CN110891665A - 在连续流动体系中保持窄停留时间分布的机械方法 - Google Patents

Abstract

在连续流动体系中维持窄停留时间分布的方法，其特别适用于病毒灭活，如在蛋白纯化过程期间。将流体样品引入轴向流动通道，并使其以离散包或区域在其中流动以使停留时间分布和轴向分散最小化。本文所述的实施方案避免或最小化了在蛋白纯化过程期间使用大罐或储器进行病毒灭活的需要；减少了病毒灭活所需的总时间，和/或减少了在蛋白纯化过程期间进行病毒灭活操作所需的总物理空间，这继而减少了纯化过程的总占地面积。

Description

在连续流动体系中保持窄停留时间分布的机械方法

本申请要求2017年5月11日提交的美国临时申请序列号62/504,633的优先权，其公开内容通过引用以其整体并入本文。

背景技术

治疗性蛋白、尤其是单克隆抗体的大规模生产和围绕纯化的经济性是生物制药工业日益重要的问题。治疗性蛋白通常在已经工程化以产生目标蛋白的哺乳动物细胞或细菌细胞中产生。然而，一旦产生，需要将目标蛋白与各种杂质如宿主细胞蛋白(HCP)、内毒素、病毒、DNA等分离。

在典型的纯化过程中，细胞培养收获物经历澄清步骤以除去细胞碎片。然后使包含目标蛋白的澄清的细胞培养收获物经历一个或多个层析步骤，该步骤可包括亲和层析步骤或阳离子交换层析步骤。为了确保治疗性候选物的病毒安全性并符合法规要求，在纯化过程中实施病毒清除单元操作。这样的步骤包括蛋白A和离子交换层析、过滤和低pH/化学灭活。病毒灭活通常在层析步骤后(例如在亲和层析后或在阳离子交换层析后)进行。在典型的大规模纯化过程中，将包含目标蛋白的层析洗脱合并物收集在大罐或储器中，并在混合下经历病毒灭活步骤/过程持续延长的时间段，这可能花费数小时至一天或更长时间，以实现洗脱合并物中可能存在的任何病毒的完全灭活。

在单克隆抗体(mAb)处理中，例如，以分批模式进行一系列独立的单元操作，其中使用存储罐在单元操作之间储存材料并有利于步骤之间的任何必要的溶液调节。通常，将材料收集到一个罐中，在此调节材料以实现目标灭活条件。这可以通过添加酸以达到低pH目标水平或者可以通过在基于去污剂的灭活过程中添加去污剂来实现。接着，将材料转移到第二罐中，在此将其保持在灭活条件下历时规定的温育时间。转移的目的是消除第一罐的壁上的液滴的风险，所述液滴可能尚未达到目标灭活条件并且可能包含病毒颗粒。通过将材料转移到不同的罐，降低了这种风险。

本领域已知几种病毒灭活技术，包括将蛋白溶液暴露于某些温度、pH或辐射，以及暴露于某些化学试剂如去污剂和/或盐。一种病毒灭活方法包括大的存储罐，在此材料保持在灭活条件如低pH和/或暴露于去污剂下，持续60分钟。这种静态保持步骤是向连续处理发展的瓶颈。

然而，病毒杀死动力学表明，灭活时间可以显著短于60分钟，这表明处理时间可以显著减少，可以消除用于病毒灭活的静态存储罐，并且该方法可以更适合于连续处理和/或流动灭活。

最近，期望有一种连续方法，其中将单元操作连接在一起并且手动溶液调节被最小化。为了促进这一点，正在努力开发在线处理方法以使得能够进行在线病毒灭活以及其它在线溶液调节。连续处理中的挑战是流体从点A到点B的有效移动。一个实例是流体通过一段管的活塞流移动。mAb处理中涉及的流动通常落入层流状态(雷诺数小于2100)。在这种状态下，分子由于径向扩散而分散，结果是，溶质脉冲沿着流动方向轴向地扩展。这被称为泰勒分散，并在图1中示意性地示出。层流的Poiseuille流导致抛物线型速度分布。脉冲的前端和尾端以尖锐的界面开始，但由于流体的层流而变成抛物线形状。轴向扩展随着时间继续，并且分子变得更加在管长度上分散。在管出口处对标记物物类的脉冲注入所获得的所得浓度分布中观察到轴向分散的影响，如图2所示。该浓度分布反映了标记物物类的停留时间的宽分布。这种变化的停留时间可能导致不确定是否所有流体在病毒灭活环境中具有足够的停留时间，或者导致体系尺寸过大以确保没有分子比预期更快地离开。因确保病毒灭活的足够长停留时间所致，蛋白(产物)暴露于灭活条件过长的停留时间，这具有不期望的后果，如潜在的降解和聚集。

在连续或半连续流动体系中，期望提供一种维持窄停留时间分布的方法。

提供用于生物分子纯化、特别是用于蛋白纯化的连续或半连续流动体系将是期望的。

概述

本文公开的实施方案提供了在连续流动体系中维持窄停留时间分布的方法，其特别适用于病毒灭活，如在蛋白纯化过程期间。

本文所述的实施方案消除或最小化了在蛋白纯化过程期间使用大罐或储器进行病毒灭活的需要，减少了病毒灭活所需的总时间，和/或减少了在蛋白纯化过程期间进行病毒灭活操作所需的总物理空间，这继而减少了纯化过程的总占地面积。此外，这增加了所有分子已经历最短停留时间的确定性，从而提供了用于确保灭活的一些安全系数，同时使延长的保持最小化。

