CN110891963A - 化合物、合成中间体、用途、药物组合物以及神经调节治疗方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药学、医学、化学和生物技术领域。本发明的化合物是一种肽，并且与最相似的肽类化合物相比，显示出令人吃惊的稳定性且易于处理。本发明的药物组合物包含所述肽类化合物，并且即使当口服给药时，也显示出令人吃惊的治疗结果。在一些实施方案中，与血加压素和大麻二酚的效果相比，本发明组合物的给药提供了优异的治疗结果。在一些实施方案中，在惊厥的治疗性和预防性治疗、疼痛阈值的调节和重要的神经保护中，本发明组合物的口服给药在神经调节方面提供了显著的且令人吃惊的结果，还大大减少了多发性硬化的临床症状。

Description

化合物、合成中间体、用途、药物组合物以及神经调节治疗 方法
技术领域
本发明属于药物科学、医学、化学和生物技术领域。更具体而言，本发明描述了一种化合物及其用于制备具有诊断和/或治疗价值的配体的用途，制备具有药用价值的化合物中的合成中间体，化合物用于制备药物的用途，含有所述化合物的药物组合物和治疗方法。本发明的化合物为肽类化合物，并且与更密切相关的肽类化合物相比，显示出令人吃惊的稳定性且易于处理。本发明的药物组合物包含所述肽类化合物，并且即使口服给药也显示出令人吃惊的治疗结果。在一些实施方案中，与血加压素(hemopressin)和大麻二酚的效果相比，本发明组合物的给药提供了优异的治疗结果。在一些实施方案中，在癫痫发作的治疗性或预防性治疗、疼痛阈值的调节和重要的神经保护中，本发明组合物的口服给药提供了重要且令人吃惊的结果，大大减少了多发性硬化的临床症状。
背景技术
本发明的肽类化合物在极端温度下令人吃惊地稳定，不会引起原纤维形成问题，并且在制备具有药用价值的产品(包括用于诊断的配体和药物组合物)时易于处理。
最接近本发明的肽类化合物为血加压素及其具有生物活性的大尺寸变体。然而，血加压素存在技术困难，如不稳定性和倾向于形成原纤维，这限制了它在药物制剂中的应用(Bomar MG&Galande AK，Modulation of the cannabinoid receptors by hemopressinpeptides.520-524)。这些局限性已经降低了对血加压素的初始热情：其天然的聚集/原纤维形成的倾向大大限制了在合成、药物制备和治疗用途中可能的浓度范围。同一文献(Bomar&Galande)甚至推测，血加压素自组装可能在生理上相关，并且可能具有潜在的致病性或神经毒性，类似于与阿尔茨海默病、帕金森氏病和II型糖尿病相关的淀粉样肽原纤维。
鉴于最接近的背景，本发明的结果是令人吃惊的，而且本发明人在文献中没有发现关于本发明的肽类化合物将比血加压素更稳定和更易于操作的任何报道或暗示，因此在此方面，本发明具有预料不到的改进和预料不到的重要性。
大麻素系统(其包含CB1和CB2受体及其内源性配体)作用于多种代谢功能，包括控制食物摄入、能量和/或脂质代谢、调节肠动力、免疫系统，钙循环平衡等。大麻素受体在脑中广泛表达，包括皮质、海马、杏仁核、垂体和下丘脑。CB受体，特别是CB1，已经在许多外周器官和组织中被鉴定出，包括甲状腺、肾上腺、生殖器官、脂肪组织、肝脏、肌肉和胃肠道。
Bomar&Galande的文章还显示，N-延长形式的血加压素(例如RVD-Hp、VD-Hp)，已对CB1受体表现出了激动剂作用，因此，仅两个或三个氨基酸的差异就会干扰所述肽表现出拮抗还是激动作用，从而对CB1产生相反的作用。此外，不同已知肽的信号通路与由G蛋白介导的经典途径不同，使得根据目前已有的文献报道进行的外推均是不可靠的。就CB2受体而言，类似的冲突作用也可能发生。
文献还清楚地显示，虽然血加压素和所述已知的尺寸延长的变体具有治疗活性，但是尺寸小于6个氨基酸的肽类化合物不能提供治疗效果(Szlavicz et al.，2015；Dvorácskóet al.，2016；Bomar&Galande，2013；Bauer et al.，2012)。
相比之下，本发明令人吃惊地证明了：除了在血加压素和尺寸延长的变体的已知用途中提供更强烈的治疗效果外，其还提供了以前不知道或未暗示的其他用途。此外，肽尺寸的小变化不仅会导致治疗效果的实质性和预料不到的变化，而且还可能导致完全没有效果。
还应注意的是，使用类似于血加压素的肽(pepcans)进行的研究已面临若干挑战。例如，所述较大的肽的操作受到原纤维聚集/形成的阻碍。此外，所述肽在体内的代谢稳定性是有限的，并且在没有药代动力学分析的情况下，各药理学实验的数据难以解释，导致文献中的混乱。虽然有关于血加压素(Hp)和RV-Hp给药的研究，但在生理水平天然存在的内源性肽似乎只有RVD-Hp(pepcan 12)和pepcan 23。
在此背景下，本领域中已检测出多种化合物具有大麻素受体调节活性。其中，一些目标是开发用于减轻体重和使腰部变细的药物，如利莫那班(rimonabant)。然而，这种化合物随后被与人类精神疾病的发生增加关联起来，并被从世界市场中移除。
本发明的化合物还提供了作为替代大麻素化合物(如大麻二酚)的良好候选物的优点。尽管大麻二酚已被证明具有效果，但由于其来源(大麻(Cannabis sativa)植物)而一直面临监管问题。本发明提供一种用于患有癫痫发作且难以获得药物的患者的另外的治疗方法，其基于一种肽类化合物且不使用大麻的衍生物。结果表明，当用作抗惊厥药时，本发明的化合物在使用中提供了其他令人吃惊的技术优势，包括增加的治疗效果、口服使用、较低的剂量、更少的副作用(如虚脱和鼻出血)的发生，以及其他技术优势。
毛果芸香碱(常称为“Pilo”)为从毛果芸香植物(毛果芸香(Pilocarpusjaborandi))的叶子中提取的生物碱，毛果芸香植物是一种被居住在巴西的图皮-拉瓜尼(Tupi-Guarani)印第安人使用了数个世纪的植物，他们利用其特性产生汗液和唾液。毛果芸香碱为一种非特异性毒蕈碱激动剂，缓慢降解，对烟碱受体无影响，由巴西医生
Figure BDA0002368148450000031
Coutinho于1874年通过毛果芸香叶子的提取物而引入临床实践，以获得发汗剂(产生汗液)和催涎剂(产生唾液)效果。
虽然毛果芸香碱具有药学特性，但其在高浓度时会诱发惊厥的发生，因此被用作相关的实验模型。毛果芸香碱诱发的癫痫发作在细胞水平上导致神经毒性，并且可能与增加的脑氧化应激和某些氨基酸浓度的变化有关(Santos et al.，2011)。
毛果芸香碱在该实验模型中的给药导致严重的脑损伤、神经毒性，并且通常以动物的死亡而告终。然而，在出现这一结果之前，毛果芸香碱引起胆碱能改变，其能够诱发与惊厥刻板动作相关的癫痫持续状态(status epilepticus)(SE)。直接将其给予大脑或通过腹膜内给药，毛果芸香碱能够诱发癫痫持续状态。在本专利申请中描述的一些实验中使用了该物质，其有害的神经元/颅内作用已经被本发明的组合物抑制或阻止：与用其他已知物质治疗的动物组相比，进行这些实验的动物中的相当大一部分没有与脑损伤相关的症状并且在没有明显损伤的情况下存活。
对癫痫机制的许多理解来源于动物实验模型中(尤其是大鼠和小鼠中)的研究。在此背景下，将毛果芸香碱给予模拟人类癫痫(ELT)的啮齿动物，并且通常称为“毛果芸香碱模型”。该模型于1983年由Turski等人开发，并且目前为最广泛使用的癫痫模型之一，这是因为其组织学、生物化学、药理学、电生理学和行为特征(Turski et al.，1983)均类似地再现了在人类ELT携带者中发现的那些特征。
毛果芸香碱模型还可用于证明毒蕈碱受体的变化，例如流涎的发生。乙酰胆碱通过其毒蕈碱受体(mAChR)在认知功能(例如学习和记忆)中发挥重要作用。mAChR为在某些神经元和其他细胞的细胞膜中与G蛋白受体形成复合物的受体。它们起着多种作用，包括作为副交感神经系统中由神经节后纤维释放的乙酰胆碱刺激的终末受体。
毒蕈碱受体之所以被称为毒蕈碱受体，是因为它们对毒蕈碱比对烟碱更敏感。其对应物为烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)，其为在自主神经系统中也很重要的离子通道受体。许多药物和其他物质(例如毛果芸香碱和东莨菪碱(escopolamine))操纵这两种不同的受体作为选择性激动剂或拮抗剂。
mAChR是跨膜受体(7TM)中得到最好表征的，在中枢神经系统(CNS)中广泛表达。克隆了5个mAChR亚型(M1、M2、M3、M4和M5)，并且通常基于信号转导分为两个不同的类。mAChRM1、M3和M5为通过Gq/11蛋白发出信号并激活磷脂酶C并调动细胞内钙的亚型。然而，mAChRM2和M4主要通过Gi/o蛋白来抑制腺苷酸环化酶并降低cAMP的细胞内浓度。CNS中主要的mAChR是M1亚型，其位于皮质、海马、纹状体和丘脑中，在这些位置存在于突触后。M2 mAChR主要位于脑干和丘脑中，尽管也位于皮质、海马和纹状体中，在此它们控制乙酰胆碱的释放。M3和M5的mAChR在CNS中的表达水平远低于M1或M2 mAChR，但是M3 mAChR存在于皮质和海马中，而M5mAChR在黑质(substantia nigra)中的位置非常离散。M4 mAChR存在于大脑的许多区域中，包括皮质和海马，但在纹状体中更突出，在此认为它们在控制多巴胺释放和调节自发活动(locomotor activity)中起作用。
鉴于mAChR在CNS中广泛而多样的分布，所有亚型都被评价为潜在的药物靶点也就不令人吃惊了。这些靶点中的一些在文献中被广泛认可，如M1参与阿尔茨海默病，而其他靶点则是相对较新的，例如M5，其已被与滥用药物的依赖性和成瘾性相关联。
多发性硬化为中枢神经系统的神经炎性疾病，具有较强的神经退行性成分，对患者的健康有很大的影响。这种疾病仍然几乎没有令人满意的可用治疗选择，非常需要开发替代品，本发明正是这种情况。
多发性硬化的特征在于少突胶质细胞和神经元的破坏，从而导致异质性和累积性的临床症状。目前可用的治疗方法仅部分有效，并且主要针对疾病的炎症期。然而，这种疾病的神经退行性成分仍然是新治疗方法的最大挑战。本发明正是为了填补这一重要空白。
虽然该疾病的确切病因尚不清楚，但推测自反应性T淋巴细胞在其病理生理学中起着核心作用。多发性硬化最常见的动物模型是实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)，因为它们共有许多生理和临床方面的特点。有几种EAE模型，反映人类多发性硬化的不同临床、免疫学和组织学方面。小鼠中EAE的主动诱导模型是稳健的(robust)，并提供可再现的结果，特别适用于通过使用由自身免疫性神经炎症激发的转基因小鼠来寻找治疗剂。EAE模型常被用作多发性硬化的新治疗策略的功效的“原理证明”。
背景技术检索已公开了仅与本发明部分相关的文献。下文将描述这些文献，在本文中阐述这些文献仅仅是为了作为现有技术的基础，因为它们均未预期或暗示本发明的任何目的。
Novel Peptide Substrates for Endopeptidase 24.15Neurolysin andAngiotensin Converting Enzyme(Vanessa Rioli,Fabio C.Gozzo,Andrea S.Heimann,Alessandra Linardi,Jose E.Krieger,Claudio S.Shida,Paulo C.Almeida,StephenHyslop,Marcos N.Eberlin,Emer S.Ferro；2003年3月7日)中记载的本发明人之一进行的一些研究证明了一种“筛选”新肽的有效技术。本发明不同于该文献，尤其是因为它提供了不同的分子实体。它还提供了更稳定和更治疗有效的化合物。此外，它还为神经调节、神经保护、痛觉缺失、惊厥或多发性硬化治疗提供了一种新的治疗方法，其结果令人吃惊。
