CN110913901A - 通过无细胞dna测量肿瘤负荷 - Google Patents

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Abstract

披露了鉴定患有癌症的受试者的方法，所述癌症对包含抗PD‑L1抗体的治疗有反应，所述鉴定通过检测一个或多个循环肿瘤DNA(ctDNA)标记中的突变进行。披露了用于在所述患者中使用抗PD‑L1抗体治疗癌症的方法。披露了用于确定抗PD‑L1治疗性抗体治疗在患有肺癌或膀胱癌的患者中的疗效的方法，所述方法包括检测血浆样品中ctDNA中的变体等位基因频率并确定第一和至少第二血浆样品之间的ctDNA中变体等位基因频率的差异，其中至少第二血浆样品中变体等位基因频率相对于第一血浆样品的减少鉴定该抗PD‑L1抗体治疗是有效的。

Description

通过无细胞DNA测量肿瘤负荷
背景技术
尽管存在一致的治疗进展，例如免疫生理学治疗，癌症仍然是死亡的主要原因。对患者对治疗干预的反应的评估可能是缓慢的，并且通常通过在开始治疗几个月后测量肿瘤大小的变化来确定。下一代测序(NGS)技术在癌症的诊断、预后和治疗中的应用允许对疾病状态和治疗选择进行更快速和患者特异性的评估。在正常条件下，无细胞DNA(cfDNA)仅在血液中以低量观察到，但是响应于力竭性运动、炎症或疾病的发生，它们不能被有效地清除。例如，源自癌细胞的循环DNA代表癌症患者中cfDNA的独特且可测量的组分。cfDNA的循环肿瘤DNA(ctDNA)部分可用于对肿瘤和癌症疾病进行分类，例如对癌症患者进行分层，允许给予更有效的治疗方法，并允许对不太可能提供临床改善的现有治疗方法进行修改。如以下所讨论，在患有癌症的受试者中ctDNA的分析提供癌症的诊断、预后和治疗方法(例如，预测反应性、确定疗程)，所述方法改善了现有技术。
发明内容
本披露涉及在被鉴定为患有癌症的患者中用抗PD-L1抗体治疗癌症(例如，肺癌(如非小细胞肺癌)、膀胱癌、实体瘤等)的方法，所述癌症表达本文披露的一个或多个循环肿瘤DNA(ctDNA)标记中的突变。本披露还提供了用于确定癌症对包含抗PD-L1抗体的治疗性治疗的反应性的方法。还提供了鉴定癌症患者作为包含抗PD-L1抗体的治疗候选者的方法。
在一方面，本披露总体上提供了一种治疗方法，所述方法包括向被鉴定为患有癌症的患者给予抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，所述癌症表达一个或多个循环肿瘤DNA(ctDNA)标记中的突变，这些标记包括BRCA1、BRCA2、PIK3CA、NFE2L2、NOTCH1、ARID1A、APC、SMAD4、或KRAS。在一些实施例中，抗PD-L1抗体是度伐鲁单抗。
在一方面，本披露总体上提供了一种治疗方法，所述方法包括向被鉴定为患有肺癌(例如，非小细胞肺癌)的患者给予抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，所述肺癌表达一个或多个循环肿瘤DNA(ctDNA)标记中的突变，这些标记包括BRCA1、BRCA2、NFE2L2、PIK3CA、ARID1A、APC、或NOTCH1。在一个实施例中，抗PD-L1抗体是度伐鲁单抗。
在一方面，本披露总体上提供了一种治疗方法，所述方法包括向被鉴定为患有膀胱症的患者给予抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，所述膀胱癌表达一个或多个循环肿瘤DNA(ctDNA)标记中的突变，这些标记包括BRCA1、BRCA2、ARID1A、APC、PIK3CA、和NOTCH1。在一些实施例中，抗PD-L1抗体是度伐鲁单抗。
在另一方面，本披露总体上提供了一种治疗方法，所述方法包括向被鉴定为患有头颈癌肿瘤的患者给予抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，所述头颈癌肿瘤表达本文披露的一个或多个标记。在一些实施例中，头颈癌表达一个或多个循环肿瘤DNA(ctDNA)标记中的突变，这些标记包括NFE2L2、APC、和PIK3CA。在一个实施例中，抗PD-L1抗体是度伐鲁单抗。
在另一方面，本披露总体上提供了一种治疗方法，所述方法包括向被鉴定为患有实体瘤癌(例如，肉瘤、恶性上皮肿瘤(carcinoma)和淋巴瘤)的患者给予抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，所述实体瘤癌表达本文披露的一个或多个标记。在一个实施例中，抗PD-L1抗体是度伐鲁单抗。
在另一方面，本披露提供了一种治疗方法，所述方法包括向被鉴定为患有非小细胞肺癌瘤的患者给予度伐鲁单抗或其抗原结合片段，所述肺癌瘤表达一个或多个标记，所述标记包括BRCA1、BRCA2、NFE2L2、PIK3CA、ARID1A、APC、或NOTCH1。
在另一方面，本发明提供了一种治疗方法，所述方法包括向被鉴定为患有膀胱癌瘤的患者给予度伐鲁单抗或其抗原结合片段，所述膀胱癌瘤表达一个或多个标记，所述标记包括BRCA1、BRCA2、ARID1A、APC、PIK3CA、或NOTCH1。
在另一方面，本发明提供了一种治疗方法，所述方法包括向被鉴定为患有头颈癌瘤的患者给予度伐鲁单抗或其抗原结合片段，所述头颈癌瘤表达NFE2L2、APC、和PIK3CA中的一个或多个。
在另外的方面，本发明提供了一种鉴定患有对抗PD-L1抗体有反应的癌症的受试者的方法，该方法包括在获得自该受试者的样品中检测一个或多个循环肿瘤DNA(ctDNA)标记中的突变的表达，包括BRCA1、BRCA2、PIK3CA、NFE2L2、NOTCH1、SMAD4、ARID1A、APC、或KRAS。
在另一方面，本文披露内容提供了一种治疗被鉴定为患有癌症的患者的方法，该方法包括：检测在第一时间点取自该患者的第一血浆样品中一个或多个ctDNA标记中的变体等位基因频率，在获得该第一血浆样品后向该患者给予抗PD-L1治疗性抗体，给予该抗PD-L1治疗性抗体后，检测至少在第二时间点取自该患者的至少第二血浆样品中一个或多个ctDNA标记中的变体等位基因频率，以及确定该第一和该至少第二血浆样品之间一个或多个ctDNA标记中变体等位基因频率的差异，其中该至少第二血浆样品中变体等位基因频率相对于该第一血浆样品的减少鉴定该抗PD-L1抗体治疗是有效的，并且其中该一个或多个循环肿瘤DNA(ctDNA)标记包括BRCA1、BRCA2、PIK3CA、NFE2L2、NOTCH1、SMAD4、ARID1A、APC、或KRAS。
在这方面的一些实施例中，该方法鉴定患有对抗PD-L1疗法有反应的肺癌的受试者，该方法包括在获得自该受试者的样品中检测一个或多个循环肿瘤DNA(ctDNA)标记中的突变的表达，包括BRCA1、BRCA2、PIK3CA、NFE2L2、NOTCH1、SMAD4、ARID1A、APC、或KRAS。在另外的实施例中，该方法包括检测一个或多个循环肿瘤DNA(ctDNA)标记中的突变的表达，包括BRCA1、BRCA2、NFE2L2、PIK3CA、ARID1A、APC、或NOTCH1。在又另外的实施例中，该方法包括检测一个或多个循环肿瘤DNA(ctDNA)标记中的突变的表达，包括BRCA2或NFE2L2。
在这方面的一些实施例中，该方法鉴定患有对抗PD-L1疗法有反应的膀胱癌的受试者，该方法包括在获得自该受试者的样品中检测一个或多个循环肿瘤DNA(ctDNA)标记中的突变的表达，包括BRCA1、BRCA2、PIK3CA、NFE2L2、NOTCH1、SMAD4、ARID1A、APC、或KRAS。在另外的实施例中，该方法包括检测一个或多个循环肿瘤DNA(ctDNA)标记中的突变的表达，包括BRCA1、BRCA2、ARID1A、APC、PIK3CA、或NOTCH1中的一个或多个。
在这方面的一些实施例中，该方法鉴定患有对抗PD-L1疗法有反应的头颈癌的受试者，该方法包括检测NFE2L2、APC、和PIK3CA的一个或多个循环肿瘤DNA(ctDNA)标记中的突变的表达。
在上述实施例的一些中，该方法还包括检测肿瘤中的PD-L1表达。
在上述方面或在此描述的本披露的任何其他方面的各种实施例中，所述患者被鉴定为对度伐鲁单抗有反应。在本文披露的任何方面的一些实施例中，所述患者被进一步鉴定为具有表达PD-L1的肿瘤。