在一些实施方案中，提供了一种用于在纯化过程中灭活样品中可能存在的一种或多种病毒的方法，其中所述方法包括当流体在流动通道(如管)的轴向上流动时通过将流体分离成离散的区域或包(packet)来维持连续流动体系中的窄停留分布。流动通道可以用作温育室。这允许流体的所有物类在流动通道中有足够的停留时间，这继而允许当流体在流动通道中流动并与一种或多种病毒灭活剂混合时使病毒灭活。流动通道可以由各种材料和形状制成，包括圆形塑料管和通过将两片塑料以一定图案熔接在一起以形成通道而形成的“Smart FLEXWARE^®”宏观流体流动路径组件，其可从MilliporeSigma商购获得(美国专利号9,181,941 B2，美国专利号9,051,929 B2)。

在某些实施方案中，温育室、流动通道或管被配置成提供有效的径向混合和最小的轴向混合，这导致窄的或减少的停留时间分布，并且其中室或管的体积不经历由于压力和温度引起的变化。在一些实施方案中，温育室、流动通道或管是单次使用的室或管并且是可灭菌的。

在某些实施方案中，提供了用于灭活可能存在于包含靶分子(例如抗体或含Fc区的蛋白)的流体样品中的一种或多种病毒的方法，其包括使流体样品经历蛋白A亲和层析过程或离子交换层析过程以获得洗脱液；将所述洗脱液连续引入轴向流动通道中以将一种或多种病毒灭活剂与所述洗脱液在流动通道中混合；和使洗脱液在轴向流动通道中以离散包流动足以灭活病毒的时间。在某些实施方案中，层析过程以连续模式进行。来自亲和层析过程的洗脱液可以是来自柱的实时洗脱物，其以所有其pH、电导率、浓度等的梯度进入体系，或者可以是洗脱的合并物，然后在均化后经历灭活。

在一些实施方案中，在线温育室、流动通道或管可以在其中存储池或罐直接位于所述室、通道或管的上游、下游或两者的过程中实施。在一些实施方案中，在线温育室、流动通道或管可以在其中所述室、通道或管直接连接两个单元操作如上游蛋白A层析操作和下游阳离子交换操作的过程中实施。

附图简述

图1是通道中流体流动的示意图；

图2是根据现有技术的由通道中的标记物物类的脉冲输入(以快的速率注入主干流中以便产生标记物物类的均匀柱塞的有限体积的标记物物类，其中柱塞的每个端部处的浓度分布接近阶跃变化)产生的浓度分布曲线图；

图3是各种流动通道的UV暴露相对于时间的图；

图4是各种流动通道的UV暴露相对于体积的图；

图5是根据某些实施方案的适于在流动通道上产生压缩力以形成流体包的装置的透视图；

图6是缠绕在图5中所示心轴周围的流动通道的透视图；

图7是缠绕在放置在图5的装置中的心轴周围的流动通道的透视图；

图8是显示各种Phi6滴度的病毒灭活时间的图；

图9是显示各种XMuLV逆转录病毒滴度的病毒灭活时间的图；

图10是显示Phi 6滴度的基于去污剂的病毒灭活动力学的图；

图11是Phi6病毒在盘管和常规流动通道中的停留时间分布的图；

图12是根据某些实施方案的在线连续灭活过程的示意图；

图13A是根据某些实施方案的用于压缩流动通道以形成包的风车设计的示意图；

图13B示出了根据某些实施方案的用于压缩流动通道以形成包的输送机设计的俯视图和透视图；以及

图13C是根据某些实施方案的用于压缩流动通道以形成包的辊设计的示意图。

详述

术语"在线"或"在线操作"是指在不存储在容器中的情况下使液体样品移动通过管或一些其它导管或流动通道的过程。术语"病毒灭活"或"病毒的灭活"是指以使得一种或多种病毒不再能够复制或变得无活性的方式处理包含所述一种或多种病毒的样品。在本文所述的方法中，术语"病毒"和"病毒的"可以互换使用。病毒灭活可以通过物理方法，例如加热、紫外线、超声振动，或使用化学方法，例如改变pH或加入化学品(例如去污剂)来实现。病毒灭活通常是在大多数哺乳动物蛋白纯化过程期间使用的工艺步骤，尤其是在从哺乳动物衍生的表达体系纯化治疗性蛋白的情况下。在本文所述的方法中，病毒灭活在流体流动通道中进行，其中使样品以离散的区域或包行进。应理解，使用本领域已知的标准测定和本文所述的那些无法检测到样品中的一种或多种病毒表明用一种或多种病毒灭活剂处理样品后所述一种或多种病毒的完全灭活。

