CN110913896A - 肿瘤中hla等位基因的分析及其用途 - Google Patents

肿瘤中hla等位基因的分析及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN110913896A
CN110913896A CN201880047010.7A CN201880047010A CN110913896A CN 110913896 A CN110913896 A CN 110913896A CN 201880047010 A CN201880047010 A CN 201880047010A CN 110913896 A CN110913896 A CN 110913896A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hla
tumor
neoantigen
lost
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201880047010.7A
Other languages
English (en)
Inventor
C.斯万顿
N.麦克格拉纳汉
R.罗森塔尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University College London
Cancer Research Technology Ltd
Francis Crick Institute Ltd
Original Assignee
University College London
Cancer Research Technology Ltd
Francis Crick Institute Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB1711349.9A external-priority patent/GB201711349D0/en
Priority claimed from GBGB1716079.7A external-priority patent/GB201716079D0/en
Application filed by University College London, Cancer Research Technology Ltd, Francis Crick Institute Ltd filed Critical University College London
Publication of CN110913896A publication Critical patent/CN110913896A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4612—B-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4615—Dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4622—Antigen presenting cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4641—Fungal antigens, e.g. Trichophyton, Aspergillus or Candida
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464401—Neoantigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2833—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2535/00—Reactions characterised by the assay type for determining the identity of a nucleotide base or a sequence of oligonucleotides
    • C12Q2535/101—Sanger sequencing method, i.e. oligonucleotide sequencing using primer elongation and dideoxynucleotides as chain terminators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
    • C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
    • C12Q2537/165—Mathematical modelling, e.g. logarithm, ratio

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及测定受试者的肿瘤中HLA等位基因是否丧失的方法，其中所述方法包括测定所述肿瘤中所述HLA等位基因的特异性拷贝数的步骤。本发明还涉及用于治疗受试者的癌症的方法，其包括靶向新抗原(neoantigen)，所述新抗原预测由HLA等位基因编码的HLA分子呈递，所述HLA等位基因已经测定为在所述受试者的肿瘤中尚未丧失。

