CN110894501A - 一种玉米砷胁迫抗性基因ZmAsR2及其分子内SNP标记与应用 - Google Patents

一种玉米砷胁迫抗性基因ZmAsR2及其分子内SNP标记与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种玉米砷胁迫抗性基因ZmAsR2、其表达产物、其克隆引物、其连锁SNP、其可追踪SNP克隆引物。所述玉米砷胁迫抗性基因ZmAsR2的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码的蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示；玉米砷胁迫抗性基因ZmAsR2分子内SNP标记，其碱基序列特征如SEQ ID NO.5所示。本发明的玉米砷胁迫抗性基因ZmAsR2分子内SNP标记可用于跟踪鉴定玉米砷胁迫抗性基因ZmAsR2，适用于玉米重金属胁迫耐受田间育种的追踪鉴定，玉米砷胁迫抗性基因ZmAsR2应用于玉米育种实践的方法可推广应用于其它重金属胁迫相关基因的鉴定克隆和育种应用。

Description

一种玉米砷胁迫抗性基因ZmAsR2及其分子内SNP标记与应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种玉米砷胁迫抗性基因ZmAsR2及其分子内SNP标记与应用。
背景技术
由于人类活动，例如金属加工、采矿、污水灌溉及除草剂和化肥的应用等，土壤重金属和类金属污染已成为一个世界性的环境问题。砷是一种有毒金属元素，已被列为I类致癌物。Wilson等人报道，在土壤中，砷的浓度低于10毫克/公斤，而在一些矿业污染的土壤中，砷的含量高达17400毫克/公斤。由于土壤中的重金属可以被植物体吸收和积累，并通过食物链进入人体，高水平的砷含量可能会给人类健康带来巨大风险。Sharma等人的研究表明，无论成人或儿童，食用砷污染的小麦，都会增加患癌症疾病的风险。食用在富含砷或其他重金属污染的土壤中种植的大米会严重影响血液中重金属的含量。另外，高浓度的砷含量对植物的生长也会产生不利影响，比如会引起侧根的损伤并抑制水分的吸收，进而降低作物的产量。较高的砷含量也会影响一些植物代谢相关的重要过程，如光合作用、蒸腾作用、呼吸作用、叶绿素的合成和核酸的合成等，从而抑制植物生长。因考虑到砷对植物生长的危害和对人类健康的潜在危险，有必要对植物中砷积累和耐受的遗传机制进行研究以减少其对植物的毒害作用以及减少其对人类健康的危害。在先前的研究中，有关砷积累和砷耐受性的相关数量性状位点已经在水稻的不同群体中被定位。此外，砷积累所涉及的各种基因也在不同的物种中被报道，例如，在烟草中，拟南芥的植物螯合肽合成酶1基因的过表达可使根中的砷含量增加。两个有关砷的编码相应谷氧还原蛋白基因的过表达可以减少拟南芥中砷的积累，进而提高拟南芥对砷的耐受性；另外，在酵母中可以通过保持谷胱甘肽含量和调节水通道蛋白显著减少亚砷酸盐的含量。在水稻中，基因编辑CRT传输器对谷胱甘肽的平衡以及砷的耐性也十分重要。有报道称，拟南芥的肌醇翻译基因不仅可以增加酿酒酵母的砷含量，也可以调节拟南芥种子中的砷含量。
发明内容
本发明的目的是提供一种玉米砷胁迫抗性基因ZmAsR2、其表达产物、其克隆引物、其连锁SNP、其可追踪SNP克隆引物。
本发明所述玉米砷胁迫抗性基因ZmAsR2的序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
本发明所述玉米砷胁迫抗性基因ZmAsR2编码的蛋白质，其序列为SEQ ID NO:2所示氨基酸序列。
本发明设计了一对扩增所述玉米砷胁迫抗性基因ZmAsR2的克隆引物，其碱基序列特征如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
本发明发掘了玉米砷胁迫抗性基因ZmAsR2分子内SNP标记，其碱基序列特征如SEQID NO.5所示。
本发明设计了一对可跟踪鉴定所述玉米砷胁迫抗性基因ZmAsR2分子内SNP标记的克隆引物，其碱基序列特征如SEQ ID NO.6 和SEQ ID NO.7所示。
本发明的再一个目的是提供所述玉米砷胁迫抗性基因ZmAsR2在玉米遗传育种中的应用及所述玉米砷胁迫抗性基因ZmAsR2分子内SNP标记在玉米遗传育种中的应用。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
本发明通过如下步骤克隆得到玉米砷胁迫抗性基因ZmAsR2：
步骤一、选定关联群体：使用的材料为350份有代表性的自交系构成的关联群体，作为玉米砷胁迫抗性基因定位群体。
步骤二、砷胁迫抗性表型数据获取：对关联群体成熟后的果穗单行混合收获以确定砷在穗轴和苞叶中的积累与分布情况。单行收获的穗轴与苞叶磨粉后，用微波消解仪消煮，每份样品用原子荧光光度计测定三次砷浓度，计算每种材料每个组织中砷浓度的平均值，用这三个重复的平均值进行GWAS分析来检测显著的QTL/SNP位点；同时使用IBM SPSS软件对表型数据进行双向方差分析，根据Knapp开发的方法计算重复力。
步骤三、GWAS分析：所用的关联群体基因型为Yang等（Liu et al.,2017）推算得到的覆盖玉米全基因组且最小等位基因频率≥0.05的1.25M个SNPs进行全基因组关联分析；利用TASSEL 3.0软件获得的每一个SNP的P值被用于构建穗轴和苞叶组织砷含量的QQ图（Quantile–quantile plot）及曼哈顿图（Manhattan plot）；根据玉米B73参考基因组序列（RefGen_v2），下载玉米基因列表用于鉴定每一个区间内的可能的候选基因，并对可能的候选基因的功能进行注释，筛选与表型相关的基因为候选基因。
步骤四、全长cDNA克隆：根据预测的cDNA序列设计克隆引物，从砷胁迫抗性玉米的cDNA中扩得1068bp片段，可以采用PCR（polymerase chain reaction）技术，从mRNA中扩增得到本发明的ZmAsR2基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。
所述玉米砷胁迫抗性基因ZmAsR2分子内SNP标记在玉米遗传育种中的应用，其步骤是：通过所述引物对扩增待检玉米基因组DNA，对PCR产物用HindⅢ进行酶切并检测扩增酶切产物，若酶切产物片段与没有酶切的产物大小没有差异165bp，则标志着玉米品种砷胁迫抗性的存在；若酶切产物片段小于没有酶切的产物大小165bp，则标志着玉米品种不存在砷胁迫抗性。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
1. 本发明克隆了调控玉米砷胁迫抗性基因ZmAsR2，发现了其DNA序列，CDS序列和编码蛋白序列，为玉米重金属胁迫耐受育种的应用实践打下基础。
2. 本发明的玉米砷胁迫抗性基因ZmAsR2分子内SNP标记可用于跟踪鉴定玉米砷胁迫抗性基因ZmAsR2，适用于玉米重金属胁迫耐受田间育种的追踪鉴定。
3. 本发明鉴定和克隆玉米砷胁迫抗性基因ZmAsR2并应用于玉米育种实践的方法可推广应用于其它重金属胁迫相关基因的鉴定克隆和育种应用。
附图说明
图1为使用三种方法（Q模型，K模型和Q + K模型）对来自不同地点的4种组织中的砷含量的全基因组关联研究结果产生的Q-Q Plot图。
图2为在不同地点的4种不同组织中的砷含量曼哈顿图。
图3为SNP信息，图中大写字母是鉴定到的砷胁迫响应相关的关键SNP。
图4为依据SNP标记开发出的dcaps标记在自然群体中的应用（可用于区分砷抗性/敏感玉米材料）。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图和本发明的优选实施例进行详细描述。
在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验或检测方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1：玉米砷胁迫抗性基因ZmAsR2的发现、鉴定与克隆
本研究使用的材料为350份有代表性的自交系构成的关联群体，其中151份来自温带地区，79份来自热带和亚热带地区，2017年分别种在中国河南的永城（YC）和原阳河南农业大学基地（YY），在每个地点，关联群体均采用完全随机区组设计，三次重复。每个小区3米行长，株距0.22米，行距0.67米，最终种植密度为每67 500株/公顷。
对关联群体成熟后的果穗进行收获以确定砷在穗轴和苞叶中的积累与分布情况。每个环境下每个自交系的穗轴和苞叶分别收集在一起并自然干燥，干燥后的穗轴和苞叶，首先用磨粉机研磨成细粉。
样品砷含量测定由如下步骤完成：
1、样品消解：称取0.2025g（±0.0025g）经磨碎后的玉米组织样品于消煮管中，加入8ml优级纯硝酸，盖紧盖子浸泡过夜。将装有样品的消煮管放入微波消解仪中，（型号：MAS6）设置温度梯度为55℃、75℃、95℃，每个温度下保持30min。待完全消煮结束并冷却后，（完全消煮后的样品呈澄清透明状。）取出样品加去离子水定容至50ml容量瓶中，经过滤后收集15ml样品原液待测。
2、样品稀释：取2ml样品原液于离心管中、加入1ml去离子水、0.8ml硫抗（硫脲和抗坏血酸混合溶液）、0.2ml浓盐酸，最终样品为4ml。
3、砷含量测定：打开双道原子荧光光度计（AFS—3000），设置砷元素通道，预热30min，配置浓度梯度为1μg/L、3μg/L、5μg/L、7μg/L、10μg/L的标准溶液，并绘制标准曲线，曲线拟合度大于等于0.999，且荧光强度1000<IF<4000为宜。准备就绪后，测定稀释后样品中的砷元素含量，每个样品平行测定三次，得出原始浓度。最后根据公式：最终浓度=（原始浓度*稀释倍数*定容体积*0.0001）/称样质量*1000。每个样品测量三次，三次平均值作为最终结果。具体来说，首先计算每个组织的砷浓度，然后，求每种材料每个组织中砷浓度的平均值，用这三个重复的平均值进行GWAS分析来检测显著的QTL/SNP位点。同时使用IBMSPSS软件对表型数据进行双向方差分析。根据Knapp开发的方法计算重复力（1986）。
两个环境，每个组织砷含量的重复力（W2）计算公式如下：
上面公式中，σ2G代表基因型方差，σ2GE代表基因型×环境方差，σ2e代表误差方差，n代表环境个数，r代表重复次数。σ2G，σ2GE和σ2e的估计值通过R语言的lme4软件包中的lmer函数的方差分析获得。
为了估计两个环境每份材料的育种值，通过R语言的lem4软件包的混合线性模型进行最佳线性无偏预测（BLUP），公式如下：
Y=(1｜LINE)+(1｜ENV)+(1｜REP％in％LINE:ENV)+(1｜LINE:ENV)
其中Y是表型数据，圆括号表示随机效应，‘1’表示组，‘：’表示互作。LINE表示材料；ENV表示环境，每一个都是年份和地点的组合；PEP是每个环境的重复数，即年份和地点的组合。BLUP值的主要目的是降低环境间的数据不平衡引起的预测表型偏差。最后，两个地点的穗轴和苞叶组织中的砷浓度的BLUP数据也被用于全基因组关联研究。两种组织中砷含量的皮尔森相关系数通过SPSS软件（v13.0）计算得到。
通过整合几种基因分型平台（包括Illumina MaizeSNP50 BeadChip，RNA测序[28]，Affymetrix Axiom Maize 600K DNA芯片和GBS基因分型），最终获得了等位基因频率大于0.05（Minor allele frequency，MAF≥0.05）的共55万个SNPs（http：//www.maizego.org/Resources.html）。由于不同性状对不同模型的敏感度不同，因此，为了测试最佳GWAS模型，在TASSEL 3.0软件中利用Q（仅考虑群体结构），K（仅考虑亲缘关系）和Q+K（同时考虑群体结构和亲缘关系）三种模型对永城，原阳和两地点的综合环境的穗轴和苞叶两种组织进行GWAS分析，以确定基因型和表型之间在统计学上是否显著关联。同时，考虑到许多SNP处于高度连锁不平衡状态，在前期研究中已经使用GEC软件计算了该套标记的有效标记数，软件给出的建议的P值为2.04×10-6（1/有效标记数），该值被用作控制全基因组I型错误率的阈值。TASSEL 3.0软件获得的每一个SNP的P值被用于构建穗轴和苞叶组织砷含量的QQ图（Quantile–quantile plot）（图1所示）及曼哈顿图（Manhattan plot）（图2所示）。
根据玉米B73参考基因组序列（RefGen_v2），从MaizeGDB数据库（http://www.maizegdb.org）中下载了玉米基因列表用于鉴定每一个位点内的可能的候选基因。根据InterProScan网站（http://www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html）对候选基因的功能进行注释。先前已有研究使用55万个SNP对该群体的LD进行了评估，发现当r2=0.1时，全基因组的平均衰减距离为50kb，因此，定义峰值SNP（peak SNP）上下游各50kb，共100kb的区间为一个QTL。
实施例2：玉米砷胁迫抗性基因ZmAsR2分子内SNP标记开发
1. 选择目标序列：在gramene http://ensembl.gramene.org/Zea_mays/Info/Index)选取包含SNP位点的目标序列；
2. 设计特异引物：将包含SNP位点上下游各25nt的序列，在dCAPS Finder 2.0(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)设计引物，再将SNP位点左侧第4个碱基G更换为A，如图3所示，则在抗砷胁迫的材料中就出现HindIII的酶切识别位点AAGCTT。
实施例3：玉米砷胁迫抗性基因ZmAsR2在玉米重金属胁迫抗性及提高品质育种中的应用
1. PCR扩增：利用设计的引物从自然群体中扩增含有目标SNP的片段；
2. 酶切：人为在引物上设计了一个HindIII的酶切识别位点，利用该限制性内切酶HindIII对PCR扩增产物进行酶切；
3. 琼脂糖电泳的分离与鉴定：用4%琼脂糖凝胶对酶切产物分析，检测其多态性。结果如图4所示，这表明在自然群体中存在这个SNP的位点。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 河南农业大学
<120> 一种玉米砷胁迫抗性基因ZmAsR2及其分子内SNP标记与应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1365
<212> DNA
<213> 玉米(Zea mays)
<400> 1
gacaattcca gtaccgcttc tgcccccagc aggtgccagc gccatcgccg ttcgcctcct 60
ctccacactc cgccagatcc catccctctc gcccacgcgc gggtatcgga gtcggagcat 120
ggcgtctgca gtggtggtgg acgccggcga cgcgccggag cccacggttc gtaacctcct 180
ggaccaggag tccctcaagt gggtcttcgt cggcgggaag ggcggcgtcg gcaagactac 240
ctgcagctcc atcctctccg tcctcctcgc cggggtccgc tcgtccgtgc tcgtcatctc 300
caccgacccc gcgcacaacc tcagcgacgc cttccagcag cgcttcacca agttccccac 360
tctcgtccgc ggattcacca acctctacgc catggaaatt gacccaaagg tagaaaatga 420
tgatttatcc aatgaaggaa tggaaggatt cctgtcagaa ctgacaaatg cgattccagg 480
agtagatgaa gctatgagtt ttgctgaaat gctaaaatta gtccaaacaa tggattactc 540
tgttgtagtt tttgatactg ctcctacagg gcatacatta cggttgcttc agttcccagc 600
aaccctagag aagggtcttg agaaaatgat ggagttgaaa aatagatttg gcggtctgtt 660
gaatcaggcc agtcgattgt ttggtcttgg tgatgagctg aacgaggatg caatgcttgg 720
gaaacttgag ggtatgaagg atgtgatcga acaagacttg acaacttttg tatgtgtttg 780
tatcccggaa tttctttcat tgtatgaaac agaaagattg gtgcaagagt tagcgaagtt 840
tgagattgat tcacacaata ttattattaa tcaagttata tttgatgagg aagctgtcga 900
gtcaaaactg ctaaaagcac ggatgaaaat gcaacaaaaa tacattgatc agttccatat 960
gttatacgat gacttcaaca tcaccaagct tcccttgctt tcagaagagg tttgtggtgt 1020
tcaagctctc caaaactttt cccagcactt ccttacacca tacaagtcta ctcttaaaag 1080
gggcaccgtc gaggagctcg aacagagaat aactatatta aaatctgcac tgcaagaagc 1140
tgagacagag ttagataggg ttaggaaagg gaagcagtca gtgtgatttt ttttccacag 1200
gtcaagtgtg taaaaccaga gagacgatca attttttcgt gtcattacac tcttgttgat 1260
ttcactatca tgtttcctca tcgaggagtt tagacttgta atagctatcg gcagagaagt 1320
gtttgattca cacaagatat atagatccat tctttttgcc ggtta 1365
<210> 2
<211> 355
<212> PRT
<213> 玉米(Zea mays)
<400> 2
Met Ala Ser Ala Val Val Val Ala Ala Gly Ala Ala Pro Gly Pro Thr
1 5 10 15
Val Ala Ala Leu Leu Ala Gly Gly Ser Leu Leu Thr Val Pro Val Gly
20 25 30
Gly Leu Gly Gly Val Gly Leu Thr Thr Cys Ser Ser Ile Leu Ser Val
35 40 45
Leu Leu Ala Gly Val Ala Ser Ser Val Leu Val Ile Ser Thr Ala Pro
50 55 60
Ala His Ala Leu Ser Ala Ala Pro Gly Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro
65 70 75 80
Thr Leu Val Ala Gly Pro Thr Ala Leu Thr Ala Met Gly Ile Ala Pro
85 90 95
Leu Val Gly Ala Ala Ala Leu Ser Ala Gly Gly Met Gly Gly Pro Leu
100 105 110
Ser Gly Leu Thr Ala Ala Ile Pro Gly Val Ala Gly Ala Met Ser Pro
115 120 125
Ala Gly Met Leu Leu Leu Val Gly Thr Met Ala Thr Ser Val Val Val
130 135 140
Pro Ala Thr Ala Pro Thr Gly His Thr Leu Ala Leu Leu Gly Pro Pro
145 150 155 160
Ala Thr Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Met Met Gly Leu Leu Ala Ala
165 170 175
Pro Gly Gly Leu Leu Ala Gly Ala Ser Ala Leu Pro Gly Leu Gly Ala
180 185 190
Gly Leu Ala Gly Ala Ala Met Leu Gly Leu Leu Gly Gly Met Leu Ala
195 200 205
Val Ile Gly Gly Ala Leu Thr Thr Pro Val Cys Val Cys Ile Pro Gly
210 215 220
Pro Leu Ser Leu Thr Gly Thr Gly Ala Leu Val Gly Gly Leu Ala Leu
225 230 235 240
Pro Gly Ile Ala Ser His Ala Ile Ile Ile Ala Gly Val Ile Pro Ala
245 250 255
Gly Gly Ala Val Gly Ser Leu Leu Leu Leu Ala Ala Met Leu Met Gly
260 265 270
Gly Leu Thr Ile Ala Gly Pro His Met Leu Thr Ala Ala Pro Ala Ile
275 280 285
Thr Leu Leu Pro Leu Leu Ser Gly Gly Val Cys Gly Val Gly Ala Leu
290 295 300
Gly Ala Pro Ser Gly His Pro Leu Thr Pro Thr Leu Ser Thr Leu Leu
305 310 315 320
Ala Gly Thr Val Gly Gly Leu Gly Gly Ala Ile Thr Ile Leu Leu Ser
325 330 335
Ala Leu Gly Gly Ala Gly Thr Gly Leu Ala Ala Val Ala Leu Gly Leu
340 345 350
Gly Ser Val
355
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 3
atggcgtctg cagtggtg 18
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 4
tcacactgac tgcttccctt 20
<210> 5
<211> 44
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 5
ttttccaggt ttgtggtgtt caagctctcc aaaacttttc ccag 44
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 6
tcaacatcac caagcttccc 20
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 7
gctctccaaa acttttccca gcac 24

Claims (7)

1.一种玉米砷胁迫抗性基因ZmAsR2，其特征在于，所述基因的序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述玉米砷胁迫抗性基因ZmAsR2编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的序列为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
3.一对扩增权利要求1所述玉米砷胁迫抗性基因ZmAsR2的克隆引物，其碱基序列特征如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
4.权利要求1所述玉米砷胁迫抗性基因ZmAsR2分子内SNP标记，其碱基序列特征如SEQID NO.5所示。
5.一对可跟踪鉴定权利要求1所述玉米砷胁迫抗性基因ZmAsR2分子内SNP标记的克隆引物，其碱基序列特征如SEQ ID NO.6 和SEQ ID NO.7所示。
6.权利要求1所述玉米砷胁迫抗性基因ZmAsR2在玉米遗传育种中的应用。
7.权利要求4所述玉米砷胁迫抗性基因ZmAsR2分子内SNP标记在玉米遗传育种中的应用。
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