术语"离散区域"或"包"是指通过居间的屏障与邻接体积分隔的单独限定的体积。

术语"病毒灭活剂(virus inactivating agent)"或"病毒灭活剂(virusinactivation agent)"或“病毒清除剂”是指能够使一种或多种病毒失活或不能复制的任何物理或化学手段。如本文所述方法中所用的病毒灭活剂可包括溶液条件改变(例如pH、电导率、温度等)或加入去污剂、盐、酸(例如乙酸，其摩尔浓度达到3.6或3.7的pH)、聚合物、溶剂、小分子、药物分子或任何其它合适的实体等或其任意组合，其与样品中的一种或多种病毒相互作用，或物理手段(例如暴露于UV光、振动等)，使得暴露于病毒灭活剂使一种或多种病毒失活或不能复制。在一个特别的实施方案中，病毒灭活剂是pH变化，其中病毒灭活剂与包含靶分子的样品(例如，来自蛋白A结合和洗脱层析步骤的洗脱液)在流动通道中混合，在流动通道中使样品以离散的区域或包流动。

本文所用的术语"连续方法"包括纯化靶分子的方法，其包括两个或更多个工艺步骤(或单元操作)，使得来自一个工艺步骤的输出直接流入该方法中的下一个工艺步骤而不中断，并且其中两个或更多个工艺步骤可以同时进行持续它们的持续时间的至少一部分。换句话说，在连续方法的情况下，只要一部分样品总是移动通过工艺步骤，就不必在下一工艺步骤开始之前完成工艺步骤。

类似地，"半连续方法"可以包括在设定的时间段内以连续模式进行的操作，其中一个或多个单元操作周期性中断。例如停止进料的装载以允许在连续捕获操作期间完成其它速度限制性步骤。

用于蛋白纯化的常规方法通常涉及细胞培养方法，例如使用重组工程化的哺乳动物或细菌细胞系以产生目标蛋白(例如单克隆抗体)，随后是细胞收获步骤以从细胞培养液中取出细胞和细胞碎片。细胞收获步骤通常后接捕获步骤，其通常后接一个或多个层析步骤，也称为精制步骤，其通常包括阳离子交换层析和/或阴离子交换层析和/或疏水相互作用层析和/或混合模式层析和/或羟基磷灰石层析、尺寸排阻层析、深度过滤或使用活性炭中的一种或多种。在捕获步骤之后还可以包括病毒灭活步骤。精制步骤通常后接病毒过滤和超滤/渗滤，这完成了纯化过程。

生物药品制造需要灭活或去除病毒(来自动物来源的组分，包括哺乳动物细胞)以保证药物安全并满足管理机构如食品和药品管理局(FDA)提出的标准。典型的方法包括许多病毒清除步骤，这些步骤累积地提供必要的保护。

一些方法包括将包含靶蛋白的溶液滴定至低pH以破坏任何包膜病毒和病毒组分。通常，包含靶蛋白的样品在这些条件下保持延长的时间段，这是因为病毒灭活需要时间，而且还更重要的是，需要时间以确保均匀混合用于有效的病毒灭活。因此，在大规模方法的情况下，通常在混合下，将包含靶蛋白的样品在低pH下温育延长的时间段以促进有效的病毒灭活。通常使用两个单独的罐，其中第一个罐用于调节pH，第二个罐用于实际的温育保持。

建立pH条件作为足以引起灭活的低pH值和足以避免靶蛋白变性或限制产物降解程度的高pH值之间的平衡。另外，样品必须暴露一定量的时间以引起病毒活性值的显著降低，通常为2-6 LRV(对数降低值)。

认为对于病毒灭活过程而言重要的参数是pH值、暴露时间、背景溶液条件的特性(例如，缓冲液类型、缓冲液浓度)、mAb浓度和温度，假定存在均匀混合。在大规模方法的情况下，由于大的体积和另外参数如混合速率和传质，混合造成挑战。

在含Fc区的蛋白(例如单克隆抗体)的情况下，病毒灭活通常在从结合和洗脱层析工艺步骤(例如，蛋白A亲和层析或阳离子交换层析)洗脱后进行，因为洗脱合并物的pH更接近病毒灭活所需的pH。例如，在当今工业中使用的方法中，蛋白A层析洗脱合并物通常具有3.5至4.0范围内的pH，阳离子交换结合和洗脱层析洗脱合并物通常具有约5.0的pH。

目前在工业中使用的大多数方法中，将包含靶蛋白的洗脱合并物调节至病毒灭活所需的pH并在那里保持一定的时间长度，pH和时间的组合已显示导致病毒灭活。较长的时间对于病毒灭活更有效，特别是在大规模方法的情况下，然而，还已知较长的时间会引起蛋白破坏和蛋白变性，这可导致形成蛋白聚集体(免疫原性的)。长期暴露于低pH可能导致沉淀和形成聚集体，这是不期望的，并且通常需要使用深度过滤器和/或无菌过滤器以除去这样的沉淀和聚集体。

本文所述的方法能够以连续或半连续的方式实现病毒灭活，相对于大多数常规方法，这可显著减少与病毒灭活相关的时间，并且继而可减少整个纯化过程的时间。

在一些实施方案中，不同的工艺步骤被连接以以连续或半连续的方式操作。在一些实施方案中，如本文所述的病毒灭活方法构成连续或半连续纯化过程中的工艺步骤，其中样品从例如蛋白A亲和层析步骤或离子交换层析步骤连续地流动到病毒灭活步骤再到该过程的下一步骤，其通常是流通式纯化工艺步骤。现有技术中已经提出了在线pH灭活(例如，Klutz S等，Continuous viral inactivation at low pH value in antibodymanufacturing, Chemical Engineering and Processing 102(2016) 88-101)，但是开发具有窄停留时间分布的合适的温育室意味着这些室尺寸过大并且可能更难以验证。