在上述方面的各种实施例中，治疗可包括给予至少约0.1、约0.3、约1、约3、约10、或约15mg/kg度伐鲁单抗或其抗原结合片段。在其他实施例中，给予至少约1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg、或15mg/kg度伐鲁单抗或其抗原结合片段。在其他实施例中，约每14天或每21天重复该给予。在其他实施例中，给予至少两个、三个、四个或五个剂量。
在另外的方面，本披露提供了用于在受试者中表征癌症对抗PD-L1抗体治疗的反应性的方法，该方法包括：检测在第一时间点取自该受试者的第一血浆样品中ctDNA中的变体等位基因频率，检测至少在第二时间点取自该受试者的至少第二血浆样品中ctDNA中的变体等位基因频率，以及确定该第一和该至少第二血浆样品之间ctDNA中变体等位基因频率的差异，其中该至少第二血浆样品中变体等位基因频率相对于该第一血浆样品的减少表征该癌症对抗PD-L1抗体治疗有反应。
在另一方面，本文披露内容提供了一种治疗患有癌症的患者的方法，该方法包括：通过检测包括BRCA1、BRCA2、PIK3CA、NFE2L2、NOTCH1、SMAD4、ARID1A、APC、或KRAS的一个或多个循环肿瘤DNA(ctDNA)标记中的突变的表达，鉴定该患者是否将对抗PD-L1抗体有反应，以及如果该一个或多个ctDNA标记不表达，则用抗PD-L1抗体以外的疗法治疗该患者。
在一些实施例中，该方法还包括在从该受试者体内取出第一血浆样品后向该受试者给予该抗PD-L1抗体。在一些实施例中，ctDNA中的变体等位基因频率由第一样品和至少第二样品中的总突变计数确定。在一些实施例中，ctDNA中的变体等位基因频率由第一样品和至少第二样品中的平均变体等位基因频率确定。
在上述方面或在此描述的本发明的任何其他方面的各种实施例中，使用NGS技术检测ctDNA标记。在上述方面或在此描述的本发明的任何其他方面的各种实施例中，ctDNA获得自癌症患者的血液。
在本文所述的方面的各种实施方案中，癌症包括选自下组的肺癌，该组由以下组成：非小细胞肺癌、鳞状细胞癌、非鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌、腺鳞癌或肉瘤样癌。
本披露提供的其他特征、方面、实施例和优点将从下文的具体实施方式中变得清楚。
定义
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。以下的参考文献为技术人员提供了本发明所用的多个术语的通用定义：Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology[微生物学和分子生物学词典](第2版，1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology[剑桥科学与技术词典](Walker编辑，1988)；The Glossary ofGenetics[遗传学词汇]，第5版，Rieger等人(编辑)，Springer Verlag[施普林格出版社](1991)；以及Hale与Marham，TheHarper Collins Dictionary ofBiology[哈珀柯林斯生物学词典](1991)。除非另外指明，否则如本文所使用的以下术语具有以下赋予它们的含意。
“抗PD-L1抗体”意指选择性结合PD-L1多肽的抗体或其抗原结合片段。示例性抗PD-L1抗体描述于例如美国专利号8,779,108和美国专利号9,493,565中，所述专利通过引用并入本文。度伐鲁单抗是示例性PD-L1抗体。在用度伐鲁单抗成功治疗后，患者实现疾病控制(DC)。疾病控制可以是完全反应(CR)、部分反应(PR)或疾病稳定(SD)。
“完全反应”(CR)是指所有病灶(无论是可测量的或不可测量的)消失，并且没有新的病灶。可以使用自第一次记载之日起不小于四周的重复连续评估来获得确认。新的不可测量的病灶排除CR。
“部分反应”(PR)是指相对于基线，肿瘤负荷减小≥50％。可使用自第一次记载日期起至少4周的连续重复评定来获得确认。
“疾病稳定”(SD)是指相对于基线无法建立50％的肿瘤负荷的减小，并且无法建立与最低点相比25％的增加。
“进行性疾病”(PD)是指相对于所记录的最小值(最低点)，肿瘤负荷增加≥25％。可以通过自第一次记载之日起至少4周的连续重复评估来获得确认。新的不可测量的病灶没有定义PD。
“ATLANTIC”是指评估MEDI4736(度伐鲁单抗)对局部晚期或转移性非小细胞肺癌患者的影响的全球性研究(临床试验政府标识符：NCT0208742)
“CP1108”是指评估MEDI4736的A期1/2研究(临床试验政府标识符：NCT01693562)。如本文所使用的，来自CP1108的数据包括NSCLC和膀胱癌结果。
“PD-L1多肽”意指与NCBI登录号NP_001254635具有至少约85％、95％或100％氨基酸同一性并且具有PD-1和CD80结合活性的多肽或其片段。
PD-L1多肽序列
NCBI登录号NP_001254635
Figure BDA0002214488090000061
“PD-L1核酸分子”意指编码PD-L1多肽的多核苷酸。示例性PD-L1核酸分子序列以NCBI登录号NM_001267706提供。
PD-L1核酸序列
NCBI登录号NM_001267706mRNA
Figure BDA0002214488090000062
Figure BDA0002214488090000071
如在本披露中使用的术语“抗体”是指免疫球蛋白或其片段或衍生物，并且涵盖包含抗原结合位点的任何多肽(无论它是在体外或在体内产生的)。该术语包括但不限于：多克隆、单克隆、单特异性、多特异性、非特异性、人源化、单链、嵌合、合成、重组、杂合、突变、以及接合抗体。除非用术语“完整”另外修饰，如在“完整抗体”中，出于本披露内容的目的，术语“抗体”还包括抗体片段例如Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb以及保留抗原结合功能(即，特异性结合PD-L1的能力)的其他抗体片段。典型地，此类片段将包含抗原结合结构域。
术语“抗原结合结构域”、“抗原结合片段”和“结合片段”是指包括负责抗体和抗原之间特异性结合的氨基酸的抗体分子的一部分。例如，在抗原很大的情况下，抗原结合结构域可只结合抗原的一部分。负责与抗原结合结构域特异性相互作用的抗原分子的一部分被称为“表位”或“抗原决定簇”。抗原结合结构域典型地包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)，然而，它不一定必须包含两者。例如，所谓的Fd抗体片段仅由VH结构域组成，但是仍然保留完整抗体的一些抗原结合功能。
抗体的结合片段通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学裂解来产生。结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv以及单链抗体。除了“双特异性”或“双功能”抗体以外，抗体应理解为其每个结合位点是相同的。使用酶(木瓜蛋白酶)来消化抗体的结果是两个相同的抗原结合片段，又称为“Fab”片段和“Fc”片段，它们不具有抗原结合活性，但具有结晶的能力。用酶(胃蛋白酶)来消化抗体的结果是F(ab')2片段，其中该抗体分子的两个臂保持连接并且包含两个抗原结合位点。F(ab')2片段具有交联抗原的能力。当本文使用时，“Fv”是指保留了抗原识别和抗原结合位点两者的抗体的最小片段。当本文使用时，“Fab”是指包含轻链的恒定结构域和重链的CHI结构域的抗体的片段。
术语“mAb”是指单克隆抗体。本发明的抗体包括但不限于：全天然抗体、双特异性抗体；嵌合抗体；Fab、Fab'、单链V区片段(scFv)、融合多肽、和非常规抗体。
“样品”意指源自生物体的任何组织、细胞、体液或其他材料的生物样品。在某些实施例中，生物样品是血液或血浆样品。
如本文所使用的，“生物标记”或“标记”通常是指与癌症相关的循环肿瘤DNA(ctDNA)。在实施例中，ctDNA标记包含与癌症(例如致癌基因)相关的基因的变体等位基因(突变)。在一些实施例中，相对于对照样品或参比中存在的水平，ctDNA标记差异地存在于获得自患有疾病(例如肺癌)的受试者的生物样品中。在一些实施例中，相对于疾病(例如肺癌)治疗期间或之后获得自受试者的样品中存在的水平，ctDNA标记差异地存在于疾病治疗之前获得自同一受试者的生物样品中。