Description

肿瘤中HLA等位基因的分析及其用途
发明领域
本发明涉及用于测定HLA等位基因在受试者中的肿瘤中是否丧失的方法，其中所述方法包括测定所述肿瘤中所述HLA等位基因的特异性拷贝数的步骤。本发明还涉及用于治疗受试者中的癌症的方法，其包括靶向新抗原(neoantigen)，所述新抗原预测由HLA等位基因编码的HLA分子呈递，所述HLA等位基因已经测定为在所述受试者中的肿瘤中尚未丧失。
发明背景
免疫逃避代表癌症的标志。癌细胞采用多种机制逃避免疫系统，以避免T细胞识别。癌症免疫疗法目的是通过在有利于免疫激活的方向上改变平衡来消除此免疫逃避，实现癌细胞消除。然而，仅小部分患者受益于免疫疗法，强调鉴定支持免疫逃避的基因组和分子决定因素的需要。
发明概述
免疫的一个重要方面是人类白细胞抗原(HLA)系统。HLA基因编码将抗原呈递给免疫系统的蛋白质。
这些HLA基因的下调可导致抗原呈递减少，从而促进免疫逃逸。已发现以免疫组织化学为特征的HLA下调在一批癌症类型中普遍存在，并且也已经与不良结果联系起来。母本或父本HLA单元型的丧失也可以影响免疫疗法的功效。
然而，由于HLA基因座的多态性性质阻止测序读段与人类参考基因组的比对和拷贝数的推断，因此尚未系统地探讨HLA单元型丧失对抗肿瘤免疫、克隆扩充和新抗原预测的影响。HLA基因座的这种多态性性质代表了测定特定HLA丧失的基于序列的方法的障碍。实际上，过去使用的先前方法已经使用抗体来检测HLA类型，参见例如Hiraki et al.(Anticancer Research 24:1525-1528,2004)，其中使用一组单克隆抗体分析等位基因特异性HLA I类表达。此类方法显然是劳动密集型的并且昂贵的，并且对于大规模使用或在诊所中并不有效。
本发明人已经开发出克服了当前的基于序列的方法固有的局限性的方法，该基于序列的方法无法测定特异性的HLA拷贝数概况。本发明允许测定哪些特定的HLA等位基因可能已经丧失。
因此，本发明对本领域提供了重要的贡献，因为它有助于简单、快速、方便和准确测定HLA特异性拷贝数丧失，这可以常规地并在临床环境中使用。与基于实验室的方法相比，本发明是更小劳动密集型并且更加成本有效的，并且提供了额外的优势，即可以使用来自患者肿瘤的历史测序信息，从而患者无需进行第二次活组织检查。
因此，在本发明之前，尚不可能在癌症背景下分析HLA丧失的普遍性和复杂性。现有方法不能推断出肿瘤中HLA基因座的单元型特异性拷贝数。当设计靶向癌症环境中的新抗原的疗法时，重要的是以高度确定性知道HLA等位基因是否已经丧失，以便靶向实际上呈递给免疫系统的新抗原。先前的方法不能进行此类测定。
现在，本发明提供了用于测定HLA等位基因在肿瘤中是否丧失的准确方法。至关重要的是，该方法允许特异性测定每个HLA基因处的哪个HLA等位基因经受丧失。该方法使得能够准确测定肿瘤内的HLA等位基因概况，这有助于设计靶向癌症中新抗原的改良疗法。
重要的是，能够测定特定HLA等位基因的拷贝数，以设计靶向预测由存在的HLA等位基因编码的特定HLA分子呈递的新抗原的疗法。重要的是知道哪个特定的HLA等位基因类型丧失，而且还知道肿瘤中存在哪种特定HLA等位基因类型，以便可以将疗法设计为靶向由存在的该特定HLA等位基因编码的HLA分子呈递的新抗原。本发明提供了用于测定受试者中特定HLA等位基因拷贝数丧失的改进方法。
本领域已知的方法(例如Polysolver)仅测定由突变得到的功能性HLA丧失，并且不评估拷贝数丧失。例如，在设计疗法时测定拷贝数丧失而不是由突变得到的功能丧失是有利的，因为由突变得到的功能丧失仅发生在很小百分比的肿瘤中，而拷贝数丧失发生在大得多(40％)的肿瘤中(例如参见本文的图4，还参见McGranahan et al.Cell 171:1259-1271 2017和Shukla et al.Nature Biotechnology 33:1152-1158 2015)。
本发明还提供了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括靶向新抗原，所述新抗原预测由HLA等位基因编码的HLA分子呈递，所述HLA等位基因已经测定为在肿瘤中尚未丧失。
附图简述
图1：用于推断肿瘤中HLA I类等位基因特异性拷贝数的LOHHLA的概述和验证。A)LOHHLA算法的示意图。B)比较ASCAT和LOHHLA的次要等位基因拷贝数。C)维恩图(Venndiagram)，显示了LOHHLA和ASCAT比较，以推断HLA基因座处的等位不平衡。D)维恩图，显示了LOHHLA和ASCAT比较，以推断HLA基因座处的LOH。
图2：LOHHLA和ASCAT的比较，与图1相关。A)显示ASCAT主要拷贝数和LOHHLA主要拷贝数的比较的图。B-C)就等位不平衡(B)和LOH(C)而言，一致和不一致的肿瘤区域的汇总。D)显示ASCAT如何不能直接推断HLA拷贝数或哪个HLA等位基因经受丧失的示意图。相比之下，LOHHLA使用覆盖HLA基因的SNP直接推断HLA拷贝数。
图3：使用片段分析验证LOHHLA，与图1相关。A)对于CRUK0010中的种系以及肿瘤区R1和R2使用Applied Biosystems软件GeneMapper v5得到的每个等位基因的曲线下面积。B)使用式(At/Bt)/(An/Bn)测定的标准化等位比率。值得注意的是，R1区显示等位不平衡和可能地LOH的明确证据，而R2区似乎与种系相似。C)显示LOH和等位不平衡的肿瘤区的标准化等位比率；无LOH，但等位不平衡；或无LOH或通过LOHHLA分类的等位不平衡。值得注意的是，具有高标准化等位比率的离群肿瘤已经通过LOHHLA分类为表现出镜像亚克隆等位不平衡(mirrored subclonal allelic imbalance)。D)肿瘤区的标准化等位比率，显示LOH和等位不平衡；无LOH但等位不平衡；或无LOH或通过ASCAT分类的等位不平衡。肿瘤区的标准化等位比率，显示LOH和等位不平衡；无LOH但等位不平衡；或无LOH或通过TITAN(E和G)和Sequenza(F和H)分类的等位不平衡，P值对应于Wilcoxon秩和检验。
图4：NSCLC中HLA LOH的频率和时机(A)。显示了在HLA基因座处表现出HLA非同义突变、HLA等位不平衡或LOH的TRACERx患者的总数。(B)在NSCLC中通过亚型鉴定的HLA等位不平衡和HLA LOH的比例。使用Fisher精确检验来检验富集显著性。
图5：NSCLC中HLA LOH的频率和时机(A-B)。饼图显示了使用肺腺癌(A)肺鳞状细胞癌(B)的多区域信息的HLA LOH事件的时机。若在所考虑的每个区域中发现个别HLA A/B/C基因座处的事件，则认为它们是克隆的，并且若仅在一部分肿瘤区中发现它们，则认为是亚克隆的。若在患者中丧失的所有个别基因座以克隆发生，则认为该患者样品具有克隆HLALOH。没有显示两个肺鳞状细胞癌患者，他们仅具有可用于拷贝数分析的单一区域。
图6：NSCLC中HLA LOH的频率和时机。已经用HLA LOH事件的最可能的时机注释显示HLA LOH证据的每个肺腺癌肿瘤的系统发生树。星号指示HLA LOH不可行的纯合HLA等位基因。系统发育树的簇指示为克隆(蓝色)或亚克隆(红色)的。若HLA LOH事件未定位到系统发育树上的可能克隆，则包括一个额外的灰色亚克隆。
图7：NSCLC中HLA LOH的频率和时机；已经用HLA LOH事件的最可能的时机注释显示HLA LOH证据的每个肺鳞状细胞癌肿瘤的系统发生树。星号指示HLA LOH不可行的纯合HLA等位基因。系统发育树的簇指示为克隆(蓝色)或亚克隆(红色)的。若HLA LOH事件未定位到系统发育树上的可能克隆，则包括一个额外的灰色亚克隆。(G)可获得成对的原发性/脑转移测序数据的NSCLC患者数目，显示无HLA LOH(灰色)，原发性肿瘤和脑转移两者中的HLA LOH(绿色)，仅原发性肿瘤中的HLA LOH(红色)，或仅脑转移中的HLA LOH(蓝色)。认为具有原发性肿瘤和每个脑转移两者中的HLA基因座间一致鉴定的HLA LOH的患者具有克隆性HLA LOH。认为具有经受LOH的不一致HLA基因座的患者或仅在原发性或脑转移样品中鉴定的HLA LOH的患者具有亚克隆HLA LOH。(H)显示了HLA LOH事件的时机。克隆HLA LOH事件在原发性肿瘤样品和脑转移两者中均发生(绿色)，而亚克隆HLA LOH事件在脑转移中产生(蓝色)，或者已经在未播种脑转移的原发性肿瘤亚克隆中发生(红色)。总体上，与原发性肿瘤相比，在脑转移样品中观察到HLA LOH升高(27％至43％)，而在未表现出HLA LOH的脑转移样品中观察到相应的降低(73％至57％)。
图8：HLA LOH反映了NSCLC中的选择。肺腺癌(A)和肺鳞状细胞癌(B)的局部LOH频率。局部LOH定义为<75％的染色体臂。箭头指示HLA基因座的位置。使用模拟，水平虚线描绘p＝0.05时的显著局部LOH。克隆LOH显示为蓝色，亚克隆LOH显示为红色。染色体臂LOH和局部亚克隆LOH在图11中显示。(C)HLA LOH的平行进化，在系统发生树上显示等位基因特异性HLA丧失。
图9：基因组间的臂水平和局部亚克隆LOH，与图8相关。A-B)肺腺癌(A)和肺鳞状细胞癌(B)的基因组间的臂水平LOH。臂水平LOH定义为染色体臂的>75％。箭头指示HLA基因座的位置。使用模拟，水平虚线描绘p＝0.05时的显著局部LOH。克隆LOH显示为蓝色，亚克隆LOH显示为红色。C-D)肺腺癌(C)和肺鳞状细胞癌(D)的基因组间的局部亚克隆LOH。局部LOH定义为染色体臂的<75％。箭头指示HLA基因座的位置。
图10：非同义突变负荷与HLA LOH相关并且新抗原更频繁结合丧失的等位基因。(A)在肺腺癌(浅蓝色)和肺鳞状细胞癌(品红色)的不同类别的HLA LOH间绘制非同义突变的总数。可以将肿瘤分类为没有HLA LOH，具有任何HLA LOH事件，而不考虑事件的时机，具有亚克隆HLA LOH或克隆HLA LOH。最低的总非同义突变四分位数以红色虚线指示，并且具有总非同义突变负荷的肿瘤的比例大于或小于由每个HLA LOH分类组的饼图指示的。(B)在肺腺癌(浅蓝色)和肺鳞状细胞癌(品红色)的不同类别的HLA LOH间绘制了克隆非同义突变数目。最低的克隆非同义突变四分位数以红色虚线指示，并且具有克隆非同义突变负荷的肿瘤的比例大于或小于由每个HLA LOH分类组的饼图指示的。(C)在肺腺癌(浅蓝色)和肺鳞状细胞癌(品红色)的不同类别的HLA LOH间绘制了亚克隆非同义突变的数目。最低的亚克隆非同义突变四分位数用红色虚线指示，并且具有亚克隆非同义突变负荷的肿瘤比例大于或小于由每个HLA LOH分类组的饼图指示的。(D)与来自没有HLA LOH的备选分支的克隆中的非同义突变的数目相比在含有HLA LOH事件的克隆中发现的非同义突变的数目。(E)对于所有表现出HLA LOH的NSCLC肿瘤，所有具有HLA LOH的肺腺癌肿瘤以及所有具有HLA LOH的肺鳞状肿瘤，指示预测与丧失的HLA等位基因或保留的HLA等位基因结合的亚克隆新抗原的数目。使用配对的wilcoxon检验计算p值。(F)对于所有具有至少一个HLA LOH事件的患者显示了预测导致针对丧失的等位基因的结合剂的突变总数。突变克隆性也指示为克隆(浅蓝色)或亚克隆(浅红色)的。
图11：与图10相关的新抗原和区域性LOH关联。
图12：与图10相关的标签(signature)LOH关联。
图13：A)来自具有克隆HLA LOH，亚克隆HLA LOH和无观察到的HLA LOH的肿瘤的FFPE诊断块上的抗PD-L1染色。描绘了基于免疫细胞的染色和肿瘤细胞染色。(B)显示了来自两种代表性肿瘤的染色，一种无HLA LOH的肿瘤和一种具有克隆HLA LOH的肿瘤。(C)对于已发表的免疫微环境测量和标签，显示了在所有基因座上含有HLA LOH事件的肿瘤和没有任何HLA LOH事件的肿瘤之间的中值的对数比率。以红色表示具有HLA LOH的免疫测量的增加，并且以蓝色指示降低。星号(*)指示比较HLA LOH组之间免疫测量分布的FDR(q)值。还参见表S1。
图14：TCGA数据中的HLA等位不平衡和HLA LOH的关联。(A)在NSCLC中通过亚型鉴定的HLA等位不平衡和HLA LOH的比例。使用Fisher精确检验来检验富集显著性。(B)在肺腺癌(浅蓝色)和肺鳞状细胞癌(品红色)的不同类别的HLA LOH间绘制非同义突变总数。肿瘤可以分类为没有HLA LOH，在HLA-A、HLA-B或HLA-C基因座处具有HLA LOH，或者在所有HLA I类三个基因座处具有HLA LOH。最低的总非同义突变四分位数以红色虚线指示，并且具有总非同义突变负荷的肿瘤比例大于或小于由每个HLA LOH分类组的饼图指示的。(C)对于肺腺癌(浅蓝色)和肺鳞状细胞癌(品红色)，显示了细胞溶解活性(CYT)得分，定义为以转录物/百万(transcripts per million，TPM)计的GZMA和PRF1表达的对数平均值(几何平均值)。
图15：NSCLC中HLA等位基因特异性丧失的模型。模型显示了HLA LOH如何导致肿瘤中的免疫逃逸。在肿瘤进化期间，新抗原的积累可以诱导局部免疫浸润物，包括CD8 T细胞。局部免疫浸润物作用为肿瘤的选择屏障。可以选择具有HLA LOH的亚克隆，因为这些可以通过避免CD8 T细胞识别来逃避杀伤。或者，其他亚克隆可通过释放免疫抑制分子来逃避杀伤。
图16：LOHHLA用于推断肿瘤中HLA II类等位基因特异性拷贝数的应用。A)用于HLA-DRB1等位基因的LOHHLA的等位基因特异性比对。B)两个HLA DRB1等位基因的等位基因特异性logR比率，C)在鉴定的杂合位置处，logR的配对差异。D)HLA DRB1等位基因特异性拷贝数。值得注意的是，HLA DRB1:01:01:01鉴定为以0拷贝存在，指示HLA丧失事件。
发明详述
本发明提供了用于测定HLA等位基因在肿瘤中是否丧失的方法。HLA表达的知识可以为靶向特定抗原(诸如如本文所述的新抗原)的疗法的设计提供信息，所述特定抗原预测由尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递，即避免设计靶向不会被呈递给免疫系统，并且不会引起对肿瘤的免疫应答的新抗原的疗法。
用于测定HLA等位基因在肿瘤中是否丧失的方法
在一方面，本发明提供了用于测定HLA等位基因是否在肿瘤中丧失的方法，其中所述方法包括测定来自所述肿瘤的样品中所述HLA等位基因的特异性拷贝数的步骤。如本文所讨论的，本发明实现了测定肿瘤中特定HLA等位基因拷贝数的有效方法，并且这代表了该方法中的重要步骤。
该方法可以对来自受试者的肿瘤样品的序列信息进行。在一方面，该方法可以对来自受试者的肿瘤样品的HLA序列信息进行。
如本文所用，“丧失”是指HLA等位基因的拷贝数丧失或缺失，而不是由于突变导致的功能丧失。
与例如仅分析肿瘤中HLA等位基因的比率或等位不平衡相反，测定HLA等位基因特异性拷贝数对于产生关于肿瘤中HLA等位基因丧失的更高水平确定性是重要的。基于以下事实预测本发明：鉴于肿瘤中HLA丧失的令人惊讶的普遍性和复杂性，重要的是测定HLA等位基因特异性拷贝数，以设计更可能靶向被呈递给免疫系统的新抗原的疗法。根据本发明的方法首次使得能够分析肿瘤中的HLA等位基因特异性拷贝数，从而准确测定特定的HLA等位基因是否已经丧失。
在一方面，根据本发明的方法可以包括以下步骤中的一个或多个：
(i)将来自受试者的肿瘤样品的HLA等位基因序列信息与基于所述受试者的HLA类型的HLA等位基因参考序列进行比对；
(ii)测定同源HLA等位基因中的错配位置，并测定每个HLA等位基因的错配覆盖；
(iii)基于步骤(ii)中测定的错配和覆盖测定每个HLA等位基因的比率和等位基因频率；
(iv)基于步骤(iii)中测定的比率和等位基因频率测定所述肿瘤样品中每个HLA等位基因的拷贝数。
本领域技术人员将知晓进行此类步骤的方式。
例如，步骤(i)中提到的序列信息可以通过标准核酸测序方法获得。我们参考例如Mardis,2013 Annu.Rev.Anal.Chem.6:287-303。
用于测定HLA类型的方法在本领域中也是已知的，例如，如Shukla,2016 NatureBiotechnology 33,1152-1158；Szolek,2014 Bioinformatics 30,3310-3316.；和Warren,2012 Genome Medicine 4,95中所述。
个体的HLA概况可以通过HLA血清分型和/或HLA基因测序来测定。使用单特异性引物PCR(SSP-PCR)进行HLA表型分型是测定个体HLA概况的备选策略。可以通过对HLA基因座进行测序和处理，例如使用Optitype预测算法来测定HLA类型来测定个体的HLA概况。
在一方面，步骤(i)可以根据如实施例1中所列的方法进行，即包括第一和第二生物信息学步骤。因此，以上步骤(i)可以包括提取HLA读段并创建HLA等位基因特异性BAM文件。
步骤(ii)可以使用Smith-Waterman算法或Biostrings R程序包进行。
步骤(iii)可以使用本领域已知的方法进行，例如如Li 2009 Bioinformatics25,2078-2079和Li 2011 Bioinformatics 27,2987-2993(SAMtools)中所述。“覆盖”是指已经测定序列的次数。这是本发明技术领域中的标准术语，并且是本领域技术人员理解的。
步骤(iv)可以使用本领域抑制的方法进行，通过考虑肿瘤纯度和/或倍性来推断特异性拷贝数状态，例如通过ASCAT(Van Loo 2010,PNAS 107,16910-16915)，FACETs(Shen2016,Nucleic Acids Res 44,e131.)。“肿瘤纯度”是指已测序的样品中癌细胞相对于其他细胞的比例。“肿瘤倍性”是指细胞具有的基因组拷贝(或染色体组)的数目。
HLA等位基因特异性拷贝数的测定使得能够测定HLA等位基因是否已经在肿瘤中丧失。
根据本发明的方法允许推断HLA基因座的HLA单元型特异性拷贝数，并且因此推断哪种特定的HLA单元型可以在肿瘤中经受丧失。
在一方面，该方法可以如本文实施例中所述进行。
样品
如本文所指，“种系”样品是指非肿瘤样品，例如来自受试者的血液样品、组织样品或外周血单个核细胞。
在一方面，样品可以是血液样品。样品可以含有血液级份(例如血清样品或血浆样品)或可以是全血。从受试者收集样品的技术是本领域公知的。
如本文所提及，“肿瘤样品”是指自肿瘤衍生或获得的样品。肿瘤可以是实体瘤或非实体瘤或血液肿瘤。
从肿瘤中分离活组织检查和样品是本领域的常规实践，并且可以根据任何合适的方法进行，并且此类方法对于本领域技术人员而言是已知的。
肿瘤样品可以是原发性肿瘤样品、肿瘤相关的淋巴结样品或来自受试者转移部位的样品。
在某些实施方案中，样品是与肿瘤相关的体液或组织。
合适地，样品可以是循环肿瘤DNA、循环肿瘤细胞或包含肿瘤DNA的外来体。循环肿瘤DNA、循环肿瘤细胞或包含肿瘤DNA的外来体可以使用本领域已知的方法从自受试者获得的血液样品中分离。
肿瘤样品和非癌性组织样品可以根据本领域已知的任何方法获得。例如，可以从已经经历切除的癌症患者获得肿瘤和非癌性样品，或者它们可以通过使用皮下针提取，通过显微解剖或通过激光捕获获得。对照(非癌性)样品可以例如从尸体供体或健康供体中获得。ctDNA和循环肿瘤细胞可以根据例如Nature.2017Apr 26；545(7655):446-451或Nat Med.2017Jan；23(1):114-119从血液样品中分离。
可以使用本领域已知的方法从样品中分离适合于下游测序的DNA和/或RNA。例如，可以使用基于酚的提取来进行DNA和/或RNA的分离。基于酚的试剂含有变性剂和RNA酶抑制剂的组合以破坏细胞和组织，并随后分离DNA或RNA与污染物。例如，可以使用提取程序，诸如使用DNAzolTM、TRIZOLTM或TRI REAGENTTM的那些提取程序。可以使用固相提取方法(例如旋转柱)，例如PureLinkTM Genomic DNA Mini Kit或QIAGEN RNeasyTM方法进一步分离DNA和/或RNA。可使用本领域已知的方法(RT-PCR)将分离的RNA转化为cDNA以用于下游测序。
在一方面，获得并且分析超过一个样品，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个样品。
在一方面，可以有必要测试来自原发肿瘤部位和一个或多个转移部位的样品。在一方面，来自原发性肿瘤部位的样品可以不代表转移部位处的癌细胞。因此，本文所述的本发明的方法和用途可涉及测定肿瘤的原发和转移部位两者处的HLA丧失。
HLA和新抗原呈递
人类白细胞抗原(HLA)系统是一种编码人类主要组织相容性复合体(MHC)蛋白的基因复合体。这些细胞表面蛋白调节人类的免疫系统。HLA基因复合体位于6p21号染色体内3Mbp的段上。HLA基因高度多态，这意味着它们具有许多不同的等位基因，从而使它们能够精确调节适应性免疫系统。在每个HLA基因座上，可能有成千个可能的等位基因，例如Shiina et al.Journal of Human Genetics(2009)54,15–39中描述的。
如本文所用，术语“HLA等位基因”旨在指HLA基因座处的任何等位基因。
对应于MHC I类的HLA(A、B和C)从细胞内部呈递多肽。这些肽从在蛋白酶体中分解的消化蛋白质产生。通常，这些肽是小的聚合物，长度约为8-11个氨基酸。I类MHC呈递的外源抗原吸引破坏细胞的杀伤性T细胞。
在一方面，本发明涉及HLA I类，因为来自癌性细胞内的肽可以通过MHC I类蛋白呈递在细胞表面上。
如本文所述，在本发明的一方面，HLA是I类HLA。在一方面，HLA是HLA-A。在一方面，HLA是HLA-B。在一方面，HLA是HLA-C。在一方面，HLA是选自HLA-A、HLA-B和HLA-C的I类HLA。
HLA I类还包括HLA-E、HLA-F和HLA-G。
对应于II类MHC的HLA(DP、DM、DOA、DOB、DQ和DR)将抗原从细胞外呈递给T淋巴细胞。MHC II类分子通常存在于抗原呈递细胞中，例如树突细胞、单核吞噬细胞、一些内皮细胞，胸腺上皮细胞和B细胞。这些细胞在启动免疫应当中是重要的。干扰素γ也可以对其他细胞诱导这些分子。
在一方面，HLA可以是II类HLA，例如选自HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ和HLA-DR。在一方面，HLA是HLA-DP。在一方面，HLA是HLA-DM。在一方面，HLA是HLA-DOA。在一方面，HLA是HLA-DOB。在一方面，HLA是HLA-DQ。在一方面，HLA是HLA-DR。
用于HLA分型的方法是本领域已知的，例如如本文所述的Polysolver或OptiType。
HLA系统呈递的抗原可以是新抗原。新抗原是一种以前尚未呈递给免疫系统的新形成的抗原。新抗原是肿瘤特异性抗原，其作为癌细胞内突变的结果而产生。因此，新抗原不从健康者(即非肿瘤细胞)表达。可以处理新抗原以产生独特的肽，它们当在MHC分子的背景下呈递时可以被T细胞识别。如本文所述，新抗原可以用作癌症疗法的基础。
鉴定或预测新抗原的方法是本领域已知的，例如，如Nielsen,2016；Hoof,2009；和Hundal,2016中所述。
可以使用本领域已知的方法来预测新抗原与特定MHC分子(由特定HLA等位基因编码)的结合。预测MHC结合的方法的实例包括Lundegaard et al.(Nucleic AcidsRes.2008:W509-12.2008&Bioinformatics.2008 Jun 1；24(11):1397-8)和Shen et al.(Proteome Sci.2013 Nov 7；11(Suppl 1):S15)描述的那些。在本实施例中，使用netMHC和netMHCpan算法预测新抗原的MHC结合。
MHC分子对新抗原肽序列的预测结合亲和力可以低于500nM。“高亲和力”可以表示0至50nM的结合亲和力。在其他实施方案中，可以预测新抗原肽以50至150nM结合亲和力的中间亲和力或150至500nM结合亲和力的低亲和力结合MHC分子。
因此，已经预测与特定MHC分子结合的新抗原预测由所述MHC分子呈递在细胞表面上。
在一方面，本发明提供了用于测定新抗原是否预测为由肿瘤呈递的方法，该方法包括以下步骤：
(i)鉴定肿瘤中的新抗原；和
(ii)测定所述新抗原是否预测为由在所述肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递。
第二个步骤可以通过根据如本文所述的本发明的方法来进行。
在一方面，本发明提供了鉴定用于癌症疗法的靶新抗原的方法，包括以下步骤：
(i)鉴定肿瘤中的新抗原；
(ii)测定所述新抗原是否预测为由所述肿瘤中已经丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递；和
(iii)将预测为由所述肿瘤中已经丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递的新抗原认为作为靶物不重要。
在一方面，提供了鉴定用于癌症疗法的靶新抗原的方法，包括以下步骤：
(i)测定是否肿瘤新抗原预测为由在所述肿瘤中已经丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递；和
(ii)将预测为由所述肿瘤中已经丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递的新抗原认为作为靶物不重要。
新抗原预测为结合超过一个HLA等位基因，其中一个HLA等位基因可以在肿瘤中丧失，而另一个HLA等位基因在肿瘤中未丧失的情况是可能的。在该情况下，新抗原仍可以是癌症疗法的靶物且不需要认为不重要。
因此，上述方法可以包括下述步骤：作为靶物认为不重要的是预测为仅由所述肿瘤中已经丧失的HLA等位基因呈递的新抗原。若新抗原预测为由至少一个在肿瘤中未丧失的HLA等位基因呈递，则它们可以作为靶物保留。
在一方面，提供了鉴定用于癌症疗法的靶新抗原的方法，包括以下步骤：
(i)测定是否肿瘤新抗原预测为由在所述肿瘤中已经丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递；和
(ii)将预测为仅由所述肿瘤中已经丧失的HLA等位基因呈递的新抗原认为作为靶物不重要，其中不将由肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的至少一个HLA分子呈递的新抗原认为作为靶物不重要。
或者，若新抗原预测为由肿瘤中没有丧失的HLA等位基因编码的至少一个HLA分子呈递，则可以将它们鉴定为癌症疗法的靶物。
根据本文的方法鉴定的靶新抗原可以是用于如本文所述的根据本发明的任何治疗方法和相应用途的靶物。
在本文方法的一方面，已经测定尚未丧失的(或在认为新抗原不重要的情况下已经丧失)的HLA等位基因在至少一个来自肿瘤的样品中尚未丧失。在一方面，已经测定所述HLA在来自所述肿瘤的2、3、4、5、6、7、8、9或10个样品中尚未丧失。
靶向新抗原
根据本发明，预测为由测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递的新抗原可以代表在治疗或预防受试者的癌症中的治疗或预防性干预的靶物。
本文中提及“新抗原”旨在还包括源自新抗原的肽。
本发明的方法可以在体外或体内使用，例如用于原位治疗或离体治疗，然后将经处理的细胞施用于受试者。
“靶向新抗原”是指基于此类新抗原的治疗或预防性干预。
下文将对此进行更详细的讨论，但简要地可以包括主动的免疫疗法方法，例如向受试者施用包含新抗原的免疫原性组合物或疫苗。或者，可以采取被动免疫疗法方法，例如过继性T细胞转移或B细胞转移，其中从肿瘤或其他身体组织(包括但不限于淋巴结、血液或腹水)分离识别新抗原的T或B细胞或T和B细胞，离体或体外扩充并且再施用于受试者。
在另一个备选方案中，可以将识别新抗原的抗体施用于受试者。本领域技术人员将理解，若新抗原是细胞表面抗原，则如本文提及的抗体将识别新抗原。在新抗原是胞内抗原的情况下，抗体将识别新抗原肽：MHC复合物。如本文中所提及，“识别”新抗原的抗体涵盖这两种可能性。
因此，在一方面，本发明涉及治疗或预防受试者的癌症的方法，包括对所述受试者施用：
(i)预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递的新抗原；
(ii)识别新抗原的免疫细胞，该新抗原预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递；或者
(iii)识别新抗原的抗体，该新抗原预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递。
在另一方面，本发明提供了预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递的新抗原，用于治疗或预防受试者的癌症。或者，本发明提供了预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递的新抗原在制备用于治疗或预防受试者的癌症的药物中的用途。在另一个备选方案中，本发明提供了预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递的新抗原在治疗或预防受试者的癌症中的用途。
