3的区别是：在其他参数维持不变的情况下，充入气体之前对反应容器不进行或进行真空化处理，考察不同充气压力值下对微泡浓度值的影响。
本实施例的实验过程如下：采用实施例2中提供的供气系统控制充入气体的体积并向反应容器中定量地充入全氟丙烷气体，通过超声空化法生成微泡。共设计3组实验，通过调压阀分别将3组实验中的充气压力值控制为0.03MPa、0.08MPa和0.13MPa，同样的，将全氟丙烷的充气时长值控制为500ms，控制各组实验的环境温度一致、并使其他实验保持条件一致，每组实验至少重复3次。最终按照前述方法采用库尔特仪进行微泡浓度值和粒径检测，结果如图8所示。
通过对比真空条件与非真空条件的实施例可以发现，上述充气压力值影响微泡浓度值的规律不受反应容器中真空度的影响，在真空或非真空条件下，充气压力值与产生的微泡浓度值都是正相关的，并且，控制充气压力值的都能够有效地控制微泡浓度值。
实施例5：通过充气时长值控制全氟丙烷-白蛋白微泡浓度值
为了观察充气时长值对微泡浓度值的影响，本实施例采用与参考实施例3的方式制备并生成微泡，区别在于：将控制充气压力值改为了充气时长值，具体实验过程如下：
本实施例采用实施例1提供的供气系统，通过控制充气时间值的方式向反应容器中定量地充入全氟丙烷气体，采用超声空化法制备微泡。
本实施例共设计3组实验，通过控制电磁阀开放的时间来控制充入全氟丙烷的充气时长值，3组实验中的充气时长值分别控制为100ms、500ms和1000ms，并使其他实验条件保持一致：包括通过调压阀控制各组实验的充气压力值一致、控制各组实验的环境温度一致。每组实验重复至少2次，步骤如下：
(1)将20％人血白蛋白注射液用0.1M、pH＝7.4的PBS缓冲液配制成浓度为5％的人血白蛋白溶液，配制好后静置于4℃冰箱中，过夜。
(2)量取16mL 5％的人血白蛋白溶液加入反应容器中，量取4mL 5％葡萄糖溶液加入反应容器中，混合均匀形成成膜材料，将反应容器密封。
(3)维持恒温条件，利用实施例1所述的供气系统，通过控制充气时长值对充入气体体积进行控制，从而向反应容器定量地充入全氟丙烷气体，供气系统的详细结构及工作方式详见本发明对应实施例，该供气系统设置在储气罐与反应容器的气体入口之间，并能够向反应容器定量地充入全氟丙烷气体。
本实施例控制充气时长值的具体操作是通过第一延时继电器和计算机系统以及二通电磁阀的配合，将充气时长值控制为100ms、500ms和1000ms，在实验过程中，利用减压阀和调压阀将充气压力值维持一致，并通过真空控制组件使反应容器在充气之前处于真空化状态。
(4)全氟丙烷充入完成后，打开反应容器的密封盖，采用超声波破碎仪通过超声空化法所产生的超声空化及乳化作用在人血白蛋白溶液中生成微泡，具体如下：
1)将超声波破碎仪的探头置于反应容器的液面以下，以30％振幅作用120s，每个循环周期为：声振10s间歇30s，共12个循环；该步骤主要利用超声波空化作用在液气混合物中形成大量微小空化核分散在液相中，此时还未完全形成稳定的膜包裹气核的形式；
2)将超声波破碎仪的探头置于反应容器的液面以上且非常接近液面的位置，以80％振幅作用30s，每个循环周期为：声振10s间歇30s，共3个循环；该步骤主要利用超声波乳化作用，让人血白蛋白缓慢变性，形成具有一定韧性的膜将气核包裹，即形成稳定的由白蛋白包裹全氟丙烷的微泡。
步骤1)与步骤2)之间间隔1min，声振的过程中反应容器始终处于4℃的冰水浴中。步骤2)声振结束后形成白色乳状悬液，静置1min左右悬液分层：上层为乳状，下层为灰黄色，轻轻震荡又呈白色乳状悬液。
按照前述方法采用库尔特仪进行微泡浓度值及粒径检测，结果如图9和图10所示。
结果发现，随着充气时长值的增加，微泡浓度值是逐渐增加的，即：充气时长值与微泡浓度值是正相关的；通过每组实验的平行实验发现，控制充气时长值后，微泡浓度值也相应的控制在同一水平，以此说明通过控制充气时长值的手段能够有效地控制微泡浓度值。
而随着充气时长值的增加，微泡平均粒径并没有随之逐渐增加。微泡平均粒径虽未呈规律性变化，但其平均粒径均分布在一个较窄的范围内并都小于4μm。
实施例6：通过充气体积值控制全氟丙烷-白蛋白微泡浓度值
为了观察充气体积值对微泡浓度值的影响，本实施例采用与参考实施例3的方式制备并生成微泡，区别在于：将其中对充气压力值的控制改成对充气体积值的控制。