本文披露的方法包括ctDNA标记的检测，并且可以包括针对特定标记或标记组的ctDNA计数总数的检测、特定标记或标记组的平均ctDNA标记频率改变的检测、或特定ctDNA标记或ctDNA标记组的存在的检测。因此，在本文披露的任何方面和实施例中，检测一个或多个ctDNA标记的存在、数量或频率变化。
在此披露中，“包括(comprises、comprising)”、“包含(containing)”和“具有(having)”等具有美国专利法赋予它们的含义并且可以意指“包括(includes、including)”等；“基本上由…组成(consisting essentially of或consists essentially)”同样具有美国专利法赋予的含义并且该术语是开放性的，允许超出所叙述的存在，只要所叙述的基本或新颖特征不被超过叙述的存在改变，但是排除现有技术实施例。
“检测”指的是在本文披露的各种方面和实施例鉴定待检测的分析物(包括ctDNA)的存在、不存在或量。如本文所讨论的，在可能是针对治疗选择的患者中或在已经接受抗PD-L1抗体治疗的患者中，ctDNA标记(即，包含变体/突变体等位基因的ctDNA)的检测可用于评估变体等位基因频率(VAF)、平均VAF的变化、总突变负荷和/或新驱动突变(即，在赋予生长优势的基因内的突变)的发展。
在本文披露的方法中，可以在(一次、或在多个时间点)源自患者的样品上进行ctDNA的检测。例如，可以在治疗之前(例如，在筛选和诊断期间)、治疗期间(例如，在给予治疗剂量之前或之后)和/或在疗程之后获得患者样品。
“疾病”意指损害或干扰细胞、组织或器官的正常功能的任何病症或失调。在本文披露的方面和实施例中，疾病通常是癌症，例如实体瘤癌。在一些实施例中，癌症可包括肺癌、膀胱癌和/或头颈癌。肺癌包括小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。有三个主要的NSCLC亚型：鳞状细胞癌、腺癌和大细胞(未分化的)癌。其他亚型包括腺鳞癌和肉瘤样癌。在某些方面，NSCLC是不可切除的晚期(例如，III期)NSCLC。在一些具体方面，这些患者在确定的放化疗后没有进展。头颈癌包括喉癌和下咽癌、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、口腔和口咽癌以及唾液腺癌。膀胱癌包括尿路上皮癌(也称为移行细胞癌)、鳞状细胞癌、腺癌、肉瘤和小细胞间变性癌。
术语“分离的”、“纯化的”或“生物学上纯的”是指在不同程度上不含在其天然状态下发现的通常伴随其的组分的材料。“分离”表示与初始来源或环境的分开程度。“纯化”表示高于分离的分开程度。“纯化的”或“生物上纯的”蛋白质充分不含其他材料，这样使得任何杂质不实质上影响蛋白质的生物特性或导致其他不利后果。也就是说，如果核酸或肽当通过重组DNA技术生产时基本上不含细胞材料、病毒材料或培养基，或者当通过化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品，则该核酸或该肽是纯化的。典型地使用分析化学技术来确定纯度和均质性，例如，聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法。术语“纯化的”可以表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中基本上产生一条带。对于可经受修饰(例如，磷酸化或糖基化)的蛋白质，不同修饰可以产生不同的分离蛋白质，这些蛋白质可以单独纯化。
“参比”意指用于比较的标准。
“反应”在疗法的背景中意指易受治疗的影响。
“特异性结合”意指化合物(例如，抗体)识别并结合一种分子(例如，多肽)，但是基本上不识别和不结合样品(例如，生物样品)中的其他分子。例如，特异性结合的两个分子形成在生理条件下相对稳定的复合物。特异性结合的特征在于区别于非特异性结合的高亲和力和低等至中等容量，非特异性结合通常具有低亲和力以及中等至高等容量。典型地，当亲和力常数KA高于106M-1，或更优选地高于108M-1时，结合被认为是特异的。如果需要的话，可以通过改变结合条件来减少非特异性结合，基本上不影响特异性结合。例如抗体浓度、溶液的离子强度、温度、允许结合的时间、封闭剂(例如，血清白蛋白、乳酪蛋白)的浓度等适当的结合条件，可被熟练的技术人员使用常规技术来优化。
“受试者”意指哺乳动物，包括但不限于人或非人哺乳动物，如牛、马、犬、羊或猫。
在此所提供的范围被理解成对在该范围内的所有值的简写。例如，1到50的范围应当理解为包括来自下组的任何数字、数字的组合或子范围，该组由以下组成：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。
如本文所使用的，术语“治疗(treat、treating、treatment等)”是指减少、改善或减缓疾病或失调的进展和/或与疾病或失调相关的症状。将被理解的是，尽管不能排除，但是治疗失调、疾病或病症并不要求完全地消除该失调、疾病或病症或与其相关的症状。
除非明确声明或从上下文显而易见，如本文所使用的，术语“或”被理解为被包括在内。除非明确声明或从上下文显而易见，如本文所使用的，术语“一种(a)”、“一个(an)”和“该(the)”被理解为单数的或复数的。
除非明确声明或从上下文显而易见，如本文所使用的，术语“约(about)”被理解为在本领域的正常公差范围内，例如，在平均数的2个标准偏差之内。约可以被理解为在声明值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、或0.01％之内。除非从上下文显而易见，本文提供的所有数值被该术语约修饰。
本文变量的任何定义中对化学基团清单的叙述包括将该变量定义为任何单个基团或所列基团的组合。在本文中对变量或方面的实施例的详述包括作为任何单个实施例或与任何其他实施例或其部分结合的实施例。
可以将在此提供的任何组合物或方法与在此提供的任何其他组合物和方法中的一种或多种进行组合。
附图说明
图1提供了在用抗PD-L1抗体(度伐鲁单抗)治疗之前，基线处非小细胞肺癌(NSCLC)患者的血浆样品中检测到的所有ctDNA变体的概述。
图2标绘了初始患者筛选时ctDNA的平均变体等位基因频率。反应者在抗PD-L1抗体疗法后(“给药后”)显示平均VAF降低，患有稳定疾病的患者通常表现出比有反应的患者更小的平均VAF降低，而进展性疾病患者在抗PD-L1抗体疗法后通常不显示平均VAF降低。每条线代表相应反应组(PR；PD；或SD)中的患者。
图3A表明治疗后平均VAF的降低与NSCLC患者中总存活(OS)的机会增加相关。在条形图中，条形上方的数字是评估PR时的时间(周)。图3B显示相对于表现出平均VAF增加的患者，具有平均VAF降低的NSCLC患者通常具有更长的无进展存活和总存活的机会。
图4鉴定了对治疗有反应(PR)的、来自研究1108的NSCLC患者具有降低的肿瘤负荷，如通过总ctDNA突变计数所证明的，而具有稳定或进展性疾病(PD/SD)的患者通常显示总ctDNA突变计数的增加。
图5鉴定了抗PD-L1抗体疗法后在PR、SD和PD NSCLC专利中检测到的新ctDNA突变的类型和数量。
图6示出了在抗PD-L1抗体疗法后出现在两个非反应性NSCLC患者(PD)中的示例性新驱动突变。
图7描绘了在抗PD-L1抗体疗法后在NSCLC患者的基线筛选中鉴定的具有ctDNA变体BRCA2、PIK3CA、NFE2L2、NOTCH1、SMAD4、和KRAS的患者对抗PD-L1抗体疗法的反应率。
图8提供了在用抗PD-L1抗体(度伐鲁单抗)治疗之前，基线处膀胱癌患者的血浆样品中检测到的所有ctDNA变体的概述。含有非同义变体或拷贝数扩增的五种最常见基因是TP53、ARID1A、PIK3CA、ERBB2、和TERT。
图9描绘了在膀胱癌患者的基线筛选中鉴定的具有ctDNA变体BRCA2、PIK3CA、NOTCH1、SMAD4、和KRAS的患者对抗PD-L1抗体疗法的反应率。
图10是鉴定初始膀胱癌患者筛选时ctDNA的平均变体等位基因频率的图。反应者在抗PD-L1抗体疗法(“给药4”)后显示平均VAF降低，患有稳定疾病的患者通常表现出比有反应的患者更小的平均VAF降低，而进展性疾病患者在抗PD-L1抗体疗法(“给药4”)后通常不显示平均VAF降低。每条线代表相应反应组(CR/PR；PD；或SD)中的患者。
图11显示平均VAF降低的膀胱癌患者通常具有更长的无进展存活和总存活的机会。
图12表明治疗后平均VAF的降低与膀胱癌患者的反应性和稳定疾病以及总存活(OS)的增加相关。在条形图中，条形上方的数字是评估PR时的时间(周)。