在另一方面，本发明提供了识别新抗原的免疫细胞，优选T细胞，用于治疗或预防受试者的癌症，该新抗原预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递。或者，本发明提供了识别新抗原的免疫细胞，优选T细胞在制备用于治疗或预防受试者的癌症的药物中的用途，该新抗原预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递。在另一个备选方案中，本发明提供了识别新抗原的免疫细胞，优选T细胞在治疗或预防受试者的癌症中的用途，该新抗原预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递。
提及“免疫细胞”旨在涵盖免疫系统的细胞，例如T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞和树突细胞。在一个优选的实施方案中，免疫细胞是如本文所讨论的T细胞。
在另一方面，本发明提供了识别新抗原的抗体，用于治疗或预防受试者的癌症，该新抗原预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递。或者，本发明提供了识别新抗原的抗体在制备用于治疗或预防受试者的癌症的药物中的用途，该新抗原预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递。在另一个备选方案中，本发明提供了识别新抗原的抗体在治疗或预防受试者的癌症中的用途，该新抗原预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递。
在一方面，通过基于序列的方法测定或已经测定特定的HLA等位基因已经丧失。“基于序列的方法”是指涉及遗传序列信息的方法，即例如通过大规模平行测序、深度测序、高通量测序、下一代测序(NGS)、第二代测序或本领域已知的任何合适方法提供遗传序列信息。
在一方面，通过对来自所述受试者的HLA等位基因序列信息进行的基于序列的方法测定或已经测定特定的HLA等位基因已经丧失。该方法可以是如本文所述的根据本发明的方法。
新抗原
“新抗原”是由于癌细胞内的突变产生的肿瘤特异性抗原。因此，受试者中的健康细胞不表达新抗原。
与由野生型健康细胞表达的非突变蛋白相比，本文所述的新抗原可以是由改变由癌细胞表达的蛋白质的任何非沉默突变引起的。例如，突变蛋白可以是易位或融合。
“突变”是指与来自同一个体的健康细胞相比，肿瘤细胞中核苷酸序列(例如DNA或RNA)的差异。核苷酸序列的差异可导致不由来自同一个体的健康细胞表达的蛋白质。
例如，突变可以是单核苷酸变体(SNV)、多个核苷酸变体、缺失突变、插入突变、易位、错义突变或剪接位点突变，其导致氨基酸序列的改变(编码突变)。
可以通过外显子组测序、RNA-seq、全基因组测序和/或靶向基因小组测序和/或打你基因的常规Sanger测序来鉴定突变。合适的方法是本领域已知的。
外显子组测序和RNA-seq的描述分别由Boa et al.(Cancer Informatics.2014；13(Suppl 2):67-82.)和Ares et al.(Cold Spring HarbProtoc.2014 Nov 3；2014(11):1139-48)提供。靶向基因小组测序的描述可以在例如参见Kammermeieret al.(J MedGenet.2014 Nov；51(11):748-55)和Yap KL et al.(Clin Cancer Res.2014.20:6605)。还参见Meyerson et al.,Nat.Rev.Genetics,2010和Mardis,Annu Rev Anal Chem,2013。靶向基因测序小组也可以是商品化的(例如由Biocompare((http://www.biocompare.com/Editorial-Articles/161194-Build-Your-Own-Gene-Panels-with-These-Custom-NG S-Targeting-Tools/)汇总)。
可以使用本领域已知的方法进行序列比对，以鉴定与来自非肿瘤样品的DNA和/或RNA相比来自肿瘤样品的DNA和/或RNA的核苷酸差异(例如SNV)。例如，可以使用由Koboldtet al.(Genome Res.2012；22:568-576)描述的方法进行与参考样品相比的核苷酸差异。参考样品可以是种系DNA和/或RNA序列。
在一方面，新抗原可以是克隆新抗原。
“克隆”新抗原是在整个肿瘤中有效表达并在基本上每个肿瘤细胞内编码的新抗原。“亚克隆”新抗原是在肿瘤中小部分或一定比例的细胞或区域中表达的新抗原。
“在整个肿瘤中存在”、“在整个肿瘤中有效表达”和“在基本上每个肿瘤细胞内编码”可意味着克隆新抗原在分析样品的肿瘤的所有区域中表达。
应当理解，确定“基本上在每个肿瘤细胞内”编码突变指统计学计算，因此经受统计学分析和阈值。
同样，确定克隆新抗原“在整个肿瘤中有效表达”是指统计学计算，因此经受统计学分析和阈值。
在基本上每个肿瘤细胞或基本上所有肿瘤细胞中有效表达意味着突变存在于样品中分析的所有肿瘤细胞中，如使用适当的统计方法所测定的。
举例来说，描述含有突变的癌细胞比例的癌细胞分数(CCF)可用于测定突变是克隆的还是亚克隆的。例如，可以通过将变体等位基因频率与拷贝数和纯度估值整合来测定癌细胞分数，如Landau et al.(Cell.2013 Feb 14；152(4):714-26)所述。
适当地，可以针对在所分析的每个肿瘤区内鉴定的所有突变计算CCF值。若仅使用一个区域(即仅单个样品)，则将仅获得一组CCF值。这将提供关于在该肿瘤区内的所有肿瘤细胞中存在哪些突变的信息，并由此将提供该突变是克隆的还是亚克隆的指示。
如所述，测定克隆突变进行统计学分析和阈值。因此，若测定突变具有CCF 95％置信区间>＝0.75，例如0.80、0.85、0.90、0.95、1.00或>1.00，则可以将它鉴定为克隆的。相反，若测定突变在分析的任何样品中具有CCF95％置信区间<＝0.75，例如0.70、0.65、0.60、0.55、0.50、0.45、0.40、0.35、0.30、0.25、0.20、0.15、0.10、0.05、0.01，则可以将它鉴定为亚克隆的。
应当认识到，通过鉴定从肿瘤分离的超过一个样品的克隆突变增加鉴定克隆突变的方法的准确性。
在一个实施方案中，该方法可以包括鉴定多个，即超过一个克隆新抗原。
在一个实施方案中，克隆新抗原的数目为2-1000。例如，克隆新抗原的数目可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000，例如克隆新抗原的数目可以是2-100。
在一方面，如本文描述的方法可以提供多个T细胞或T细胞群体，即超过一个，其中多个T细胞包含识别克隆新抗原的T细胞和识别不同克隆新抗原的T细胞。因此，该方法提供了识别不同克隆新抗原的多个T细胞。
在一个优选的实施方案中，由多个T细胞识别的克隆新抗原的数目为2-1000。例如，识别的克隆新抗原的数目可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000，例如识别的克隆新抗原的数目可以是2至100。
在一方面，多个T细胞识别相同的克隆新抗原。
在一方面，新抗原可以是如本文所述的亚克隆新抗原。
如上所述，克隆新抗原是在基本上每个肿瘤细胞内编码的新抗原，即编码新抗原的突变存在于基本上每个肿瘤细胞内。然而，如本文所述，可以预测克隆新抗原由在肿瘤中丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递。在此情况下，克隆新抗原实际上可以不呈递于基本上每个肿瘤细胞上。因此，新抗原的呈递可以不是克隆的，即，它不在基本上每个肿瘤细胞内呈递。
如本文所述，在本发明的一方面，预测新抗原呈递于基本上每个肿瘤细胞内(即，新抗原的呈递是克隆的)。
在一方面，预测新抗原不呈递于基本上每个肿瘤细胞内，也就是说，新抗原的呈递是亚克隆的。因此，克隆新抗原可以以亚克隆呈递。
可以使用上文就克隆突变测定而言描述的方法来测定新抗原以克隆还是以亚克隆呈递，也就是说，CCF分数可以备选描述呈递特定新抗原的癌细胞的比例，可以用来测定新抗原的呈递是克隆的还是亚克隆的。
如所述，测定克隆呈递经受统计学分析和阈值。因此，若测定呈递具有CCF 95％置信区间≥0.7，例如0.80、0.85、0.90、0.95、1.00或>1.00，则可以将呈递鉴定为克隆的。相反，若测定呈递在分析的任何样品中具有CCF 95％置信区间<＝0.75，例如0.70、0.65、0.60、0.55、0.50、0.45、0.40、0.35、0.30、0.25、0.20、0.15、0.10、0.05、0.01，则将它鉴定为亚克隆的。
在一方面，新抗原可以是插入/缺失突变(插入/缺失新抗原)的结果。
如本文所指，“插入/缺失突变”是指生物体的核苷酸序列(例如DNA或RNA)中碱基的插入和/或缺失。通常，插入/缺失突变发生在生物体的DNA，优选基因组DNA中。适当地，插入/缺失突变发生在受试者的肿瘤细胞的基因组DNA中。适当地，插入/缺失可以是插入突变。适当地，插入/缺失可以是缺失突变。
适当地，插入/缺失可以是1至100个碱基，例如1至90、1至50、1至23或1至10个碱基。
在一方面，插入/缺失突变可以是移码插入/缺失突变。移码插入/缺失突变是由一个或多个核苷酸的插入或缺失引起的核苷酸序列阅读框中的变化。此类移码插入/缺失突变可产生新的可读框，其通常与受试者的相应健康细胞中非突变DNA/RNA编码的多肽高度不同。
移码突变通常将过早的终止密码子(PTC)引入可读框中，并且将所得的mRNA以无义介导的衰变(nonsense mediated decay，NMD)为目标。
在一方面，插入/缺失移码突变可以是或可以不是以NMD为目标。
在一方面，插入/缺失新抗原是克隆新抗原。即，插入/缺失突变产生克隆插入/缺失新抗原。克隆插入/缺失新抗原可以是移码的，即克隆移码插入/缺失新抗原。
在一方面，插入/缺失是非移码插入/缺失。
新抗原肽
如本文所用，术语“新抗原”旨在涵盖免疫原性的新抗原的任何部分。这可以包括源自新抗原的肽。如本文所提及，“抗原性”分子是本身或其一部分在以合适的方式对免疫系统或免疫细胞呈递时能够刺激免疫应答的分子。
可以使用本领域已知的方法合成新抗原肽。
术语“肽”以通常的含义使用是指通常通过相邻氨基酸的α-氨基和羧基之间的肽键彼此连接的一系列残基，通常为L-氨基酸。该术语包括修饰的肽和合成的肽类似物。
可以使用化学方法(Peptide Chemistry,A practicalTextbook.MikosBodansky,Springer-Verlag,Berlin.)制备肽。例如，可以通过固相技术(Roberge JY et al(1995)Science 269:202-204)合成肽，从树脂上切割，并通过制备型高效液相层析(例如Creighton(1983)Proteins Structures And Molecular Principles,WHFreeman and Co,New York NY)纯化。例如，可以根据制造商提供的说明，使用ABI 43 1A肽合成仪(Perkin Elmer)实现自动合成。
或者，肽可以通过重组方式或通过从作为新抗原或包含新抗原的多肽切割而制备。肽的组成可以通过氨基酸分析或测序(例如，Edman降解程序)来确认。
新抗原肽可以在肽内的任何残基位置处包含癌细胞特异性突变(例如，由单核苷酸变体(SNV)编码的非沉默氨基酸取代)。举例来说，能够结合MHC I类分子的肽的长度通常为7至13个氨基酸。因此，氨基酸取代可以存在于包含13个氨基酸的肽中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13位处。
在另一方面，可以使用更长的肽，例如21-31聚体，并且该突变可以在任何位置处，例如在肽的中心，例如在13、14、15或16位处，也可用于刺激CD4和CD8细胞两者以识别新抗原。
T细胞和T细胞群体
如本文所讨论的，本发明涵盖识别新抗原的T细胞用于提供此类T细胞或其群体的治疗效用，该新抗原预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递。
本发明涵盖一种提供对新抗原特异性的T细胞的方法，该新抗原预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递，其中所述方法包括以下步骤：
i)鉴定预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递的新抗原；和
iv)提供识别所述新抗原的T细胞或T细胞群体。
在一方面，HLA丧失的测定可以通过如本文所述的根据本发明的方法来进行。
如本文所述，在本发明的一方面，可以在从肿瘤分离的多个样品中测定突变。
可以扩充T细胞群体以增加识别或靶向新抗原的T细胞的数目，该新抗原预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递。T细胞的扩充可以使用本领域已知的方法进行。
例如，可以在已知为T细胞提供促有丝分裂刺激物的条件下通过离体培养来扩充T细胞。举例来说，可以将T细胞与细胞因子例如IL-2或与有丝分裂抗体例如抗CD3和/或CD28一起培养。可以将T细胞与可以已经经过照射的抗原呈递细胞(APC)共培养。APC可以是树突细胞或B细胞。树突细胞可以已经用含有鉴定的新抗原的肽作为单一刺激物或作为刺激性新抗原肽合并物进行脉冲。T细胞的扩充可以使用本领域已知的方法进行，包括例如使用提供额外的共刺激信号的人工抗原呈递细胞(aAPC)和呈递适当肽的自体PBMC。自体PBMC可以用含有如本文所讨论的新抗原的肽作为单一刺激物或备选作为刺激性新抗原的合并物进行冲击。
在一方面，本发明提供了用于扩充T细胞群体以用于治疗受试者的癌症的方法，其中所述T细胞群体靶向新抗原，该新抗原预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递，该方法包括以下步骤：
a)提供包含能够特异性识别所述新抗原的T细胞的T细胞群体；和
b)将T细胞群体与包含新抗原的组合物共培养。
在一方面，扩充可以通过将T细胞与新抗原和抗原呈递细胞共培养来进行。抗原呈递细胞可以是树突细胞。新抗原可以是克隆性抗原。扩充可以是对新抗原特异性的T细胞的选择性扩充。
本发明提供了一种用于产生包含抗原呈递细胞和新抗原或新抗原肽的组合物的方法，其中所述新抗原或新抗原肽是预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递的肽。可以根据本发明的方法鉴定新抗原。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
(a)鉴定新抗原，该新抗原预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递；和
b)产生包含所述新抗原或新抗原肽和抗原呈递细胞的组合物。
本发明还提供了一种组合物，其包含抗原呈递细胞，例如树突细胞和新抗原或新抗原肽，其中所述新抗原或新抗原肽是预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递的肽。
组合物可以根据如本文所述的方法生产。组合物也可用于本文所述的本发明的方法中，例如用于产生如本文讨论的T细胞或T细胞群体或组合物的方法中。
如本文所述的组合物可以是另外包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。药物组合物可以任选地包含一种或多种其他药物活性多肽和/或化合物。此类配制剂可以例如是适合于静脉内输注的形式。
在一方面，扩充可涉及用IL-2或抗CD3和/或CD28抗体培养T细胞群体。
在如本文所述的本发明的一方面，T细胞群体是从待治疗的患者中分离的，例如从获自所述患者的肿瘤样品中分离的。
T细胞群体可包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
提供了T细胞组合物，其中所述T细胞群体与从受试者中分离的初始T细胞群体相比富含增加数目的靶向新抗原的T细胞，所述新抗原预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递的。
还提供了可用于治疗受试者的癌症的T细胞组合物，其包含选择性扩充以靶向受试者癌症特征的新抗原的T细胞，其中所述新抗原预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递。
如本文所述的T细胞组合物可以富含对新抗原特异性的T细胞，所述新抗原预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递。
在如本文所述的T细胞组合物中，新抗原反应性T细胞的扩充群体可以比尚未扩充的T细胞群体具有更高的活性，如通过T细胞群体对用新抗原肽再刺激的应答来测量的。活性可以通过细胞因子的产生来测量，并且其中较高的活性是活性的5-10倍或更大的增加。
如本文所述的T细胞、T细胞群体或T细胞组合物可以通过如本文所述的任何方法获得或可获得。
如本文所述的T细胞、T细胞群体或T细胞组合物可用于治疗癌症。
本发明涵盖一种用于治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用如本文所述的T细胞组合物。本发明还涵盖如本文所述的T细胞组合物，用于制备用于治疗癌症的药物。
该方法可以包括以下步骤：
(i)从受试者的样品中分离T细胞群体；
(ii)扩充靶向新抗原的T细胞群体，所述新抗原预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递；和
(iii)对受试者施用(ii)的T细胞群体。
该方法可以包括以下步骤：
(i)从受试者的样品中分离T细胞；
(ii)工程化改造T细胞以表达识别如本文所述的所述新抗原的CAR或TCR，以提供靶向新抗原的T细胞群体；和
(iii)对受试者施用来自(ii)的T细胞群体。
在一方面，使用多种新抗原选择性扩充所述T细胞，其中每个所述肽包含不同的突变。所述多个可以是2至250、3至200、4至150或5至100个新抗原，例如5至75或10至50个新抗原。
本发明的方法可以包括首先鉴定预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递的新抗原，然后扩充T细胞群体以靶向新抗原。
因此，在一方面，本发明提供了一种提供靶向新抗原的T细胞群体的方法，所述新抗原预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递，所述方法包括以下步骤：
(a)鉴定新抗原，该新抗原预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递：和
(b)扩充T细胞群体以提供靶向新抗原的T细胞群体。
可以在从所述肿瘤分离的多个样品中测定新抗原。
扩充后，所得的T细胞群体富含增加数目的T细胞，所述T细胞靶向新抗原，所述新抗原预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失(例如，与从受试者分离的样品相比)的HLA等位基因编码的HLA分子呈递。
因此，在一方面，本发明提供了识别新抗原的T细胞，该新抗原预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递。在另一方面，本发明涉及识别新抗原的T细胞群体，该新抗原预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递，或者如本文所述的T细胞群体。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了多个T细胞或T细胞群体，即超过一个T细胞，其中多个T细胞包含识别预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递的新抗原的T细胞，和识别可以由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA呈递的不同新抗原的T细胞。因此，本发明提供了识别不同新抗原的多个T细胞。多个或群体中的不同T细胞可以具有识别相同新抗原的不同TCR。
在一个优选的实施方案中，由多个T细胞识别的新抗原的数目为2-1000。例如，识别的新抗原的数目可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000，优选2-100。可以存在有多个具有不同TCR但识别相同新抗原的T细胞。
T细胞群体可以全部或主要由CD8+T细胞构成，或全部或主要由CD8+T细胞和CD4+T细胞的混合物构成，或者全部或主要由CD4+T细胞构成。
在具体的实施方案中，T细胞群体从自患有肿瘤的受试者分离的T细胞产生。
例如，T细胞群体可以从自患有肿瘤的受试者分离的样品中的T细胞产生。样品可以是肿瘤样品、外周血样品或来自受试者的其他组织的样品。
在一个具体的实施方案中，T细胞群体从来自鉴定出新抗原的肿瘤的样品产生。换言之，从源自待治疗患者的肿瘤的样品中分离T细胞群体。
在一个实施方案中，T细胞群体包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
可以使用本领域公知的方法分离T细胞。例如，可以基于CD3、CD4或CD8的表达，从样品产生的单细胞悬浮液中纯化T细胞。可以通过经Ficoll-paque梯度的通过从样品中富集T细胞。
本发明还提供了提供靶向来自受试者的肿瘤中的新抗原的T细胞群体的方法，其包括以下步骤：
i)从自受试者分离的样品中分离T细胞或T细胞群体；和
ii)扩充T细胞或T细胞群体以增加靶向新抗原的T细胞的数目或相对比例，所述新抗原预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递。
根据本发明产生的T细胞群体将具有增加的靶向一种或多种新抗原的T细胞数目或比例，所述新抗原预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递。例如，本发明的T细胞群体将具有增加的靶向新抗原的T细胞数目，所述新抗原预测为由已经测定为与从受试者分离的样品中的T细胞相比在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递。
也就是说，T细胞群体的组成与“天然”T细胞群体(即未经历本文讨论的扩充步骤的群体)的组成的不同之处在于靶向新抗原的T细胞的百分比或比例将增加，所述新抗原预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递。靶向预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递的新抗原的群体中T细胞与不靶向此类新抗原的T细胞的比率将是较高的，有利于靶向预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA呈递的新抗原的T细胞。
根据本发明的T细胞群体可以具有至少约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％的靶向新抗原的T细胞，所述新抗原预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递。例如，T细胞群体可以具有约0.2％-5％、5％-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-70％或70-100％靶向新抗原的T细胞，所述新抗原预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递。在一方面，T细胞群体具有至少约1、2、3、4或5％的靶向新抗原的T细胞，所述新抗原预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递，例如至少约2％或至少2％的靶向新抗原的T细胞，所述新抗原预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递。
或者，T细胞群体可以具有不超过约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8％不靶向新抗原的T细胞，所述新抗原可以由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递。例如，T细胞群体可以具有不超过约95％-99.8％、90％-95％、80-90％、70-80％、60-70％、50-60％、30-50％或0-30％不靶向新抗原的T细胞，所述新抗原可以由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递。在一方面，该T细胞群体具有不超过约99、98、97、96或95％的不靶向新抗原的T细胞，所述新抗原预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递，例如不超过约98％或95％不靶向新抗原的T细胞，所述新抗原预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递。
扩充的新抗原反应性T细胞群体可以比例如未使用抗原肽扩充的T细胞群体具有更高的活性。提及“活性”可以代表T细胞群体对用新抗原肽，例如与用于扩充的肽对应的肽，或新抗原肽的混合物再刺激的应答。用于测定应答的合适方法是本领域已知的。例如，可以测量细胞因子的产生(例如，可以测量IL2或IFNγ的产生)。提及“更高的活性”包括例如1-5倍、5-10倍、10-20倍、20-50倍、50-100倍、100-500倍、500-1000倍的活性增加。在一方面，活性可以高超过1000倍。
T细胞群体可以包含CD8+T细胞、CD4+T细胞或CD8+和CD4+T细胞。
辅助T辅助细胞(TH细胞)在免疫过程中协助其他白细胞，包括将B细胞成熟为浆细胞和记忆B细胞，以及激活细胞毒性T细胞和巨噬细胞。TH细胞在其表面上表达CD4。当抗原呈递细胞(APC)表面上的II类MHC分子给TH细胞呈递肽抗原时，它们会被激活。这些细胞可以分化为几种亚型之一，包括TH1、TH2、TH3、TH17、Th9或TFH，它们分泌不同的细胞因子以促进不同类型的免疫应答。
细胞毒性T细胞(TC细胞或CTL)破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且也牵涉移植物排斥。CTL在其表面处表达CD8。这些细胞通过结合与存在于所有有核细胞表面上的I类MHC缔合的抗原来识别其靶物。通过IL-10、腺苷和调节性T细胞分泌的其他分子，可以使CD8+细胞失活，从而预防自身免疫性疾病。
如本文所述的T细胞可以是工程化T细胞。
本文所述的新抗原特异性T细胞可表达特异性结合新抗原或新抗原肽的嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)，或特异性结合新抗原或新抗原肽的亲和力增强的T细胞受体(TCR)(如下文进一步讨论)。例如，T细胞可以表达特异性结合新抗原或新抗原肽的嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)(例如特异性结合新抗原或新抗原肽的亲和力增强的T细胞受体(TCR))。
CAR是下述的蛋白质，它们以其通常的形式将单克隆抗体(mAb)的特异性植入T细胞的效应器功能。它们通常的形式是I型跨膜域蛋白的形式，具有识别抗原的氨基端、间隔物、跨膜域，它们都连接到复合胞内域，所述复合胞内域传输T细胞存活和激活信号。
这些分子的最常见形式使用源自单克隆抗体的单链可变片段(scFv)来识别靶抗原。scFv通过间隔物和跨膜域融合到信号传导胞内域。此类分子响应scFv对其靶物的识别导致T细胞活化。当T细胞表达此类CAR时，它们识别并杀死表达靶抗原的靶细胞。已经开发出几种针对肿瘤相关抗原的CAR，并且使用此类表达CAR的T细胞的过继转移方法目前在临床试验中，用于治疗各种癌症。
用于产生TCR和亲和力增强的TCR的方法是本领域已知的。亲和力增强的TCR是对肽-MHC复合物具有增强的亲和力的TCR(包括例如从患者样品(例如患者外周血或TIL)中分离编码TCR的TCR基因，并且通过修饰TCR序列改善对肽-MHC复合物的TCR亲和力(例如通过体外诱变和选择增强的亲和力(或亲和力成熟的)TCR)。将此类TCR基因导入T细胞中的方法是本领域已知的。鉴定最佳亲和力TCR的方法也是本领域中已知的，所述方法涉及用抗原免疫具有多种多样的人TCR全集的抗原阴性人源化转基因小鼠(例如，TCR/MHC人源化小鼠，例如ABabDII小鼠)，并且从此类免疫的转基因小鼠中分离抗原特异性TCR(参见例如ObenausM et al.,Nat Biotechnol.33(4):402-7,2015)。