Gomes et al(Gomes I,Grushko JS,Golebiewska U,Hoogendoorn S,Gupta A,Heimann AS,Ferro ES,Scarlata S,Fricker LD,and Devi LA Novel endogenouspeptide agonists of cannabinoid receptors FASEB J.2009年9月；23(9):3020-3029)是另一科学出版物，其作者之一为本发明的共同发明人(Heimann)。当另一共同发明人提出进行测试以验证本发明的假设时，所述共同发明人对该假设感到惊讶——所述假设本身显示了其非显而易见性。应注意的是，Gomes et al在2009年发表，而本发明的优先权是2017年，即，甚至在Gomes et al发表后七年多，且实际上在本发明人自己发现血加压素(Hp)(Heimann et al.，Proc Natl Acad Sci USA,2007年1218日；104(51):20588-93)后十年，不但她而且世界上其他研究者均未发表或暗示了本发明的目的。
此外，Gomes et al公开了在已发现N-延长形式的Hp的小鼠大脑中天然存在某些内源性大麻素(即，局部表达)。此外，Gomes et al的结论之一是在大脑中发现的N-延长形式(RVD-Hpα和VD-Hpα)与本发明的肽具有相反的功能，本发明的肽是拮抗剂/反向激动剂，而那些是大麻素受体激动剂。因此，Gomes et al既没有公开或暗示在癫痫发作或神经调节的控制中使用任何内源性大麻素，也没有公开或暗示包含这些实体中任一种的药物组合物——更不用说本发明的肽的用途，任一种所要求保护的用途，或包含其的口服组合物。因此，不仅Gomes et al没有公开本发明的肽的用途，而且本领域的技术人员在阅读Gomes etal后，也不会有动机：(i)合成本发明的肽类化合物；(ii)预期其稳定性显著大于血加压素的稳定性；(iii)预期其治疗作用大于血加压素的治疗作用；(iv)测试其用于本文所述的其他用途并具有合理的成功预期；或(v)制备用于神经调节、神经保护、癫痫发作或多发性硬化治疗的口服药物组合物。在此背景下，在进行由另一共同发明人建议的测试之前，所述共同发明人自己没有看到这种方法具有多大意义。本发明的化合物是新颖的且具有令人吃惊的特性；在先前已知的用途中，本发明是实质性且令人吃惊的改进；在先前未知的用途中，本发明是新颖的和令人吃惊的，这是因为含有肽的口服药物组合物具有神经调节作用也是令人吃惊的。本领域技术人员不会预期本发明的所述肽类化合物具有更高的稳定性，并耐受胃肠道并相互作用以产生神经调节/神经保护效果。
文献WO 2014/008567的发明人之一为本发明的共同发明人(Heimann)。其公开了可用于治疗包括肥胖症、糖尿病、全身性动脉高血压(或相关疾病、病症和/或相关并发症)的代谢疾病；预防超重；调节食欲；诱发饱腹感；在成功减肥后预防体重增加；增加能量消耗；美学减肥；或暴食症的肽类化合物和组合物。所述文献的化合物与CB受体相互作用，但是具有与本发明的化合物不同的化学结构。此外，在所述文献中没有报道或暗示本发明的化合物用作神经调节物质、神经保护剂、抗惊厥药或作为可用于治疗多发性硬化的实体的用途，因为该方法既不是发明人所能想象的，也不是基于现有技术显而易见的。
文献WO 2011/011847(＝US2015/297669、US9452196、EP 2459207)的发明人之一为本发明的发明人(Heimann)。该文献仅公开了血加压素(Hp)用于控制糖尿病和肥胖/体重增加的用途，并限于Hp和更大的衍生物，如DV-Hp、PVD-Hp、RVD-Hp。本发明与所述文献不同，尤其是由于其公开了一种不同的化合物，所述化合物与血加压素相比提供了益处，包括更容易制备、更高的稳定性和生物活性，以及其他优势。此外，本发明的化合物提供了在WO2011/011847中没有公开或暗示的其他治疗用途：本发明人进行的测试显示出令人吃惊的结果，特别是关于神经调节、神经保护、抑制癫痫发作和多发性硬化症状——在所述文献中未描述或暗示的事实。此外，WO 2011/011847的所述共同发明人在另一共同发明人提出进行测试以验证本发明的假设时对该假设感到震惊——这本身就显示了其非显而易见性。文献WO 2011/011847公开于2011年，而本发明的优先权是2017年，即甚至在最早的在先公开之后五年多，且实际上在共同发明人自己发现血加压素(Heimann et al.，Proc Natl AcadSci USA,2007年12月18日；104(51):20588-93)之后十年，不但她而且世界上其他研究者均未发表或暗示本发明的目的。最后，文献WO 2011/011847关注的是对脂肪组织中存在的受体的作用，这些受体位于脑外而不是脑受体中。
同样重要的是应注意，文献中没有提到血加压素用于控制癫痫发作，更不用说本发明的肽。血加压素用于控制癫痫发作的用途尚未在现有技术中公开或暗示，并且是相同发明人的另一项共同未决申请PCT/BR2017/050313的主题。文献所揭示的是其他分子实体，它们是CB1受体激动剂，而本发明的肽是反向激动剂和拮抗剂(调节剂)，这使得本发明的结果甚至更加令人吃惊。
文献WO 2013/021196公开了血加压素作为干扰少突胶质细胞(oligodentrite)分化的药剂的用途。本发明与所述文献不同，尤其在于其揭示了其他化合物、其他用途，并与血加压素相比提供了益处，包括更容易制备、更高的稳定性和生物活性，以及其他优势。此外，本发明人进行的测试显示出令人吃惊的结果，特别是关于用本发明化合物进行神经调节、神经保护、抑制癫痫发作的发生和/或多发性硬化的症状，这些在所述文献中均未描述或暗示。
其他科学文献的参考文献限制本发明但没有预期或暗示本发明，包括下列文献：
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从回顾的文献中，没有发现预期或暗示本发明的教导的文献，更不用说其令人吃惊的技术效果，使得在本发明人看来，本文提出的技术方案相对于现有技术具有新颖性和创造性。
发明内容
本发明解决了现有技术中许多已知的问题，例如提供：比血加压素更稳定和更易于处理的肽化合物；可用于制备具有药用价值的化合物的合成中间体；所述化合物用于制备大麻素和/或毒蕈碱系统的具有诊断价值的配体的用途；所述化合物用于制备与那些含有血加压素或大麻二酚的药物相比改进的药物的用途；一种用于调节代谢功能和/或与含有血加压素的组合物相比镇痛作用改进的药物组合物；一种免疫调节药物组合物；一种用于治疗性或预防性治疗惊厥和/或多发性硬化的神经调节性、神经保护性药物组合物；一种治疗方法；一种分子实体，其提供这些和/或其他技术效果，而没有因使用血加压素而产生的缺点，如不稳定性、形成聚集物和/或较低的治疗效果，也没有因使用大麻素物质而产生的不便，如虚脱和鼻出血等。
本发明的另一个目的是提供一种肽类化合物，其在极端温度下具有高稳定性和/或易于处理，特别适用于药物制剂和药物。与通常具有较大尺寸(9-15个氨基酸)的其他肽(如血加压素和已知变体)相比，本发明的肽类化合物尤其在动物的给药、生物利用度和/或治疗作用方面具有优势。除了提供先前未知的用途和在各个方面令人吃惊之外，本发明的肽类化合物还向哺乳动物提供口服给药，并提供比血加压素更高的治疗效果。
本发明的另一个目的是提供一种大麻二酚的化合物替代品，其在制备、处理、使用和安全性方面均具有优势，并且可以在所有或几乎所有已经描述过的应用中取代大麻二酚。
本发明的另一个目的是提供一种可用作毒蕈碱和/或大麻素系统受体配体的肽类化合物。因此，本发明的肽类化合物可用于诊断应用。本发明的另一个目的是体外方法，其用于诊断大麻素和/或毒蕈碱受体的存在、位置和/或数量以及评估其他化合物与此类受体的结合。
本发明的化合物还可用于通过以下方式调节毒蕈碱和/或大麻素受体：通过调节CB1受体、CB2受体、同时两者，通过调节在大麻素系统相互作用的其他物质的结合或作用，通过调节在大麻素系统中导致活性肽的生成或降解的蛋白酶或肽酶，或它们的组合。
本发明的另一个目的是制备具有药物和/或诊断价值的化合物中的合成中间体，其包含本发明的肽类化合物，还可包含化学修饰、取代、包含其他官能团。
本发明的另一个目的是本发明的肽类化合物用于制备用于调节哺乳动物代谢功能的改进的药物组合物的用途。
本发明的另一个目的是本发明的肽化合物用于制备改进的镇痛药物组合物的用途。
本发明的另一个目的是本发明的肽类化合物用于制备哺乳动物的神经调节物质和/或神经保护药物的用途。
本发明的另一个目的是本发明的肽类化合物用于制备用于治疗性或预防性治疗哺乳动物的癫痫发作的药物的用途。此外，将本发明的肽类化合物给予动物提供了重要的和令人吃惊的技术优势，包括与大麻二酚和血加压素相比优异的抗惊厥活性，其(血加压素)作为抗惊厥药的用途是相同发明人的共同未决专利申请的主题。
本发明的另一个目的是本发明的肽类化合物用于制备用于治疗性或预防性治疗哺乳动物的多发性硬化的药物的用途。
本发明的其他目的是治疗方法，其用于：治疗性或预防性治疗代谢紊乱、疼痛、癫痫发作、多发性硬化，以及用于神经调节和/或神经保护。
本发明的另一个目的是一种用于调节哺乳动物的代谢功能的改进的药物组合物。
本发明的另一个目的是一种改进的镇痛药物组合物。
本发明的另一个目的是一种哺乳动物的神经调节和/或神经保护药物组合物。
本发明的另一个目的是一种用于治疗性或预防性治疗哺乳动物的癫痫发作的改进的药物组合物。
本发明的另一个目的是一种用于治疗性或预防性治疗哺乳动物的多发性硬化的药物组合物。
本发明的化合物是一种下式的肽类化合物和/或其修饰形式，其环状、酰胺化、烷基化、烷氧基化、卤化、羟基化、聚乙二醇化形式，用其他官能团修饰的形式，用包括非天然氨基酸、D-氨基酸在内的氨基酸或肽修饰的形式，其盐，和/或它们的组合：
R1-N-AA1-K-AA2-R2
其中：
AA1为选自F、W、L、I、V、P、G的氨基酸；
AA2为氢或选自F、W、L、I、V、P、G的氨基酸；
当R2为氨基酸L时，R1不存在，或R1为氢或氨基酸V；和
当AA2为氢时，R2不存在，或当R1为氢时，R2为氢或氨基酸L。
本发明的化合物是合成的且不同于已知的天然形式，并且可用于制备具有药用价值的产物，其选自用于诊断用途的配体和用于哺乳动物的治疗性或预防性药物。
在一个实施方案中，AA1为F、W或L。
在一个实施方案中，R1和R2均为氢。
在一个实施方案中，本发明的化合物选自：NFKF、NWKF、NLKF、NFKW、NWKW、NLKW、NFKL、NWKL、NLKL、VNFK、VNWK、VNLK，以及其修饰或环状形式，其酰胺化、烷基化、烷氧基化、卤化、羟基化或聚乙二醇化形式，用其他官能团以及包括非天然形式如d-氨基酸形式在内的氨基酸或肽修饰的形式，其盐；和/或它们的组合。
在一个实施方案中，本发明的肽类化合物选自：NFK三肽、NFKF四肽、NFKL四肽，以及其修饰或环状形式，酰胺化、烷基化、烷氧基化、卤化、羟基化、聚乙二醇化形式，用其他官能团以及用包括非天然形式如d-氨基酸形式在内的氨基酸或肽修饰的形式，其盐；和/或它们的组合。
本发明的药物组合物包含本发明的肽类化合物和药学上可接受的载体，并且可为片剂、凝胶剂、口服液或糖浆剂、胶囊剂、栓剂、可注射溶液、可吸入形式或粘附形式(adhesive form)，任选地包含其它活性成分。
本领域技术人员和对该领域有兴趣的公司将立即意识到本专利申请的这些和其他目的，并将在以下说明书中对其再现性进行充分详细的描述。
附图说明
以下详细描述和附图阐明了本发明的主要特征和实施方案，进行更详细地阐述以向本领域技术人员提供进一步的支持，从而使得她/他可在其任何实施方案中理解并再现本发明的发明构思。这些细节或图不应被解释为是限制性的，而仅用于说明本发明的一些实施方案。
图1示出了NFKF实施方案中的本发明化合物相对于Hp(PVNFKFLSH)的比较稳定性测试的结果。图上的数据示出了在冷冻24小时后或分别在100℃下加热10分钟(n＝2)后，通过HPLC对这些活性物质中的每种进行浓度测量的结果。还示出了统计学显著性数据，星号表示：(＊)与对照相比p<0.05，(＊＊＊)与对照相比p<0.005；(＊＊＊＊)与对照相比p<0.0001。