图13提供了在用抗PD-L1抗体(度伐鲁单抗)治疗(ATLANTIC临床试验)的基线临床评估处，NSCLC癌患者的血浆样品中检测到的所有ctDNA变体的概述。最常见的变体是TP53、KRAS、EGFR、ARID1A、和PIK3CA(总共88个样品)。
图14标绘了初始患者筛选时ctDNA的平均变体等位基因频率。从ATLANTIC和CP1108生成数据。反应者在抗PD-L1抗体疗法后(“给药后”)显示平均VAF降低，患有稳定疾病的患者通常表现出比有反应的患者更小的平均VAF降低，而进展性疾病患者在抗PD-L1抗体疗法后通常不显示平均VAF降低。每条线代表相应反应组(CR/PR；PD；或SD)中的患者。
图15表明治疗后平均VAF的降低与NSCLC患者中总存活(OS)的机会增加相关。从ATLANTIC和CP1108生成数据。
图16显示相对于表现出平均VAF增加的患者，具有平均VAF降低的ATLANTIC患者通常具有更长的无进展存活和总存活的机会。
图17提供了以月计的、NSCLC和UBC患者的个体患者反应数据
图18描绘了在抗PD-L1抗体疗法后在NSCLC患者中，具有ctDNA变体NFE2L2、RET、EGFR、MET、和PIK3CA的患者对抗PD-L1抗体疗法的反应率。从ATLANTIC和CP1108生成数据。
图19描绘了在抗PD-L1抗体疗法后在NSCLC患者中，来自具有ctDNA变体NFE2L2、BRCA2、RET、PIK3CA、NOTCH1、EGFR、和KRAS的合并患者数据的抗PD-L1抗体疗法的反应率。
序列
度伐鲁单抗轻链可变区氨基酸序列：SEQ ID NO:1
度伐鲁单抗重链可变区氨基酸序列：SEQ ID NO:2。
度伐鲁单抗重链可变区CDR1、CDR2、和CDR3的氨基酸序列：SEQ ID NO:3-5。
度伐鲁单抗轻链可变区CDR1、CDR2、和CDR3的氨基酸序列：SEQ ID NO:6-8。
具体实施方式
本发明至少部分地基于以下发现：循环肿瘤DNA(ctDNA)中的突变(变体等位基因频率，或“VAF”)在自罹患癌症(例如肺癌、膀胱癌或头颈癌)的受试者获得的样品中可检出；ctDNA中的VAF可用于鉴定可能对抗PD-L1抗体治疗有反应的患者。本文披露的方法利用下一代测序提供的技术进步，并将ctDNA中的特定突变和/或从血浆样品中分离的ctDNA中观察到的突变负荷与癌症对抗PD-L1抗体疗法的反应性相关联。本文披露的方法利用ctDNA，ctDNA允许相对非侵入性的方法，所述方法可以快速评估肿瘤DNA改变和对治疗的阳性临床反应的可能性(例如，比较治疗之前、期间和/或之后ctDNA中的突变负荷)。利用ctDNA的方法提供了患者中所有肿瘤病变的代表性说明以及肿瘤异质性，因为这些方法不依赖于应用于个体组织和/或肿瘤样品的活组织检查或免疫组织化学技术。本文披露的方法提供重复取样，其允许更有效和快速地监测对治疗的治疗性反应、癌症的突变状态、以及在与疾病复发相关的任何典型临床表现之前发展分子抗性。
因此，在各种方面中，包含ctDNA标记的检测的所披露的方法提供突变负担的测量、允许特定ctDNA突变的鉴定(治疗之前或期间可预测阳性临床反应)、并且还允许修改治疗(当未观察到对当前治疗的反应性的迹象时)。
在一个方面，本披露提供了在通过检测ctDNA标记鉴定的患者中用抗PD-L1抗体治疗癌症的方法，所述标记包括BRCA1、BRCA2、PIK3CA、NFE2L2、NOTCH1、SMAD4、ARID1A、APC、和/或KRAS中的一个或多个中的突变。
在该方面的一些实施例中，本披露提供了在通过检测ctDNA标记鉴定的患者中用抗PD-L1抗体治疗肺癌(例如，NSCLC)的方法，所述标记包括BRCA1、BRCA2、PIK3CA、NFE2L2、NOTCH1、SMAD4、ARID1A、APC、和/或KRAS中的一个或多个中的突变。在进一步的实施例中，用于治疗患者的肺癌(例如，NSCLC)的方法包括通过检测ctDNA标记来鉴定患者，所述标记包括BRCA2、NFE2L2、和NOTCH1中的一个或多个中的突变。
在该方面的一些实施例中，本披露提供了在通过检测ctDNA标记鉴定的患者中用抗PD-L1抗体治疗膀胱癌的方法，所述标记包括BRCA1、BRCA2、PIK3CA、NFE2L2、NOTCH1、SMAD4、ARID1A、APC、和/或KRAS中的一个或多个中的突变。在进一步的实施例中，用于治疗患者的膀胱癌的方法包括通过检测ctDNA标记来鉴定患者，所述标记包括BRCA1、BRCA2、ARID1A、APC、PIK3CA、或NOTCH1中的一个或多个中的突变。
在一些实施例中，本披露提供了在通过检测ctDNA标记鉴定的患者中用抗PD-L1抗体治疗头颈癌的方法，所述标记包括BRCA1、BRCA2、PIK3CA、NFE2L2、NOTCH1、SMAD4、和/或KRAS中的一个或多个中的突变。在一些实施例中，ctDNA标记包括NFE2L2、APC或PIK3CA。
在上述方面和实施例中，所述方法可以结合PD-L1生物标记的检测而进行。
上文披露的方法包括鉴定患有对抗PD-L1抗体治疗有反应的癌症的患者。因此，本披露提供了方面和实施例，其包括鉴定患有对抗PD-L1抗体有反应的癌症的受试者的方法，其中所述方法包括检测一个或多个循环肿瘤DNA(ctDNA)标记(如此处和上文方面和实施例中所述的)中的突变的表达。
表征对抗PD-L1抗体疗法的反应性
在另外的方面，本披露提供了用于在受试者中表征癌症(如肺癌或膀胱癌)对抗PD-L1抗体治疗的反应性的方法，其中该方法包括检测在第一时间点取自该受试者的第一血浆样品中ctDNA中的变体等位基因频率，检测至少在第二时间点取自该患者的至少第二血浆样品(包含ctDNA)中ctDNA中的变体等位基因频率，以及确定该第一和该至少第二血浆样品之间ctDNA中变体等位基因频率的差异。
在该方面的一些实施例中，ctDNA中变体等位基因频率可以通过第一和第二样品中的总突变计数确定。在一些实施例中，ctDNA中的变体等位基因频率可以使用第一和第二样品中的平均变体等位基因频率确定。
用于表征反应性的方法是基于在第一和第二样品中检测到ctDNA标记的总突变负担的差异。在一些实施例中，ctDNA标记可包括BRCA1、BRCA2、PIK3CA、NFE2L2、NOTCH1、SMAD4、ARID1A、APC、和/或KRAS中的一个或多个中的突变的差异。在进一步的实施例中，该方法可以包括检测变体等位基因频率的差异，任选地与在一种或多种类型的生物样品(例如，肿瘤样品)中测量的PD-L1的检测组合。
在实施例中，该方法鉴定对抗PD-L1抗体治疗有反应的受试者，所述鉴定是通过确定至少第二样品中变体等位基因频率当相比于第一样品时减少进行的。在一些实施例中，检测到在至少第二样品中ctDNA中的总突变计数相对于第一样品中ctDNA中的总突变计数为较低数值后，方法鉴定受试者为反应性。在一些实施例中，检测到在至少第二样品中ctDNA中的平均变体等位基因频率相对于第一样品中ctDNA中的平均变体等位基因频率较低后，方法鉴定受试者为反应性。
如本文所例示的，ctDNA标记(包括例如，BRCA1、BRCA2、PIK3CA、NFE2L2、NOTCH1、SMAD4、ARID1A、APC、和/或KRAS)可以使用本领域中已知的任何下一代测序技术来检测。
治疗方法的选择
在选择治疗方法的过程中，可以针对BRCA1、BRCA2、PIK3CA、NFE2L2、NOTCH1、SMAD4、ARID1A、APC、和/或KRAS中的一个或多个的ctDNA中的突变、以及任选地PD-L1多核苷酸或多肽表达对患有癌症(诸如像肺癌(例如，NSCLC)、膀胱癌、或头颈癌)的受试者进行筛选。在一些实施例中，患有NSCLC的、具有BRCA1、BRCA2、NFE2L2、PIK3CA、和/或NOTCH1 ctDNA中的一个或多个中的突变的受试者可以被鉴定为抗PD-L1治疗的可能反应者。在一些实施例中，患有膀胱癌的、具有BRCA1、BRCA2、ARID1A、APC、PIK3CA、或NOTCH1 ctDNA中的突变的受试者可以被鉴定为抗PD-L1治疗的可能反应者。
B7-H1/PD-L1