T细胞可以带有高亲和力TCR，因此亲和力增强可以不是必需的。可以从来自受试者的T细胞分离高亲和力TCR，并且可以不需要亲和力增强。
例如，可以使用包含新抗原肽的MHC多聚体来鉴定能够结合如本文所述的新抗原肽的候选T细胞克隆。
可以使用本领域已知的方法，例如通过多种手段之一，包括用病毒载体转导，用DNA或RNA转染引入编码TCR或CAR的DNA或RNA，在来自受试者的自体T细胞中表达鉴定的特异性靶向新抗原肽或新抗原的TCR和/或CAR。
本发明涵盖如本文所述的T细胞，例如工程化T细胞。
在如本文所述的根据本发明的某些方面，例如在如本文所述的T细胞分离和扩充之后，将T细胞或T细胞群体再输注到受试者中。实现这点的合适方法将是本领域技术人员已知的。例如，用于产生、选择和扩充T细胞的方法在本领域中是已知的，参见例如Dudley JImmunother.2003；26(4):332–342,and Rosenberg et al.2011Clin Cancer Res:17(13):4550-7。用于再输注T细胞的方法记载于Dudley et al.Clin Cancer Res.2010Dec 15；16(24):6122–6131和Rooney et al.Blood.1998Sep 1；92(5):1549-55。根据本发明的T细胞、T细胞群体或T细胞组合物可以用于如本文所述的根据本发明的癌症的治疗或预防。
在一方面，本发明涉及一种用于治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括对受试者施用根据本发明的T细胞或T细胞群体。
该方法可以包括以下步骤：
(i)从受试者中分离含有T细胞的样品；
(ii)扩充靶向如本文所定义的新抗原的T细胞群体；和
(iii)将来自(ii)的细胞施用于受试者。
在一方面，可以工程化改造T细胞以表达如本文所述的CAR或亲和力增强的TCR。
本发明还提供了一种治疗患有癌症的患者的方法，该方法包括对所述患者施用如本文所定义的T细胞或T细胞群体。
可以根据如本文所述的本发明的任何方面来鉴定或产生新抗原、T细胞或T细胞群体。
扩充可以离体或体外进行，并且可以通过本领域已知的方法进行。
本发明还提供了一种组合物，其包含抗原呈递细胞和如本文所述的新抗原或新抗原肽。
在一方面，抗原呈递细胞已经用所述肽进行冲击或加载。
本发明还提供了包含如本文所述的新抗原特异性T细胞群体的T细胞组合物，其中所述新抗原特异性T细胞群体是通过将T细胞与呈递新抗原肽的抗原呈递细胞共培养而产生的。
如本文所述的组合物可以是另外包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。药物组合物可以任选地包含一种或多种其他药物活性多肽和/或化合物。此类配制剂可以例如是适合于静脉内输注的形式。
在一方面，抗原呈递细胞是树突细胞。在一方面，照射抗原呈递细胞。在一方面，抗原呈递细胞是能够例如在正确的HLA环境中呈递相关肽的细胞。此类细胞可以是表达自体HLA分子的自体活化的PBMC，或者是表达一批匹配的HLA的非自体细胞。在一方面，照射人工抗原呈递细胞。
也可以如下富集T细胞：在存在或不存在外源APC的情况下用新抗原初始刺激TIL，然后用细胞因子(如IL-2)或有丝分裂抗体(如抗CD3和/或CD28)进行多克隆刺激和扩充。此类方法是本领域已知的。例如，参见Forget et al.J Immunother.2014 Nov-Dec；37(9):448-60,Donia et al.Cytotherapy.2014 Aug；16(8):1117-20,Donia et al.Scand JImmunol.2012 Feb；75(2):157-67和Ye et al.J Transl Med.2011 Aug 9；9:131。
MHC多聚体
可以使用本领域已知的方法鉴定混合的T细胞起始群体中的新抗原特异性T细胞。例如，可以使用包含如本文所述的新抗原肽的MHC多聚体来鉴定此类T细胞。
MHC多聚体是MHC分子的寡聚形式，其经设计以识别和分离一大组无关的T细胞中对特定抗原具有高亲和力的T细胞。多聚体可用于展示与I类MHC、II类MHC或非经典分子(例如CD1d)结合的抗原。
最常用的MHC多聚体是四聚体。这些通常通过对可溶性MHC单体进行生物素化来产生，所述MHC单体通常是在真核或细菌细胞中重组产生的。然后，这些单体结合主链，例如链霉亲合素或抗生物素蛋白，从而创建四价结构。例如，将这些主链与荧光染料缀合，以随后通过流式细胞术分离结合的T细胞。
本发明提供了包含新抗原肽的MHC多聚体，其中所述新抗原可以由HLA呈递，所述HLA已测定在肿瘤中尚未丧失。
根据本发明的MHC多聚体可以用于鉴定、分离、扩充或以其他方式产生如本文所述的T细胞、T细胞群体或组合物的方法中。可以使用本领域已知的方法合成新抗原肽。
组合物
本发明进一步提供了一种组合物，其包含新抗原或肽、新抗原特异性T细胞或识别新抗原的抗体，其中所述新抗原可以由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递。
如本文所述的组合物可以是另外包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。药物组合物可以任选地包含一种或多种其他药物活性多肽和/或化合物。此类配制剂可以例如是适合于静脉内输注的形式。
抗体
在本发明的一个方面，提供了识别新抗原的抗体，所述新抗原预测为由已经测定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递。
一旦例如通过根据本发明的方法鉴定出合适的新抗原，就可以使用本领域已知的方法来产生抗体。
“抗体”(Ab)包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和表现出期望生物学活性的抗体片段。术语“免疫球蛋白”(Ig)可以与“抗体”互换使用。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；线性抗体；单链抗体分子；由抗体片段形成的多特异性抗体。
“Fc”片段包含通过二硫化物保持在一起的两条H链的羧基端部分。抗体的效应器功能由Fc区中的序列决定，该区也是在某些类型的细胞上发现的Fc受体(FcR)识别的部分。
抗体可以是人抗体。“人抗体”是指天然存在于人中的抗体、其功能片段或人源化抗体，即遗传工程化抗体，其一部分(例如Fc区)源自天然存在的人抗体。通常认为“人源化抗体”是人抗体，其具有从非人类来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其通常通过用输入高变区序列代替人抗体的相应序列而取自“输入”可变域。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体，其中基本上少于完整的人可变域已经由来自非人物种的相应序列替换。此外，嵌合抗体可包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。
在一个优选的方面，抗体是单克隆抗体。如本文所用，“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体中获得的抗体，即，除了可能以少量存在的可能天然存在的突变以外，构成该群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体针对单个抗原位点具有高度特异性。此外，与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。单克隆抗体可以通过杂交瘤方法(Kohler et al.,Nature,256:495(1975))来制备，或者可以使用重组DNA方法在细菌、真核动物或植物细胞中制备。例如，还可以使用Clackson et al.,Nature,352:624-628(1991)和Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离单克隆抗体。
单克隆抗体也可以通过本领域已知的重组DNA方法产生。可以使用常规程序(例如，通过使用能够与编码鼠抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)分离编码合适的单克隆抗体的DNA并对其进行测序。
体外方法也适用于制备单价抗体。可以使用本领域已知的常规技术消化抗体以产生其片段，特别是Fab片段。例如，可以使用木瓜蛋白酶进行消化。木瓜蛋白酶消化的实例在WO 94/29348中描述。抗体的木瓜蛋白酶消化通常产生两个相同的各具有单个抗原结合位点的抗原结合片段，称为Fab片段，和一个残留的Fc片段。胃蛋白酶处理产生F(ab’)2片段和pFc’片段。
单克隆抗体可包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的部分与自特定物种衍生或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而一条或多条链的剩余部分与自另一物种衍生或属于另一种抗体类别或亚类的抗体以及此类抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要它们表现出相同的生物学活性。
抗体片段还可以包括特定区域或特定氨基酸残基的插入、缺失、取代或其他选择的修饰，条件是与未修饰的抗体或抗体片段相比，片段的结合活性不明显改变或受损。
这些修饰可以提供一些其他特性，例如以除去/添加能够二硫键键合的氨基酸，增加其生物学寿命，改变其分泌特性等。在任何情况下，抗体片段必须拥有生物活性特性，诸如结合活性，在结合域处的结合调节，等等。抗体的功能或活性区域可通过诱变蛋白质的特定区域，然后表达和测试表达的多肽来鉴定。此类方法是本领域技术人员已知的，并且可以包括编码抗体片段的核酸的位点特异性诱变。
抗体可以是人源化抗体或人抗体。非人(例如鼠)抗体的人源化形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab’或抗体的其他抗原结合亚序列)，其含有自非人免疫球蛋白衍生的最小序列。
人源化抗体包含人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体抗体的互补决定区(CDR)的残基被具有期望特异性、亲和力或能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠或兔的CDR替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架(FR)残基被相应的非人残基替代。人源化抗体还可包含在受体抗体或输入的CDR或框架序列中均未发现的残基。通常，人源化抗体将包含至少一个，且通常两个基本上整个可变域，其中所有或基本上所有的CDR区域对应于非人免疫球蛋白的那些，以及所有或基本上所有的FR区域是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的。
用于将非人抗体进行人源化的方法是本领域已知的。通常，人源化抗体具有从非人源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变域。人源化基本上可以通过用啮齿类CDR或CDR序列代替人抗体的相应序列来进行。因此，“人源化”抗体是嵌合抗体，其中基本上少于完整的人可变结构域已用来自非人物种的相应序列替代。实际上，人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和可能的某些FR残基被来自啮齿类抗体中类似位点的残基替代。
在不存在内源免疫球蛋白的情况下可以使用转基因动物(例如小鼠)产生人抗体的完整全集。例如，已经描述了在嵌合和种系突变体小鼠中抗体重链连接区基因的纯合缺失导致内源抗体产生的完全抑制。在此类种系突变体小鼠中人种系免疫球蛋白基因阵列的转移将导致抗原攻击后产生人抗体。人抗体也可以在噬菌体展示文库中产生。
如本文所用，“合成抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，诸如例如，由噬菌体表达的抗体，如本文所述的。该术语也应解释为意指通过合成编码该抗体的DNA分子产生的并且该DNA分子表达抗体蛋白或指定该抗体的氨基酸序列的抗体，其中DNA或氨基酸序列已经使用本领域可用且公知的合成DNA或氨基酸序列技术获得。
免疫原性组合物
本发明提供了一种免疫原性组合物或疫苗，其包含可以由HLA呈递的新抗原或新抗原肽，所述HLA已经测定为在肿瘤中尚未丧失。免疫原性组合物或疫苗可用于根据本发明的任何治疗或预防癌症的方法。因此，本发明包括治疗或预防受试者的癌症的方法，其包括向受试者施用根据本发明的免疫原性组合物或疫苗。
“免疫原性组合物”是指能够在受试者中诱导免疫应答的组合物。免疫原性组合物可以是疫苗组合物。“疫苗组合物”是指能够在受试者中诱导免疫应答的组合物，其对要治疗的病况具有治疗或预防效果。
免疫原性组合物或疫苗可包含超过一种新抗原或新抗原肽。
在一方面，免疫原性组合物或疫苗可包含超过一种不同的新抗原或新抗原肽，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同的新抗原或新抗原肽。新抗原也可以为蛋白质形式。
在一个实施方案中，免疫原性组合物或疫苗可包含多肽，该多肽包含如本文所定义的新抗原。在本发明的一个实施方案中，免疫原性组合物或疫苗可包含超过一种不同的多肽，每种多肽包含新抗原，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同的多肽。
免疫原性组合物或疫苗可以是另外包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。药物组合物可以任选地包含一种或多种其他药学活性多肽和/或化合物。此类配制剂可以例如是适合于静脉内输注的形式。关于癌症疫苗的讨论，参见例如Butterfield,BMJ.2015 22；350。
特别地，免疫原性组合物或疫苗可另外包含佐剂。佐剂的实例包括但不限于铝盐、油乳剂和细菌组分(例如LPS和脂质体)。在一个实施方案中，佐剂可以是聚ICLC，其是羧甲基纤维素、聚肌苷酸-聚胞苷酸和聚-L-赖氨酸双链RNA的合成复合物。
肽的合适剂量可以由本领域技术人员确定。剂量可以取决于要使用的肽。对于肽的体内使用，可以采用0.1-4000μg，例如0.1-2000μg，0.1-1000μg或0.1-500μg，例如0.1-100μg的体内剂量。
如本文讨论的根据本发明的免疫原性组合物或疫苗可导致在受试者中产生免疫应答。可产生的“免疫应答”可以是体液和/或细胞介导的免疫，例如刺激抗体产生，或刺激细胞毒性或杀伤细胞，其可以识别和破坏(或以其它方式消除)其表面上表达抗原的细胞，所述抗原对应于疫苗中的抗原。因此，术语“刺激免疫应答”包括所有类型的免疫应答和刺激它们的机制，并且涵盖刺激CTL，其形成本发明的优选方面。优选地，刺激的免疫应答是细胞毒性CD8+T细胞和辅助CD4+T细胞。免疫应答的程度可以通过免疫应答的标志物，例如分泌分子(例如IL-2或IFNγ)或抗原特异性T细胞的产生评估。
另外，新抗原可以以细胞的形式递送，例如抗原呈递细胞，例如树突细胞。可以将抗原呈递细胞(例如树突细胞)用新抗原或新抗原肽进行脉冲或加载，或进行遗传修饰(通过DNA或RNA转移)以表达一种、两种或多种新抗原或新抗原肽(参见例如Butterfield2015，上文；Palucka 2013，上文)，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个新抗原或新抗原肽。制备树突细胞免疫原性组合物或疫苗的方法是本领域已知的。
或者，如本文所定义的编码一种或多种新抗原的DNA或RNA，或自它们衍生的肽或蛋白质可用于免疫原性组合物或疫苗中，例如通过直接注射至受试者。例如，编码2、3、4、5、6、7、8、9或10种新抗原的DNA或RNA，或自其衍生的肽或蛋白质。一种或多种新抗原或新抗原肽可通过细菌或病毒载体递送，所述细菌或病毒载体包含编码一种或多种新抗原或新抗原肽的DNA或RNA序列。
如本文所述的免疫原性组合物或疫苗可以以任何合适的方式施用。例如，它们可以通过如本领域已知的任何合适的递送机制来递送。组合物可涉及载体递送系统的使用，或者载体递送系统可以不是必需的。载体可以是病毒的或细菌的。合适的病毒载体可以衍生自逆转录病毒、腺病毒、慢病毒或痘病毒。脂质体可用作递送系统。还可以使用李斯特氏菌(Listeria)疫苗或电穿孔。
可以离体制备基于细胞的免疫原性组合物或疫苗，然后施用于受试者。
本发明进一步提供了在其表面上表达如本文定义的新抗原或其部分的细胞或其群体，该细胞通过本文的任何方法可获得(或获得)。此类细胞可以用于治疗或预防癌症。
因此，本发明进一步提供了在其表面(或细胞内)表达如本文定义的新抗原或新抗原肽的细胞，或此类细胞的群体，该细胞或群体通过如本文定义的方法可获得(或获得)。在一个优选的实施方案中，细胞是抗原呈递细胞，例如树突细胞。
对于如本文所述的细胞的体内施用，可以通过合适的路径使用本领域中常见或标准的细胞群体的任何施用模式，例如注射或输注。在一方面，每kg受试者施用1x104至1x108个细胞(例如，人每kg的1.4x104至2.8x106)。在一方面，每kg受试者施用约107个细胞或不超过107个细胞。因此，例如在人中，可以以一定剂量，即每剂量，例如作为T细胞剂量或疫苗接种剂量，施用每kg受试者0.1-20x107个细胞的剂量。在一方面，每kg受试者施用1x104至1x105个细胞，1x105至1x106个细胞，1x106至1x107个细胞或1x107至1x108个细胞。对于疫苗接种应用，每剂可使用1-20x106个细胞。若必要的话，可以在以后的时间重复剂量。
根据本发明的免疫原性组合物或疫苗可用于治疗癌症。
本发明还提供了治疗受试者中的癌症的方法，其包括向所述受试者施用本文所述的免疫原性组合物或疫苗。该方法可以另外包括鉴定患有癌症的受试者的步骤。
在另一方面，本发明提供了用于产生包含新抗原肽或新抗原的免疫原性组合物或疫苗的方法，其中所述新抗原可以由已经确定为在肿瘤中尚未丧失的HLA等位基因编码的HLA分子呈递，所述方法包括以下步骤：
(a)鉴定新抗原，所述新抗原预测由HLA等位基因编码的HLA分子呈递，所述HLA等位基因已经测定为在肿瘤中尚未丧失；和
(b)使用所述新抗原肽或新抗原蛋白生产免疫原性组合物或疫苗。
在本发明的一方面，生产疫苗涉及制备树突细胞疫苗，其中所述树突细胞呈递如本文定义的新抗原或新抗原肽。
新抗原蛋白也可以用于根据本发明的免疫原性组合物或疫苗和与疫苗接种有关的方法中。
在另一方面，本发明提供了生产包含编码新抗原肽或新抗原的DNA或RNA分子的免疫原性组合物或疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)鉴定新抗原，所述新抗原预测由HLA等位基因编码的HLA分子呈递，所述HLA等位基因已经测定为在肿瘤中尚未丧失；和
(b)产生编码新抗原肽或新抗原的DNA或RNA分子；和
(c)使用所述DNA或RNA分子生产免疫原性组合物或疫苗。
免疫原性组合物或疫苗可通过如上文所述的合适方法递送。
在一方面，疫苗接种是治疗性疫苗接种。在这方面，将免疫原性组合物或疫苗施用于患有癌症的受试者以治疗该癌症。
在另一方面，疫苗接种是预防性疫苗接种。在这方面，将免疫原性组合物或疫苗施用于可以有形成癌症的风险的受试者。
在一方面，将免疫原性组合物或疫苗施用于先前患有癌症并且有癌症复发风险的受试者。
免疫原性组合物或疫苗也可以是DNA或RNA形式，其编码一种或几种新抗原肽或蛋白质，并通过其他方法递送，包括但不限于病毒载体、抗原呈递细胞和电穿孔。
受试者
在本发明的一个优选实施方案中，受试者是哺乳动物，优选猫、狗、马、驴、绵羊、猪、山羊、牛、小鼠、大鼠、兔或豚鼠，但最优选受试者是人。
如本文所定义，“治疗”是指相对于治疗之前的症状，降低、减轻或消除所治疗的疾病的一种或多种症状。
“预防”(或防范)是指延迟或预防疾病症状的发作。预防可以是绝对的(使得不发生疾病)或者可以仅在某些个体中或在有限的时间内有效。
癌症
适当地，癌症可以是卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、肾癌(肾细胞)、肺癌(小细胞、非小细胞和间皮瘤)、脑癌(神经胶质瘤、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤)、黑素瘤、梅克尔细胞癌、透明细胞肾细胞癌(ccRCC)、淋巴瘤、小肠癌(十二指肠和空肠)、白血病、胰腺癌、肝胆肿瘤、生殖细胞癌、前列腺癌、头颈癌、甲状腺癌和肉瘤。
在一方面，癌症是肺癌。在一方面，肺癌是肺腺癌。在一方面，该癌症是肺鳞状细胞癌。
在一方面，癌症是黑素瘤。
在一方面，该癌症可以选自黑素瘤、梅克尔细胞癌、肾癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、膀胱尿路上皮癌(BLAC)和头颈鳞状细胞癌(HNSC)和微卫星不稳定性(MSI)高癌症。
在一方面，癌症可以是非小细胞肺癌(NSCLC)。
在一方面，癌症可以是MSI-高癌症。
在一方面，癌症可在DNA修复途径中具有突变。
在一个实施方案中，癌症可在DNA修复途径中具有突变。
在一个实施方案中，癌症可以是MSI-高癌症。
使用本发明的组合物和方法的治疗还可以涵盖靶向循环肿瘤细胞和/或源自肿瘤的转移。
如本文所讨论的，转移性肿瘤细胞可以具有与原发性肿瘤部位处的细胞不同的抗原概况。在如本文所述的本发明的任何方面中，可以在原发性部位和一个或多个转移部位两者处靶向新抗原，所述新抗原预测为由HLA等位基因编码的HLA分子呈递，所述HLA等位基因已测定在肿瘤中尚未丧失。
在一方面，与转移部位相比，可以在原发部位处靶向不同新抗原，这取决于哪些新抗原预测为在原发部位和转移部位处呈递。根据本发明的治疗可以涵盖原发部位和转移部位两者的治疗。
靶向一种或多种新抗原的根据本发明的治疗可以帮助防止可以通过标准方法发生的疗法抗性肿瘤细胞的进化。
与其他癌症治疗组合
根据本发明的治疗癌症的方法和用途可以与另外的癌症疗法组合进行。特别地，根据本发明的T细胞组合物可以与免疫检查点干预、共刺激抗体、化学疗法和/或放射疗法、靶向疗法或单克隆抗体疗法组合施用。
免疫检查点分子包括抑制性分子和激活性分子两者，并且干预可以适用于这两种类型的分子中的任一种或两者。例如，免疫检查点抑制剂包括但不限于例如PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、Lag-3抑制剂、Tim-3抑制剂、TIGIT抑制剂、BTLA抑制剂和CTLA-4抑制剂。共刺激抗体通过免疫调节受体递送阳性信号，所述受体包括但不限于ICOS、CD137、CD27 OX-40和GITR。在一个优选的实施方案中，检查点抑制剂是CTLA-4抑制剂。
预防、减少或最小化对免疫细胞活性的抑制的合适的免疫检查点干预的实例包括派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、avelumab、替西木单抗(tremelimumab)和伊匹单抗(ipilimumab)。
在一方面，肿瘤的微环境可以显示增加的免疫激活。图13显示了肿瘤微环境中T细胞、NK细胞、PDL1和CLTA4的上调。
例如，在一方面，在肿瘤微环境中PDL1的水平可以增加(参见例如图13)。因此，在一方面，可以与PDL1干预(例如与PD-L1抑制剂或PD-1抑制剂)联合进行根据本发明的治疗癌症的方法和用途。在一方面，本发明的治疗癌症的方法和用途可以与阿特珠单抗、德瓦鲁单抗或avelumab组合进行。在一方面，可以与派姆单抗或纳武单抗组合进行根据本发明的治疗癌症的干预方法和用途。
在一方面，可以在肿瘤微环境中提高CTLA-4的水平。因此，在一方面，可以与CTLA-4干预，例如与CTLA-4抑制剂组合进行根据本发明的治疗癌症的方法和用途。在一方面，根据本发明的用于治疗癌症的方法和用途可以与替西木单抗或伊匹单抗组合进行。
在一方面，癌症可以是肺腺癌。
如本文所用，化学治疗实体是指对细胞具有破坏性的实体，即该实体降低细胞的生存力。化学治疗实体可以是细胞毒性药物。预期的化学治疗剂包括但不限于烷基化剂、蒽环类药物、埃博霉素、亚硝基脲、乙烯亚胺(ethylenimines)/甲基三聚氰胺、烷基磺酸盐、烷基化剂、抗代谢物、嘧啶类似物、表鬼臼毒素(epipodophylotoxins)、酶如L-天冬酰胺酶；生物反应修饰剂，例如IFNα，IL-2，G-CSF和GM-CSF；铂配位配合物，例如顺铂，奥沙利铂和卡铂，蒽二酮，取代的尿素(例如羟基脲)，甲基肼衍生物(包括N-甲基肼(MIH)和丙卡巴肼)，肾上腺皮质抑制剂，例如米托坦(o,p'-DDD)和氨鲁米特；激素和拮抗剂，包括肾上腺皮质类固醇拮抗剂，如泼尼松及等同物、地塞米松和氨鲁米特；黄体酮如己酸羟孕酮，乙酸甲羟孕酮和乙酸甲地孕酮；雌激素，例如乙酚和炔雌醇等同物；抗雌激素药，如他莫昔芬；雄激素，包括丙酸睾酮和氟甲睾酮/等同物；抗雄激素，如氟他胺，促性腺激素释放激素类似物和亮丙瑞林；和非甾体抗雄激素，如氟他胺。
“组合”可以指在施用根据本发明的T细胞组合物之前，同时或之后施用另外的疗法。
除了与检查点阻断的组合之外或作为与检查点阻断的组合的备选，本发明的T细胞组合物还可以使用基因编辑技术进行遗传修饰，以使其对免疫检查点具有抗性，所述基因编辑技术包括但不限于TALEN和Crispr/Cas。此类方法在本领域中是已知的，参见例如US20140120622。基因编辑技术可用于防止T细胞表达的免疫检查点的表达，包括但不限于PD-1、Lag-3、Tim-3、TIGIT、BTLA CTLA-4及其组合。如本文讨论的T细胞可以通过任何这些方法来修饰。
还可以对根据本发明的T细胞进行遗传修饰以表达增加归巢到肿瘤中的分子和/或将炎性介质递送至肿瘤微环境中，包括但不限于细胞因子、可溶性免疫调节受体和/或配体。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。Singleton,et al.,DICTIONARY OF MICROBIOLOGYAND MOLECULAR BIOLOGY,20ED.,John Wiley and Sons,New York(1994)和Hale&Marham,THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY,Harper Perennial,NY(1991)为技术人员提供了本公开中使用的许多术语的通用词典。
本公开内容不受本文公开的示例性方法和材料的限制，并且与本文描述的那些方法或材料类似或等同的任何方法和材料都可以用于本公开内容的实施方案的实践或测试中。数字范围包括定义范围的数字。除非另有说明，否则任何核酸序列均以5’至3’的方向从左至右书写；氨基酸序列分别以氨基至羧基的方向从左至右书写。
本文提供的标题不是可以通过参考说明书作为整体具有的本公开的各个方面或实施方案的限制。因此，直接在下文定义的术语通过参考说明书作为整体更完整定义。
在本文中使用氨基酸名称、三字母缩写或单字母缩写来指代氨基酸。
如本文所用，术语“蛋白质”包括蛋白质、多肽和肽。
术语的其他定义可在整个说明书中出现。在更详细描述示例性实施方案之前，应理解，本公开不限于所描述的具体实施方案，因为其当然可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述具体实施方案的目的，而并不意图为限制性的，因为本公开的范围将仅由所附权利要求书限制。
在提供数值范围的情况下，应理解的是，除非上下文另外明确指出，否则也明确公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值(直到下限单位的十分之一)。在所述范围内的任何规定值或中间值与在所述规定范围内的任何其他规定值或中间值之间的每个较小范围都包括在本公开内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在该范围中或在该范围内排除，并且本公开内也涵盖每个范围，其中任一个、无一或两个限度包括在较小范围中，服从规定范围中的任何明确排除限度。在规定的范围包括限度之一或两者的情况下，排除那些包括的限度之任一或两者的范围也包括在本公开中。
必须注意的是，如本文和所附权利要求书中所使用的，单数形式的“一种”、“一个”和“所述/该”包括复数提及物，除非上下文另有明确规定。
如本文所用，术语“包含”与“包括”同义，并且是包括性的或开放式的，并且不排除其他的、非叙述的成员、元素或方法步骤。术语“包括”也包括术语“由……组成”。
本文中讨论的出版物仅提供其在本申请的申请日前的公开内容。本文中的任何内容均不应解释为承认此类出版物构成所附权利要求书的现有技术。
现在将参考以下实施例仅举例而言描述本发明。
实施例
实施例1
方法详情
LOHHLA(人白细胞抗原中的杂合性丧失)算法
作为输入，LOHHLA需要肿瘤和种系BAM，患者特异性的HLA调用物(calls)(通过HLA推理工具(例如POLYSOLVER(Shukla,2015)或Optitype(Szolek 2014))预测)，HLA fasta文件位置，纯度和倍性估算(通过拷贝数工具(例如ASCAT(Van Loo,2015)或FACETS(Shen,2016))预测)。