在一些实施方案中，病毒灭活工艺步骤连续或半连续地进行，即，来自先前工艺步骤如先前的结合和洗脱层析步骤(例如，蛋白A亲和层析，图12)的洗脱液连续地流入病毒灭活步骤，所述病毒灭活步骤使用一个或多个流体通道，其中使洗脱液以离散的区域或包流动，之后在一些实施方案中，病毒灭活的洗脱液可收集在储存容器中直到进行下一个工艺步骤，或在一些实施方案中，可直接和连续地进料至下一个下游工艺步骤。例如，参考图12，在某些实施方案中，使用精确的注射泵和静态混合器使用在线酸添加使蛋白A mAb洗脱液快速地达到均匀的低pH。使用1M乙酸浓缩物在可变的蛋白进料浓度下保持稳健的低pH。pH可以使用采样和离线传感器来验证。可以在没有复杂的连续反馈控制回路和不可靠的pH传感器的情况下实现对延长的多日操作的稳健的pH控制。灭活或温育室为稳健的LRV提供可靠的保持时间，并快速一致地猝灭至后续步骤所需的pH(例如5-7.5)。

根据某些实施方案，在连续或半连续流动体系中维持窄的停留时间分布。停留时间分布足够窄(并且与常规设计相比减少)以实现在体系中行进的流体样品的有效病毒灭活。合适的窄停留时间分布可基于与从常规设计获得的结果的比较来量化。可以使用统计量化度量来比较来自不同设计的脉冲数据(例如，UV吸收峰)。例如，可以比较流体的中间80%离开流动通道所需的时间量。也就是说，可以得到10%和90%面积值之间的扩展(其中t_10%表示流体的10%已经离开通道的时间，t_90%表示流体的90%已经离开通道的时间)。对图3所示的峰进行该比较，并在下表1中列出，其使用具有1/8" ID和250英寸长度的管，以等于50 mL的体系体积(滞留体积)。也可以利用分析峰特性的其它方法如由本领域技术人员应用的那些方法，例如矩分析。

表1

方法	t<sub>10%</sub>(s)	t<sub>90%</sub>(s)	t<sub>10%</sub>与t<sub>90%</sub>之间的差异(s)
				直管	251	1416	1165
盘管(3/8"棒)	166	403	237
				本流动通道	231	260	29

为了比较具有不同体系体积的各种设计，这些数据也可以表示为标准化体积(针对体系体积标准化)。这在图4中示出并在下表2中列出：

表2

方法	(V/V<sub>体系</sub>)<sub>10%</sub>	(V/V<sub>体系</sub>)<sub>90%</sub>	(V/V<sub>体系</sub>)<sub>10%</sub>与(V/V<sub>体系</sub>)<sub>90%</sub>之间的差异
				直管	0.84	4.72	3.88
盘管(3/8"棒)	1.02	2.49	1.47
				本流动通道	0.96	1.08	0.12

在这些分析实例中，本文所公开的实施方案的10-90%扩展显著小于常规设计的值，并且构成根据本文所公开的实施方案的窄停留时间分布，其从常规设计的分布减少。在活塞流的理想情况下，该10-90%扩展将变为零。

在一些实施方案中，通过使用机械方法将流体沿着样品在其中行进的流体流动通道的轴向方向分成不同或离散的区域或包来产生和维持窄的停留时间分布。离散包是通过居间的屏障与另一个包或区域分隔的包或区域；在一体积的工艺流体和相邻一体积或多体积的工艺流体之间形成边界的任何程度的分隔是离散的区域或包。该屏障可以通过将流体通道的壁机械地挤压在一起而形成(如下面更详细地讨论的)。包分隔的长度(即，压缩区域的长度)不是关键的；只要大小足以维持包之间的分隔，包就可以被非常小的长度或长得多的长度分隔。

在一些实施方案中，通过当流体在通道中流动时，沿着通道的轴向长度间隔开向流体流动通道的外部施加压缩力(基本上模拟蠕动泵)来实现不同或离散的流体区域或包。将流体分成区域或包使流体在通道中的轴向分散和混合最小化。停留时间的轴向分散将影响颗粒可能经历的停留时间的范围。较长的停留时间对于在低pH下灭活病毒颗粒可能是更期需的。然而，在低pH下经历过长停留时间的相同溶液中的蛋白颗粒可能降解，这是不期需的。停留时间最小化的程度将取决于被处理的产品(例如蛋白)的敏感性，但是在任何情况下，停留时间越低将是有益的。因此，可以容许的分散量将取决于具体应用。对于病毒清除应用，使轴向分散最小化将在减少处理时间方面提供显著的优势，因为在短时间窗内将有更大的病毒灭活的置信度。

在某些实施方案中，离散的流体包或区域的形成允许流体物类沿着流动通道的长度轴向地平移，使得通道入口处的分布匹配或基本上匹配通道出口处的分布，从而增加流体物类在通道中的停留时间的一致性和确定性。