B7-H1，也称为PD-L1，是大小约53kDa的I型跨膜蛋白。在人中，B7-H1表达于许多免疫细胞类型(包括活化和无变应性的/耗尽的T细胞)上、初试的和活化的B细胞上，连同髓样树突细胞(DC)、单核细胞和肥大细胞上。它还表达于非免疫细胞上，包括胰腺的胰岛、肝脏的库普弗细胞、血管内皮和选择的上皮细胞(例如气道上皮细胞和肾小管上皮细胞)，其中其表达在炎性发作期间增强。在许多肿瘤(包括但不限于乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、肺癌、包括肾细胞癌的肾癌、胃癌、膀胱癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肝细胞癌(HCC)、以及胰腺癌、连同黑色素)上也发现增加水平的B7-H1表达。
已知B7-H1结合两种可供选择的配体，这些中的第一种，PD-1，是最初在经受活化-诱导凋亡的T细胞系中鉴定的50-55kDa的I型跨膜受体。PD-1表达于活化的T细胞、B细胞、以及单核细胞连同免疫系统的其他细胞上，并且结合B7-H1(PD-L1)和相关的B7-DC(PD-L2)两者。第二种是B7家族成员B7-1，其表达于活化的T细胞、B细胞、单核细胞以及抗原递呈细胞上。
经由PD-1/B7-H1轴的信号传导被认为通过负面调节T细胞反应在免疫系统内起重要的非丰余功能。肿瘤细胞上的B7-H1表达被认为有助于肿瘤避开免疫系统的检测和消除。B7-H1经由若干可供选择的机制在这个方面起作用，包括驱动肿瘤浸润性T淋巴细胞耗尽和失能，刺激免疫压制细胞因子分泌到肿瘤微环境中，刺激压制调节性T细胞功能并且保护B7-H1表达肿瘤细胞免于被肿瘤细胞特异性细胞毒性T细胞裂解。
抗PD-L1抗体
特异性结合并抑制PD-L1活性(例如，结合PD-1和/或CD80)的抗体可用于治疗肺癌(例如，非小细胞肺癌)
度伐鲁单抗是示例性抗PD-L1抗体，其对B7-H1有选择性并且阻断B7-H1与PD-1和CD80受体的结合。度伐鲁单抗可以在体外解除B7-H1介导的对人T细胞活化的抑制，并且经由T细胞依赖性机制在异种移植物模型中抑制肿瘤生长。可使用的其他试剂包括抑制PD-L1和/或PD-1的试剂(AB或其他)。
用于在此提供的这些方法中的关于度伐鲁单抗(或其片段)的信息可以见于国际申请公开号WO 2011/066389 A1，该国际申请的披露内容通过引用以其全文结合在此。度伐鲁单抗的片段可结晶(Fc)结构域在IgG1重链的恒定结构域中含有三重突变，所述三重突变减少与负责介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的补体组分C1q和Fcγ受体的结合。
用于在此提供的这些方法中的度伐鲁单抗和其抗原结合片段包括重链和轻链或重链可变区和轻链可变区。在一个特定方面，用于本文提供的方法中的度伐鲁单抗或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，所述重链可变区包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在具体的方面，用于本文提供的这些方法中的度伐鲁单抗或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含SEQ ID NO:3-5的卡巴特(Kabat)定义的CDR1、CDR2和CDR3序列，并且其中该轻链可变区包含SEQ ID NO:6-8的卡巴特定义的CDR1、CDR2和CDR3序列。本领域普通技术人员将能够容易地鉴定本领域普通技术人员已知的乔西亚(Chothia)定义的、Abm定义的或其他的CDR定义。在具体的方面，用于本文提供的这些方法中的度伐鲁单抗或其抗原结合片段包含如在美国专利号8,779,108；美国专利号9,493,565；和WO 2011/066389 A1中所披露的2.14H9OPT抗体的可变重链和可变轻链CDR序列，所述专利通过引用以其全文结合在此。
用抗PD-L1抗体进行的治疗
向被鉴定为可能对抗PD-L1抗体疗法有反应的患者给予抗PD-L1抗体(例如度伐鲁单抗)或其抗原结合片段。度伐鲁单抗或其抗原结合片段可以仅被给予一次或偶尔给予，而仍然为该患者提供益处。在另外的方面，向所述患者给予另外的后继剂量。可以取决于患者的年龄、体重、临床评估、肿瘤负荷和/或其他因素(包括主治医师的判断)，以不同时间间隔给予后继剂量。
在一些实施例中，向患者给予至少两个剂量的度伐鲁单抗或其抗原结合片段。在一些实施例中，可以向所述患者给予至少三个剂量、至少四个剂量、至少五个剂量、至少六个剂量、至少七个剂量、至少八个剂量、至少九个剂量、至少十个剂量或至少十五个剂量或更多剂量。在一些实施例中，在两周治疗期内、在四周治疗期内、在六周治疗期内、在八周治疗期内、在十二周治疗期内、在二十四周治疗期内或在一年或更长时间的治疗期内给予度伐鲁单抗或其抗原结合片段。在一些实施例中，在三周治疗期内、在六周治疗期内、在九周治疗期内、在十二周治疗期内、在二十四周治疗期内或在一年或更长时间的治疗期内给予度伐鲁单抗或其抗原结合片段。在一些实施例中，在两个月治疗期内、在四个月治疗期内或在六个月或更长时间的治疗期内(例如，在维持阶段期间)给予度伐鲁单抗或其抗原结合片段。
有待向该患者给予的度伐鲁单抗或其抗原结合片段的量将取决于不同参数，如该患者的年龄、体重、临床评估、肿瘤负荷和/或其他因素(包括主治医师的判断)。
在某些方面中，该患者被给予一个或多个剂量的度伐鲁单抗或其抗原结合片段，其中该剂量是约0.1mg/kg。在某些方面，向所述患者给予一个或多个剂量的度伐鲁单抗或其抗原结合片段，其中所述剂量是约0.3mg/kg。在某些方面，向所述患者给予一个或多个剂量的度伐鲁单抗或其抗原结合片段，其中所述剂量是约1mg/kg。在某些方面，向所述患者给予一个或多个剂量的度伐鲁单抗或其抗原结合片段，其中所述剂量是约3mg/kg。在某些方面，向所述患者给予一个或多个剂量的度伐鲁单抗或其抗原结合片段，其中所述剂量是约10mg/kg。在某些方面，向所述患者给予一个或多个剂量的度伐鲁单抗或其抗原结合片段，其中所述剂量是约15mg/kg。
在某些方面中，该患者被给予至少两个剂量的度伐鲁单抗或其抗原结合片段，其中该剂量是约0.1mg/kg。在某些方面，向所述患者给予至少两个剂量的度伐鲁单抗或其抗原结合片段，其中所述剂量是约0.3mg/kg。在某些方面，向所述患者给予至少两个剂量的度伐鲁单抗或其抗原结合片段，其中所述剂量是约1mg/kg。在某些方面，向所述患者给予至少两个剂量的度伐鲁单抗或其抗原结合片段，其中所述剂量是约3mg/kg。在某些方面，向所述患者给予至少两个剂量的度伐鲁单抗或其抗原结合片段，其中所述剂量是约10mg/kg。在某些方面，向所述患者给予至少两个剂量的度伐鲁单抗或其抗原结合片段，其中所述剂量是约15mg/kg。在一些实施例中，相隔约两周给予该至少两个剂量。在一些实施例中，相隔约三周给予该至少两个剂量。
在某些方面中，该患者被给予至少三个剂量的度伐鲁单抗或其抗原结合片段，其中该剂量是约0.1mg/kg。在某些方面，向所述患者给予至少三个剂量的度伐鲁单抗或其抗原结合片段，其中所述剂量是约0.3mg/kg。在某些方面，向所述患者给予至少三个剂量的度伐鲁单抗或其抗原结合片段，其中所述剂量是约1mg/kg。在某些方面，向所述患者给予至少三个剂量的度伐鲁单抗或其抗原结合片段，其中所述剂量是约3mg/kg。在某些方面，向所述患者给予至少三个剂量的度伐鲁单抗或其抗原结合片段，其中所述剂量是约10mg/kg。在某些方面，向所述患者给予至少三个剂量的度伐鲁单抗或其抗原结合片段，其中所述剂量是约15mg/kg。在一些实施例中，相隔约两周给予该至少三个剂量。在一些实施例中，相隔约三周给予该至少三个剂量。
在某些方面中，根据本文提供的这些方法给予度伐鲁单抗或其抗原结合片段是通过肠胃外给予进行的。例如，可以通过静脉内输注或通过皮下注射来给予度伐鲁单抗或其抗原结合片段。在一些实施例中，所述给予是通过静脉内输注进行的。
在某些方面中，根据在此提供的这些方法与另外的癌症疗法组合或结合给予度伐鲁单抗或其抗原结合片段。此类疗法包括，但不限于化学治疗剂如威罗菲尼、埃罗替尼、阿法替尼、西妥昔单抗、卡铂、贝伐单抗、埃罗替尼或培美曲塞或其他化学治疗剂，以及辐射或任何其他抗癌治疗。
本文提供的这些方法可以减小肿瘤大小、延迟肿瘤生长或维持稳定状态。在某些方面中，基于适当的统计分析，该肿瘤大小的减少可以是显著的。可以通过与基线处的患者肿瘤的大小、针对预期的肿瘤大小、针对基于大的患者群体的预期的肿瘤大小或针对对照群体的肿瘤大小进行比较来测量肿瘤大小的减少。在本文提供的某些方面中，给予度伐鲁单抗可以使肿瘤大小减少至少25％。在本文提供的某些方面中，给予度伐鲁单抗可以在第一次治疗的约6周内使肿瘤大小减少至少25％。在本文提供的某些方面中，给予度伐鲁单抗可以使肿瘤大小减少至少50％。在本文提供的某些方面中，给予度伐鲁单抗可以在第一次治疗的约10周内使肿瘤大小减少至少50％。在本文提供的某些方面中，给予度伐鲁单抗可以使肿瘤大小减少至少75％。在本文提供的某些方面中，给予度伐鲁单抗可以在第一次治疗的约10周内使肿瘤大小减少至少75％。
在某些方面中，使用本文提供的这些方法，即，给予度伐鲁单抗或其抗原结合片段可以在第一次治疗的6周内、7周内、8周内、9周内、10周内、12周内、16周内、20周内、24周内、28周内、32周内、36周内、40周内、44周内、48周内或52周内使肿瘤大小减小。
在一些实施例中，给予1mg/kg的度伐鲁单抗或其抗原结合片段(例如，每两周或每三周至少一个剂量、至少两个剂量、至少三个剂量、至少四个剂量、至少五个剂量、至少六个剂量、至少七个剂量、至少八个剂量、至少九个剂量、至少十个剂量或更多个剂量)可以足以减小肿瘤尺寸。然而，如在此所提供，还可以给予更大的剂量，例如以便优化功效、所必需的剂量数目或某些药物代谢动力学参数。
本文提供的这些方法可以减弱或延迟肿瘤生长。在一些方面，所述减少或延迟可以是统计学上显著的。可以通过与基线处的患者肿瘤的生长、针对预期的肿瘤生长、针对基于大的患者群体的预期的肿瘤生长或针对对照群体的肿瘤生长进行比较来测量肿瘤生长的减少。
在某些方面中，患者实现了疾病控制(DC)。疾病控制可以是完全反应(CR)、部分反应(PR)或疾病稳定(SD)。
在某些方面中，给予度伐鲁单抗或其抗原结合片段可以使无进展存活期(PFS)增加。
在某些方面中，给予度伐鲁单抗或其抗原结合片段可以使总体存活期(OS)增加。
根据在此提供的这些方法，给予度伐鲁单抗或其抗原结合片段可以产生希望的药物代谢动力学参数。可以使用“曲线下面积”(AUC)来评估总药物暴露。“AUC(τ)”是指直到给药周期结束的AUC，而“AUC(inf)”是指直到无穷时间的AUC。该给予可以产生约100至约2,500d·μg/mL的AUC(τ)。该给予可以产生约15μg/mL至约350μg/mL的观察到的最大浓度(Cmax)。该度伐鲁单抗或其抗原结合片段的半衰期可以是约5天至约25天。另外，该度伐鲁单抗或其抗原结合片段的清除率可以是约1-10毫升/天/千克。
如本文所提供的，度伐鲁单抗或其抗原结合片段还可以使游离B7-H1水平降低。游离B7-H1是指没有结合(例如，通过度伐鲁单抗)的B7-H1。在一些实施例中，B7-H1水平被降低至少80％。在一些实施例中，B7-H1水平被降低至少90％。在一些实施例中，B7-H1水平被降低至少95％。在一些实施例中，B7-H1水平被降低至少99％。在一些实施例中，在给予度伐鲁单抗或其抗原结合片段之后，B7-H1水平被消除。在一些实施例中，例如与给予度伐鲁单抗或其抗原结合片段之前的B7-H1水平的增长率相比，给予度伐鲁单抗或其抗原结合片段使B7-H1水平的增长率降低。
在某些方面，如果如本文所披露的一个或多个ctDNA标记不表达，则可以用抗PD-L1抗体以外的疗法对患有癌症的患者进行治疗。这些疗法可以是例如免疫检查点抑制剂、化疗、放射疗法、免疫系统激动剂、DNA损伤应答(DDR)抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、溶瘤病毒、癌症疫苗、腺苷生成抑制剂、或抗体-药物缀合物。
除非另外指明，在此披露的方法的实施采用很好地处在普通技术人员能力范围之内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术。此类技术在文献中已被充分解释，例如“Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册]”,第二版(Sambrook，1989)；“Oligonucleotide Synthesis[寡核苷酸合成]”(Gait，1984)；“Animal Cell Culture[动物细胞培养]”(Freshney，1987)；“Methodsin Enzymology[酶学方法]”“Handbook ofExperimental Immunology[实验免疫学手册]”(Weir，1996)；“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells[用于哺乳动物细胞的基因转移载体]”(Miller和Calos，1987)；“Current Protocols in Molecular Biology[当前分子生物学方法]”(Ausubel，1987)；“PCR:The Polymerase Chain Reaction[PCR：聚合酶链式反应]”，(Mullis，1994)；“CurrentProtocols in Immunology[免疫学现代实验方案]”(Coligan，1991)。
以下实例提供上文所描述的方面和实施例中的一部分的说明，并且不旨在限制要求保护的发明的范围。
实例
材料和方法
患者样品。从参加1/2期临床试验的患者获得血浆样品，评估抗PD-L1抗体(度伐鲁单抗)在患有晚期实体瘤的受试者中的安全性、耐受性和药代动力学。来自28名患有肺癌(非小细胞肺癌)的患者和29名患有膀胱癌的患者的血浆样品在治疗(度伐鲁单抗为10.0mg/kg)前的患者筛选期间获得，并且在第4个治疗剂量(在第6周给予)后在第8周再次获得。
ctDNA测定/NGS.使用Guardant360基因面板(Guardant Health公司，红杉市，CA)进行下一代测序和ctDNA检测。该面板(panel)包括73个基因，并为每个检测到的SNV、插入缺失(indel)和融合提供突变等位基因频率，以及为检测到的扩增提供拷贝数。
实例1：在反应性NSCLC患者中观察到ctDNA平均变体等位基因频率降低
患者样品的分析证实，ctDNA在从血浆中分离的无细胞DNA中可检测到。对筛查期间获得自116名患者的样品进行的分析在96％的样品中鉴定到变体(111/116)，其中若干种变体被频繁观察到，包括TP53(69％的样品)、PIK3CA(29％的样品)、EGFR(28％的样品)、KRAS(24％的样品)和CDKN2A(16％的样品)。参见图1。
在治疗过程中的平均变体等位基因频率(VAF)的变化与疾病进展相关。在4个剂量/治疗后，反应性患者(responding patient，PR)具有显著降低(-1.6％，p＝0.008)的ctDNA VAF，而无反应者具有可观察到的平均VAF增加(+1.4％，p＝0.05)。参见图2，其包括在筛选时具有等位基因频率≥0.3％的SNV和插入缺失，并描述了在度伐鲁单抗给药6周后表现出平均VAF减少或增加的患者的PFS概率和OS概率。这个数据表明，早在治疗开始后6周观察到的平均VAF降低可预测用包括度伐鲁单抗进行治疗将获得较长的PFS和OS。
在图3A中，患者反应被绘制为平均VAF变化的函数并且指出所有反应患者(responder patient)和67％(4/6)SD患者中的VAF减少。图3B显示相对于表现出平均VAF增加的患者，具有平均VAF降低的NSCLC患者通常具有更长的无进展存活和总存活的机会。
在评价抗PD-L1抗体疗法(度伐鲁单抗)的第二个NSCLC临床试验(ATLANTIC)中，患者样品的分析证实ctDNA在从高百分比患者的血浆中分离的无细胞DNA中可检测到。对筛查期间获得自88名患者的样品进行的分析在94％的样品中鉴定到变体(83/88)，其中若干种变体是先前观察到和新近频繁观察到的，包括TP53(72％的样品)、PIKCA(16％的样品)、EGFR(22％的样品)、KRAS(27％的样品)和ARID1A(16％的样品)。参见图13。
如在NSLC研究中均观察到的，在治疗过程中的平均变体等位基因频率(VAF)的变化与疾病进展相关。在4个剂量/治疗后，反应性患者(PR)具有显著降低(-4.07％，p＝0.0009)的ctDNA VAF，具有疾病稳定(SD)的患者具有较低的ctDNA VAF降低(-1.06，p＝0.2)，而无反应者具有可观察到的平均VAF增加(+1.37％，p＝0.3)。参见图14。在图15中，患者反应被绘制为平均VAF变化的函数并且指出所有反应患者和64％(14/22)SD患者中的VAF减少。图16描述了在度伐鲁单抗给药6周后表现出平均VAF减少或增加的患者的PFS概率和OS概率。如由研究CP1108显示的，这些数据表明早在治疗开始后6周观察到的平均VAF降低可预测用包括度伐鲁单抗进行治疗将获得较长的PFS和OS。肺癌和膀胱癌患者的个体患者反应如图17中所示。
实例2：在反应性NSCLC患者中观察到ctDNA突变负荷降低
除了实例1中所讨论的平均VAF降低，治疗8周后，当与无反应(PD/SD)患者(平均差为+1.6，p＝0.036，ci(95％)＝0.1,3.1)相比时，反应性患者(PR)表现出突变负担显著减少，如通过总突变计数(平均差为-5.3，p＝0.037，且ci(95％)＝-10.2,-0.4)确定的。参见图4，其绘制了筛选(给药前)和第6周给予剂量4后(给药后)的总突变计数。
实例3：新ctDNA突变与具有进展性NSCLC的患者相关
8周(4个剂量)后在PD患者中100％检测到新ctDNA突变，相较而言，分类为SD的患者中为57％且分类为PR的患者中为56％。参见图5。在PR患者(5/9)中检测到的新突变不包括NSCLC常见的驱动突变，而在42％的PD患者(5/12)和14％的SD患者(1/7)中检测到NSCLC常见的驱动突变。因此，在治疗过程中，筛查中不存在的突变的检测更可能与非反应(PD)患者相关。图6提供了出现在两个非反应患者中的新驱动突变的实例(EGFR，TP53(S215R)和ALK(M1302T)；和TP53(p.Gln375fs)，KRAS(G12C)和TP53(T125T))。
对数据的进一步分析鉴定了可在基线(筛选)检测到的若干种ctDNA变体与反应者相关，包括BRCA1、BRCA2、PIK3CA、NFE2L2、NOTCH1、SMAD4、和KRAS，并且可用于提供早期患者预后和分层(分层为抗PD-L1抗体疗法(例如度伐鲁单抗)的良好候选者)。表1a鉴定了显示ORR增加的变体，其中BRCA2和NFE2L2可能与中值PFS的提高相关，除PIK3CA外的所有突变都与OS的提高相关。还参见图7。BRCA2(OR，18.4；Pval 0.002)；PIK3CA(OR，5.5；Pval 0.004)；NFE2L2(OR，12.2；Pval 0.004)；NOTCH1(OR，6.3；Pval 0.040)；SMAD4(OR，5.2；Pval 0.115；KRAS(OR，0.9；Pval 1.000)；图18。NFE2L2(100％反应，Pval 0.071)；RET(100％反应，Pval0.071)；EGFR(0.3反应，Pval 0.135)；MET(0.27反应，Pval 0.272)；PIK3CA(1.86反应，Pval0.325)。
特别地，BRCA1/2、NFE2L2、NOTCH1、和PIK3CA突变在抗PD-L1抗体治疗干预之前可更常见地在反应者中鉴定。
表1a.与对度伐鲁单抗的潜在反应相关的ctDNA突变
Figure BDA0002214488090000241
NR＝未达到；
*N和影响大小(有/无突变)
ORR计算中省略了NE
表1b.与对度伐鲁单抗的潜在阴性/阳性ORR相关的ctDNA突变
基因 OR Pval
NFE2L2 INF 0.071
RET INF 0.071
EGFR 0.30 0.135
RB1 0 0.181
SMO INF 0.272
CCND2 INF 0.272
GATA3 INF 0.272
DDR2 INF 0.272
MET 0.27 0.272
PIK3CA 1.86 0.325
ALK 2.90 0.337
BRCA2 2.90 0.337
BRCA1 2.90 0.337
CDKN2A 2.15 0.382
TP53 1.73 0.423
实例4：在反应性膀胱癌患者中观察到ctDNA平均变体等位基因频率降低。
对筛查期间获得自33名患者的样品进行的分析在94％的样品中鉴定到变体(31/33)，其中若干种变体被频繁观察到，包括TP53(73％的样品)、ARID1A(55％的样品)、PIK3CA(39％的样品)、ERBB2(33％的样品)、和TERT(33％的样品)，以及CDKN2A(16％的样品)。参见图8。在膀胱癌患者中也鉴定了若干种具有与NSCLC反应相关的突变的基因，其中NOTCH1可能与增加的反应率相关。(图9)。
如在与NSCLC患者中的反应相关联的数据中观察到的，在治疗过程中的平均VAF变化与膀胱癌疾病进展相关。在4个剂量/治疗后，反应性患者(CR/PR)具有显著降低(-2.36％，p＝0.02)的ctDNA VAF，而无反应者(PD)具有可观察到的平均VAF增加(+2.69％，p＝0.31)。参见图10。特别地，改善的PFS和OS概率与度伐鲁单抗给药后平均VAF的降低强烈相关，如图11所示。图12将患者反应被绘制为平均VAF变化的函数并且指出所有反应(PR/CR)患者中(一个除外)和所有SD患者中的VAF减少。
汇集数据以识别最常与反应相关的筛选突变
汇集来自所讨论的临床试验的突变数据允许鉴定在给药前取样检测到的前15种突变(与对鳞状和非鳞状细胞癌的反应相关联)。表2a总结了基因且表2b鉴定了可能具有益处的突变以及抗性突变(反应者和非反应者中的EGFR或STK11)。图19提供了所选数目的鉴定变体的直方图，鉴定了被分类为吸烟者和患有鳞状细胞癌的患者的百分比(总共194名患者)。
表2a按p值排列的前15种基因突变关联
Figure BDA0002214488090000251
Figure BDA0002214488090000261
表2b与益处有关的突变和反应患者/非反应患者中的抗性突变百分比。
Figure BDA0002214488090000262
上述实例说明了包含ctDNA的检测的方法可鉴定与癌症的诊断、预后、和治疗相关的特定ctDNA突变，所述癌症可能对抗PD-L1抗体疗法有反应。因此，所述方法提供了可以受益于抗PD-L1抗体疗法的患者的鉴定和分层。ctDNA标记(包括NOTCH1、BRCA2、BRCA2、PIK3CA、和NFE2L2)中的若干种突变可以在患有肺癌或膀胱癌的受试者的初步筛选时鉴定，并将所述受试者鉴定为对用抗PD-L1抗体进行治疗的可能反应者。
此外，数据表明，在进行抗PD-L1抗体疗法期间或该疗法完成后，当该疗法诱导总ctDNA突变负荷减少或平均VAF降低时，该疗法与更高可能性的积极结局(增加的OS和PFS)相关。
其他实施例
从前述说明中将清楚地是可以对在此所述的发明作出变更和修改以使其适应于各种用途和状况。此类实施例也在以下权利要求的范围内。
在此变量的任何定义中对要素清单的叙述包括将所述变量定义为任何单个要素或所列要素的组合(或亚组合)。本文的实施例的叙述包括为任何单个实施例的实施例或与任何其他实施例或其部分组合的实施例。
本说明书中提及的全部专利和出版物通过引用以与如同每份单独的专利和出版物具体地且单个地指出通过引用结合相同的程度结合在此。
序列表
Figure BDA0002214488090000271
Figure IDA0002362519590000011

Claims (55)

1.一种治疗方法，其包括向被鉴定为患有癌症的患者给予抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，所述癌症表达一个或多个循环肿瘤DNA(ctDNA)标记中的突变，这些标记包括BRCA1、BRCA2、PIK3CA、NFE2L2、NOTCH1、SMAD4、ARID1A、APC、或KRAS。
2.如权利要求1所述的方法，其中该癌症选自肺癌、膀胱癌和头颈癌。
3.如权利要求2所述的方法，其中该癌症是肺癌并且该一个或多个ctDNA标记中的突变包括BRCA1、BRCA2、NFE2L2、PIK3CA、或NOTCH1。
4.如权利要求2所述的方法，其中该癌症是肺癌并且该一个或多个ctDNA标记中的突变包括BRCA2和NFE2L2。
5.如权利要求3所述的方法，其中该肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。
6.如权利要求2所述的方法，其中该癌症是膀胱癌并且该一个或多个ctDNA标记中的突变包括BRCA1、BRCA2、ARID1A、APC、PIK3CA、或NOTCH1。
7.如权利要求1所述的方法，其中该抗PD-L1抗体是度伐鲁单抗。
8.一种治疗方法，其包括向被鉴定为患有癌症的患者给予度伐鲁单抗或其抗原结合片段，所述癌症表达一个或多个ctDNA标记中的突变，这些标记包括BRCA1、BRCA2、PIK3CA、NFE2L2、NOTCH1、SMAD4、ARID1A、APC、或KRAS。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中该患者被鉴定为对度伐鲁单抗有反应。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中该患者被进一步鉴定为具有表达PD-L1的肿瘤。
11.如权利要求5所述的方法，其中该NSCLC选自下组，该组由以下组成：鳞状细胞癌、非鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌、腺鳞癌和肉瘤样癌。
12.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中给予至少约0.1、约0.3、约1、约3、约10、或约15mg/kg度伐鲁单抗、或其抗原结合片段。
13.如权利要求12所述的方法，其中给予约1mg/kg度伐鲁单抗、或其抗原结合片段。
14.如权利要求12所述的方法，其中给予约3mg/kg度伐鲁单抗、或其抗原结合片段。
15.如权利要求12所述的方法，其中给予约10mg/kg度伐鲁单抗、或其抗原结合片段。
16.如权利要求12所述的方法，其中给予约15mg/kg度伐鲁单抗、或其抗原结合片段。
17.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中约每14天或每21天重复该给予。
18.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中给予至少两个剂量。
19.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中给予至少三个剂量。
20.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中给予至少四个剂量。
21.一种用于表征患者的癌症对抗PD-L1抗体治疗的反应性的方法，该方法包括：
检测在第一时间点取自该患者的第一血浆样品中ctDNA中的变体等位基因频率，
检测至少在第二时间点取自该患者的至少第二血浆样品中ctDNA中的变体等位基因频率，以及
确定该第一和该至少第二血浆样品之间ctDNA中变体等位基因频率的差异，
其中该至少第二血浆样品中变体等位基因频率相对于该第一血浆样品的减少表征该癌症对抗PD-L1抗体治疗有反应。
22.如权利要求21所述的方法，其进一步包括在从该患者体内取出第一血浆样品后向该患者给予该抗PD-L1抗体。
23.如权利要求21所述的方法，其中该ctDNA中的变体等位基因频率由该第一样品和该至少第二样品中的总突变计数确定。
24.如权利要求21所述的方法，其中该ctDNA中的变体等位基因频率由该第一样品和该至少第二样品中的平均变体等位基因频率确定。
25.如权利要求24所述的方法，其进一步包括检测该肿瘤中的PD-L1表达。
26.一种确定抗PD-L1治疗性抗体治疗在患有肺癌或膀胱癌的患者中的功效的方法，该方法包括：
检测在第一时间点取自该患者的第一血浆样品中ctDNA中的变体等位基因频率，
在获得该第一血浆样品后向该患者给予抗PD-L1治疗性抗体，
给予该抗PD-L1治疗性抗体后，检测至少在第二时间点取自该患者的至少第二血浆样品中ctDNA中的变体等位基因频率，以及
确定该第一和该至少第二血浆样品之间ctDNA中变体等位基因频率的差异，
其中该至少第二血浆样品中变体等位基因频率相对于该第一血浆样品的减少鉴定该抗PD-L1抗体治疗是有效的。
27.如权利要求26所述的方法，其中该ctDNA中的变体等位基因频率由该第一样品和该至少第二样品中的总突变计数确定。
28.如权利要求26所述的方法，其中该ctDNA中的变体等位基因频率由该第一样品和该至少第二样品中的平均变体等位基因频率确定。
29.一种鉴定患有对抗PD-L1抗体有反应的癌症的患者的方法，该方法包括检测一个或多个循环肿瘤DNA(ctDNA)标记中的突变的表达，这些标记包括BRCA1、BRCA2、PIK3CA、NFE2L2、NOTCH1、SMAD4、ARID1A、APC、或KRAS。
30.如权利要求29所述的方法，其中该癌症选自肺癌、膀胱癌和头颈癌。
31.如权利要求30所述的方法，其中该癌症是肺癌并且该一个或多个ctDNA标记中的突变包括BRCA1、BRCA2、NFE2L2、PIK3CA或NOTCH1。
32.如权利要求30所述的方法，其中该癌症是肺癌并且该一个或多个ctDNA标记中的突变包括BRCA2和NFE2L2。
33.如权利要求31所述的方法，其中该肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。
34.如权利要求30所述的方法，其中该癌症是膀胱癌并且该一个或多个ctDNA标记中的突变包括BRCA1、BRCA2、ARID1A、APC、PIK3CA、或NOTCH1。
35.如权利要求29所述的方法，其中该抗PD-L1抗体是度伐鲁单抗。
36.如权利要求33所述的方法，其中该NSCLC选自下组，该组由以下组成：鳞状细胞癌、非鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌、腺鳞癌和肉瘤样癌。
37.一种治疗被鉴定为患有癌症的患者的方法，该方法包括：
检测在第一时间点取自该患者的第一血浆样品中一个或多个ctDNA标记中的变体等位基因频率，
在获得该第一血浆样品后向该患者给予抗PD-L1治疗性抗体，
给予该抗PD-L1治疗性抗体后，检测至少在第二时间点取自该患者的至少第二血浆样品中一个或多个ctDNA标记中的变体等位基因频率，以及
确定该第一和该至少第二血浆样品之间一个或多个ctDNA标记中变体等位基因频率的差异，
其中该至少第二血浆样品中变体等位基因频率相对于该第一血浆样品的减少鉴定该抗PD-L1抗体治疗是有效的，并且其中该一个或多个循环肿瘤DNA(ctDNA)标记包括BRCA1、BRCA2、PIK3CA、NFE2L2、NOTCH1、SMAD4、ARID1A、APC、或KRAS。
38.如权利要求37所述的方法，其中该癌症选自肺癌、膀胱癌和头颈癌。
39.如权利要求38所述的方法，其中该癌症是肺癌并且该一个或多个ctDNA标记中的突变包括BRCA1、BRCA2、NFE2L2、PIK3CA或NOTCH1。
40.如权利要求39所述的方法，其中该癌症是肺癌并且该一个或多个ctDNA标记中的突变包括BRCA2和NFE2L2。
41.如权利要求39所述的方法，其中该肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。
42.如权利要求38所述的方法，其中该癌症是膀胱癌并且该一个或多个ctDNA标记中的突变包括BRCA1、BRCA2、ARID1A、APC、PIK3CA、或NOTCH1。
43.如权利要求37所述的方法，其中该抗PD-L1抗体是度伐鲁单抗。
44.如权利要求37至43中任一项所述的方法，其中该患者被进一步鉴定为具有表达PD-L1的肿瘤。
45.如权利要求41所述的方法，其中该NSCLC选自下组，该组由以下组成：鳞状细胞癌、非鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌、腺鳞癌和肉瘤样癌。
46.如权利要求37至45中任一项所述的方法，其中给予至少约0.1、约0.3、约1、约3、约10、或约15mg/kg度伐鲁单抗、或其抗原结合片段。
47.如权利要求46所述的方法，其中给予约1mg/kg度伐鲁单抗、或其抗原结合片段。
48.如权利要求46所述的方法，其中给予约3mg/kg度伐鲁单抗、或其抗原结合片段。
49.如权利要求46所述的方法，其中给予约10mg/kg度伐鲁单抗、或其抗原结合片段。
50.如权利要求46所述的方法，其中给予约15mg/kg度伐鲁单抗、或其抗原结合片段。
51.如权利要求37至45中任一项所述的方法，其中约每14天或每21天重复该给予。
52.如权利要求37至45中任一项所述的方法，其中给予至少两个剂量。
53.如权利要求37至45中任一项所述的方法，其中给予至少三个剂量。
54.如权利要求37至45中任一项所述的方法，其中给予至少四个剂量。
55.一种治疗患有癌症的患者的方法，该方法包括：
通过检测一个或多个循环肿瘤DNA(ctDNA)标记中的突变的表达，鉴定该患者是否将对抗PD-L1抗体有反应，这些标记包括BRCA1、BRCA2、PIK3CA、NFE2L2、NOTCH1、SMAD4、ARID1A、APC、或KRAS；以及
如果该一个或多个ctDNA标记不表达，则用抗PD-L1抗体以外的疗法治疗该患者。
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