为了调用HLA LOH，LOHHLA依赖于四个计算步骤：
步骤1：提取HLA读段
首先，使用samtools view提取肿瘤和种系读段，它们定位到基因组的HLA区(chr6:29909037-29913661,chr6:31321649-31324964和chr6:31236526-31239869)以及染色体6个重叠群(chr6_cox_hap2,chr6_dbb_hap3,chr6_mann_hap4,chr6_mcf_hap5,chr6_qbl_hap6,chr6_ssto_hap7)。除去来自此步骤的未配对的配偶物，并且将输出转换为FASTQ格式。
步骤2：创建HLA等位基因特异性BAM文件
对于每个患者的杂合HLA等位基因，创建患者特异性参考Fasta。使用先前步骤中生成的FASTQ文件来生成HLA特异性BAM文件，其使用允许读段定位到多个HLA等位基因的定位参数，并使用与先前发布(Shukla，2015)的定位参数类似的定位参数进行。进行比对后过滤，从而弃去其配偶物定位到不同等位基因的读段，以及与参考HLA等位基因相比含有超过一个插入、缺失或错配事件的任何读段。对于每个过滤的肿瘤/种系HLA等位基因特异性BAM文件，使用samtools mpileup计算覆盖。
步骤3：测定同源HLA等位基因之间错配位置处的覆盖
对于每个HLA基因座，使用R Biostrings包在两个同源HLA等位基因之间进行局部成对比对。从成对的比对中，提取两个同源物之间的所有错配位置。使用步骤2中计算的HLA特异性覆盖来测定每个错配位置处的覆盖差异。生成一个额外的文件，其含有每个错配位置处的覆盖，对每个读段仅计数一次，以避免过多计数跨越超过一个错配位置的读段。
步骤4：获得HLA特异性logR和BAF
对于肿瘤和正常两者，通过以150个碱基对的间隔对跨越两个同源等位基因的覆盖进行框并(binning)，获得跨越每个HLA基因的LogR。对于每个仓(bin)，将肿瘤/正常覆盖比率乘以乘数M(其对应于种系中独特的定位读段的数目)，除以肿瘤区域中独特的定位读段的数目。
在每个多态性位点处计算BAF，并简单地反映HLA等位基因1的覆盖除以HLA等位基因1的覆盖+HLA等位基因2的覆盖。
步骤5：测定HLA单元型特异性的拷贝数
在每个多态性位点处，使用以下等式获得主要和次要等位基因拷贝数的估算值，所述等式具有利用的来自发现多态性位点所在的相应仓的logR值和多态性位点的BAF。
Figure BDA0002366315070000391
Figure BDA0002366315070000392
其中ρ＝肿瘤纯度；γ＝标准化常数，对于外显子组测序数据为1，关于更多详情，参见ASCAT；并且
Figure BDA0002366315070000393
ρ和
Figure BDA0002366315070000394
使用ASCAT(van Loo，2010)估算，如下所述。
然后，对于每个仓，测定中值等位基因1和等位基因2的拷贝数。为了估算等位基因1的拷贝数，计算跨越仓的中值。同样，为了估算等位基因2的拷贝数，计算跨越仓的中值。
拷贝数<0.5分类为受到丧失。另外，为了避免过度调用LOH，我们计算与每个HLA基因的等位不平衡相关的p值。此p值对应于两个HLA同源物之间错配位点处的logR值的差异，若它跨越超过一个错配位点，则进行调节以对每个测序读段计数。若在两个分布之间使用配对的Student t检验得到P<0.01，则确定等位不平衡。
TRACERx 100分组
考虑的TRACERx样品获自{Jamal-Hanjani,2017#11854}。由于所有三个HLA基因座处的纯合性或HLA等位基因之间的错配位太少，排除了四名患者。考虑将肺腺癌和肺鳞状细胞癌肿瘤用于下游分析。7个肿瘤分类为具有独立地组织学。在这些中，一例癌肉瘤显示HLALOH，并且3例腺鳞癌、1例癌肉瘤、1例大细胞癌和1例大细胞神经内分泌肿瘤不然。
使用ASCAT的拷贝数估算
如前所述(Jamal-Hanjani，2017)估算ASCAT的拷贝数。鉴于不可能使用ASCAT直接推断HLA等位基因的拷贝数，使用与HLA基因座重叠的区段，或者备选最接近的区段。
TRACERx突变数据
TRACERx突变表来自(Jamal-Hanjani，2017)。
ASCAT和LOHHLA的比较
为了比较ASCAT和LOHHLA，我们将每个肿瘤区域作为独立的样品进行处理，并使用默认设置将其通过LOHHLA管线运行。
为了评估HLA基因座的预测拷贝数状态，我们测定与HLA基因座重叠的基因组区段的拷贝数状态。若发现无基因组区段与HLA基因座重叠，则选择最接近的区段。
为了比较我们的等位不平衡估算，我们认为若ASCAT预测跨基因座的等位不平衡，并且发现使用LOHHLA的至少一个HLA基因含有等位不平衡，则肿瘤区域是一致的。同样，对于LOH，我们认为若ASCAT预测次要等位基因为0，并且这对于至少一个HLA基因也得到预测，则ASCAT和LOHHLA估算是一致的。
相反，若使用LOHHA任何HLA基因中预测等位不平衡而ASCAT未预测到不平衡，则将等位不平衡估算分类为不一致。类似地，若将使用LOHHLA的任何HLA基因分类为表现出次要等位基因0，并且使用ASCAT未鉴定LOH，则将LOH分类为不一致。
LOHHLA结果的片段分析验证
使用位于6号染色体短臂上，靠近HLA基因座的四个多态性序列标签化位点(STR)标志物(D6S2852，D6S2872，D6S248和D6S1022)验证了等位不平衡。使用PCR扩增20ng患者种系和肿瘤区域DNA。PCR包括在95C变性45秒，然后在55C退火温度45秒，然后在72C的PCR延伸45秒的35个循环。在ABI3730xl DNA分析仪上分离PCR产物。使用Applied Biosystems软件GeneMapper v5测定每个等位基因的片段长度和曲线下面积。当为特定标志物鉴定两个分开的等位基因时，可以使用公式(At/Bt)/(An/Bn)分析片段的等位不平衡。该公式的输出定义为标准化等位比率。
HLA类型、HLA突变和预测的新抗原结合剂
使用POLYSOLVER(POLYmorphic loci reSOLVER)推断每个样品的4位HLA类型，所述POLYSOLVER使用正常组织BAM文件作为输入并使用贝叶斯分类器测定基因型(Shukla，2015)。还使用POLYSOLVER评估每个肿瘤区域中的HLA突变。
测定可源自样品中存在的鉴定的非沉默突变的新型9-11聚体肽(Jamal-Hanjani，2017)。使用netMHCpan-2.8和netMHC-4.0(Andreatta2016；Nielsen 2003；Hoof 2009；Nielsen 2009)计算了与每个患者HLA等位基因结合的所有肽的预测IC50结合亲和力和等级百分数得分，代表与一组400,000个随机天然肽相比的预测亲和力等级。推定的新抗原结合剂是那些具有预测的结合亲和力<500nM或排名百分比得分<2％的肽。
将HLA LOH定位到系统发生树并鉴定平行进化
在每个测试的肿瘤区域中检测到的LOH事件认为是克隆事件，并定位到系统发生树的干上。对于异质性LOH事件，使用R包quadprog以二次编程方法将丧失的HLA等位基因的区域拷贝数与患者树结构和亚克隆癌细胞分数一起使用，以测定LOH事件的最佳位置。
这通过求解二次编程方程来实现：
min(-d^T b+1/2b^T D b)
其中约束：
A^T b>＝bvec
在每个分支处测试LOH事件。对于每种可能性，系统发生树分为两个，一个含有LOH事件后的所有克隆，另一个由树的剩余部分组成。构建2xn矩阵，其中n是采样区域的数目，其含有子树中每个亚克隆的癌细胞分数的区域总和和来自剩余树中的亚克隆的癌细胞分数的区域总和。将区域癌细胞分数矩阵乘以其自身的转置，以生成2x2矩阵，用于将输入(Dmat)输入到quadprog函数solve.QP中。通过将每个区域的LOHHLA计算的HLA等位基因拷贝数乘以区域癌细胞分数矩阵的转置来获得要最小化的载体(dvec)。最后，使用约束矩阵Amat(使得所有结果都必须为正)和约束向量bvec(使得剩余树的HLA等位基因的估算拷贝数为至少0.5)用Dmat和dvec调用solve.QP函数。输出来自在每个分支上放置LOH事件的观察拷贝数值和预测拷贝数值之间的误差，并且选择提供最小误差的解决方案。
检查每个定位的事件，并手动调节不适合系统进化树或具有较大误差值的事件，表明存在其他亚克隆或多个独立的HLA LOH事件。
评估聚焦和臂水平LOH的重要性
为了评估HLA LOH是否超过偶然预期发生，我们考虑了每个LOH事件本质上是聚焦(focal)事件还是臂水平事件。简言之，为了将LOH分类为臂水平或聚焦，我们聚焦于整个基因组的次要等位基因频率。首先，合并具有相同次要等位基因拷贝数的任何区段(如通过ASCAT预测)。随后，将跨越给定染色体臂长度>＝75％的区段分类为“臂水平”，而将＜75％的区段视为聚焦。
为了评估聚焦事件的显著性，对于每个肿瘤，测定服从聚焦次要等位基因丧失的基因组比例。假定该值反映每个肿瘤中聚焦次要等位基因丧失的可能性。基于此概率，我们分别为每个样品生成了像差状态(aberration state)(丧失或无丧失)，并测定了表现出丧失的样品比例。我们重复了此过程10,000次，以获得背景分布，该分布反映了鉴于每个样品中的丧失概率，观察丧失的可能性。通过计数显示比观察值显示更高比例丧失的模拟百分比测定p值，其反映观察到HLA基因座处看到的次要等位基因丧失水平的可能性。
使用每个肿瘤中臂水平等位基因特异性丧失的观察频率，对臂水平事件进行了相同的程序。
突变签名分析
如前所述(Jamal-Hanjani，2017)，使用deconstructSigs R包估算突变签名。
评估新抗原是否优先结合丧失的HLA等位基因
为了评估新抗原是否优先结合丧失的HLA等位基因，我们聚焦于至少一个肿瘤区域中表现出6种不同的HLA等位基因(即种系中任何等位基因无纯合性)和一种HLA单元型(3个亲本等位基因)丧失的肿瘤。
根据IC50结合评分对新抗原(如上定义)进行排序。除去重复突变，以确保每种新抗原对任何给定的突变均反映出最高的结合得分(最低的IC50值)。我们进一步过滤了突变列表，以仅包含发生在含有丧失事件(>5％VAF)的肿瘤区域中的亚克隆突变(如前所述(Jamal-Hanjani，2017)定义)。然后，针对每种肿瘤测定与每种单元型结合的亚克隆新抗原的数目。使用配对的wilcoxon检验比较与保留的单元型相比，与丧失的单元型结合的亚克隆新抗原的数目。
PD-L1免疫组织化学
在符合GCP的中心实验室(Targos Molecular Pathology GmbH)中用OptiViewDAB IHC检测试剂盒和OptiView扩增试剂盒(Ventana Medical Systems Inc.)在自动化染色平台上(Benchmark；Ventana)用抗人PD-L1兔单克隆抗体(克隆SP142；Ventana，Tucson，AZ)对4um厚的福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)组织切片进行PD-L1染色。在肿瘤细胞和肿瘤浸润免疫细胞上评估PD-L1表达。对于肿瘤细胞，PD-L1阳性细胞的比例估算为总肿瘤细胞的百分比。对于肿瘤浸润免疫细胞，记录了占据肿瘤的PD-L1阳性肿瘤浸润免疫细胞的百分比。评分由经训练的组织病理学家进行[根据以前发布的评分标准(Herbst，2014)]。
使用TCGA进行RNA-seq表达分析
从TCGA数据门户网站下载RNA测序数据。对于每个LUAD和LUSC样品，获得所有可用的“Level_3”基因水平数据。原始读段计数用作对R包DESeq2的输入以进行分析。使用0.05的FDR截留测定显著差异表达的基因。
量化与统计学分析
所有分析均在R统计环境版本>＝3.2.1中进行。所有统计检验都是双向的，除非明确规定，并且若P值小于0.05，则确定统计显著性，除非另有规定。使用费舍尔精确检验图2B，如上文对图3所述，未配对的Wilcoxon测试(用于图4A-C)和配对的Wilcoxon测试(用于图4D-E)进行比较。
数据和软件可用性
TRACERx 100分组包括由肺TRACERx研究(https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01888601,由独立的研究伦理学委员会批准,13/LO/1546)进行前瞻性分析的前100名患者，并且反映了(Jamal-Hanjani，2017)中描述的前瞻性100名患者分组。
序列数据可在欧洲生物信息学研究所(EBI)和基因组调控中心(CRG)托管的欧洲基因组-现象库(EGA)获得，登录号为EGAS00001002247(原发性肿瘤数据)。有关EGA的更多信息可参见https://ega-archive.org(人类数据欧洲基因组-现象库，同意进行生物医学研究)。
从癌症基因组图谱(TCGA,http://cancergenome.nih.gov/)经由https:// cghub.ucsc.edu获得了肺腺癌(LUAD，n＝397)和肺鳞状细胞癌(LUSC，n＝350)两者的TCGA肿瘤和匹配的种系外显子组测序BAM文件。数据如先前所述(Jamal Hanjani，2017)进行处理。
结果
使用LOHHLA推断肿瘤样品中的HLA LOH和不平衡
为了测定等位基因特异性拷贝数，大多数拷贝数工具依赖于在基因组或外显子组间肿瘤和匹配正常中单核苷酸多态性(SNP)的相对覆盖和变体等位基因频率(Van Loo；Shen,2016；Carter,2012)。然而，由于该区域的较差覆盖和多态性质，在HLA位点处推断拷贝数状态是成问题的。不能使用已经与人参考基因组比对的测序数据在HLA基因座处容易鉴定SNP，因为高度多态性的读段不会对齐，因此将弃去。的确，尽管是人基因组中最多态的区域之一，但是使用最先进的SNP调用器Platypus(Rimmer，2014)在来自TRACERx分组的97位患者(Jamal-Hanjani,2017)中鉴定三个HLA I类基因中的小于1(均值0.84，范围0-7)信息性杂合SNP的平均值。这些数据提示，常规的拷贝数调用算法不适合直接推断HLA基因座的单元型特异性拷贝数。
我们推断通过利用专门定位到个体种系HLA等位基因而非人参考基因组的读段，可以准确测定HLA单元型特异性拷贝数。为此，我们开发了LOHHLA(图1A)。LOHHLA的实施取决于五个步骤。第一，提取定位到基因组和染色体6(包括重叠群)的HLA区的肿瘤和种系读段。第二，通过将读段与患者特异性HLA等位基因(从HLA血清分型或推断工具，例如Polysolver(Shukla，2015)或Optitype(Szolek)获得)比对来生成肿瘤和种系HLA等位基因特异性.bam文件。第三，鉴定同源HLA等位基因之间的多态性位点。第四，利用鉴定的多态性位点，在每个HLA基因座处推断相对于种系的肿瘤覆盖(logR)和b-等位基因频率(BAF)。最后，为每个HLA基因测定HLA等位基因特异性拷贝数，说明肿瘤纯度和倍性(从拷贝数调用器获得，例如ASCAT(Van Loo，2010)或FACET(Shen，2016)。
据我们所知，目前尚无其他方法推断HLA基因座的单元型特异性拷贝数，因此，没有我们可以与LOHHLA拷贝数估算比较或者推断HLA单元型受到丧失的金标准方法。
因此，为了测试HLA拷贝数估算的准确性，我们假设邻近HLA基因座的基因组区段通常会表现出与HLA基因座自身相同的拷贝数概况，其适用于没有高度局部HLA事件的情况(图2D)。我们使用ASCAT(Van Loo，2010)估算来自97位患者的303个TRACERx NSCLC外显子组中HLA基因座周围的基因组区域中等位不平衡和LOH的频率(Jamal-Hanjani，2017)，并将这些与LOHHLA拷贝数估算进行比较。值得注意的是，鉴于ASCAT不设计用于推断哪个HLA单元型受到丧失或不平衡，因此对于此分析，我们只能比较ASCAT和LOHHLA是否表现出一致的拷贝数概况，而不是比较是否预测丧失一致的单元型。
我们观察到从LOHHLA和ASCAT获得的次要和主要等位基因拷贝数估算之间存在高度显著的关系(P<0.001，rho＝0.70，Spearman秩检验，图1B，图2A)，支持了LOHHLA准确估算拷贝数和LOH的效用。我们在246/288个肿瘤区域中发现了一致的等位不平衡估算(图1C和图2B-C)。使用LOHHLA发现了肿瘤区域中另外34个等位不平衡，而使用ASCAT而不是LOHHLA，仅8个肿瘤区域表现出等位不平衡的证据。在许多情况下，可以通过以下事实来解释ASCAT与LOHHLA之间的差异：如讨论，ASCAT不能直接推断HLA基因座处的单元型特异性拷贝数，因此错误假设5’或3’相邻区段的拷贝数覆盖HLA基因座(图2D)。
在264/288个肿瘤区域中观察到一致的LOH推论，在21个肿瘤区域中鉴定由LOHHLA定义的其他LOH，而通过ASCAT而非LOHHLA鉴定仅9个肿瘤区域含有丧失的单元型(图1D和图2C)。
为了进一步验证我们的方法，我们对来自27个肿瘤的82个肿瘤区域中HLA基因座极其接近的高度多态性的DNA段进行了片段分析(图3)。预测分析的肿瘤区域具有服从LOH的所有基因座(HLA-A、HLA-B和HLA-C)，或者无基因座受到影响。支持LOHHLA准确分类LOH的效用，我们观察到归类为表现出LOH、无LOH的等位不平衡或无观察到的不平衡的肿瘤之间的标准化等位比率的显著差异(p＝1.07e-19[LOH对无不平衡]，p＝4.57e-05[LOH对等位不平衡]，图3)。此外，使用LOHHLA比拷贝数工具ASCAT(Van Loo，2010)，Sequenza(Favero，2015)或TITAN(Ha，2014)，这三个类别之间的区别更加清晰。
总之，这些数据提示了LOHHLA能够准确推断肿瘤样品中的等位不平衡和LOH两者。尽管在大多数情况下，可以使用ASCAT(Van Loo)等拷贝数工具来推断HLA基因座是否受到等位不平衡和/或LOH，但是LOHHLA提供了额外的灵敏度和特异性来检测这些异常，即使它们是高度聚焦的。至关重要的是，LOHHLA还可以特异性推论哪些HLA等位基因同源物在三个HLA基因的每处均受到丧失，据我们所知，目前这用其他任何工具是不可能的。
NSCLC中HLA不平衡和丧失的发生率和时机
HLA突变(其具有破坏新抗原-MHC结合的能力)先前已在包括NSCLC的许多癌症类型中进行了描述(Shukla，2015)。然而，尽管与癌症和免疫逃逸有关，但很少检测到HLA基因中的突变(Lawrence，2014；Shukla，2015)。在我们的100位TRACERx患者分组中，使用Polysolver(Shukla，2015)，仅来自3名患者的肿瘤含有HLA基因中的非同义突变(图4)。一个肺腺癌肿瘤也获得了β-2微球蛋白(B2m)的突变，这对于MHC I类表达和肽结合稳定性至关重要。在该分组中未鉴定预测为破坏抗原呈递或MHC I类复合物的进一步突变。同样，对来自TCGA的174个肺鳞状细胞癌和223个肺腺癌患者进行的更广泛研究仅将8％和5％的肿瘤分别归类为含有HLA突变(Shukla，2015)。
在19/32(61％)的肺鳞状细胞癌和17/59(29％)的肺腺癌中，LOHHLA鉴定出HLALOH，其中一个母本或父本HLA等位基因丧失，导致HLA纯合性。正如在肺鳞状细胞癌中HLA突变更频繁发生一样(Shukla，2015)，与肺腺癌相比，我们还观察到了肺鳞状细胞癌中HLALOH的富集(p＝0.004)(图4A-B)。HLA LOH发生频率的增加以及以前抗原性肽不再在丧失的等位基因上呈递的可能性提示，HLA LOH具有作为比HLA或B2M突变更广泛的免疫破坏机制的能力。
为了研究HLA等位基因特异性丧失是否是每个癌细胞中克隆存在的肿瘤进化的早期事件，或者它是否仅在癌细胞的子集中亚克隆性存在，指示在进化中后来以及潜在响应免疫识别和逃避之间的平衡转换的发生，我们利用TRACERx数据集的高深度和多区域特性。在这两种组织学亚型中，HLA LOH似乎经常亚克隆发生，其中13/17例肺腺癌和9/17例肺鳞状细胞癌在癌细胞的子集中表现出HLA等位基因的丧失(图5A-B)。系统发生分析允许我们将HLA LOH事件定位到来自肿瘤进化树的可能亚克隆(图6-7)(Jamal-Hanjani，2017)。这些数据提示来自免疫系统的选择性压力可随着肿瘤形成而增加，并且此外在没有多区域测序的情况下，HLA LOH的普遍性可以是显著低估的。
为了进一步阐明HLA LOH在NSCLC肿瘤进化中的时机，我们获得了具有匹配脑转移的37例NSCLC原发性肿瘤的测序数据(Brastianos，2015)。与来自早期NSCLC的数据一致，我们在17/37(46％)的肿瘤中鉴定出HLA LOH，并且发现LOH事件在11/17(65％)的病例中是亚克隆发生的(图7G)。此外，当我们比较自同一患者采集的原发性和转移性样品时，与匹配的原发性肿瘤相比，我们观察到转移部位的HLA LOH富集(P＝0.08)，仅在转移性样品中含有HLA LOH的7名患者和观察到相反情况的仅1名患者，HLA LOH仅在原发性肿瘤中(图7H)。这些结果支持了HLA LOH在癌症进化的后期发生的观点，并指示在晚期疾病中可能有免疫逃逸机制的选择。
在NSCLC中正选择HLA丧失
考虑到与免疫逃逸的相关性以及HLA基因中克隆和亚克隆LOH两者的高发生，我们询问HLA LOH是否比偶然预期的情况显著更频率。考虑到每个肿瘤中LOH的频率，我们模拟了聚焦和臂水平事件两者的预期频率。观察到的聚焦而非臂水平HLA LOH的频率以比偶然预期的情况以显著更大的频率发生(图8，P<0.001和图9)。的确，我们在围绕这两种组织学亚型的HLA基因座为中心的聚焦LOH中观察到一个清晰的峰，强烈提示HLA基因座在NSCLC进化过程中受到选择性压力。当将分析限制于亚克隆LOH时，该峰更为明显(图9)，这与肿瘤进化后期的强选择压力相一致。
此外，与肿瘤进化后期HLA丧失的强选择性压力一致，在四个肿瘤中，我们观察到作为肿瘤系统发生树的分开分支上的独特事件发生的HLA单元型的丧失，这指示HLA丧失时具有趋异的平行进化。例如，在两个肺腺癌LTX080和LTX050中，我们发现相同的单元型在独特的亚克隆内丧失的证据(图6和图8C)。值得注意的是，在我们观察到平行进化的所有四种情况下，相同的等位基因在独特的分支上受到丧失，这指示这些等位基因的丧失特异地可以对于亚克隆扩充是需要的。我们还注意到，在某些情况下(例如LTX041)，仅一个HLA基因受到等位基因特异性丧失，这暗示干预与该基因特异性相关的新抗原呈递的选择性益处。
与最近描述的整个肿瘤间HLA基因中的显著突变频率(Shukla，2015)一起，这些数据暗示HLA LOH为肺癌进化中免疫逃逸的常见机制，此外，表明免疫系统作用为分支肿瘤形成过程中的强选择压力。
还值得注意的是，虽然在37个肿瘤中鉴定出HLA LOH，但我们没有鉴定任何表现出HLA纯合缺失的肿瘤。与此观察结果一致，已经在HLA基因中鉴定的突变的变体等位基因频率指示杂合状态(Shukla，2015)。这些数据支持以下观点：HLA单元型的单个拷贝可以是强制的，以避免NK介导的靶细胞裂解(Moretta，2014)。
HLA丧失反映免疫编辑并与亚克隆突变的富集相关
可想到，若含有HLA单元型的同源染色体之一遭受拷贝数丧失，则呈递给T细胞的推定新抗原的数目将减少。因此，我们假设HLA单元型的丧失可允许亚克隆扩充，并会与突变/新抗原负荷增加有关。
我们首先比较了在HLA基因座处有或没有LOH的肿瘤样品中存在的非同义突变和新抗原的数目，而不考虑HLA LOH事件的时机或克隆性质。虽然总体上，我们观察到表现出任何HLA LOH的肿瘤样品中非同义突变(图10A)和新抗原(图11A)的数目的显著增加，但是当分别考虑亚型时，这并不显著。(NSCLC p＝0.016；肺腺癌p＝0.07；肺鳞状细胞癌p＝0.82，wilcoxon检验)。然而，值得注意的是，与无HLA LOH的21/54例肿瘤相比，我们仅观察到3/36例具有HLA LOH的肿瘤，其表现出较低的突变负荷(如通过NSCLC突变负荷的最低四分位数定义)。
当我们考虑突变的克隆性质时，我们发现在具有HLA LOH的肿瘤中，亚克隆而非克隆非同义突变的数目显著增加(图10B-C)(NSCLC p＝0.008；肺腺癌)p＝0.01；肺鳞状细胞癌p＝0.6，wilcoxon检验)和新抗原(图11B-C)。此观察结果与经常作为分支亚克隆事件发生的HLA LOH一致，并指示HLA LOH可允许潜在抗原性亚克隆突变的积累(图10C)。与此一致，我们发现当HLA LOH作为克隆事件发生时，在肿瘤的系统发生树的干上，这与升高的克隆(NSCLC p＝0.002；肺腺癌p＝0.01；肺鳞状细胞癌p＝0.29，wilcoxon检验)和亚克隆(NSCLC p＝0.03；肺腺癌p＝0.004；肺鳞状细胞癌p＝0.89，wilcoxon检验)非同义突变和新抗原负荷两者显著相关(图10B，图11B)。
当我们在区域水平上考虑HLA LOH事件时，与来自没有任何HLA LOH证据的患者的肿瘤区域相比，我们还观察到表现出HLA丧失的肿瘤区域之间的亚克隆突变显著增加(图11D；NSCLC p＝1.9e-05；肺腺癌p＝0.009；肺鳞状细胞癌p＝0.07)。令人感兴趣的是，即使在没有HLA LOH的肿瘤区域中，但在作为整体的肿瘤中HLA LOH的证据，与源自没有任何HLALOH证据的肿瘤的肿瘤区域相比，我们观察到亚克隆突变的负荷显著更高(图11D)。因此，尽管HLA LOH可允许随后的亚克隆扩充，但具有高突变负荷的肿瘤可以处于HLA LOH事件的增加的选择性压力下。
接下来，我们考虑发生HLA LOH事件的特定癌症亚克隆，从而使我们更直接评估HLA LOH对癌细胞中非同义突变和新抗原负荷的影响(图11E)。在具有亚克隆HLA LOH的肿瘤中，我们直接比较含有HLA丧失的癌症亚克隆与其源自相同祖先癌细胞但没有HLA丧失的姐妹亚克隆的突变负荷。具有HLA LOH的亚克隆始终比其没有HLA LOH的对应物显示更高的非同义突变负荷，而不管组织学亚型如何(图10D；NSCLC p＝4e-04；肺腺癌p＝0.018；肺鳞状细胞癌p＝0.008)。实际上，仅有两个具有HLA LOH的亚克隆的情况，所述亚克隆比其没有HLA LOH的姐妹亚克隆具有更少的非同义突变。该结果提示了HLA LOH直接促成在含有HLALOH的肿瘤中观察到的亚克隆非同义突变的增加。
虽然仅有含有HLA LOH事件的肿瘤中低突变负荷的三种情况(图10A)并且在这两种癌症类型中观察到含有HLA LOH的亚克隆中突变负荷增加，但我们注意到仅在肺腺癌中观察到具有HLA等位基因丧失的肿瘤区域中非同义突变负荷的显著增加。这提示尽管HLALOH可允许获得亚克隆突变，但存在有肺鳞状癌中的其他机制，其促成没有HLA LOH的肿瘤中观察到的较高的亚克隆突变负荷。
为了解决特定的突变过程是否促成没有HLA LOH的肿瘤中存在的亚克隆突变负荷，我们询问了每种肿瘤中存在的突变签名(Alexandrov，2013；Rosenthal，2015)。在表现出任何HLA LOH的肺腺癌肿瘤中，我们观察到APOBEC致突变签名(签名2和签名13)显著增加(NSCLC p＝0.03；肺腺癌p＝0.003，肺鳞状细胞癌p＝0.63)；然而，在该分组中发现的其他签名(签名1A，4和5)似乎在组之间没有差异性贡献(图12)。
仅与保持的HLA等位基因结合的新抗原会被呈递给免疫系统。因此，我们推断若HLA LOH反映癌症免疫编辑，则与保持的HLA等位基因相比预期观察到亚克隆抗原的富集，所述亚克隆抗原预测与丧失的HLA等位基因结合。因此，我们进一步研究了在至少一个肿瘤区域(n＝20；9个肺腺癌和11个肺鳞状细胞癌)中具有6个独特的HLA等位基因和1个HLA单元型(3个等位基因)丧失的肿瘤。与代表免疫编辑和促进亚克隆新抗原的积累的HLA位点处的LOH一致，我们观察到与保持的等位基因相比，预测与丧失的HLA等位基因结合的亚克隆新抗原的显著富集(图10E)(P＝0.0083，配对的wilcoxon检验)。当将分析限于肺鳞状细胞癌而不是肺腺癌(肺腺癌，P＝0.29；肺鳞状细胞癌，P＝0.02)时，这仍然是重要的。在一种肿瘤LTX083(肺腺癌)中，我们观察到总共1220个预测产生新抗原的突变，其中92％预测与丧失的HLA等位基因结合。
为了更广泛地确定HLA LOH可以对呈递给免疫系统的新抗原具有的影响，我们在37名表现出任何HLA LOH的患者的完整分组中鉴定预测与丧失的等位基因结合的新抗原(图10F)。我们发现，所有患者含有预测与现在丧失的HLA等位基因结合的突变，这突出显示了HLA LOH在临床环境中可以对靶向推定的新抗原的潜在影响，例如通过个性化的新抗原疫苗方法(Ott，2017；Sahin，2017)。值得注意的是，在没有HLA单元型特异性拷贝数估算的情况下，此分析将是不可能的。
HLA丧失和免疫表型
接下来，为了研究HLA丧失是否与特定的肿瘤微环境有关，我们进行了免疫组织化学分析，以确定肿瘤和免疫细胞上的PDL1表达。PDL1是免疫抑制受体PD1的配体，并且其表达可反映对主动免疫系统的癌症适应性免疫应答。