作为脉冲在流动通道的一端引入的样品将在已知时间以尖锐、明确的峰离开流动通道。这对于在线连续病毒灭活应用具有优势，其中需要实现流过体系的物类的目标最小停留时间。它也可以在其中流动相(例如缓冲液)条件改变或其中发生缓冲液稀释的体系中实施。这可以在典型mAb纯化方法中的多个地方进行。一个实例是在结合-洗脱阳离子交换步骤和流通式阴离子交换步骤之间通常需要的调节。来自阳离子交换步骤的洗脱合并物通常处于比阴离子交换步骤的目标值更低的pH和更高的电导率。为了在连续流动体系中有效地调节阳离子交换洗脱合并物至合适的条件，可以形成离散包，其将允许有效过渡至新条件。可以提供不同缓冲液类型之间的急剧过渡区域，从而最小化所需的时间和缓冲液的量，并且允许在线缓冲液稀释或在线调节应用。

现在转向图5-7，示出了根据本文所公开的实施方案的用于向流体通道施加压缩力以产生流体区域或包的合适的装置。可以设计许多其它几何形状和配置，它们将产生相同的效果，如图13A-13C所示的那些。图6和7示出了心轴5，流体通道10如管可围绕该心轴缠绕以将流体通道10固定在适当的地方。一个或多个辊15围绕心轴5旋转，并且当它们旋转时，向流体通道10的外部施加恒定的压缩力。当辊15旋转时，通道10内的流体轴向移动通过通道。来自辊15的压力沿着流体通道10的整个长度使流体保持分隔成许多不同的区域或包。分隔成区域或包使流体的轴向分散最小化并因此提供了涉及物类有效移动的应用(如在线病毒灭活或从一种流体到另一种流体的过渡，如缓冲液过渡，或缓冲液稀释)所期需的流动特性。完全封闭跨越"蠕动螺旋"设计的一个象限的所有流动通道所需的力是用作流动通道的管的类型和尺寸的函数。例如，当使用增强的硅胶管(3/8" OD，1/8" ID)时，跨越螺旋的一个象限(每个象限由2.23"的圆周分隔；即，每2.23"(辊之间的管的弧长)施加压缩力)压缩17圈管所需的力为187 lbsf(每圈管11 lbsf)。辊之间的间距决定了每个包的轴向长度。本领域技术人员将理解，前述内容仅是示例性的；其它设计可以提供其它包大小。

在一些实施方案中，可以使用"风车"设计，其在具有变化横截面的径向模式上操作，以在恒定角速度的辊驱动下保持恒定的流体速度。一个或多个辊可以连接到旋转的中枢(hub)上。当中枢旋转时，辊压缩流动通道，从而沿着流动通道形成流体包。流动通道可以由圆形塑料管制成，或者可以由熔接在一起以形成通道的塑料片材形成(例如，SmartFLEXWARE^®)。图13A是机械设计的一个实例，其中管以具有变化的横截面的径向模式布置。一个或多个辊用于在中枢旋转时压缩管。在图13A所示的实例中，四个辊显示在风车上，但是根据所需的流体包尺寸可以使用不同数量的辊。

在一些实施方案中，可以使用"输送机"设计，其包括具有一对夹送辊的两个滚子(roll)，所述夹送辊跨越管阵列移动。夹送辊沿着两个滚子之间的间隙横穿，然后在分离并返回到另一端之后再次回转。夹送辊之间的间距基于期望的包尺寸而确定。图13B示出了机械设计的一个实例，其中管围绕两个滚子缠绕并且由沿着两个滚子之间的间隙横穿的辊挤压。

在一些实施方案中，辊可以定位在管圈的内侧上，使得它们抵靠固定的外壁压缩管。辊之间的间距和管尺寸基于期望的包尺寸而确定。图13C示出了机械压缩方法的实例，其中辊放置在管圈的内侧上，并且辊抵靠抵靠固定的外壁压缩管。

可以选择流速和管长度以靶定特定停留时间。对于病毒灭活应用，将停留时间选择为足以在流动通道内实现病毒灭活的时间，优选具有一定安全系数。例如，在需要30分钟灭活时间的情况下，可以采用2的安全系数，导致流动通道中60分钟的目标停留时间。在其它实施方案中，在病毒灭活在少于1-2分钟发生时，可以采用安全系数，并且使用4或5分钟的在流动通道中的目标停留时间。最小停留时间也可以取决于在病毒灭活的可接受安全系数方面的规章指南。

合适的标称停留时间包括但不限于1-2分钟、2-4分钟、4-6分钟、6-8分钟、8-10分钟、10-15分钟和15-30分钟。

保持窄的停留时间分布的能力对于病毒灭活方法如mAb处理具有优势，其中病毒必须在规定的灭活条件如低pH、暴露于去污剂等下停留最小量的时间。通过保持窄的停留时间分布，可以满足病毒灭活的最小时间要求，同时也使产物(例如蛋白/ mAb)最少地暴露于苛刻的灭活条件。

在低pH灭活的情况下，例如，病毒灭活剂如酸可以作为侧流加入到主进料流动通道中。在某些实施方案中，可以使用由软件程序控制的注射泵来添加所需量的病毒灭活剂。在一些实施方案中，可以提供用于泵的控制器，该控制器具有处理单元和存储元件。处理单元可以是通用目的的计算装置如微处理器。或者，它可以是专用处理装置，如可编程逻辑控制器(PLC)。存储元件可以利用任何存储器技术，如RAM、DRAM、ROM、Flash ROM、EEROM、NVRAM、磁介质或适于保存计算机可读数据和指令的任何其他介质。指令可以是操作泵所必需的那些指令。控制器还可以包括输入装置，如触摸屏、键盘或允许操作者输入待由控制器使用的一组参数的其它合适的装置。该输入装置也可以称为人机界面或HMI。控制器可以具有适于控制泵的输出。这些输出本质上可以是模拟或数字的，并且可以提供二进制输出(即，开或关)，或者可以提供一系列可能的输出，如模拟信号或多位数字输出。在加入试剂并混合(例如，通过在线静态混合器)后，然后其进入其流动通过的温育室流动通道达目标灭活时间。试剂的添加量取决于酸的类型、酸的强度和进料溶液的缓冲能力。进料溶液缓冲能力将取决于许多因素，包括缓冲液种类、缓冲液浓度和mAb浓度。类似的方法可用于去污剂灭活，而不是低pH灭活。

根据本文公开的实施方案，引入流体通道的流体样品将以最小的峰加宽离开流体通道。当应用本文公开的方法时观察到的峰加宽的量显著小于当采用常规病毒灭活方法时观察到的峰加宽的量。图4说明了由本文公开的方法产生的峰加宽与常规方法的比较。图4中显示了峰加宽，其中将样品注入直管、盘管(缠绕在直径3英寸的棒周围的管)和根据本文公开的实施方案引入离散流体包的管中。所有管具有相同的内径和对应于50 mL理论滞留体积的长度。将0.5 mL样品注入最初包含水的管中，在样品注入后，使水以10 mL/min (对应于5分钟的标称停留时间)通过每个管。在管出口处收集所得UV迹线。将体积针对体系体积标准化。

在文献中，由于二次流动性质，盘管已经显示出提供优于直管的优势(例如，Dean涡流, 美国专利号5,203,002 “Curved channel membrane filtration”)。Dean涡流已经被特别地用于连续病毒灭活(WO 2015/135844 A1 "Device and method for continuousvirus inactivation")。使用本文公开的方法获得的峰比直管和盘管两者的峰窄得多，表明以离散包或区域在流动通道中行进的流体物类在体系中具有更窄的停留时间分布。

本文所述的方法还导致工艺的较小的物理占地面积，例如，通过消除使用用于病毒灭活的合并物罐的需要或通过最小化以适当的安全系数灭活病毒所必需的温育室的尺寸。通常，对于通过减少工艺的整体物理占地面积(即，地面面积)来提高效率的更灵活的制造工艺的需求日益增长。本文所述的方法能够通过消除通常用于病毒灭活的大合并物罐来减少纯化工艺的总占地面积。

实施例

实施例1. 用噬菌体病毒进行的静态低pH病毒灭活。

在该代表性实验中，目的是评价在低pH条件下包膜噬菌体病毒(Phi6)的灭活动力学。目的是确定完全灭活所需的暴露时间。

将单克隆抗体(mAb)通过标准蛋白A层析纯化并以5 mg/mL的浓度制备。用8.7 M乙酸将pH从pH 6.3调节至pH 3.6。针对Phi6稳定性加入人血清白蛋白(HSA)(0.25% v/v)。在证实pH后，将病毒掺加物加入到包含该mAb的样品储器中，并涡旋以确保充分混合的体系。Phi6的目标掺加水平为1×10⁷ pfu(空斑形成单位)/mL。在病毒加入的0.3分钟内，取出1mL样品并转移到包含预先确定体积的pH为10的2M Tris碱的管中，以中和(pH 6-8)样品并猝灭灭活步骤。加入碱后，将管涡旋。在每个时间点重复该取出和中和样品的过程。这些实验在室温(22-25℃)下进行。还分析了在初始和最终时间点的对照样品。对于对照样品，pH保持在进料pH水平(pH 6.3)，但样品使用pH 6.3的背景缓冲液与实际样品类似地稀释。

使用空斑测定法测定中和样品的感染性，结果在表3中所示。相应的Phi6滴度以"静态"值示于图8。

表3

这些结果表明pH 3.6条件迅速使Phi6灭活，在1分钟内完全灭活。在0和15分钟时的对照样品保持原始滴度水平。

实施例2. 用XMuLV逆转录病毒进行的静态低pH病毒灭活。

本研究的目的是评价异嗜性鼠白血病病毒(XMuLV，一种常用于单克隆抗体产物的清除研究的包膜病毒)在低pH条件下的病毒灭活动力学。目的是确定完全灭活所需的暴露时间。

将单克隆抗体通过标准蛋白A层析纯化，并以18g/L的浓度制备。用8.7M乙酸将pH调节至pH 3.5、pH 3.7、pH 4.0或pH 4.2的目标水平。在证实pH后，将病毒掺加物加入到包含mAb的样品储器中并涡旋以确保充分混合的体系。XMuLV目标掺加水平是1×10⁷ TCID₅₀/mL(TCID₅₀ =组织培养感染剂量)(4%掺加物v/v)。在病毒加入0.3分钟内，取出1 mL样品并转移到包含预先确定体积的2M Tris碱的管中，以中和(pH 6-8)样品并猝灭灭活步骤。加入碱后，将管涡旋。在每个时间点重复该取出和中和样品的过程。这些实验在室温(22-25℃)下进行。还分析了在初始和最终时间点的对照样品。对于对照样品，pH保持在进料pH水平，但样品使用背景缓冲液与实际样品类似地稀释。

使用基于细胞的TCID₅₀感染性测定使用PG4指示细胞测定中和的样品的感染性(Bolton G, Cabatingan M, Rubino M,等人. Normal-flow virus filtration:detection and assessment of the endpoint in bio-processing. Biotechnol ApplBiochem 2005; 42: 133-42)。为了减轻细胞毒性和猝灭病毒灭活，将样品在细胞培养基中用十倍连续稀释1:50稀释，随后将每个稀释液的100μL等分试样加入96孔板中。在37℃下在5% CO₂中温育7天后，目测评估感染孔的细胞病理效应(CPE)。使用标准方法计算滴度和LRV(ICH. Guidance on Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products DerivedFrom Cell Lines of Human or Animal Origin. 载于: Use ICoHoTRfRoPfH, ed.Geneva, Switzerland: ICH, 1998)。为了确定每个时间点的LRV，从最接近的对照时间点的滴度减去该时间点的滴度。对数降低值示于表4。相应的滴度示于图9。

表4

这些结果表明pH3.5和pH3.7条件快速灭活XMuLV，在1分钟内完全灭活。在0和60分钟时的对照样品保持原始滴度水平。

实施例3. 用Phi6噬菌体病毒进行的静态基于去污剂的病毒灭活。

该研究的目的是检查基于去污剂的病毒灭活动力学。在该代表性实验中，使用两种不同浓度(0.1%和1.0% v/v)的去污剂Triton X-100来灭活噬菌体病毒Phi6。目的是确定完全灭活所需的暴露时间。

将单克隆抗体通过标准蛋白A层析纯化并以15 mg/mL的浓度制备。加入病毒掺加物并涡旋以确保充分混合的体系。Phi6目标掺加水平为1×10⁸ pfu/mL。加入去污剂以达到0.1%和1.0% v/v的所需浓度。在不同的时间点处，取出样品并通过将其以1:1000的稀释比加入缓冲液中而猝灭。加入去污剂后，将管涡旋。这些实验在室温(22-25℃)下进行。还分析了在初始和最终时间点的对照样品。对照样品使用背景缓冲液与实际样品类似地稀释。

使用空斑测定法测定中和样品的感染性，并且对数降低值如表5所示。相应的Phi6滴度如图10所示。

表5

这些结果表明0.1%和1.0% Triton X-100条件迅速使Phi6灭活，在1分钟内完全灭活。在0和30分钟时的对照样品保持原始滴度水平。

实施例4. 产生包的机械方法的实施。

该代表性实验证明了使用机械方法来沿着流体通道产生包。

设计装置(如图5-7所示)以沿管的长度以限定的间隔提供压缩力。基于在规定的流速(即10 mL/min)下实现特定停留时间所需的体积来选择管尺寸。使用具有1/8" ID和3/8" OD的硅酮增强的管。该管围绕具有3" OD的心轴盘绕。心轴具有147″的螺旋路径长度。另外长度的管将该装置连接到主进料泵，并且另一长度的管用于温育室的出口侧。

使用一组4个辊同时压缩围绕心轴盘绕的管。这些辊由允许它们抵靠管紧固的装置支撑，这迫使管被压在心轴和辊之间。这将流体路径机械地分成包。辊以一定的旋转速度围绕心轴旋转，使得流体达到由主进料泵设定的目标流速。

实施例5. 停留时间确定。

该代表性实施例提供了用于确定停留时间分布的方法。

使用蠕动泵将包含标记物物类(核黄素，0.2 mg/mL)的进料溶液泵送通过管、温育室并进入UV检测器。进料流速为10 mL/min。温育室利用实施例4中所述的机械方法以在体系内产生流体包。温育室由机械装置内的147″的硅酮增强管(1/8″ ID)组成。将另外的30"管连接到入口和出口温育室管上。这些另外的管具有1/8″的内径并且填充有螺旋静态混合器以使分散最小化。温育室出口上的管将该室与UV检测器连接。

将入口管连接到缓冲液储器。最初，整个体系都充满了水。随着流动停止，将固定体积(0.5 mL)的标记物物类(核黄素)加入到温育室上游的管中。将流速设定为10 mL/min，用水推动标记物物类通过体系。作为时间函数的来自UV检测器的信号用于确定标记物物类在体系中的停留时间。

实施例6. 病毒停留时间分布

该代表性实施例证明了通过温育室的病毒停留时间分布。如实施例5中所述设立体系，其中实施机械方法以在温育室内产生流体包。

Phi6病毒用作标记物物类。在缓冲液中Phi6目标掺加水平为1 × 10⁷ pfu/mL。该体系由管入口处的缓冲液储器、处于机械压缩下的温育室内的管段和将温育室连接到UV检测器的出口管组成。最初，将体系用缓冲液填充。然后，将5 mL Phi6病毒样品注入体系。流速设定为10 mL/min，使用缓冲液推动标记物物类通过体系。在管出口处收集样品并使用空斑测定法测定样品感染性。结果示于图11中，其中Phi6滴度作为标准化体积的函数作图。将体积针对体系体积标准化。这些实验在室温(22-25℃)下进行。

对于实施机械压缩方法的当前流动通道观察到较窄的峰。这些结果表明机械压缩方法提供了比盘管更窄的病毒停留时间分布。

实施例7. 使用连续流动体系的病毒灭活。

该代表性实施例描述了使用连续流动体系进行低pH病毒灭活。

使用由主进料泵、酸添加泵和碱添加泵组成的体系在连续流动条件下灭活病毒。mAb溶液掺加有Phi6并连接到主进料泵入口。Phi6目标掺加水平为1×10⁸ pfu/mL。酸是1M乙酸，碱是2M Tris碱溶液。将进料流速设定为1 mL/min。以0.75 mL/min的流速将酸加入到主干流中。然后，流体通过静态混合器和设计成包含特定体积(靶定所需的停留时间)的管段。在考虑到酸添加点和温育室起始处之间的阀和pH探测器的死体积后，使用不同长度的管来容纳每个目标平均停留时间(1、2、3、4、5、15分钟)所需的体积。在所有情况下，管具有1/8"的内径。在温育室的出口处，通过以0.4 mL/min的流速向干线中加入碱来中和该材料。流体通过另一个静态混合器，然后在出口处收集中和的样品，并使用空斑测定法测定样品感染性。对数降低值示于表6。这些实验在室温(22-25℃)下进行。还测定了对照样品。对于对照样品，pH保持在进料pH水平，但样品使用背景缓冲液与实际样品类似地稀释。相应的Phi6滴度在图8中显示为"在线"值。

表6

这些结果表明，使用在线连续灭活体系，病毒灭活发生在1分钟内。在0和15分钟时的对照样品保持原始滴度水平。

这些来自在线体系的数据与实施例1中使用用于Phi6病毒的静态低pH灭活条件获得的数据相同，表明这两种方法之间的等价性。

Claims (23)

1.一种用于维持在具有轴向长度的流体通道中流动的流体样品的窄停留时间分布的方法，其包括使所述流体样品在所述流体通道内沿着所述轴向长度以离散包流动。

2.根据权利要求1所述的方法，其中通过向所述流体通道施加压缩力使所述流体样品以离散包流动。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述流体样品在所述流体通道中具有一至两分钟的标称停留时间。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述流体样品在所述流体通道中具有二至四分钟的标称停留时间。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述流体样品在所述流体通道中具有四至六分钟的标称停留时间。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述流体样品在所述流体通道中具有六至八分钟的标称停留时间。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述流体样品在所述流体通道中具有八至十分钟的标称停留时间。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述流体样品在所述流体通道中具有十至十五分钟的标称停留时间。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述流体样品在所述流体通道中具有十五至三十分钟的标称停留时间。

10.一种用于灭活包含靶分子的样品中的一种或多种病毒的方法，其中所述方法包括在纯化所述靶分子的过程期间使所述样品在流动通道中以离散包流动，同时使所述样品连续地暴露于灭活条件。

11.一种用于灭活包含靶分子的流体样品中的一种或多种病毒的方法，其包括使所述流体样品经历蛋白A亲和层析过程，从而获得洗脱液；将所述洗脱液连续地转移至轴向流动通道以将一种或多种病毒灭活剂与所述洗脱液混合；和使所述洗脱液在所述轴向通道中以离散包流动足以灭活所述病毒的时间。

12.一种用于灭活包含靶分子的流体样品中的一种或多种病毒的方法，其包括使所述流体样品经历离子交换层析过程，从而获得洗脱液；将所述洗脱液连续地转移至轴向流动通道以将一种或多种病毒灭活剂与所述洗脱液混合；和使所述洗脱液在所述轴向通道中以离散包流动足以灭活所述病毒的时间。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述流体样品在所述流体通道中具有一至两分钟的标称停留时间。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述流体样品在所述流体通道中具有二至四分钟的标称停留时间。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述流体样品在所述流体通道中具有四至六分钟的标称停留时间。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述流体样品在所述流体通道中具有六至八分钟的标称停留时间。

17.根据权利要求1所述的方法，其中所述流体样品在所述流体通道中具有八至十分钟的标称停留时间。

18.根据权利要求1所述的方法，其中所述流体样品在所述流体通道中具有十至十五分钟的标称停留时间。

19.根据权利要求11所述的方法，其中所述流体样品在所述流体通道中具有十五至三十分钟的标称停留时间。

20.根据权利要求11所述的方法，其中通过向所述流体通道施加压缩力使所述洗脱液以离散包流动。

21.根据权利要求11所述的方法，其中所述靶是抗体或含Fc区的蛋白。

22.一种具有轴向长度的流体通道，其中所述流体通道包含含靶分子的流体样品的多个离散包和一种或多种病毒灭活剂。

23.根据权利要求22所述的流体通道，其中所述流体样品包括病毒。

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