本实施例采用实施例1提供的供气系统，通过控制充气体积值控制充入气体的体积，并向反应容器中定量地充入全氟丙烷气体，采用超声空化法制备微泡。
本实施例共设计3组实验，3组实验中的充气体积值分别控制为11.523mL、40.195mL和115.23mL，在实验过程中，使其他实验条件保持一致：包括通过调压阀控制各组实验的充气压力值一致、控制各组实验的环境温度一致。每组实验重复至少2次，步骤如下：
(1)将20％人血白蛋白注射液用0.1M、pH＝7.4的PBS缓冲液配制成浓度为5％的人血白蛋白溶液，配制好后静置于4℃冰箱中，过夜。
(2)量取16mL 5％的人血白蛋白溶液加入反应容器中，量取4mL 5％葡萄糖溶液加入反应容器中，混合均匀形成成膜材料，将反应容器密封。
(3)利用实施例1所述的供气系统通过充气体积值对充入气体体积进行控制，从而向反应容器定量地充入全氟丙烷气体，供气系统的详细结构及工作方式详见本发明对应实施例，该供气系统设置在储气罐与反应容器的气体入口之间，并能够控制向反应容器充入全氟丙烷气体的体积。
在实验过程中，利用实施例1所述的供气系统的其他部件使其他实验条件保持一致，具体包括：利用减压阀和调压阀将充气压力值维持一致，并通过真空控制组件使反应容器在充气之前处于真空化状态。
(4)全氟丙烷充入完成后，打开反应容器的密封盖，采用超声波破碎仪通过超声空化法所产生的超声空化及乳化作用在人血白蛋白溶液中生成微泡，具体如下：
1)将超声波破碎仪的探头置于反应容器的液面以下，以30％振幅作用120s，每个循环周期为：声振10s间歇30s，共12个循环；该步骤主要利用超声波空化作用在液气混合物中形成大量微小空化核分散在液相中，此时还未完全形成稳定的膜包裹气核的形式；
2)将超声波破碎仪的探头置于反应容器的液面以上且非常接近液面的位置，以80％振幅作用30s，每个循环周期为：声振10s间歇30s，共3个循环；该步骤主要利用超声波乳化作用，让人血白蛋白缓慢变性，形成具有一定韧性的膜将气核包裹，即形成稳定的由白蛋白包裹全氟丙烷的微泡。
步骤1)与步骤2)之间间隔1min，声振的过程中反应容器始终处于4℃的冰水浴中。步骤2)声振结束后形成白色乳状悬液，静置1min左右悬液分层：上层为乳状，下层为灰黄色，轻轻震荡又呈白色乳状悬液。按照前述方法采用库尔特仪进行微泡浓度值与微泡粒径检测，结果如图11，12所示。
结果发现，随着充气体积值的增加，微泡浓度值是逐渐增加的，即：充气体积值与微泡浓度值是正相关的；通过每组实验的平行实验发现，控制充气体积值后，微泡浓度值也相应的控制在同一水平，以此说明通过控制充气体积值的手段能够有效地控制微泡浓度值。
而随着充气时长值的增加，微泡平均粒径并没有随之逐渐增加。微泡平均粒径虽未呈规律性变化，但其平均粒径均分布在一个较窄的范围内并都小于4μm。
实施例7：通过充气压力值控制六氟化硫-磷脂微泡浓度值
本实施例研究在冷冻干燥法制六氟化硫-磷脂微泡产品：声诺维(SonoVueTM)的制备过程中控制充气压力值对于微泡浓度的影响，以确认通过充气压力值控制六氟化硫-磷脂微泡浓度值的有效性。
共设计3组实验，各组实验分别控制各组实验控制调压阀的压力分别为0.03MPa、0.08MPa和0.13MPa，各组实验均控制充入全氟丙烷的时间为500ms且其他实验条件完全相同，每组实验重复3次，步骤如下：
(1)提供具有成膜材料的反应容器，本实验将未开封的盛装有磷脂的声诺维超声造影剂作为盛有成膜材料的反应容器，采用真空泵完全抽出声诺维容器中的SF6气体，从而提供制备所需的容纳有成膜材料的反应容器，根据标示和产品说明书，成膜材料为：聚乙二醇4000，二硬脂磷脂酰胆碱，二棕榈磷脂酰甘油钠，棕榈酸。
(2)维持恒温条件，通过实施例1所述的供气系统控制充入气体的体积，向反应容器定量地充入六氟化硫气体，供气系统的详细结构及工作方式详见本发明对应实施例，该供气系统设置在储气罐与反应容器的气体入口之间，能够控制向反应容器充入六氟化硫气体的体积并定量地充入六氟化硫气体。
(3)六氟化硫充入完成后，打开反应容器的密封盖，用封口膜密封容器，注入5mL生理盐水复溶，用手轻柔地摇晃使之形成微泡。
按照前述方法采用库尔特仪进行微泡浓度，结果如图13所示。
结果发现，随着充气压力值的增加，微泡浓度值是逐渐增加的，即：充气压力值与微泡浓度值是正相关的；通过每组实验的平行实验发现，控制充气压力值后，微泡浓度值也相应的控制在同一水平，以此说明通过控制充气体积值的手段能够有效地控制微泡浓度值。
实施例8：通过控制充气时长值控制背向散射强度
本实施例中，以实施例5的方法制备的微泡作为超声造影剂对恒河猴肝门静脉造影，分析评价其背向散射强度进行评价。
选择分别充入100ms,500ms,1000ms全氟丙烷制作的白蛋白超声造影剂的四个样本进行恒河猴肝门静脉造影，选择造影影像中的ROI，绘制时间-强度曲线，统计分析曲线峰强度，曲线下面积，分析统计结果如下：
按照前述超声造影用微泡的背向散射强度评价方法绘制出每个白蛋白超声造影剂在恒河猴肝门静脉造影时的时间-强度曲线，对比分析每个白蛋白超声造影剂样品的曲线峰强度和曲线下面积。
选择造影影像中的ROI，绘制时间-强度曲线，统计分析曲线峰强度以及曲线下面积，结果如图14，15所示。图14中A.曲线峰强度；B.曲线下面积，*，p＜0.05。100ms，500ms，1000ms分别充气时长值；图15中(A)-(C)依次为随机选择的充气时长值为100ms、500ms和1000ms制备的白蛋白超声造影剂的造影增强效果及时间-强度曲线，(A)图对应的充气时长值为100ms，其曲线峰强度和曲线下面积分别为4.74dB，137.85dB sec；(B)图对应的充气时长值为500ms，其曲线峰强度和曲线下面积分别为11.52dB，365.83dB sec；(C)图对应的充气时长值为500ms，其曲线峰强度和曲线下面积分别为9.94dB，323.77dB sec。
结果发现，随着充气压力值的增加，微泡浓度值是逐渐增加的，即：充气压力值与微泡浓度值是正相关的；通过每组实验的平行实验发现，控制充气压力值后，微泡浓度值也相应的控制在同一水平，以此说明通过控制充气体积值的手段能够有效地控制微泡浓度值。
通过实施例5已证明随着充气时长值的增加，微泡浓度值逐渐增加，即：充气时长值与微泡浓度值是正相关的，而本实施例的分析结果证明了微泡浓度值在一定范围内与超声造影剂的背向散射强度正相关，微泡的浓度超出这一范围，高浓度微泡会发挥其衰减作用而削弱白蛋白超声造影剂的背向散射强度。实际应用中可根据不同的分析对象，选择合适的微泡浓度。
根据实施例3，5，6的实验结果可推断气体量的多少决定了超声造影剂的背向散射强度，因此通过对分别通过体积值、充气时长值、充气压力值对气体量进行控制可制备出符合应用需求的超声造影剂。

Claims (9)

1.一种微泡制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)向反应容器提供成膜材料；
(2)向所述反应容器充入形成微泡所需的气体并控制充入气体的体积；
(3)用预设方法生成由所述成膜材料包裹所述气体的微泡。
2.根据权利要求1所述的微泡制备方法，其特征在于：所述制备方法用于制备靶向递送微泡，所述靶向递送微泡结合有药物，基因或微量元素。
3.根据权利要求2所述的微泡制备方法，其特征在于：所述微量元素包括铜、锌、硒、铁中的任意一种或一种以上的任意组合。
4.根据权利要求1所述的微泡制备方法，其特征在于：在所述步骤(2)中，通过控制充气体积值控制充入气体的体积。
5.根据权利要求4所述的微泡制备方法，其特征在于：所述控制充气体积值具体包括以下步骤：
设定所述充气体积值；
按照所设定的所述充气体积值向所述反应容器充入所述形成微泡所需的气体。
6.根据权利要求5所述的微泡制备方法，其特征在于：所述设定所述充气体积值的步骤包括：
设定微泡浓度值；
根据微泡浓度值与充气体积值之间的映射关系，确定与所述微泡浓度值所对应的所述充气体积值。
7.根据权利要求1至6中任一所述的微泡制备方法，其特征在于：所述步骤(2)通过定量充气的充气方式控制充入气体的体积。
8.一种批量制备微泡的方法，包括进行至少两次如述权利要求1-7中任一所述微泡制备方法，其特征在于：控制各次微泡制备方法之间充入气体的体积差异在容许偏差范围以内。
9.根据权利要求8所述的批量制备微泡的方法，其特征在于：控制各次微泡制备方法中的其他操作条件一致。
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