我们发现与无任何HLA LOH的肿瘤相比，表现出克隆HLA LOH的肿瘤的特征是免疫细胞的PDL1染色显著升高(P＝0.029)，并且观察到肿瘤细胞上PDL1染色升高的趋势(P＝0.14)。这些数据与HLA LOH可以促进响应主动免疫微环境的免疫逃逸的观点相一致。
最后，为了验证我们在更大分组中的发现并探索HLA LOH是否与免疫表型相关，我们从TCGA获得了383例肺腺癌和309例肺鳞状细胞癌样品(Campbell，2016)。
与来自TRACERx分组的结果一致，我们发现HLA LOH在肺鳞状细胞癌(133/309)和肺腺癌(118/383)肿瘤中高度普遍，再次是肺鳞状细胞癌中的较为常见的事件(p＝0.001，费舍尔精确检验)(图13A)。由于增加的来自TCGA的样品大小，我们还可以进一步分析在单个基因座处具有HLA LOH(56个肺鳞癌，56个肺腺癌)或在所有三个HLA基因座处具有HLALOH(77个肺鳞状细胞癌，62个肺腺癌)的样品。与TRACERx样品一致，在表现出HLA LOH的肺腺癌肿瘤中观察到显著更高的非同义突变负荷(p＝0.0001，wilcoxon检验)，无论HLA LOH影响单个基因座(p＝0.002，wilcoxon检验)还是所有三个HLA基因座(p＝0.003，wilcoxon检验)(图13B)。值得注意的是，对于可获得RNA-seq的数据集，我们观察到有或没有HLA-LOH的肿瘤间在HLA-A、B或C的RNAseq表达上均无显著差异，这指示在不考虑使用LOHHLA的单元型特异性的情况下，RNA不能用于可靠鉴定HLA LOH。
先前的工作已经鉴定指示免疫活性和/或免疫细胞浸润物的免疫签名(Rooney,2015；Li,2016；Davoli,2017)。通过使用这些签名，我们能够研究HLA丧失是否与特定的免疫表型有关。在所有三个基因座处具有HLA LOH的肺腺癌中，我们观察到CD8+T细胞的丰度增加，如通过先前发表的方法(Li)估算的(p＝0.04，wilcoxon检验)。此外，在具有HLA LOH的肺腺癌和肺鳞状细胞癌两者中，我们鉴定出显著升高的细胞溶解活性得分，其测量CD8+T细胞活化后上调的两个基因，颗粒酶A(GZMA)和穿孔蛋白(PRF1)的水平(Rooney)(图13C)。在所有三个基因座处具有HLA LOH的肺腺癌中，我们观察到CD8+T细胞的丰度的增加和与改善的检查点阻断应答相关的表达概况(Li,2016；Rooney,2015；Tumeh,2014；Herbst,2014；Ribas,2015；Piha-Paul,2016)。此外，我们鉴定出NK细胞增加，提示单独的HLA LOH可中断抑制性NK细胞/MHC相互作用(图13C)。在有和没有LOH的肿瘤之间的差异表达分析证实，具有HLA LOH的肺腺癌而非肺鳞状细胞癌中PD-L1和效应分子如颗粒酶A、B和-H以及STAT1和IFNγ增加。这些数据提示，具有HLA丧失的肺腺癌肿瘤具有更有活性的免疫微环境，并且抗原呈递的破坏可以起到逃避免疫系统的机制的作用。
表S1：具有HLA LOH对没有HLA LOH的肺腺癌中显著差异表达的免疫基因
baseMean log2FoldChan lfcSE stat pvalue padj
ADAR 20464.572 0.33681769 0.07050847 4.77698168 1.78E-06 0.00023037
CD244 80.3637882 0.4386209 0.15169315 2.89150098 0.00383406 0.03555357
CD274 252.875369 0.62413258 0.182343 3.4228492 0.00061968 0.01092229
CISH 2152.3247 -0.5647881 0.13152013 -4.2943097 1.75E-05 0.00107987
CNTFR 16.4832332 -0.930897 0.2251708 -4.1341818 3.56E-05 0.00167619
CXCL10 1661.47782 0.51766283 0.18737132 2.76276452 0.00573141 0.04635113
GZMA 513.167711 0.68095869 0.16875497 4.03519182 5.46E-05 0.0022004
GZMB 483.606115 0.57112356 0.17806044 3.20747029 0.00133908 0.01792377
GZMH 192.868787 0.50567793 0.17441457 2.89928727 0.00374012 0.03500216
HHLA2 1420.84224 -0.830894 0.24216229 -3.4311453 0.00060104 0.01074405
HLA-DQB1 12945.44 -0.562477 0.1703199 -3.3024737 0.00095836 0.01432935
IFNG 38.6691528 0.59658884 0.21148721 2.82092158 0.00478859 0.0411964
IFRD1 1773.18959 0.30982523 0.11285137 2.74542723 0.00604322 0.04773899
IL15 223.10475 0.44811921 0.13461896 3.32879715 0.00087222 0.01355629
IL1A 54.8220652 0.8953501 0.20896873 4.2846128 1.83E-05 0.00109258
IL1B 346.227047 0.62701377 0.16223619 3.86482063 0.00011117 0.00354474
IL2RB 1121.20854 0.39996941 0.13922619 2.872803 0.00406848 0.03699801
IRF1 3852.92659 0.39739594 0.11506885 3.45354929 0.00055326 0.01013419
IRF4 646.735229 0.49456082 0.1754994 2.81802001 0.00483208 0.04136758
MADCAM1 9.08894517 -0.5386424 0.19674534 -2.7377645 0.00618584 0.04846157
MPL 32.644779 -0.31813 0.11368205 -2.7984185 0.00513535 0.04315725
NR4A1 6647.98795 -0.557312 0.17719956 -3.1451096 0.00166025 0.02061118
PVR 2921.01052 0.25504895 0.09367721 2.72263614 0.00647633 0.04996622
SP110 1343.37583 0.23814933 0.08717816 2.73175438 0.00629981 0.04891736
STAT1 16843.0562 0.36611007 0.11898785 3.07686942 0.00209187 0.0239596
TAP1 9613.85234 0.36988624 0.13172484 2.80802204 0.00498468 0.04220568
TNFSF13 3083.20997 -0.3707851 0.1037302 -3.5745142 0.00035088 0.00751138
ULBP1 80.3432407 0.51683211 0.17451923 2.96146224 0.00306182 0.03082616
讨论
丧失呈递生产性肿瘤新抗原的能力可导致逃避免疫捕食。新抗原呈递的组成部分是HLA I类分子，它向细胞表面上的T细胞呈递表位。因此，导致HLA纯合性的HLA等位基因丧失可以是免疫逃逸的机制(图14)。
然而，HLA基因座的多态性性质妨碍使用常规拷贝数工具进行准确的拷贝数调用。在这里，我们介绍了LOHHLA，一种使用下一代测序数据来系统评估肺癌进化中HLA丧失的普遍性和重要性的工具(图1)。
我们使用两种独立的方法评估LOHHLA的性能。我们发现LOHHLA LOH和等位不平衡估算与使用最先进的拷贝数工具ASCAT(Van Loo，2010)从相邻基因组区段推断的结果一致。DNA多态性段的片段分析验证了LOHHLA的准确性。重要的是，LOHHLA还能够确定哪种特定的HLA单元型受拷贝数丧失，这使用常规拷贝数工具是不可能的。
使用LOHHLA，我们发现在40％的早期NSCLC中发生HLA丧失。聚焦性质和高频率(超出使用模拟所预期)提示在NSCLC进化中强烈选择HLA LOH和免疫编辑。HLA丧失的亚克隆频率(发生在肿瘤系统发生树的分支上的癌细胞子集中)提示它通常是肿瘤进化中的晚期事件，并且局部的、区域特异性的免疫微环境可以在塑造分支肿瘤进化中起到关键选择力的作用。与此相一致，在四个肿瘤中，我们观察到了HLA丧失平行进化的证据，提示逃避免疫捕食代表了对肿瘤进化的重要限制。这些结果与HIV中的观察结果相似，其中与具有杂合HLA等位基因的患者相比，具有纯合HLA等位基因的患者表现出快速进展成AIDS(Martin和Carrington，2013)。
在肺腺癌和肺鳞状细胞癌两者中，与源自相同祖先癌细胞但没有HLA LOH的亚克隆相比，含有HLA LOH的亚克隆与显著升高的亚克隆非同义突变/新抗原负荷有关。此外，HLA LOH与免疫激活的RNA签名有关，并且发现具有HLA LOH的肿瘤表现出新抗原的富集，所述抗原预测为与丧失的HLA等位基因结合。这些数据提示，在免疫捕食的选择压力下，HLA等位基因的丧失可允许亚克隆扩充，并导致对免疫系统变得有效不可见的先前抗原性的突变。
肺鳞状细胞肿瘤中的高突变负荷和低水平的HLA表达(McGranahan，2016)，甚至在没有HLA LOH的肿瘤中也提示了逃避免疫的备选机制，例如上调免疫抑制分子(例如PD-1，LAG3)(Spranger 2013；)和/或通过其他机制(例如B2M或NLRC5的突变)破坏新抗原的呈递(del Campo 2014；Yoshihama，2016)可以发生在癌症的此子集中。在这方面，我们注意到可以将LOHHLA扩展为在已进行单元型分析的任何基因组区段上进行单元型特异性拷贝数。例如，若已经进行了II类HLA分型，则可以实施LOHHLA来评估在肿瘤进化中发生II类HLA丧失的程度，以及哪个单元型受到丧失。
总之，LOHHLA能够准确估算单元型特异性HLA丧失，揭示HLA LOH是NSCLC的共同特征，促进免疫逃逸和亚克隆基因组进化。
实施例2
也可以实施LOHHLA算法以探索HLA II类LOH。
如图16所示，若进行了HLA II类分型，则LOHHLA能够评估等位基因特异性拷贝数。在此种情况下，使用xHLA[Xie，PMDI：28674023]对HLA-DRB1基因座进行HLA分型，并且揭示了患者含有两个独特的等位基因DRB1:10:01:01:01和DRB1:01:01:01。
使用LOHHLA(如实施例1中概述的)将正常和肿瘤序列读段与患者特异性的HLA等位基因进行比对证明了HLA等位基因的不平衡(图16-A-C)。纯度和倍性估算的合并揭示了HLA-DRB1:01:01:01的丧失，剩余HLA-DRB1:10:01:01:01的一个拷贝。
参考文献
Alexandrov,L.B.,Nik-Zainal,S.,Wedge,D.C.,Aparicio,S.A.,Behjati,S.,Biankin,A.V.,Bignell,G.R.,Bolli,N.,Borg,A.,Borresen-Dale,A.L.,et al.(2013).Signatures of mutational processes in human cancer.Nature 500,415-421.
Andreatta,M.,and Nielsen,M.(2016).Gapped sequence alignment usingartificial neural networks:application to the MHC class Isystem.Bioinformatics32,511-517.
Brown,S.D.,Warren,R.L.,Gibb,E.A.,Martin,S.D.,Spinelli,J.J.,Nelson,B.H.,and Holt,R.A.(2014).Neo-antigens predicted by tumour genome meta-analysis correlate with increased patient survival.Genome research 24,743-750.
Campbell,J.D.,Alexandrov,A.,Kim,J.,Wala,J.,Berger,A.H.,Pedamallu,C.S.,Shukla,S.A.,Guo,G.,Brooks,A.N.,Murray,B.A.,et al.(2016).Distinctpatterns of somatic genome alterations in lung adenocarcinomas and squamouscell carcinomas.Nature genetics 48,607-616.
Campoli,M.,and Ferrone,S.(2008).HLA antigen changes in malignantcells:epigenetic mechanisms and biologic significance.Oncogene 27,5869-5885.
Carter,S.L.,Cibulskis,K.,Helman,E.,McKenna,A.,Shen,H.,Zack,T.,Laird,P.W.,Onofrio,R.C.,Winckler,W.,Weir,B.A.,et al.(2012).Absolute quantificationof somatic DNA alterations in human cancer.Nature biotechnology30,413-421.
Davoli,T.,Uno,H.,Wooten,E.C.,and Elledge,S.J.(2017).Tumour aneuploidycorrelates with markers of immune evasion and with reduced response toimmunotherapy.Science(New York,NY 355.
del Campo,A.B.,Kyte,J.A.,Carretero,J.,Zinchencko,S.,Mendez,R.,Gonzalez-Aseguinolaza,G.,Ruiz-Cabello,F.,Aamdal,S.,Gaudernack,G.,Garrido,F.,et al.(2014).Immune escape of cancer cells with beta2-microglobulin loss overthe course of metastatic melanoma.Int J Cancer 134,102-113.
Hanahan,D.,and Weinberg,R.A.(2011).Hallmarks of cancer:the nextgeneration.Cell 144,646-674.
Hicklin,D.J.,Marincola,F.M.,and Ferrone,S.(1999).HLA class I antigendownregulation in human cancers:T-cell immunotherapy revives an old story.MolMed Today 5,178-186.
Hoof,I.,Peters,B.,Sidney,J.,Pedersen,L.E.,Sette,A.,Lund,O.,Buus,S.,and Nielsen,M.(2009).NetMHCpan,a method for MHC class I binding predictionbeyond humans.Immunogenetics 61,1-13.
Jamal-Hanjani,M.,Wilson,G.A.,McGranahan,N.,Birkbak,N.J.,Watkins,T.B.K.,Veeriah,S.,Shafi,S.,Johnson,D.H.,Mitter,R.,Rosenthal,R.,et al.(2017).Tracking the Evolution of Non-Small-Cell Lung Cancer.The New England journalof medicine 376,2109-2121.
Langmead,B.,and Salzberg,S.L.(2012).Fast gapped-read alignment withBowtie 2.Nat Methods 9,357-359.
Lawrence,M.S.,Stojanov,P.,Mermel,C.H.,Robinson,J.T.,Garraway,L.A.,Golub,T.R.,Meyerson,M.,Gabriel,S.B.,Lander,E.S.,and Getz,G.(2014).Discoveryand saturation analysis of cancer genes across 21 tumour types.Nature 505,495-501.
Li,B.,Severson,E.,Pignon,J.C.,Zhao,H.,Li,T.,Novak,J.,Jiang,P.,Shen,H.,Aster,J.C.,Rodig,S.,et al.(2016).Comprehensive analyses of tumourimmunity:implications for cancer immunotherapy.Genome biology 17,174.
Li,H.,and Durbin,R.(2009).Fast and accurate short read alignment withBurrows-Wheeler transform.Bioinformatics 25,1754-1760.
Martin,M.P.,and Carrington,M.(2013).Immunogenetics of HIVdisease.Immunological reviews 254,245-264.
McGranahan,N.,Furness,A.J.,Rosenthal,R.,Ramskov,S.,Lyngaa,R.,Saini,S.K.,Jamal-Hanjani,M.,Wilson,G.A.,Birkbak,N.J.,Hiley,C.T.,et al.(2016).Clonalneoantigens elicit T cell immunoreactivity and sensitivity to immunecheckpoint blockade.Science(New York,NY 351,1463-1469.
Mehta,A.M.,Jordanova,E.S.,Kenter,G.G.,Ferrone,S.,and Fleuren,G.J.(2008).Association of antigen processing machinery and HLA class I defectswith clinicopathological outcome in cervical carcinoma.Cancer ImmunolImmunother 57,197-206.
Moretta,L.,Montaldo,E.,Vacca,P.,Del Zotto,G.,Moretta,F.,Merli,P.,Locatelli,F.,and Mingari,M.C.(2014).Human natural killer cells:origin,receptors,function,and clinical applications.Int Arch Allergy Immunol 164,253-264.
Nielsen,M.,Lundegaard,C.,Worning,P.,Lauemoller,S.L.,Lamberth,K.,Buus,S.,Brunak,S.,and Lund,O.(2003).Reliable prediction of T-cell epitopes usingneural networks with novel sequence representations.Protein Sci 12,1007-1017.
Ott,P.A.,Hu,Z.,Keskin,D.B.,Shukla,S.A.,Sun,J.,Bozym,D.J.,Zhang,W.,Luoma,A.,Giobbie-Hurder,A.,Peter,L.,et al.(2017).An immunogenic personalneoantigen vaccine for patients with melanoma.Nature.
Rimmer,A.,Phan,H.,Mathieson,I.,Iqbal,Z.,Twigg,S.R.,Consortium,W.G.S.,Wilkie,A.O.,McVean,G.,and Lunter,G.(2014).Integrating mapping-,assembly-andhaplotype-based approaches for calling variants in clinical sequencingapplications.Nature genetics 46,912-918.
Rizvi,N.A.,Hellmann,M.D.,Snyder,A.,Kvistborg,P.,Makarov,V.,Havel,J.J.,Lee,W.,Yuan,J.,Wong,P.,Ho,T.S.,et al.(2015).Cancer immunology.Mutationallandscape determines sensitivity to PD-1 blockade in non-small cell lungcancer.Science(New York,NY 348,124-128.
Rooney,M.S.,Shukla,S.A.,Wu,C.J.,Getz,G.,and Hacohen,N.(2015).Molecular and genetic properties of tumours associated with local immunecytolytic activity.Cell 160,48-61.
Rosenthal,R.,McGranahan,N.,Herrero,J.,Taylor,B.S.,and Swanton,C.(2016).deconstructSigs:delineating mutational processes in single tumoursdistinguishes DNA repair deficiencies and patterns of carcinomaevolution.Genome biology 17,31.
Sahin,U.,Derhovanessian,E.,Miller,M.,Kloke,B.P.,Simon,P.,Lower,M.,Bukur,V.,
Tadmor,A.D.,Luxemburger,U.,Schrors,B.,et al.(2017).Personalized RNAmutanome vaccines mobilize poly-specific therapeutic immunity againstcancer.Nature.
Schumacher,T.N.,and Schreiber,R.D.(2015).Neoantigens in cancerimmunotherapy.Science(New York,NY 348,69-74.
Shen,R.,and Seshan,V.E.(2016).FACETS:allele-specific copy number andclonal heterogeneity analysis tool for high-throughput DNA sequencing.NucleicAcids Res 44,e131.
Shukla,S.A.,Rooney,M.S.,Rajasagi,M.,Tiao,G.,Dixon,P.M.,Lawrence,M.S.,Stevens,J.,Lane,W.J.,Dellagatta,J.L.,Steelman,S.,et al.(2015).Comprehensiveanalysis of cancer-associated somatic mutations in class I HLA genes.Naturebiotechnology 33,1152-1158.
Snyder,A.,Makarov,V.,Merghoub,T.,Yuan,J.,Zaretsky,J.M.,Desrichard,A.,Walsh,L.A.,Postow,M.A.,Wong,P.,Ho,T.S.,et al.(2014).Genetic basis forclinical response to CTLA-4 blockade in melanoma.The New England journal ofmedicine 371,2189-2199.
Spranger,S.,Spaapen,R.M.,Zha,Y.,Williams,J.,Meng,Y.,Ha,T.T.,andGajewski,T.F.(2013).Up-regulation of PD-L1,IDO,and T(regs)in the melanomatumour microenvironment is driven by CD8(+)T cells.Sci Transl Med 5,200ra116.
Szolek,A.,Schubert,B.,Mohr,C.,Sturm,M.,Feldhahn,M.,and Kohlbacher,O.(2014).OptiType:precision HLA typing from next-generation sequencingdata.Bioinformatics 30,3310-3316.
Tran,E.,Robbins,P.F.,Lu,Y.C.,Prickett,T.D.,Gartner,J.J.,Jia,L.,Pasetto,A.,Zheng,Z.,Ray,S.,Groh,E.M.,et al.(2016).T-Cell Transfer TherapyTargeting Mutant KRAS in Cancer.The New England journal of medicine 375,2255-2262.
Van Allen,E.M.,Miao,D.,Schilling,B.,Shukla,S.A.,Blank,C.,Zimmer,L.,Sucker,A.,Hillen,U.,Foppen,M.H.,Goldinger,S.M.,et al.(2015).Genomiccorrelates of response to CTLA-4blockade in metastatic melanoma.Science(NewYork,NY 350,207-211.
Van Loo,P.,Nordgard,S.H.,Lingjaerde,O.C.,Russnes,H.G.,Rye,I.H.,Sun,W.,Weigman,V.J.,Marynen,P.,Zetterberg,A.,Naume,B.,et al.(2010).Allele-specific copy number analysis of tumours.Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America 107,16910-16915.
Yoshihama,S.,Roszik,J.,Downs,I.,Meissner,T.B.,Vijayan,S.,Chapuy,B.,Sidiq,T.,Shipp,M.A.,Lizee,G.A.,and Kobayashi,K.S.(2016).NLRC5/MHC class Itransactivator is a target for immune evasion in cancer.Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America 113,5999-6004.
以上说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所描述的方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员将是明显的。尽管已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，所要求保护的发明不应过度限于此类具体的实施方案。实际上，所描述的用于实施本发明的方式的各种修改意图落入所附权利要求书的范围内，所述修饰对于生物化学和生物技术或相关领域的技术人员而言是明显的。