图2示出了NFKF实施方案中的本发明化合物的测试结果，并与血加压素测试结果比较，两者均在毛果芸香碱模型中。给出了以下治疗剂量的给药后第一次流涎发生的时间：对照(盐水)；血加压素(Hp或PVNFKFLSH，0.551334μmol/kg)；血加压素(0.91889μmol/kg)；NFKF实施方案中的本发明化合物(0.540882μmol/kg)；NFKF(0.901469μmol/kg)；化合物PEP-19(DIIADDEPLT，0.908117μmol/kg)。星号表示统计学显著性：(＊)与对照相比p<0.05；(＊＊)与对照相比p<0.01；+号表示与Hp 0.91889μmol/kg相比p<0.05。
图3示出了NFKF实施方案中的本发明化合物作为抗惊厥药的测试结果，并与作为抗惊厥药的血加压素测试结果比较，两者均在毛果芸香碱模型中。给出了以下治疗剂量的给药后第一次癫痫发作的时间百分比(相对于对照)：对照(盐水)；血加压素(Hp或PVNFKFLSH，0.551334μmol/kg)；血加压素(0.91889μmol/kg)；NFKF实施方案中的本发明化合物(0.540882μmol/kg)；NFKF(0.901469μmol/kg)；化合物PEP-19(DIIADDEPLT，0.908117μmol/kg)。星号表示统计学显著性：(＊)与对照相比p<0.05；(＊＊)与对照相比p<0.01；+号表示与Hp 0.91889μmol/kg相比p<0.05。
图4示出了NFKF实施方案中的本发明化合物在毛果芸香碱模型中的测试结果，标明了对照、大麻二酚(30mg/kg)或NFKF(500μg/kg)的给药后发生第一次流涎的时间。在所测试的条件下，对照与其他测试化合物之间的数据之间不具有统计学显著性。
图5示出了NFKF实施方案中的本发明化合物在毛果芸香碱模型中作为抗惊厥药的测试结果，标明了大麻二酚(30mg/kg)或NFKF(500μg/kg)的给药后发生第一次惊厥的时间。星号表示统计学显著性：(＊＊)与对照相比p<0.02；(＊＊＊)与对照相比p<0.002。
图6示出了在毛果芸香碱模型中用NFKF实施方案中的本发明化合物进行神经保护测试的结果，标明了NFKF给药后动物的存活/死亡曲线。在A)中示出了给予对照(仅盐水)的动物的存活曲线；在B)中示出了给予大麻二酚30mg/kg的动物的存活曲线；在C)中示出了给予NFKF 500μg/kg的动物的存活曲线；在D)中，在一个图中示出了所有的曲线。值得注意的是，在用神经调节物质NFKF 500μg/kg治疗的组中，仅有2只动物死亡。NFKF组中剩余的动物(总共3只)保持存活超过一周，而实际上所有其他动物均在不到30分钟内死亡。因此，该组的平均存活时间明显不同并且远高于其他组。此外，当将NFKF组(500μg/kg)与给予大麻二酚(30mg/kg)的组比较时，第一组(即NFKF 500μg/kg组)的存活率高3倍，甚至在使用相对浓度低60倍的该化合物时。
图7示出了本发明化合物的不同实施方案(NFKF、NFKL和NFK，全部为600μg/kg)进行神经保护测试的结果，将本发明化合物预先给予动物组(每组n＝5)，随后给予毛果芸香碱，示出了在测试的模型中24小时后动物的存活/死亡曲线。纵轴显示死亡动物的数量。对照为在给予毛果芸香碱之前给予盐水。
图8示出了本发明的化合物NFKF、NFKL、NFK、FKF、FKL以及二肽NF、FK、KF和KL在毛果芸香碱模型中的测试结果，标明了在对照或测试化合物给药后发生第一次流涎的时间。＊与对照相比p<0.05。结果反映了对照组中7只动物的平均结果，以及用NFK治疗的组中6只动物的平均结果。
图9示出了本发明的化合物NFKF、NFKL、NFK、FKF、FKL以及二肽NF、FK、KF和KL在毛果芸香碱模型中的测试结果，标明了在对照或测试化合物给药后发生第一个信号的时间。
图10示出了本发明的化合物NFKF、NFKL、NFK、FKF、FKL以及二肽NF、FK、KF和KL在毛果芸香碱模型中的测试结果，标明了在对照或测试化合物给药后发生癫痫发作的时间。＊与对照相比p<0.05；＊＊与对照相比p<0.001。
图11示出了本发明的化合物NFKF、NFKL、NFK、FKF、FKL以及二肽NF、FK、KF和KL在毛果芸香碱模型中的测试结果，标明了在对照或测试化合物给药后发生死亡的时间。＊与对照相比p<0.05。
图12示出了在用对受体的激活/构象变化敏感的抗-CB1抗体的测定中，各种化合物与CB1受体的结合测定的结果。标明了相对于对照，与CB1受体结合的百分比值。＊与对照相比p<0.05。
图13显示了GPCR的三维结构的概况，在这种情况下，其为亚型1的大麻素受体。参考七个跨膜螺旋(I-VII)、细胞内环(ICL1和ICL2)和细胞外环(ECL2和ECL3)。
图14示出了AM6538结构在晶体结构(PDB 5TGZ)处的重叠，以及通过Goldscore函数验证之后获得的结果(当该图为彩色时，晶体结构为紫色，而Goldscore函数的结果为蓝色/青色，尽管对于本申请而言，这样的颜色是不相关的)。
图15示出了所观察到的AM6538在CB1受体结合位点处的主要相互作用。
图16示出了所观察到的利莫那班在CB1受体结合位点处的主要相互作用。
图17示出了所观察到的大麻二酚在CB1受体结合位点的主要相互作用。
图18示出了所观察到的NFKF实施方案中的本发明的肽类化合物在CB1受体结合位点的主要相互作用。
图19示出了获得CB2受体结构的方法的结果。在A)中，示出了所获得的CB2受体的三维结构；在B)中，示出了所获得的人CB2模型的Ramachandran图。
图20示出了CB2受体与AM6538配体之间的主要相互作用。
图21示出了CB2受体与利莫那班之间的主要相互作用。
图22示出了CB2受体与大麻二酚之间的主要相互作用。
图23示出了CB2受体与NFKF实施方案中的本发明化合物之间的主要相互作用。
图24示出了施加到大鼠右爪背部的疼痛阈值结果，表示为以克计的力。当动物通过踢做出反应时，诱导该反应所需的以克计的力为疼痛阈值。纵轴表示在腿部施加的压力。抗疼痛(antinoniceptive)活性表示为与对照动物相比疼痛阈值的增加。将本发明的化合物以0.5至0.25mg/kg的剂量口服给予动物，使用盐水作为对照。＊与对照相比p<0.05。
图25示出了NFKF实施方案中的本发明化合物用于控制多发性硬化的测试结果。A)示出接受用MOG进行的EAE诱导的野生型(WT)小鼠(即正常的)的临床评分曲线；B)示出接受MOG诱导的敲除内肽酶基因24.15的小鼠(即，转基因的且倾向于具有多发性硬化症状的)在EAE模型中的临床评分曲线；C)示出敲除内肽酶基因24.15的小鼠(即，转基因的和倾向于具有多发性硬化症状的)在接受MOG诱导和用NFKF获得的神经保护后在EAE模型中的临床评分曲线。＊与WT相比，24.15KO+NFKF的P<0.05；+与WT相比，24.15KO的P<0.05。
具体实施方式
本发明的几个目的的发明构思为下式的肽类化合物和/或其修饰形式，其环状、酰胺化、烷基化、烷氧基化、卤化、羟基化、聚乙二醇化形式，用其他官能团、用包括非天然氨基酸、D-氨基酸在内的氨基酸或肽修饰的形式，其盐，和/或它们的组合：
R1-N-AA1-K-AA2-R2
其中：
AA1为选自F、W、L、I、V、P、G的氨基酸；
AA2为氢或选自F、W、L、I、V、P、G的氨基酸；
当R2为氨基酸L，R1不存在，或R1为氢或氨基酸V；和
当AA2为氢时，R2不存在，或当R1为氢时，R2为氢或氨基酸L。
本发明的化合物是合成的且不同于已知的天然形式，并且可用于制备具有药用价值的产物，其选自用于诊断用途的配体和用于哺乳动物的治疗性或预防性药物。
在一个实施方案中，AA1为F、W或L。
在一个实施方案中，R1和R2均为氢。
在一个实施方案中，本发明的化合物选自：NFKF、NWKF、NLKF、NFKW、NWKW、NLKW、NFKL、NWKL、NLKL、VNFK、VNWK、VNLK以及其修饰或环状形式，其酰胺化、烷基化、烷氧基化、卤化、羟基化或聚乙二醇化形式，用其他官能团以及用包括非天然形式如d-氨基酸形式在内的氨基酸或肽修饰的形式，其盐；和/或它们的组合。
在一个实施方案中，本发明的肽类化合物选自：NFK三肽、NFKF四肽、NFKL四肽，以及其修饰或环状形式，酰胺化、烷基化、烷氧基化、卤化、羟基化、聚乙二醇化形式，用其他官能团以及用包括非天然氨基酸如d-氨基酸形式在内的氨基酸或肽修饰的形式，其盐；和/或它们的组合。
所述肽类化合物在极端温度下具有令人吃惊的高稳定性且易于处理，特别适用于药物制剂和药物。与通常具有较大尺寸(9至23个氨基酸)的其他肽(如血加压素和已知变体)相比，本发明的肽类化合物尤其在动物的给药、生物利用度和/或治疗作用方面具有优势。本发明的肽类化合物还提供哺乳动物的口服给药，并且提供比血加压素的已知治疗效果更高的治疗效果，并且可有利地在所有或几乎所有已经描述过的应用中替代血加压素。
本发明的化合物也是制备具有药用价值的化合物中的合成中间体，其包含本发明的肽类化合物，并包含化学修饰、取代、包含其他官能团。
本发明的化合物是大麻二酚的有利替代品，在制备、处理、使用和安全方面均具有优势，并且可用于在所有或几乎所有已经描述过的应用中替代大麻二酚。
本发明的化合物是毒蕈碱和/或大麻素系统受体的配体，可用于诊断应用或用于通过以下方式调节毒蕈碱和/或大麻素受体：通过调节CB1受体、CB2受体、同时两者，通过调节在大麻素系统中相互作用的其他物质的结合或作用，通过调节在大麻素系统中导致活性肽的生成或降解的蛋白酶或肽酶，或它们的组合。本专利申请中给出的测试结果表明本发明的化合物与大麻素和/或毒蕈碱受体相互作用，和/或调节大麻素和/或毒蕈碱受体的活性。
本发明的化合物可用于调节哺乳动物代谢功能的改进的药物组合物。
本发明的化合物可用于改进的镇痛药物组合物。
本发明的化合物可用于治疗性或预防性治疗哺乳动物的癫痫发作的药物组合物。将本发明的肽类化合物给药至动物提供了重要和令人吃惊的技术优势，包括优于大麻二酚和血加压素的优异的抗惊厥活性，血加压素作为抗惊厥药的用途是相同发明人的共同未决专利申请PCT/BR2017/050313的主题。
本发明的化合物可用于哺乳动物的神经调节和/或神经保护药物组合物。本专利申请中给出的测试结果表明，本发明的组合物调节神经元的作用，并且也是神经保护的、抗惊厥的并且可用于治疗多发性硬化。
为了本发明的目的，使用以下定义。
具有药用价值的产物
在本申请的上下文中，“具有药用价值的化合物”意指任何分子实体，其包含描述为本申请共同的发明构思的化合物，还包括通过以下方式获得的分子实体：对其进行化学修饰/衍生化，或包含其他官能团、直链或支链侧链，改变亲水性或疏水性等，条件是它们包含如上定义的实体R1-N-AA1-K-AA2-R2作为核心，天然和已知的实体除外。
药物组合物
在本专利申请的上下文中，“药物组合物”应理解为含有有效成分的任何和全部组合物，其用于预防、缓和和/或治疗目的，以维持和/或恢复体内平衡的方式起作用，并可口服、局部、肠胃外、肠内和/或鞘内给药。
药学上可接受的制剂
在本申请的上下文中，“药学上可接受的制剂”意指含有本领域技术人员所熟知的药学上可接受的赋形剂和载体的制剂，例如开发用于可在许多治疗方案中描述的特定组合物的方便剂量和治疗，包括口服、肠胃外、静脉内、鼻内、玻璃体内和肌内、脑内、脑室内及眼内治疗和给药和/或制剂。
修饰的肽
在本申请的上下文中，“修饰的肽”应理解为非天然存在的、人工修饰或合成的肽，包括卤化物、环化、酰胺化、烷基化、烷氧基化、羟基化、聚乙二醇化形式，在任何氨基酸上具有其他官能团的形式，或其盐形式，以及在包括非天然形式如d-氨基酸形式在内的氨基酸或肽。肽类化合物可使用本领域技术人员已知的技术进行聚乙二醇化，例如，用含有琥珀酰亚胺基团的试剂进行聚乙二醇化，所述试剂优先地与存在于肽的N-末端区域中的伯胺反应。本发明的肽类化合物可以使用本领域技术人员已知的技术在任何氨基酸上进行烷基化，所述技术包括，例如，在Reichwein&Liskamp中记载的Mitsuobu反应(Reichwein JF&Liskamp RMJ,Site-specific N-alkylation of peptides on the solid phase,Tetrahedron Letters,Volume 39,Issue 10,5March 1998,Pages 1243-1246)。所述文章描述了将任何烷基基团引入肽的特定酰胺官能团中。本发明的肽类化合物可以使用本领域技术人员已知的技术在任何氨基酸上进行烷氧基化，用卤素、羟基或其他官能团进行取代，所述技术包括，例如，在书Special Periodic Reports,Amino Acids,Peptides andProteins:Volume 42,Royal Society of Chemistry,2013中记载的那些。使用本领域技术人员已知的技术，本发明的肽类化合物可用可用于诊断和/或治疗应用的其他分子物质(如生物素)进行修饰。
环肽或环状肽
在本申请的上下文中，“环肽、环化肽或环状肽”应理解为这样的肽，其通过本领域已知的任何方法(特别是通过酶活性)而在直链肽分子的两端之间具有共价键。环肽可代替直链肽使用，因为它更难降解，这是因为它的末端或水解酶攻击的区域不像直链肽那样暴露。
激动剂
在本申请的上下文中，“激动剂”应理解为药剂、药物、激素、神经递质或其他信号分子，它与受体位点形成复合物，从而触发细胞的主动应答。
反向激动剂/拮抗剂
在本申请的上下文中，“反向激动剂或拮抗剂”应理解为一种或多种药剂(例如药剂、药物、激素或酶)，其与激动剂受体结合并产生与激动剂相反的药理学作用，使得一种药剂的作用部分或全部抑制另一种药剂的作用。具体地，当一种化合物在激动剂的存在下起作用，但降低其活性时，它就是反向激动剂；拮抗剂是完全阻断激动剂活性的化合物。
人体等效剂量
在本发明中，“人体等效剂量”的概念是预期在人体中产生与在给定剂量下在动物中的作用相同大小的作用的剂量，如美国卫生和公共服务部食品和药物监督管理局药物评估和研究中心(CDER)2005年7月在Pharmacology and Toxicology中发表的“Guidance forIndustry Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trialsfor Therapeutics in Adult Healthy Volunteers”中所述。在所述指南中，将观察到的动物剂量(mg/kg)转化为人体等效剂量(mg/kg)需要将在大鼠中获得的结果除以6.2，将在小鼠中获得的结果除以12.3。这些值适用于具有60kg标准重量的人。对于其他物种或在标准重量范围之外的重量，可通过下式计算人体等效剂量(DEH)：DEH＝以mg/kg计的动物剂量x(以kg计的动物重量/以kg计的人体重量)0.33。本指南认为安全范围为所测试的浓度极限的10倍是足够的。
CB受体配体
在本专利申请的上下文中，“CB受体配体”应理解为与CB系统和/或与CB1或CB2受体相互作用的化合物或分子。
调节CB受体功能或大麻素系统
在本专利申请的上下文中，“调节CB受体功能”是指一种相互作用，其导致CB受体(特别是CB1或CB2)的生化活性改变。应当理解，当在CB受体处发生拮抗剂或反向激动剂作用时，变化是正的，而当在CB受体处发生激动剂作用时，该变化是负的。本专利申请中提出的测试结果表明本发明的化合物可能作为CB1和/或CB2受体的别构调节剂而与CB1受体和/或CB2受体相互作用，并且/或者调节CB1受体和/或CB2受体。因此，本发明的化合物可用于通过以下方式调节大麻素系统：通过调节CB1受体或CB2受体、同时两者，通过调节在大麻素系统相互作用的其他物质的结合或作用，通过调节在大麻素系统中导致活性肽的生成或降解的蛋白酶或肽酶，或通过用本发明的化合物保护天然分子来改善天然系统，即，本发明的化合物还可独立于与所述受体的结合而使天然系统受到保护作用，或所述作用的组合。
调节毒蕈碱受体的功能
在本申请的上下文中，术语“调节毒蕈碱受体的功能”应理解为导致毒蕈碱乙酰胆碱受体(mAChR)改变的相互作用，所述毒蕈碱乙酰胆碱受体在认知功能(如学习和记忆、控制多巴胺释放、调节自发活动)中起重要作用，其调节也可用于控制阿尔茨海默病和/或控制对滥用药物的依赖性或成瘾性。应理解，当在毒蕈碱受体上发生拮抗剂或反向激动剂作用时，变化是正的，而当在毒蕈碱受体上发生激动剂作用时，变化是负的。本专利申请中提出的测试表明本发明的化合物与毒蕈碱受体相互作用和/或调节毒蕈碱受体。
调节代谢功能
在本申请的上下文中，该术语应理解为包括调节：能量和/或脂质代谢；动脉高血压、肠动力调节；免疫系统；钙循环的平衡，与甲状腺、外周器官和组织(包括生殖器官、脂肪组织、肝脏、肌肉和胃肠道)相关的病症，可用于治疗肥胖症、糖尿病、疾病或免疫性/炎性病症、骨质减少、骨质疏松、癌症。在这种情况下，本发明的肽类化合物也可用于治疗代谢紊乱的药物组合物，包括预防超重；调节食欲；诱发饱腹感；在成功减肥之后预防体重增加；增加能量消耗；美学减肥；或暴食症。
神经调节物质
在本申请的上下文中，术语“神经调节物质(neuromodulador)”或“神经调节物质(neuromoduladora)”旨在调节神经元/神经功能，包括调节大脑、皮质、海马、杏仁核、垂体、下丘脑活动；肾上腺。神经调节包括对抗导致病理生理过程的药剂或病症的神经保护的有益调节。神经保护剂或化合物优选地在疾病的前驱期之前(或期间)使用，所述前驱期通常在症状发作前许多年开始。在本发明中，神经调节物质可潜在地用于治疗性或预防性治疗各种神经病症或疾病，包括特发性震颤、偏头痛、疼痛、神经性疼痛、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化，精神疾病如焦虑、精神分裂症或双相型障碍，先天性疾病如痴呆、阿尔茨海默症、帕金森氏症、孤独症，还可潜在地用于改善癫痫发作和/或癫痫的发生所涉及的病理生理过程，以及与由于缺血、缺氧或其他有害状况引起的神经元兴奋性紊乱或神经元损伤相关的其他临床病症。
尽管在本专利申请中证明了本发明的化合物结合和/或调节大麻素受体，但是本发明的令人吃惊的药物作用可能与对CB1和/或CB2和/或毒蕈碱受体的作用相关，或可能与腺苷摄取、GGPR55、PPARγ受体、胞内钙水平的调节相关，与大麻素受体形成异源二聚体的阿片样物质受体的调节相关，或与它们的组合相关。因此，与这些目标相关的任何治疗适应症都可受益于本发明。
本发明还由下列条款限定。
上述肽类化合物。
上述肽类化合物用于制备具有药用价值的产物的用途，所述产物选自用于诊断用途的配体以及哺乳动物的治疗性或预防性药物。
如上所述的用途，其中AA1和/或AA2为F、W或L。
如上所述的用途，其中所述肽类化合物选自：NFKF、NWKF、NLKF、NFKW、NWKW、NLKW、NKKL、NWKL、NLKL、VNFK、VNWK、VNLK，以及修饰的、环状形式，酰胺化、烷基化、烷氧基化、卤化、羟基化、聚乙二醇化形式，用其他官能团修饰的形式，及用包括非天然形式如d-氨基酸形式在内的氨基酸或肽修饰的形式，其盐；和/或它们的组合。
如上所述的用途，其中所述肽类化合物选自：NFK三肽、NFKF四肽、NFKL四肽，以及其修饰的、环状形式，酰胺化、烷基化、烷氧基化、卤化、羟基化、聚乙二醇化形式，用其他官能团修饰的形式，以及用包括非天然形式如d-氨基酸形式在内的氨基酸或肽修饰的形式，其盐；和/或它们的组合。
制备包含上述化合物的具有药用价值的化合物中的合成中间体。
上述化合物作为制备具有药物和/或诊断价值的其他化合物中的合成中间体的用途。
上述化合物，其被修饰。
上述化合物用于制备大麻素受体配体和/或毒蕈碱受体的用途。
上述化合物用于制备在哺乳动物中具有诊断价值的结合物(binder)的用途。
上述化合物用于制备调节代谢功能的药物组合物的用途。
上述化合物用于制备镇痛药物组合物的用途。
上述化合物用于制备免疫调节药物组合物的用途。
上述化合物用于制备哺乳动物的神经调节物质和/或神经保护药物的用途。
上述化合物用于制备哺乳动物的治疗性或预防性抗惊厥药的用途。
上述化合物用于制备用于治疗性或预防性治疗哺乳动物的多发性硬化的药物的用途。
一种在哺乳动物中调节代谢功能的药物组合物，其包含药学上可接受的载体；以及作为有效成分的上述化合物。
哺乳动物的镇痛药物组合物，其包含药学上可接受的载体；以及作为有效成分的上述化合物。
一种神经调节和/或神经保护药物组合物，其包含药学上可接受的载体；以及作为有效成分的上述化合物。
一种用于治疗性或预防性治疗哺乳动物的癫痫发作的药物组合物，其包含药学上可接受的载体；以及作为有效成分的上述化合物。
用于治疗性或预防性治疗哺乳动物的多发性硬化的药物组合物，其包含药学上可接受的载体；以及作为有效成分的上述化合物。
一种药物组合物，其包含NFK三肽、NFKF四肽、NFKL四肽或它们的组合。
如上所述的药物组合物，其形式为片剂(tablete)、片剂(comprimido)、凝胶剂、口服液或糖浆剂、胶囊剂、栓剂、注射用溶液、可吸入形式或粘附形式。
一种动物的代谢功能的治疗调节剂，包括给予上述肽。具体而言，对于该应用，本发明的肽优选地被修饰，使得其分子量更大，从而最小化或阻止其通过血脑屏障。
一种治疗性或预防性治疗疼痛的治疗方法，其包括给予动物上述化合物。
治疗性或预防性神经调节和/或神经保护的治疗方法，其包括给予动物上述化合物。
治疗性或预防性治疗癫痫发作的治疗方法，其包括给予动物上述化合物。
治疗性或预防性治疗多发性硬化的治疗方法，其包括给予动物上述化合物。
体外和计算机模拟测试的结果已表明，本发明的化合物在药物组合物的制备、其稳定性和治疗效果方面具有优势。
已证明本发明的化合物比血加压素稳定得多，所述血加压素及其已知变体还引起纤维形成或原纤维的技术问题。
在哺乳动物的体内测试的结果表明，在低剂量下具有优异的治疗效果，没有明显副作用的迹象。
还已证明本发明的肽类化合物为用于制备可用于诊断和/或治疗应用的其他化合物的合适的合成中间体。在本发明中进行的测试表明，本发明的化合物可用本领域技术人员已知的生物素进行适当修饰，所述生物素可用于诊断制剂或试剂盒中。当用生物素修饰/保护时，本发明的肽类化合物在用对受体的激活/构象变化敏感的抗CB1抗体的测试中也显示出与CB1受体结合。本发明的另一个目的是一种诊断大麻素、阿片样物质和/或毒蕈碱受体的存在、数量和/或位置，以及评价其他化合物与这些受体的结合的体外方法。
由在哺乳动物中给予本发明的化合物所产生的神经调节/神经保护作用，可通过与给予已知有害的物质(如毛果芸香碱)相关的症状、脑损伤和死亡的减少和/或不存在来证明。用EAE/MOG模型(用于复制多发性硬化的最常用模型)进行的测试还表明，将本发明的肽类化合物给予动物大大减少了多发性硬化(一种本质上与神经元损伤相关的疾病)的临床症状。
在一个实施方案中，本发明提供了所述化合物用于制备神经调节、神经保护药物和/或用于治疗性或预防性治疗哺乳动物的癫痫发作的用途。将本发明的化合物给予动物提供了神经调节、神经保护、抗惊厥和/或抑制有症候的多发性硬化(symptomaticmultiple sclerosis)的活性；使口服给药可行；不具有或不涉及由制备、储存、运输和使用大麻素物质导致的缺点，并在制备用于哺乳动物的治疗产品、其给药和/或效果方面提供额外的优势。此外，将本发明的化合物给予动物提供了重要的且令人吃惊的技术优势，包括优于血加压素的优异的抗惊厥活性，血加压素作为抗惊厥药的用途是相同发明人的共同未决申请的主题。
本发明描述了化合物用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物可用于多种医学病症，包括与中枢神经系统相关的那些。令人吃惊地，尽管本发明的活性化合物是肽类或主要是肽类，但口服给药在动物中提供了脑作用。
在一个实施方案中，用本发明的组合物进行的体内测试显示出关于其神经保护活性的令人吃惊的结果。当将本发明的组合物预先给予动物时，其提供了令人吃惊的、有效的和长期的保护，以防止由随后给予的已知对神经元有害的物质所引起的损伤。因此，由本发明的化合物提供的神经保护可特别用作多种医学病症的治疗选择，所述医学病症包括与神经元兴奋性紊乱相关的那些，例如癫痫发作。
在多个实施方案中，用本发明的化合物进行的体内测试证明了关于其抗惊厥活性的令人吃惊的效果。当用作抗惊厥药时，本发明的化合物还提供了作为代替已知用作抗惊厥药的大麻素化合物(例如大麻二酚)的良好候选物的优势。尽管大麻二酚已被证明作为抗惊厥药具有作用，但由于其来源(大麻植物)而面临监管问题。本发明为患有癫痫发作且难以获得药物的患者提供了一种另外的治疗方法，该方法基于肽，即，不使用大麻的衍生物。此外，结果表明，当用作抗惊厥药时，本发明的化合物在使用中提供了其他令人吃惊的技术优势，包括更高的治疗效果、口服使用、更低的剂量、更少的副作用(如虚脱和鼻出血)的发生，以及其他技术优势。
大麻二酚(CBD)如何停止癫痫发作的分子机制尚未完全了解。已知CBD：抑制腺苷再摄取；是5-HT 1A激动剂；是GPR55(CB3)的拮抗剂；是PPARγ受体激动剂；除了与CB1和CB2相互作用外，还增加细胞内Ca2+。另一方面，血加压素通过pERK1/2和AKT而具有主要作用。因此，令人吃惊且难以解释的是为什么本发明的肽类化合物和CBD都具有抗惊厥作用。
在实验性惊厥模型测试中，与参考化合物大麻二酚的剂量相比，将本发明的药物组合物给予哺乳动物在低剂量下产生优异的治疗效果。此外，测试结果表明，本发明的组合物在使用中提供了令人吃惊的技术优势，包括更高的治疗效果、口服使用的可行性、不使用载体油(其在许多情况下会引起副作用)、更低的剂量和更少的副作用(如虚脱和鼻出血)发生。
体内比较测试证明，本发明的化合物与血加压素相比具有优异的活性和/或需要更少的剂量，血加压素作为抗惊厥药的用途是相同发明人的共同未决的专利申请的主题。
本发明的药物组合物还可用于治疗与调节大麻素系统、大麻素(CB)和/或毒蕈碱受体的活性相关的疾病，其具有若干技术优势，并且没有现有技术中可获得的同类物(congener)的已知不良影响。
此外，如将在以下实施例中证明的，本发明的化合物在制备神经调节、神经保护和/或抗惊厥药物中的用途提供了可口服给予哺乳动物的药物的递送。测试结果显示了显著的大脑作用，表明本发明的化合物的给药允许活性成分跨越血脑屏障。因此，结果证明/支持本发明的化合物的用途，无论本发明的化合物是直接作用于靶点的活性物质(即在口服摄入过程中不降解)，还是该化合物是前体，所述前体在化学修饰后作用于靶点(在这种情况下，其被表征为前药)。即使通过口服给药也能提供重要效果的特性是特别符合需要的，因为哺乳动物的天然酶通常在消化道中降解肽和蛋白质，而且很少有具有肽活性的药物被证明是可行的。然而，令人吃惊地，本发明的化合物(即使当口服给药时)提供了强的治疗作用，在这种情况下，甚至更令人吃惊地，在大脑中起作用。
因此，不论作用机制如何(不是本申请的主题)，本发明的药物组合物的口服给药提供了重要的神经调节、神经保护、抗惊厥、疼痛调节和有症候的多发性硬化，甚至避免死亡，清楚地证明了所解决的技术问题的令人吃惊程度和相关性。
本发明的药物组合物包含上述化合物以及药学上可接受的载体，任选地还包含其他药学上可接受的活性物质和/或其盐。本发明的药物组合物可以片剂、凝胶剂、胶囊剂、口服液或糖浆剂、栓剂、注射液的形式或其他合适的用于药学和医学目的的给药形式给药。
以下实施例只是为了举例说明实施本发明的多种方法中的一些，但并不限制其范围。
比较测试表明，与血加压素相比，本发明的化合物在极端温度下具有优异的体外稳定性。
在一些实施例中，本发明组合物的神经调节/神经保护/抗惊厥作用已通过动物的口服给药而在体内进行评价。将本发明的药物组合物以本发明化合物的不同实施方案以口服治疗剂量给予哺乳动物(小家鼠(Mus musculus)或小鼠)，并与其他化合物或盐水对照比较。在这些实验中，在毛果芸香碱(腹膜内)给药之前10分钟口服给予测试化合物。将溶于0.9％的无菌盐水中的毛果芸香碱盐酸盐(320mg/kg，Merck)经腹膜内给药以诱发SE(癫痫持续状态)(Turski et al.，1983)。在Turski模型中，神经毒性作用在注射Pilo后大约15-25分钟开始，伴随运动性和边缘性癫痫发作的发生，所述动物逐渐发展到持续性(阵挛性)癫痫发作状态，这是SE的特征(Sanabria和Cavalheiro，2000)。
比较测试还证明，与血加压素相比，本发明的化合物显示出优异的体内治疗活性，血加压素作为抗惊厥药的用途是相同发明人的共同未决的专利申请PCT/BR/2017050313的主题。
本发明的化合物是重要的GPCR(大麻素受体)的配体/调节剂，可用于在病理条件下调节GPCR受体的活性，以及调节靶GPCR，也可作为用于细胞的其他靶向治疗分子实体的载体，所述细胞表达与大麻素受体二聚的GPCR。本发明的化合物还可用于与对受体的激活/调节构象具有选择性的抗体(尤其是单克隆抗体)结合的疗法。这类疗法提供了赋予高特异性的优势，还潜在地减少了给药剂量。
实施例
实施例1.在极端条件下的稳定性测试——本发明化合物相对于血加压素的优越 性
在该实施方案中，在极端条件下，将NFKF实施方案中的本发明化合物的稳定性与血加压素(Hp,PVNFKFLSH)的稳定性进行了比较。已知Hp具有原纤维形成的问题以及其变体含有更多氨基酸。对NFKF和Hp样品进行了两次单独的测试，即通过冷冻24小时并在100℃下加热10分钟进行稳定性测试。
图1的结果表明，通过冷冻24h，相当大部分的Hp损失或降解(从140到97，即大约31％)，如通过HPLC(分析柱为2.1mm，10-60％B梯度运行。溶剂A为水/0.1％TFA，溶剂B为乙腈/0.075％TFA)测量所证明的。另一方面，NFKF实施方案中的本发明的化合物稳定得多，并且降解的相当少(从120到100，即16.7％)。图1的结果还表明，在100℃下加热10分钟后，甚至更大部分的Hp损失或降解(从140到50，即大约64.3％)，如通过HPLC测量所证明的。另一方面，NFKF实施方案中的本发明的化合物保持稳定，并且没有统计学上显著的降解。
总之，这些数据表明，本发明的化合物在极端温度条件下提供了更高的稳定性和更低的降解，这有利于其有效成分的采购后阶段、在药品的工业生产中以及尤其是在运输物流链中的操作、盖仑制剂、药物制备和药物稳定性。数据表明，含有本发明化合物的药物产品的保质期应大于含有Hp或其他有不稳定性问题的活性物质的同类物。
实施例2.化合物R1-N-AA1-K-AA2-R2 在制备药物组合物中的用途
在该实施方案中，化合物R1-N-AA1-K-AA2-R2为四肽NFKF，其通过化学合成而合成。所述肽已用于制备口服液体药物组合物，其包含2.7x10-4摩尔的所述肽和药学上可接受的载体。在该实施方案中，所述载体为盐水，所述药物组合物为口服用溶液。所述组合物用于以下实施例3-8的哺乳动物的体内口服给药。
在其他实施方案中，所述药物组合物为片剂、凝胶剂、口服液或糖浆剂、胶囊剂、栓剂、注射液、可吸入形式或粘附形式，任选地包含其他有效成分。
实施例3.比较包含化合物NFKF的药物组合物与包含Hp的药物组合物——体内测 试结果
在该实施例中，比较了本发明的组合物相对于含有血加压素(Hp或PVNFKFLSH)的药物组合物的效果，血加压素作为抗惊厥药的用途是相同发明人的共同未决的专利申请PCT/BR2017/050313。
图2示出了本发明化合物NFKF的测试结果，并与血加压素测试结果比较，两者均在毛果芸香碱模型中。给出了以下治疗剂量给药后相对于对照的第一次流涎发生的时间百分比：对照(盐水)；血加压素(Hp或PVNFKFLSH，0.551334μmol/kg)；血加压素(0.91889μmol/kg)；本发明的肽NFKF(0.540882μmol/kg)；NFKF(0.901469μmol/kg)；或PEP-19(DIIADDEPLT，0.908117μmol/kg)。星号表示统计学显著性：(＊)与对照相比P<0.05；(＊＊)与对照相比P<0.01；+号表示与Hp 0.91889μmol/kg相比P<0.05。
一方面，由毛果芸香碱给药引起的流涎表明毒蕈碱受体的变化。因此，在本发明化合物的预先给药后观察到的第一次流涎发生的时间曲线的实质变化表明，直接或间接地调节毒蕈碱受体。
此外，图2的结果清楚地表明，本发明化合物的口服给药提供了显著更高的流涎时间调节活性，其显著高于口服给药Hp后所观察到的。
实施例4.比较包含化合物NFKF的抗惊厥药物组合物与包含Hp的抗惊厥药物组合 物——体内测试结果
在该实施例中，比较了本发明的组合物与含有血加压素(Hp或PVNFKFLSH)的药物组合物的抗惊厥效果，血加压素作为抗惊厥药的用途是相同发明人的共同未决的专利申请PCT/BR2017/050313。
图3示出了本发明化合物NFKF作为抗惊厥药的测试结果，并与血加压素作为抗惊厥药的测试结果比较，两者均在毛果芸香碱模型中。以下治疗剂量给药后第一次癫痫发生的时间百分比(相对于对照)：血加压素(Hp或PVNFKFLSH，0.551334μmol/kg)；血加压素(0.91889μmol/kg)；本发明的肽NFKF(0.540882μmol/kg)；NFKF(0.901469μmol/kg)；PEP-19(DIIADDEPLT，0.908117μmol/kg)和对照(盐水)。星号表示：(＊)与对照相比P<0.05；(＊＊)与对照相比P<0.01；+号表示与Hp 0.91889μmol/kg相比P<0.05。
此外，图3的结果清楚地表明，本发明化合物的口服给药提供的调节第一次癫痫发作发生的活性显著高于口服给药Hp后所观察到的。例如，与Hp相比，用一半剂量的本发明化合物观察到相同的效果。
实施例5.包含化合物NFKF的抗惊厥药物组合物——体内测试结果。
在该实施方案中，通过预先将本发明组合物给予动物，随后将毛果芸香碱给予动物来评价根据实施例2制备的本发明组合物的抗惊厥效果。图4显示了毛果芸香碱模型的结果，表明对照、大麻二酚(30mg/kg)、本发明的化合物R1-N-AA1-K-AA2-R2(在该实施方案中为NFKF四肽)(500μg/kg)给药后第一次流涎的时间。
图5给出了毛果芸香碱模型的结果，表明大麻二酚(30mg/kg)和本发明的肽NFKF(500μg/kg)给药后第一次癫痫发作发生的时间。星号表示：(＊＊)与对照相比p<0.02；(＊＊＊)与对照相比p<0.002。
除了图4和图5所示的结果外，重要的额外技术效果包括观察到在接受使用本发明化合物NFKF的治疗的动物中没有发生虚脱或鼻出血，而在使用大麻二酚治疗的动物组中，观察到虚脱和鼻出血。因此，这些是由本发明的化合物解决的额外技术问题。
实施例6.包含化合物NFKF的神经调节药物组合物——体内测试结果
在该实施方案中，通过预先将本发明组合物给予动物，随后将毛果芸香碱给予动物来评价根据实施例2制备的本发明组合物的神经调节作用。其他测试化合物也如下所述进行评估。毛果芸香碱的给药会导致严重的脑损伤、神经毒性，并且通常以动物死亡而告终。这种物质用于下述实验，但其有害的神经元/颅内作用被本发明组合物的预先给药所抑制：与使用其他已知物质治疗的动物组相比，大多数经历这些实验的动物没有与脑损伤相关的症状，并且存活下来而没有明显的损伤。
将根据实施例2制备的本发明的组合物预先给予动物。图6示出了在毛果芸香碱模型中用NFKF实施方案中的本发明化合物进行神经保护测试的结果，标明了NFKF给药后动物的存活/死亡曲线。在A)中示出了给予对照(仅盐水)的动物的存活曲线；在B)中示出了给予大麻二酚30mg/kg的动物的存活曲线；在C)中示出了给予NFKF 500μg/kg的动物的存活曲线；在D)中，在一个图中示出了所有的曲线。值得注意的是，在用NFKF 500μg/kg治疗的组中，仅有两只动物死亡。在NFKF组中剩余的动物总共3只存活超过一周，而实际上所有其他动物都在不到30分钟内死亡。因此，该组的平均存活时间显著不同且远高于其他组。此外，当将NFKF组(500μg/kg)与给予大麻二酚(30mg/kg)的组进行比较时，第一组(即给药NFKF500μg/kg的组)的存活率高三倍，甚至在使用相对浓度低60倍的化合物时。
除了上图6所示的结果外，重要的额外技术效果包括观察到在接受NFKF治疗的动物中没有发生虚脱或鼻出血，而在使用大麻二酚治疗的动物组中，观察到了虚脱和鼻出血。因此，这些是由本发明的化合物解决的额外技术问题。
实施例7.包含化合物NFKF、NFKL或NKF的神经调节药物组合物——体内测试结果
鉴于在实施例6中获得的令人吃惊的结果，在下述实验中对NFKF、NFKL和NKF实施方案中的本发明的肽进行了比较，其表明，预先给予这些实施方案的本发明的化合物抑制了毛果芸香碱的有害的神经元/颅内作用：与用对照治疗的动物组相比，一些经历这些实验的动物没有与脑损伤相关的症状，并且存活下来而没有明显的损伤。本发明的组合物是根据实施例2制备的，并进行了适当的浓度校正，以比较NFKF、NFKL和NKF的效果，这些化合物预先给予动物组。图7示出了毛果芸香碱模型中神经保护测试的结果，通过给予本发明的这些化合物并随后给予毛果芸香碱来标明动物的存活/死亡曲线。值得注意的是，在NFKL 600μg/kg治疗的组中，结果甚至比用NFKF得到的结果更好，而用NFK的结果与用NFKF得到的结果相当。
实施例8.一种包含化合物NFKF、NFKL、NFK、FKF、FKL的抗惊厥药物组合物——体内 测试结果
在该实施方案中，在毛果芸香碱模型中评价了本发明化合物的不同实施方案NFKF、NFKL、NFK、FKF、FKL以及NF、FK、KF和KL二肽的抗惊厥效果。
表1示出了在所测试的模型中第一次流涎发生的时间数据。
表1：
对照 NFKF NFKL NFK FKF FKL NF FK KF KL
1 0.6667 1.83 1.183 1.38 0.38 1.6 0.83 0.1833 1.38 0.95
2 3.2000 1.97 1.067 0.75 0.95 0.2 0.97 1.5 1.75 0.50
3 1.6333 2.73 1.25 0.42 0.50 0.633 1.73 0.95 1.42 1.50
4 2.6667 1.58 2.45 0.98 1.50 1.5 0.58 2.183 1.98
5 0.8333 3.2 1.25 0.333 1.2
图8示出了本发明的化合物NFKF、NFKL、NFK、FKF、FKL以及二肽NF、FK、KF和KL在毛果芸香碱模型中的测试结果，标明了在对照或测试化合物的给药后第一次流涎发生的时间。值得注意的是，NFK给药的结果，其在毛果芸香碱模型中抑制或延缓第一次流涎的发生。该结果表明调节毒蕈碱受体功能，如乙酰胆碱(mAChR)，其在认知功能如学习和记忆、多巴胺释放的控制、自发活动的调节中起着重要作用。这些受体的调节可用于控制阿尔茨海默病和/或控制滥用药物的依赖性或成瘾性以及对抗老年痴呆症的保护作用。
表2示出了在所测试的模型中第一信号发生的时间数据。
表2：
对照 NFKF NFKL NFK FKF FKL NF FK KF KL
1 2.67 8.43 9.317 6.28 5.3 5.67 5.67 6.5 5.8 8.5
2 10.2 10.23 10.17 8.92 6.35 9.5 4.99 7.33 6.33 7.33
3 10.5 13.53 3.83 4.83 8.33 8.5 5.5 7.4 6.5
4 5.5 9.9 10.17 7.82 8.82 4.5 3.5 6.17 7.5
5 9.65 12.33 10.25 9.17 6.5
图9示出了本发明的化合物NFKF、NFKL、NFK、FKF、FKL以及二肽NF、FK、KF和KL在毛果芸香碱模型中的测试结果，标明了对照给药或测试化合物给药后第一信号发生的时间。
表3示出了在所测试的模型中第一次癫痫发作发生的时间数据。
表3：
对照 NFKF NFKL NFK FKF FKL NF FK KF KL
1 7.9 15.17 18.4 11.33 6.28 5.3 5.67 5.67 6.5 5.8
2 10.5＊ 19.95 15.33 9.67 8.92 6.35 9.5 4.99 7.33 6.33
3 8.38 15.18 30 8 3.83 4.83 8.33 8.5 5.5 7.4
4 9.55 16 27.3 9.93 7.82 8.82 4.5 3.5 6.17
5 9.65 17.88 15.33 13.38 10.25 9.17 6.5
图10示出了本发明的化合物NFKF、NFKL、NFK、FKF、FKL以及二肽NF、FK、KF和KL在毛果芸香碱模型中的测试结果，标明了对照给药或测试化合物给药后第一次癫痫发作发生的时间。
表4示出了在所测试的模型中发生死亡的时间数据。
表4：
对照 NFKF NFKL NFK FKF FKL NF FK KF KL
1 13.17 18.92 26.63 13.53 13.17 14.53 13.17 13.17 11.7 16.67
2 18.67 20 25.13 11.7 20.67 11.7 20.67 20.67 10.92 13.5
3 17.67 15.18 10.92 16.67 10.92 16.67 16.67 13.5 19.88
4 10.87 13.5 10.87 13.5
5 13.9 16.83 12.9 12.9
图11示出了本发明的化合物NFKF、NFKL、NFK、FKF、FKL以及二肽NF、FK、KF和KL在毛果芸香碱模型中的测试结果，标明了对照化合物或测试化合物给药发生后死亡的时间。
在上表1-4的FKF、FKL、NF、FK、KF和KL测试的情况下，空白区域来自发生惊厥且同时死亡的动物。
在上述实施例3至8中进行的测试的结果示出了重要的且显著的体内结果，剂量范围为每kg动物大约500至1000μg本发明化合物的量级。考虑到在小鼠中进行测试并转化为上述人体等效剂量，在每kg人体40至80μg本发明化合物的剂量范围内预期在人体内具有相同程度的效果，并且在本发明中考虑了人体给药的安全范围为4至800μg/kg的浓度。
实施例9.化合物R1-N-AA1-K-AA2-R2作为制备其他化合物中的合成中间体的用途
在本申请中，本发明的肽类化合物也可用作合成中间体以获得具有药物/诊断价值的其他化合物。在该实施方案和其他实施方案中，该化合物称为“修饰的肽”，其为非天然的、经人工修饰或通过合成得到，包括其卤化物，环化、酰胺化、烷基化、烷氧基化、羟基化、聚乙二醇化形式，在任何氨基酸中具有其他官能团的形式，或盐形式，以及用包括非天然形式如d-氨基酸形式在内的氨基酸或肽修饰的形式。在该实施例的实施方案中，使用本领域技术人员已知的技术用可用于诊断和/或治疗应用的分子物质(如生物素)对本发明的肽类化合物进行修饰。生物素为标记或标签，其可用于通过使用抗生物素抗体或采用酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶)的亲和素/链霉亲和素检测策略或荧光探针来检测本发明的配体靶，在此例中为大麻素和/或毒蕈碱受体。
生物素化实施方案中的经修饰的本发明化合物用于使用对构象变化敏感的抗CB1受体抗体进行的筛选技术。
制备对CB1受体激活敏感的抗体，并通过其特异性进行表征。为了筛选化合物，将纹状体膜(每孔5μg)铺在NUNC-Immuno 96孔板(Nalge-Nunc)上，并在室温下干燥。将膜用PBS(磷酸盐缓冲盐水)洗涤，并在有或没有不同配体(1μM)的情况下培养，用ELISA测量抗体对受体的识别程度。测试结果如表5所示，其标明了相对于对照的与CB1受体的结合％：
表5：
Figure BDA0002368148450000331
图12示出了这些结果，并且证实本发明的肽类化合物也已被证明为用于制备可用于诊断和/或治疗应用的其他化合物的合适的合成中间体。当通过生物素修饰/保护时，本发明的肽化合物在用对受体的激活/构象变化敏感的抗CB1抗体进行的测试中也显示出与CB1受体结合。
在此背景下，本共同发明人已经证明(Gupta et al.)μ和δ阿片样物质受体与CB1大麻素受体二聚，并且异源二聚化导致受体功能的调节。此外，其他CB1受体结合物质的使用提供了增加的对μ阿片样物质受体的识别，其显然是由它们的构象变化介导的。这些观察结果支持了这样的观点，即CB受体配体引起的构象变化可能影响异源二聚体中的受体配偶体(receptor partner)，并且这可使用对构象变化敏感的抗体进行检测。因此，该实施例的测试结果支持了用于调节GPCR(G蛋白偶联受体，或G-蛋白偶联受体/GPCR)功能的蛋白-蛋白或肽-蛋白相互作用(包括异源二聚体相互作用)的体外诊断方法的构思。
本实施例的结果支持了本发明的目的之一，其为一种用于诊断大麻素、阿片样物质和/或毒蕈碱受体的存在、数量和/或位置，以及评价其他化合物与这些受体的结合的体外方法。
所述方法包括使任选修饰的本发明的化合物与含有大麻素、阿片样物质和/或毒蕈碱受体的生物样品接触。所述方法还可用于与这些受体结合的其他分子实体的鉴定和/或定量，并包括检测所述视觉、光学、放射性、化学、光谱信号连接的步骤。实例包括生物化学、细胞化学、组织化学测试。本发明的配体还可潜在地用于体内诊断和/或预后方法，包括对比和非对比成像测试，例如通过给予本发明化合物来调节其存在和/或数量的分子实体的磁共振波谱(MRS)。该方法可潜在地用于退行性疾病(尤其是神经退行性疾病)的诊断和/或预后。
实施例10.化合物NFKF与CB1受体的体外和计算机模拟结合/相互作用测试
在该实施例中，用大麻素受体CB1评价了本发明的化合物R1-N-AA1-K-AA2-R2(其中为NFKF四肽)的体外亲和力谱。
为此，使用结合技术通过浓度为1和10μM的大麻素CB1受体测量NFKF四肽(纯度为100％的粉末，并制成10mM的DMSO原液)的亲和力。使用与放射性配体激动剂CP 55940(IC50(M)＝1.1nM；Ki(M)＝0.94nM；nH＝1)相关的人重组CB1大麻素受体进行该评价。使用表达人CB1受体的重组CHO细胞和[3H]CP 55940接头(浓度为0.5nM；3.5dM Kd)，并使用非特异性化合物WIN 55212-2(10mM)在37℃下培养120分钟，进行体外结合测定，用闪烁扫描术计数检测(Munro et al.，1993)。
结果根据下式表示为特异性对照的结合的百分比：
Figure BDA0002368148450000341
并且在本发明化合物的存在下获得的特异性对照的结合的抑制百分比为：
Figure BDA0002368148450000342
IC50值(导致特异性对照结合的最大抑制作用一半的浓度)和Hill(nH)系数是通过用平行测定的平均值使用Hill方程生成的竞争曲线的非线性回归确定：
Figure BDA0002368148450000343
其中Y＝特异性结合，A＝左渐近曲线(asymptotic left of curve)，D＝右渐近曲线，C＝化合物浓度，C50＝IC50，nH＝曲线系数/斜率因子。该分析使用Hill软件进行，所述软件通过与用Sigmaplot 4.0软件生成的数据进行比较而进行验证。使用Chen Prusoff方程计算了抑制常数(Ki)：
Figure BDA0002368148450000344
其中L＝测定中放射性配体的浓度；KD＝放射性配体对于受体的亲和力。使用图表来确定KD。
认为显示抑制或刺激大于50％的结果代表测试化合物的显著效果。显示抑制或刺激在25％和50％之间的结果表明测试化合物的低至中度效果。可认为显示抑制或刺激小于25％的结果是次要的。显示抑制大于或等于50％的结果表明测试化合物的非特异性或变构效应。
所获得的每个测试浓度(1和10μM)的结果示于表6中，设两个平行测定。
表6——NFKF对放射性配体激动剂CP55940与CB1受体结合的体外抑制数据
特异性对照的结合的抑制％
浓度 第一次测量 第二次测量 平均值
1mM -121.4 -27.8 -74.6
10mM -18.9 -0.9 -9.9
即使不考虑以1mM进行的第一次测量，但由于令人吃惊的高数值，以1mM进行的第二次测量的数据本身仍将被视为表明效果。
结果表明，在低浓度时，NFKF有更大的调节各放射性配体的结合的能力，表明在nM范围内作用更大。
这些结果表明与证明NFKF四肽的治疗谱相关的可能作用机制涉及CB1大麻素受体的变构调节，这与令人惊讶/预料不到的体内测试结果(实施例3、4、5、6、7、8)，以及上述体外实验的结果和下述计算机模拟实验的结果是一致的。
这些实验数据表明，本发明的化合物与CB1受体和/或其内源性配体相互作用和/或调节CB1受体和/或其内源性配体的活性。因此，本发明的化合物可潜在地用于多种代谢功能，包括控制食物摄入、能量代谢和/或脂质代谢、调节肠动力、免疫系统、钙循环平衡等。大麻素受体在脑中广泛表达，包括皮质、海马、杏仁核、垂体、下丘脑、肾上腺。CB受体(特别是CB1)已在许多外周器官和组织中被鉴定出，包括甲状腺、生殖器官、脂肪组织、肝脏、肌肉和胃肠道。这些结果支持了本发明的化合物在代谢功能调节和/或神经调节中的用途。
大麻素受体1(CB1)对应于在人脑中表达最多的GPCR(蛋白G的表达受体)，并且发现其通常在中枢神经系统中处于高水平(图13)。它被内源性大麻素激活，并被鉴定为治疗多种疾病的有希望的治疗靶点，所述疾病为例如疼痛和炎症、多发性硬化和神经退行性疾病(激动剂作用)以及肥胖症、肝纤维化和尼古丁依赖(HUA)et al.，2016)。
图13显示了GPCR的三维结构的概况，在这种情况下，其为亚型1的大麻素受体。七个跨膜螺旋(I-VII)，细胞内环(ICL1和ICL2)和细胞外环(ECL2和ECL3)。
通过使用分子建模工具，本发明人在该实施例中评价了本发明化合物R1-N-AA1-K-AA2-R2(在该实施方案中，其为四肽NFKF)在CB1结合位点处的相互作用模式。此外，将观察到的图谱与其他已知结合物(如大麻二酚、利莫那班和AM6538)的相互作用模式进行比较。
Figure BDA0002368148450000361
通过配体结构的设计和优化，对NFKF四肽与CB1受体的相互作用谱进行了计算机模拟测试。最初，使用Percepta程序验证这些配体在血浆pH(pH＝7.4)下的离子化状态。随后，在Spartan v.16(Wavefunction,Inc.)中进行配体结构的构建，然后通过分子力学使能量最小化。
用于对接研究的CB1晶体结构的选择是根据PDB编码5TGZ中可用的数据进行，所述PDB编码5TGZ属于智人(Homo sapiens)种，解析度为
Figure BDA0002368148450000362
所述结构对应于数据库中唯一可用的CB1晶体，并且在本专利申请的优先权日时可获得。
验证GOLD v.5.1的函数并进行对接研究。为了鉴定最稳定的复合物，在GOLDProgram中考虑了三个评分函数(ChemScore、Goldscore和ChemPLP)。为了在GOLD v.5.5(CCDC)中实现分子锚定，需要使用共结晶结合物(AM6538)本身以及距离其
Figure BDA0002368148450000363
的所有氨基酸作为参考来确定活性位点的位置。随后，在PyMOL v.1.8.6.2(
Figure BDA0002368148450000371
LCC)中进行分子锚定和结果分析。
最初，根据预测与实验结果相符的蛋白质结合复合物的能力，评价了GOLD v.5.5的评分函数。为此，通过在CB1受体结合位点(PDB 5TGZ)重新对接参考配体AM6538，验证了3个评分函数(Goldscore、ChemScore和ChemPLP)。首先，在没有水分子的情况下进行对接，然后尝试估计在结合位点存在多少水分子会影响结合物的取向，在水分子存在的情况下进行同样的评价。在考虑了得分较高的复合物的情况下，通过均方根偏差RMSD获得的结果可见于表7中。
为了计算RMSD，考虑并比较分子建模实验和晶体结构实验结果的原子对。因此，计算这些原子的距离之间的平均值的平方根，获得偏差的值。偏差越小，结果之间的近似越大，因此表明了要使用的最适当的函数(MAIOROV；CRIPPEN，1994；HILDEBRANDT et al.，2013)。
表7：通过在CB1受体中重新对接AM6538时验证GOLD v.5.5的评分函数所获得的RMSD值。
Figure BDA0002368148450000372
如表7所示，在结合位点没有水分子的情况下，显示最低的RMSD值且被证明为最适于对接实验的函数是Goldscore，这表明这类分子不影响配体的模式。
图14可视地示出了结晶结构复合物(PDB 5TGZ)和使用经验证的方法由AM6538重新对接实验得到的复合物之间的重叠。
由在CB1中重新对接AM6538得到的复合物得分为87.39，所观察到的相互作用谱与文献(Hua et al.，2016)中描述的一致，与氨基酸残基(如：Phe-102、Phe-170、Phe-174和Phe-379以及亮氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸和缬氨酸残基)具有若干疏水相互作用(参见图15)。
另一方面，对于利莫那班和大麻二酚，所观察到的相互作用谱分别与AM6538非常相似，得分为73.43和54.91(分别为图16和17)。
在本发明化合物的一个实施方案(NFKF四肽)的对接实验中，在Percepta程序中分析其结构在血清pH(pH＝7.4)下的离子化状态，其标明了下面所示的结构，其用于对接研究。
Figure BDA0002368148450000381
NFKF四肽在CB1中得到的对接配合物的得分为100.66，远远高于参考配体获得的得分。这一事实可通过在四肽和残基Ser-123、Thr-197、Ser-167和Ser-383之间观察到的额外的氢键来解释。此外，所观察到的对于AM6538的疏水相互作用也存在于NFKF相互作用模式中(图18)。
总之，这些实验的结果表明，所观察到的NFKF的相互作用谱——具有与参考配体相似的相互作用以及导致在对接研究中获得较高得分的额外相互作用，表明NFKF四肽是亚型1的大麻素受体的潜在配体。
实施例11.化合物NFKF与CB2受体的体外和计算机模拟结合/相互作用测试
在该实施例中，用大麻素受体CB2评价本发明化合物R1-N-AA1-K-AA2-R2(其中为NFKF四肽)的体外亲和力谱。
为此，使用结合技术通过浓度为1和10μM的大麻素CB2受体测量NFKF四肽(纯度为100％的粉末，并制成10mM的DMSO原液)的亲和力。使用与放射性配体激动剂WIN 55212-2(IC 50(M)＝1.5nM；Ki(M)＝0.96nM；nH＝0.9)相关的重组人CB2大麻素受体进行该评价。使用表达人CB2受体的重组CHO细胞和[3H]WIN55212-2接头(浓度为0.8nM；1.5nM Kd)，使用非特异性化合物WIN 55212-2(5mM)在37℃下培养120分钟，进行体外结合测定，用闪烁扫描术计数检测(Rinaldi-Carmona et al.，1996)。
如上文实施例10所示表示结果。
所获得的每个测试浓度(1和10μm)的结果示于表8，设两个平行测定。
表8——NFKF对放射性配体激动剂WIN 55212-2与CB2受体结合的体外抑制数据
特异性对照的结合的抑制％
浓度 第一次测量 第二次测量 平均值
1mM 3.5 0.3 1.9
10mM 9.5 13.1 11.3
结果表明，NFKF在测试条件下对相应放射性配体结合没有提供显著的调节。
将这些结果与实施例10中所述的实验结果一起考虑，得出了有趣的结论。尽管已证明NFKF肽为CB2大麻素受体的选择性配体，如对于该受体的对接实验的结果所表明的，但体外测试结果表明该四肽不能以显著的方式与该大麻素受体结合。然而，不能排除本发明化合物与变构型CB2受体的相互作用。因此，测试结果表明CB2受体的正调节——尽管在所测试的浓度下为中等的——表明组合的(变构)调节效应，其对于CB1为负，而对于CB2为正。
此外，体外测试结果(实施例9、10和/或11)表明，本发明的化合物可用作具有诊断价值的结合物，例如放射性或发色团标记，用于随后鉴定细胞和/或组织中的结合位点。
为了进行本发明化合物R1-N-AA1-K-AA2-R2(其中其为NFKF四肽)与CB2受体相互作用的计算机模拟试验，首先构建CB2受体的三维模型，用于随后的对接实验。
在该实施方案中，CB2的3D模型的构建是通过在UniProt数据库中搜索该受体的氨基酸序列而进行。用于序列选择的标准是物种(智人)。因此，被选择进行分子建模研究的序列是编码P34972的序列。
接下来，使用SwissModel服务器的Template Identification工具来识别和选择蛋白质模板。由服务器鉴定为与人CB2序列具有最高结构同一性的序列为属于智人种的PDT5TGZ编码(Hua et al.，2016)的序列，其对应于CB1受体。
然后，使用链接到UniProt数据库的ClustalW2软件对目标序列和模板序列进行比对，以比较序列以确定它们之间的同一性百分比。利用Swiss-model服务器页面上可用的Automated Mode工具构建人CB2的3D同源性模型，并且为了验证所生成的模型，通过给出的GMQE参数的值和Ramachandran图分析来分析模型的整体结构质量和立体化学质量。
在建立了CB2的3D模型之后，对NFKF四肽以及大麻二酚、利莫那班和AM6538进行了对接研究。
在UniProt中鉴定和选择人CB2受体序列并从Swiss-Model服务器上的TemplateIdentification工具中识别模板蛋白(PDB编码5TGZ)之后，在程序ClustalW2中进行两个序列的比对。这两个序列之间的同一性为46.18％，这使得可以使用比较建模作为工具来获得人CB2受体的3D结构，如之前发表的研究(MORGAN and HURLEY，2015)所建议的，所述研究确认用于创建同源性模型的一级序列之间的同一性必须至少为30％。
使用Ramachandran图(图19B)分析了模型的立体化学质量。Ramachandran图对应一个数学模型，其把x轴上的二面角Φ(角C-N-Cα-C)和y轴上的Ψ(角N-Cα-C-N)联系起来。该图被划分为能够表示角Φ和Ψ之间组合的概率的区域(RAMACHANDRAN；RAMAKRISHNAN；SASISEKHARAN，1963)。这些区域分为：有利、允许、高度允许和禁止。
针对人CB2模型构建的Ramachandran图显示在最有利的区域中存在大约96％的氨基酸残基，而在可接受区域中存在超过4％的残基。在禁止区域中没有发现氨基酸残基，这表明所建立模型的立体化学验证。验证模型后，进行NFKF四肽、AM6538拮抗剂、大麻二酚内源性配体和利莫那班拮抗剂对CB2的对接研究。
对于所有分析的化合物，研究中获得的得分均低于对于CB1获得的得分，AM6538为61.53，NFKF四肽为72.33，大麻二酚为43.31，最后利莫那班为57.40。
因为以简化的方式，标点值
Figure BDA0002368148450000401
可被认为是在蛋白质和接头之间鉴定的相互作用的总和，所以可通过在结合位点处的较少数量的相互作用来解释较低的得分，尽管在CB1中观察到的主要疏水相互作用继续存在于CB2中，如在图20-23中可看出的。
同样重要的是要注意，对于NFKF四肽，CB1中所示的氢键相互作用未出现在CB2中，导致其较低的CB2得分(图23)，尽管该肽与Lys-192残基存在另一个氢键。
表9简要总结了在实施例10和该实施例中，通过在两个受体(CB1和CB2)中的对接研究获得的得分之间的比较。
表9：CB1和CB2受体的对接研究中获得的得分之间的比较
Figure BDA0002368148450000411
以上实施例9、10和/或11中所述的实验测试的结果使得对于所测试的其他化合物，可以复制拮抗剂AM6538在CB1受体结合位点的相互作用模式，如Hua等人在文献中所述。此外，结果验证提了与大麻二酚和利莫那班拮抗剂相比，用NFKF四肽进行实验的对接方法，因此可以预测它们在CB1中的相互作用谱。
通过CB2受体同源性的3D模型的构建和验证，还可以使所提到的所有配体在这种受体的结合位点处的行为可视化，提供了与用CB1获得的结果的比较分析。
总之，实施例9、10和11的体外和计算机模拟实验的结果表明，本发明的化合物是CB1受体配体。此外，在CB2受体中证明了NFKF化合物的不太有利的相互作用，从而表明可能的选择性谱。实施例10和11的实验结果，特别是图17和23中所示的结果，表明NFK氨基酸参与CB1和CB2的结合的程度比C-末端位置的氨基酸F更强，这表明该三肽是这类受体的配体/调节剂的潜在候选物。图7所示的体内测试的结果与该陈述相符。
实施例12.包含本发明化合物的镇痛或调节神经性疼痛的药物组合物——体内测 试结果
还测试了本发明的化合物作为镇痛剂或神经性疼痛调节剂。为此，在疼痛阈值模型中测试了化合物PVNFKF、PVNFK、VNFKF、NFKF。疼痛阈值使用压力装置(Ugo Basile,Italy)进行测量，基本上如(Randall&Selitto,1957)所述。简言之，将逐渐增加的力(16g/s)施加到大鼠的右爪的背部。当动物通过踢做出反应时，诱发该反应所需的以克计的力为疼痛阈值。抗疼痛活性表示为与对照动物相比疼痛阈值的增加。
这种诱发疼痛的模型不需要伴随其他物质的给药。将本发明的化合物以0.5至0.25mg/kg的剂量口服给予动物，并用盐水作为对照。
表10显示了疼痛阈值的以克计的强度结果：
表10：
即时
1 对照 70 70 60 65 70 70
2 PVNFKF 75 65 60 70 80 75
3 PVNFK 70 75 75 65 60 75
4 VNFKF 70 65 65 70 75 75
5 NFKF 70 75 75 75 80 60
3小时后
1 对照 30 55 55 50 45 40
2 PVNFKF 45 30 55 45 65 55
3 PVNFK 55 45 40 55 60 40
4 VNFKF 85 40 35 50 50 50
5 NFKF 80 70 80 75 70 70
图24显示了疼痛阈值结果——施加到动物右爪背部的以克计的力。显著且非常明显的是，由化合物NFKF提供的镇痛效应，与即时疼痛阈值相比，化合物NFKF增加了给药3小时后的疼痛阈值。此外，证明了化合物NFKF显著且远远优于PVNFKF，与PVNFKF相比，在给予NFKF的动物中疼痛阈值高50.1％。
在此背景下，本共同发明人已证明(Gupta et al.)μ和δ阿片样物质受体与CB1大麻素受体二聚，而异源二聚化导致对受体功能的调节。此外，使用其他CB1受体结合物质提供了增加的对μ阿片样物质受体的识别，这显然是由它们的构象变化所介导的。这些观察结果支持这样的观点：由CB受体配体引起的构象变化可以影响异源二聚体中的受体配偶体，从而提供治疗效果。
在本实施例中，本发明化合物的明显镇痛效果数据表明，当与吗啡组合时(即与较低剂量的吗啡与Hp的组合相比)，本发明的化合物提供与Hp类似的效果——相同的镇痛效果。因此，本发明化合物与吗啡联合使用可有助于减少吗啡引起的成瘾性和耐受性导致的重要影响。
实施例13.用于治疗多发性硬化的包含化合物NFKF的药物组合物——体内测试结 果
虽然多发性硬化的确切病因尚不清楚，但推测自身反应性T淋巴细胞在其病理生理学中起着核心作用。多发性硬化最常见的动物模型是实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)，因为它们共有许多生理和临床方面的特点。有几种EAE模型，反映人类多发性硬化的不同临床、免疫学和组织学方面。小鼠中EAE的主动诱导模型是稳健的，并提供可再现的结果，特别适用于通过使用由自身免疫性神经炎症激发的转基因小鼠来寻找治疗剂。EAE模型常用于证明用于多发性硬化的新治疗策略的功效。
在该实施方案中，用MOG(髓鞘少突胶质细胞糖蛋白)激发敲除内肽酶24.15基因的转基因小鼠，并给予本发明的化合物NFKF或作为对照的盐水。在诱发该疾病后，根据下表11，每天对症状进行评估。
表11.临床评分系统
Figure BDA0002368148450000431
图25示出了根据上述模型通过将盐水(对照)或NFKF给予敲除小鼠而进行的实验的结果。在A中，接受用MOG进行的EAE诱导的野生型(WT)小鼠(即正常的)的临床评分曲线；在B中，示出了接受MOG诱导的敲除内肽酶基因24.15的小鼠(即，转基因且倾向于具有多发性硬化症状的)在EAE模型中的临床评分曲线；在C中，示出了敲除24.15的小鼠(即，转基因和倾向于具有多发性硬化症状的)在接受MOG诱导和NFKF神经保护后在EAE模型中的临床评分曲线。＊与WT相比，24.15KO+NFKF的P<0.05；+与WT相比，24.15KO的P<0.05。结果表明用本发明化合物治疗的动物的临床症状显著降低，尽管其是转基因的且缺少内肽酶基因24.15，但所述动物表现出的行为与正常动物非常接近。这些结果构成了对用于治疗性或预防性治疗多发性硬化的该新治疗策略的功效的“原理证明”。
还应注意的是，正常动物接受MOG诱导后，干扰素和白细胞介素17的水平增加；在敲除动物中，这些标记物(都是促炎性的)也都增加。这些数据，连同NFKF治疗的转基因动物的反应时间曲线(图25)，与本发明化合物对免疫反应的作用和/或抗炎作用是一致的。在此背景下，已知大麻素系统参与多种免疫细胞，所述免疫细胞通过受体的激活触发一系列信号转导，所述信号转导影响细胞因子和趋化因子的转录和产生。已知大麻素受体的调节抑制了多种类型免疫细胞的迁移活性。此外，大麻素系统对免疫功能的影响可能发生在外周以及中枢神经系统内的位点，这就是为什么文献认为大麻素系统在稳态免疫平衡的精细调节中起着重要的作用。本发明的化合物(已被证明可调节大麻素系统)可干扰该系统，可潜在地用于多种炎症、免疫、自身免疫病症。
本文以一种或多种形式公开和举例说明的发明构思被视为工业秘密，并直到提交本专利申请或其优先权才公开。这个工业秘密是申请人的无形资产。专利申请可能的未来公布本身并不构成对第三方使用的授权，其仅作为：(i)在提交时使第三方科学地认识所述工业秘密的存在；(ii)明确表明其持有人；和(iii)根据所公开的概念促进开发新的改进，以避免对申请人已持有的同一资产的开发进行再投资。
要指出的是，任何商业用途都需要持有人的授权，未经授权的使用会受到法律规定的处罚。在此背景下，要澄清的是，基于本发明构思的公开内容，本领域的技术人员可以考虑与上文仅示例说明的那些形式不同的本发明的其他形式，但是如果要求用于商业用途，这类形式可以被认为在所附权利要求书的范围内。

Claims (17)

1.下式的化合物，和/或其修饰形式，其环状、酰胺化、烷基化、烷氧基化、卤化、羟基化、聚乙二醇化形式，用其他官能团修饰的形式，用包括非天然氨基酸、D-氨基酸在内的氨基酸或肽修饰的形式，其盐，和/或它们的组合：
R1-N-AA1-K-AA2-R2
其中：
AA1为选自F、W、L、I、V、P、G的氨基酸；
AA2为氢或选自F、W、L、I、V、P、G的氨基酸；
当R2为氨基酸L时，R1不存在，或R1为氢或氨基酸V；并且
当AA2为氢时，R2不存在，或当R1为氢时，R2为氢或氨基酸L。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于被修饰，环化，用酰胺、烷基、烷氧基、卤素、羟基或聚乙二醇基团修饰，或用其他官能团修饰，用包括非天然氨基酸和D-氨基酸在内的氨基酸或肽修饰，其盐；和/或它们的组合。
3.用于制备药物化合物的合成中间体，其特征为包含下式的肽类化合物和/或其修饰形式，其环状、酰胺化、烷基化、烷氧基化、卤化、羟基化、聚乙二醇化形式，用其他官能团修饰的形式，用包括非天然氨基酸、D-氨基酸在内的氨基酸或肽修饰的形式，其盐，和/或它们的组合：
R1-N-AA1-K-AA2-R2
其中：
AA1为选自F、W、L、I、V、P、G的氨基酸；
AA2为氢或选自F、W、L、I、V、P、G的氨基酸；
当R2为氨基酸L时，R1不存在，或R1为氢或氨基酸V；并且
当AA2为氢时，R2不存在，当R1为氢时，R2为氢或氨基酸L。
4.下式的肽类化合物和/或其修饰形式，其环状、酰胺化、烷基化、烷氧基化、卤化、羟基化、聚乙二醇化形式，用其他官能团修饰的形式，用包括非天然氨基酸、D-氨基酸在内的氨基酸或肽修饰的形式，其盐，和/或它们的组合的用途：
R1-N-AA1-K-AA2-R2
其中：
AA1为选自F、W、L、I、V、P、G的氨基酸；
AA2为氢或选自F、W、L、I、V、P、G的氨基酸；
当R2为氨基酸L时，R1不存在，或R1为氢或氨基酸V；并且
当AA2为氢时，R2不存在，或当R1为氢时，R2为氢或氨基酸L，
其特征在于，所述用途为用于制备具有药用价值的产品，所述产品选自用于诊断用途的配体和用于哺乳动物的治疗性或预防性药物。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于所述化合物选自：NFK、NWK、NLK、NFKF、NWKF、NLKF、NFKW、NWKW、NLKW、NFKL、NWKL、NLKL、VNFK、VNWK、VNLK，其修饰形式，包括环状、酰胺化、烷基化、烷氧基化、卤化、羟基化、聚乙二醇化形式，用其他官能团修饰的形式，或用包括非天然氨基酸、D-氨基酸在内的氨基酸或肽修饰的形式，其盐；和/或它们的组合。
6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述用途为用于制备药物，所述药物用于治疗：能量和/或脂质代谢紊乱；高血压、肠动力障碍；免疫系统；钙循环平衡；甲状腺病症、生殖器官病症、肥胖症、糖尿病、免疫系统/炎症疾病或病症、骨质减少、骨质疏松、癌症。
7.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述用途为用于制备用于镇痛和/或治疗哺乳动物的偏头痛、疼痛、神经性疼痛的药物。
8.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述用途为用于制备治疗性或预防性治疗哺乳动物的惊厥的药物。
9.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述用途为用于制备神经调节或神经保护药物，用于治疗精神疾病、焦虑、精神分裂症或双相型障碍、阿尔茨海默症、帕金森氏症、孤独症、癫痫、多发性硬化的药物。
10.用于调节哺乳动物的代谢功能的药物组合物，其特征在于包含药学上可接受的载体；以及作为活性成分的权利要求1的化合物。
11.用于哺乳动物镇痛的药物组合物，其特征在于包含药学上可接受的载体；以及作为活性成分的权利要求1的化合物。
12.用于治疗性或预防性治疗哺乳动物的惊厥的药物组合物，其特征在于包含药学上可接受的载体；以及作为活性成分的权利要求1的化合物。
13.用于哺乳动物的治疗性或预防性神经调节和/或神经保护的药物组合物，其特征在于包含药学上可接受的载体；以及作为活性成分的权利要求1的化合物。
14.用于治疗性或预防性治疗哺乳动物的多发性硬化的药物组合物，其特征在于包含药学上可接受的载体；以及作为活性成分的权利要求1的化合物。
15.根据权利要求10-14中任一项所述的药物组合物，其特征在于，其形式为片剂、凝胶剂、口服液或糖浆剂、胶囊剂、栓剂、可注射溶液、可吸入形式或粘附形式。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，其特征在于其为用于人的包含4至800μg/kg的活性成分的剂型。
17.用于体外诊断大麻素和/或毒蕈碱受体的存在、数量和/或位置，以及评估其他化合物与所述受体的结合的方法，其特征在于包括：使权利要求1的化合物与含有一种或多种所述受体的生物样本接触；然后通过视觉、光学、光谱、化学和/或放射性信号检测所述结合。
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