Claims (34)

1.用于测定HLA等位基因是否在受试者的肿瘤中丧失的方法，其中所述方法包括测定所述肿瘤中所述HLA等位基因的特异性拷贝数的步骤。
2.根据权利要求1的方法，其中所述方法是基于序列的方法。
3.权利要求1或权利要求2的方法，其中对来自受试者的肿瘤样品的序列信息进行所述方法。
4.权利要求3的方法，其中对来自受试者的肿瘤样品的HLA序列信息进行所述方法。
5.根据权利要求1的方法，其中所述方法包括以下步骤中的一个或多个：
(i)将来自受试者的肿瘤样品的HLA等位基因序列信息与基于所述受试者的HLA类型的HLA等位基因参考序列进行比对；
(ii)测定同源HLA等位基因中的错配位置，并测定每个HLA等位基因的错配覆盖；
(iii)基于步骤(ii)中测定的错配和覆盖测定每个HLA等位基因的比率和等位基因频率；
(iv)基于步骤(iii)中测定的比率和等位基因频率测定所述肿瘤样品中每个HLA等位基因的拷贝数。
6.根据权利要求5的方法，其中所述方法包括步骤(i)至(iv)的全部。
7.根据权利要求1至7中任一项的方法，其中通过使用由下一代测序(NGS)获得的信息来进行步骤(i)。
8.根据权利要求1至8中任一项的方法，其中使用Smith-Waterman算法或Biostrings R包来进行步骤(ii)。
9.根据权利要求1至9中任一项的方法，其中使用SAMtools进行步骤(iii)。
10.根据权利要求1至10中任一项的方法，其中使用ASCAT或FACET进行步骤(iv)。
11.根据权利要求1至10中任一项的方法，其中所述HLA序列信息是RNA序列信息或DNA序列信息。
12.治疗或预防受试者中的癌症的方法，其包括靶向新抗原(neoantigen)，所述新抗原预测由HLA等位基因编码的HLA分子呈递，所述HLA等位基因已经测定为在肿瘤中尚未丧失，其中测定所述HLA等位基因是否已经丧失包括测定所述肿瘤中所述HLA等位基因的特异性拷贝数的步骤。
13.根据权利要求12的方法，其中通过基于序列的方法来进行测定所述HLA等位基因是否已经丧失。
14.根据权利要求13的方法，其中对来自受试者的肿瘤样品的HLA序列信息进行所述方法。
15.根据权利要求12至14中任一项的方法，其中所述新抗原是克隆新抗原。
16.根据权利要求12至15中任一项的方法，其包括对所述受试者施用：
(i)新抗原，所述新抗原预测由HLA等位基因编码的HLA分子呈递，所述HLA等位基因已经测定为在肿瘤中尚未丧失；
(ii)识别新抗原的免疫细胞，所述新抗原预测由HLA等位基因编码的HLA分子呈递，所述HLA等位基因已经测定为在肿瘤中尚未丧失；或
(iii)识别新抗原的抗体，所述新抗原预测由HLA等位基因编码的HLA分子呈递，所述HLA等位基因已经测定为在肿瘤中尚未丧失。
17.根据权利要求16的方法，其中所述免疫细胞是T细胞、B细胞或树突细胞。
18.根据权利要求17的方法，其中所述免疫细胞是T细胞。
19.根据权利要求16的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
20.根据权利要求12至19中任一项的方法，其中所述癌症选自下组：膀胱癌、胃癌、食道癌、乳腺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肾癌(肾细胞)、肺癌(小细胞、非小细胞和间皮瘤)、脑癌(神经胶质瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤)、黑素瘤、淋巴瘤、小肠癌(十二指肠和空肠)、白血病、胰腺癌、肝胆肿瘤、生殖细胞癌、前列腺癌，头颈癌、甲状腺癌和肉瘤。
21.根据权利要求20的方法，其中所述癌症是肺癌。
22.根据权利要求12至21中任一项的方法，其中所述受试者是人。
23.组合物，其包含新抗原、新抗原特异性免疫细胞或对新抗原特异性的抗体，其中所述新抗原预测由HLA等位基因编码的HLA分子呈递，所述HLA等位基因已经测定为在肿瘤中尚未丧失，其中测定所述HLA等位基因是否已经丧失包括测定所述肿瘤中所述HLA等位基因的特异性拷贝数的步骤。
24.根据权利要求23的组合物，其中所述免疫细胞是T细胞。
25.根据权利要求24的组合物，其中所述组合物是靶向新抗原的T细胞富集的，所述新抗原预测由HLA等位基因编码的HLA分子呈递，所述HLA等位基因已经测定为在肿瘤中尚未丧失。
26.用于提供靶向新抗原的T细胞群体的方法，所述新抗原预测由HLA等位基因编码的HLA分子呈递，所述HLA等位基因已经测定为在受试者的肿瘤中尚未丧失，所述方法包括以下步骤：
i)从所述受试者分离T细胞群体；和
ii)扩充所述T细胞群体以增加靶向所述新抗原的T细胞的数目或相对比例，
其中测定所述HLA等位基因是否已经丧失包括测定所述肿瘤中所述HLA等位基因的特异性拷贝数的步骤。
27.组合物，其包含通过根据权利要求26的方法获得或可获得的T细胞群体。
28.免疫原性组合物或疫苗，其包含新抗原，所述新抗原预测由HLA等位基因编码的HLA分子呈递，所述HLA等位基因已经测定为在肿瘤中尚未丧失，其中测定所述HLA等位基因是否已经丧失包括测定所述肿瘤中所述HLA等位基因的特异性拷贝数的步骤。
29.根据权利要求28的组合物或疫苗，其中所述新抗原是肽、蛋白质、编码所述肽或蛋白质的DNA或RNA分子的形式，或被包含在细胞中。
30.细胞或其群体，所述细胞在其表面上表达新抗原性分子或其部分，其中所述新抗原性分子或其部分预测由HLA等位基因编码的HLA分子呈递，所述HLA等位基因已经测定为在肿瘤中尚未丧失，其中测定所述HLA等位基因是否已经丧失包括测定所述肿瘤中所述HLA等位基因的特异性拷贝数的步骤。
31.新抗原、识别新抗原的免疫细胞或识别新抗原的抗体，用于治疗或预防受试者中的癌症，其中所述新抗原预测由HLA等位基因编码的HLA分子呈递，所述HLA等位基因已经测定为在肿瘤中尚未丧失，其中测定所述HLA等位基因是否已经丧失包括测定所述肿瘤中所述HLA等位基因的特异性拷贝数的步骤。
32.新抗原、识别新抗原的免疫细胞或识别新抗原的抗体在制备用于治疗或预防受试者中的癌症的药物中的用途，其中所述新抗原预测由HLA等位基因编码的HLA分子呈递，所述HLA等位基因已经测定为在肿瘤中尚未丧失，其中测定所述HLA等位基因是否已经丧失包括测定所述肿瘤中所述HLA等位基因的特异性拷贝数的步骤。
33.根据前述权利要求中任一项的方法、组合物、新抗原特异性免疫细胞或对新抗原特异性的抗体、或它们的用途，其中已经通过根据权利要求1至11中任一项的方法测定所述HLA等位基因是否丧失。
34.治疗或预防受试者中的癌症的方法，其包括靶向新抗原，所述新抗原预测由HLA等位基因编码的HLA分子呈递，所述HLA等位基因已经测定为在肿瘤中尚未经受拷贝数丧失而丧失，其中所述方法包括以下步骤：
(a)通过以下方法选择新抗原，所述新抗原预测由HLA等位基因编码的HLA分子呈递，所述HLA等位基因已经测定为在肿瘤中尚未经受拷贝数丧失而丧失：
(i)将来自受试者的肿瘤样品的HLA等位基因序列信息与基于所述受试者的HLA类型的HLA等位基因参考序列进行比对；
(ii)测定同源HLA等位基因中的错配位置，并测定每个HLA等位基因的错配覆盖；
(iii)基于步骤(ii)中测定的错配和覆盖，测定每个HLA等位基因的比率和等位基因频率；
(iv)基于步骤(iii)中测定的比率和等位基因频率，测定所述肿瘤样品中每个HLA等位基因的拷贝数；
(b)对所述受试者施用：
(i)新抗原，所述新抗原预测由HLA等位基因编码的HLA分子呈递，所述HLA等位基因已经在步骤(a)中测定为在肿瘤中尚未丧失；
(ii)识别新抗原的免疫细胞，所述新抗原预测由HLA等位基因编码的HLA分子呈递，所述HLA等位基因已经在步骤(a)中测定为在肿瘤中尚未丧失；或
(iii)识别新抗原的抗体，所述新抗原预测由HLA等位基因编码的HLA分子呈递，所述HLA等位基因已经在步骤(a)中测定为在肿瘤中尚未丧失。
CN201880047010.7A 2017-07-14 2018-07-13 肿瘤中hla等位基因的分析及其用途 Pending CN110913896A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1711349.9A GB201711349D0 (en) 2017-07-14 2017-07-14 Method
GB1711349.9 2017-07-14
GBGB1716079.7A GB201716079D0 (en) 2017-10-02 2017-10-02 Method
GB1716079.7 2017-10-02
PCT/GB2018/052004 WO2019012296A1 (en) 2017-07-14 2018-07-13 ANALYSIS OF HLA ALLELS IN TUMORS AND USES THEREOF

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110913896A true CN110913896A (zh) 2020-03-24

Family

ID=63013064

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880047010.7A Pending CN110913896A (zh) 2017-07-14 2018-07-13 肿瘤中hla等位基因的分析及其用途

Country Status (8)

Country Link
US (1) US11634773B2 (zh)
EP (1) EP3651791A1 (zh)
JP (1) JP7307048B2 (zh)
CN (1) CN110913896A (zh)
AU (1) AU2018298971A1 (zh)
CA (1) CA3068203A1 (zh)
RU (1) RU2020106732A (zh)
WO (1) WO2019012296A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111883211A (zh) * 2020-08-07 2020-11-03 张哲� 一种表征hrd同源重组修复缺陷的基因瘢痕及鉴定方法
CN112509638A (zh) * 2020-12-04 2021-03-16 深圳荻硕贝肯精准医学有限公司 人类hla染色体区域杂合性缺失的分析方法和分析处理装置
CN112885406A (zh) * 2020-04-16 2021-06-01 深圳裕策生物科技有限公司 检测hla杂合性缺失的方法及系统

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11475978B2 (en) * 2019-02-12 2022-10-18 Tempus Labs, Inc. Detection of human leukocyte antigen loss of heterozygosity
CA3130203A1 (en) 2019-02-12 2020-08-20 Tempus Labs, Inc. Detection of human leukocyte antigen loss of heterozygosity
GB201911066D0 (en) 2019-08-02 2019-09-18 Achilles Therapeutics Ltd T cell therapy
US20220389102A1 (en) * 2019-11-01 2022-12-08 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Hla class i sequence divergence and cancer therapy
GB201918290D0 (en) 2019-12-12 2020-01-29 Achilles Therapeutics Ltd Method
US20230052157A1 (en) 2019-12-12 2023-02-16 Achilles Therapeutics Uk Limited Method for obtaining nucleic acid for sequencing
WO2021174052A1 (en) * 2020-02-27 2021-09-02 Foundation Medicine, Inc. Mitigation of statistical bias in genetic sampling
EP4142746A1 (en) 2020-04-28 2023-03-08 Achilles Therapeutics UK Limited T cell therapy
CN112699948A (zh) * 2020-12-31 2021-04-23 无锡祥生医疗科技股份有限公司 超声乳腺病灶的分类方法、装置及存储介质
GB202104715D0 (en) * 2021-04-01 2021-05-19 Achilles Therapeutics Uk Ltd Identification of clonal neoantigens and uses thereof
US20220323500A1 (en) 2021-04-09 2022-10-13 Achilles Therapeutics Uk Limited Cancer immunotherapy
GB202109886D0 (en) 2021-07-08 2021-08-25 Achilles Therapeutics Uk Ltd Assay
IL309200A (en) 2021-06-22 2024-02-01 Achilles Therapeutics Uk Ltd A method for producing antigen-specific T cells
WO2023277932A1 (en) * 2021-06-28 2023-01-05 Tempus Labs, Inc. Detection of human leukocyte antigen loss of heterozygosity
GB202205147D0 (en) * 2022-04-07 2022-05-25 Achilles Therapeutics Uk Ltd Identification of clonal neoantigens and uses thereof
GB202205135D0 (en) 2022-04-07 2022-05-25 Francis Crick Institute Ltd Analysis of HLA alleles transcriptional deregulation
WO2023194491A1 (en) 2022-04-07 2023-10-12 The Francis Crick Institute Limited Analysis of hla alleles transcriptional deregulation
GB202210006D0 (en) * 2022-07-07 2022-08-24 Achilles Therapeutics Uk Ltd Analysis of T cell samples
GB202307096D0 (en) 2023-05-12 2023-06-28 Achilles Therapeutics Uk Ltd Method

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017042394A1 (en) * 2015-09-10 2017-03-16 Cancer Research Technology Limited "immune checkpoint intervention" in cancer
WO2017106638A1 (en) * 2015-12-16 2017-06-22 Gritstone Oncology, Inc. Neoantigen identification, manufacture, and use

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2139092C1 (ru) 1993-06-03 1999-10-10 Терапьютик Антибодиз Инк. Фрагменты антител в терапии
HUE050797T2 (hu) 2012-10-10 2021-01-28 Sangamo Therapeutics Inc T-sejt módosító vegyületek és alkalmazásaik
CN106103736B (zh) 2013-10-15 2020-03-03 瑞泽恩制药公司 高分辨率等位基因鉴定
US11725237B2 (en) 2013-12-05 2023-08-15 The Broad Institute Inc. Polymorphic gene typing and somatic change detection using sequencing data
CN104914242B (zh) 2014-09-29 2017-08-11 深圳华大基因科技服务有限公司 用于癌症诊断和治疗的方法和组合物
ES2836273T3 (es) 2015-04-27 2021-06-24 Cancer Research Tech Ltd Método para el tratamiento del cáncer
KR20190001953A (ko) 2016-05-27 2019-01-07 휴먼 롱제비티 인코포레이티드 인간 백혈구 항원 판정 방법
WO2018005276A1 (en) 2016-06-29 2018-01-04 The Johns Hopkins University Neoantigens as targets for immunotherapy
KR20190140935A (ko) * 2017-04-19 2019-12-20 그릿스톤 온콜로지, 인코포레이티드 신생항원 동정, 제조, 및 용도
GB201710815D0 (en) 2017-07-05 2017-08-16 Francis Crick Inst Ltd Method

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017042394A1 (en) * 2015-09-10 2017-03-16 Cancer Research Technology Limited "immune checkpoint intervention" in cancer
WO2017106638A1 (en) * 2015-12-16 2017-06-22 Gritstone Oncology, Inc. Neoantigen identification, manufacture, and use

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BARBARA SCHRÖRS等: "HLA class I loss in metachronous metastases prevents continuous T cell recognition of mutated neoantigens in a human melanoma model" *
ERIC TRAN等: "T-Cell Transfer Therapy Targeting Mutant KRAS in Cancer" *
R XING等: "Copy number variations of HLA-I and activation of NKp30 pathway determine the sensitivity of gastric cancer cells to the cytotoxicity of natural killer cells" *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112885406A (zh) * 2020-04-16 2021-06-01 深圳裕策生物科技有限公司 检测hla杂合性缺失的方法及系统
CN111883211A (zh) * 2020-08-07 2020-11-03 张哲� 一种表征hrd同源重组修复缺陷的基因瘢痕及鉴定方法
CN111883211B (zh) * 2020-08-07 2021-04-23 张哲� 一种表征hrd同源重组修复缺陷的基因瘢痕及鉴定方法
CN112509638A (zh) * 2020-12-04 2021-03-16 深圳荻硕贝肯精准医学有限公司 人类hla染色体区域杂合性缺失的分析方法和分析处理装置
CN112509638B (zh) * 2020-12-04 2021-12-03 深圳荻硕贝肯精准医学有限公司 人类hla染色体区域杂合性缺失的分析方法和分析处理装置

Also Published As

Publication number Publication date
RU2020106732A (ru) 2021-08-16
JP2020526209A (ja) 2020-08-31
EP3651791A1 (en) 2020-05-20
AU2018298971A1 (en) 2020-01-16
WO2019012296A1 (en) 2019-01-17
RU2020106732A3 (zh) 2021-11-01
US20210147934A1 (en) 2021-05-20
CA3068203A1 (en) 2019-01-17
US11634773B2 (en) 2023-04-25
JP7307048B2 (ja) 2023-07-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11634773B2 (en) Analysis of HLA alleles in tumours and the uses thereof
McGranahan et al. Allele-specific HLA loss and immune escape in lung cancer evolution
Sahin et al. Personalized RNA mutanome vaccines mobilize poly-specific therapeutic immunity against cancer
JP6918703B2 (ja) がんを治療するための方法
US20210308241A1 (en) Determinants of cancer response to immunotherapy by pd-1 blockade
Veatch et al. Endogenous CD4+ T cells recognize neoantigens in lung cancer patients, including recurrent oncogenic KRAS and ERBB2 (Her2) driver mutations
US11078278B2 (en) Treatment of renal cell carcinoma
WO2015075939A1 (ja) Ｔ細胞受容体およびｂ細胞受容体レパトアの解析システムならびにその治療および診断への利用
Nebot-Bral et al. Why is immunotherapy effective (or not) in patients with MSI/MMRD tumors?
CN110799196B (zh) 致免疫性的癌症特异抗原决定位的排名系统
US20220152176A1 (en) Cancer biomarkers for durable clinical benefit
US20220241331A1 (en) Identification of recurrent mutated neopeptides
US20190284640A1 (en) Methods and Systems for Predicting Response to Immunotherapies for Treatment of Cancer
Weeden et al. Early immune pressure initiated by tissue-resident memory T cells sculpts tumor evolution in non-small cell lung cancer
Jafarzadeh et al. Biomarkers for predicting the outcome of various cancer immunotherapies
Castro et al. Neoantigen controversies
Catalano et al. Immunotherapy-related biomarkers: Confirmations and uncertainties
Jain et al. Role of biomarkers in assessing response to immune checkpoint inhibitors in cancer treatment
Caushi NEOANTIGEN SPECIFIC TISSUE RESIDENT MEMORY T CELLS FACILITATE PATHOLOGICAL RESPONSE IN RESECTABLE NSCLC TREATED WITH NEOADJUVANT ANTI-PD-1
Chaudhuri et al. Mediator complex subunit 1 architects a tumorigenic Treg cell program independent of inflammation
Yang The Molecular Determinants of Response to Immune Checkpoint Therapy in Solid Tumors
Rosenthal Immune editing and surveillance in cancer evolution
Yang Long-lived antitumor CD8+ T cells in Melanoma patients who had complete response to checkpoint blockade immunotherapy
WO2023194491A1 (en) Analysis of hla alleles transcriptional deregulation
Pizzolla Supplementary Figure legends Supplementary Figure S1: Patient clinical history

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination