CN110872266B - 海洋青霉倍半萜内酯抗肿瘤活性物质及制备和用途 - Google Patents

海洋青霉倍半萜内酯抗肿瘤活性物质及制备和用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种海洋青霉倍半萜内酯抗肿瘤活性物质及制备和用途，所述海洋青霉倍半萜内酯为青霉倍半萜内酯A。本发明利用源自海洋沉积物中的朱黄青霉的大米培养制备获得青霉倍半萜内酯A，朱黄青霉，分类命名为Penicillium minioluteum ZZ1657。所述青霉倍半萜内酯A显著抑制肿瘤细胞的增殖，具有降低肿瘤细胞葡萄糖消耗和乳酸生成从而抑制肿瘤细胞的异常糖酵解代谢途径的作用机制，在制备抗肿瘤药物方面具有应用前景。青霉倍半萜内酯A的化学结构式为：

Description

海洋青霉倍半萜内酯抗肿瘤活性物质及制备和用途
技术领域
本发明属医药领域,涉及从海洋朱黄青霉Penicillium minioluteum ZZ1657的代谢产物中获得的海洋青霉倍半萜内酯，尤其涉及海洋青霉倍半萜内酯抗肿瘤活性物质，以及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。所述海洋青霉倍半萜内酯为海洋青霉倍半萜内酯A(Penicisesquiterpenoid A)。
背景技术
肿瘤是一类世界范围内严重威胁人类健康的最常见、最严重也是最难以有效治疗的重大疾病之一。临床上通过手术，结合放疗和药物是目前肿瘤治疗最为常见的方法。药物治疗在肿瘤的预防和治疗中具有重要的意义。但是，传统的抗肿瘤化疗药多有疗效有限、毒副作用大和严重耐药性的不足。尽管分子靶向药物为肿瘤的治疗开辟了新途径，但是，也存在疗效有限和容易产生耐药性的严重问题。显然，临床上需要疗效更好、安全性更高和作用机制独特的新型抗肿瘤药物。
海洋特殊的物理化学环境以及生物多样性和复杂性,迫使海洋微生物具有与陆地微生物不同的新陈代谢途径、生存繁殖方式和适应机制，因而产生许多陆地微生物无法产生的化学结构新颖和生物活性独特的代谢产物，是发现抗肿瘤药或药物先导化合物的重要资源。
肿瘤细胞代谢重编程为新型抗肿瘤药物的研究与开发提供了新靶标。大量研究证明，肿瘤细胞高葡萄糖的消耗和高乳酸的生成是肿瘤细胞异常糖酵解的重要特性，活性物质对肿瘤细胞葡萄糖消耗和乳酸生成的改变可反映其对肿瘤细胞异常糖酵解代谢途径的影响。降低肿瘤细胞葡萄糖的高消耗和乳酸的高生成就可抑制肿瘤细胞的异常糖酵解代谢途径，从而抑制肿瘤细胞的增殖和生长。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种海洋青霉倍半萜内酯抗肿瘤活性物质，具体为青霉倍半萜内酯A(Penicisesquiterpenoid A),其化学结构式为：
Figure BDA0002281692600000011
本发明的第二个目的是提供青霉倍半萜内酯A的制备方法，通过以下步骤实现：
(1)朱黄青霉的分离培养
取空气干燥的海底沉积物用灭菌自来水稀释成一定的浓度，取一定量的样品稀释液均匀分散到含有固体培养基的培养皿中，在室温条件下培养一定时间后,将不同的菌落分别转移到另一含有固体培养基的培养皿中，在室温条件下继续培养一定时间。最后将ZZ1657的单一菌落接种到斜面培养基培养后置4℃冰箱保存备用。
所述的海底沉积物是从浙江省舟山市枸杞岛附近的海域(30°29′9"N和122°59′52"E)获得；所述样品稀释液的浓度为1×10-4～1×10-2g/mL；所述样品稀释液的取样量为200μL；所述培养皿和斜面培养的固体培养基均为马铃薯葡萄糖琼脂培养基；所述的室温培养温度为20～30℃；所述的培养时间为6～10天。
(2)朱黄青霉的菌种鉴定
上述步骤(1)分离培养所获得的菌株ZZ1657用目前实验室普遍使用的内转录间隔 区(Internal Transcribed Spacer,ITS)DNA序列分析方法鉴定其种类，确定为朱黄青霉，分类命名为Penicillium minioluteum ZZ1657，已被中国典型培养物保藏中心-武汉中心保藏，保藏编号:CCTCC NO：M 2019906，保藏日：2019.11.8；保藏地址：中国.武汉.武汉大学。
(3)朱黄青霉培养物的制备
将上述步骤(2)获得的朱黄青霉的菌株接种到含有一定量的液体培养基的大三角烧瓶中，将含有ZZ1657菌种的培养液在室温条件下振荡培养一定时间后得到菌种液。最后将菌种液转入含有一定量的固体培养基的大三角烧瓶中，在室温静置培养一定时间后，得到含有活性物质青霉倍半萜内酯A的ZZ1657培养物。
所述的ZZ1657菌株为产生抗肿瘤活性物质青霉倍半萜内酯A的朱黄青霉；所述的液体培养基为马铃薯葡萄糖培养基(土豆200g,葡萄糖20g,水1L)液体培养基，所述的用量为250mL；所述的固体培养基为大米培养基(大米40克和3.5％海盐水60毫升)；所述的大三角培养瓶为500mL；所述的室温培养温度为20～30℃；所述的静置培养时间为3～5天，大米培养基的培养时间为26～30天。
(4)青霉倍半萜内酯A的提取分离纯化
将上述步骤(3)获得的菌株ZZ1657的培养物用乙酸乙酯提取得到乙酸乙酯提取物。将乙酸乙酯总提取物先用硅胶柱层析分离，用环己烷和乙酸乙酯混合溶剂梯度洗脱，收集洗脱液，用高效液相色谱(HPLC)检测各组分，合并含有相同成分的组分，得到四个组分(A～D)。组分D再用十八烷基硅烷键合硅胶(ODS)柱层析分离,分别用60％、70％和80％的甲醇洗脱，得到D1～D3三个组分。最后，组分D2用高效液相色谱(HPLC)分离纯化得到纯化合物青霉倍半萜内酯A。
所述的硅胶柱层析的硅胶用量与上柱的样品量比例是10～15g:1.0g；所述的环己烷和乙酸乙酯混合溶剂梯度为10:1，5:1，2:1，1:1(体积比)；所述的十八烷基硅烷键合硅胶(ODS)柱层析的ODS用量与上柱的样品量比例是20～30g:1.0g；所述的高效液相分离条件是:安捷伦1260型高效液相色谱仪,安捷伦Zorbax SB-C18色谱柱(280×9.4mm,5μm)，乙腈和水为流动相(53/47,体积比)，检测波长210nm，流速为1.0mL/min。
(5)青霉倍半萜内酯A的结构鉴定
青霉倍半萜内酯A的结构是根据它的紫外光谱、红外光谱、一维和二维核磁共振(NMR)光谱、高分辨质谱(HRESIMS)数据、和单晶X-射线衍射等方法相结合而确定。
本发明的第三个目的是提供青霉倍半萜内酯A在制备抗肿瘤药物中的应用。所述的青霉倍半萜内酯A显著抑制肺癌细胞A549、H157、H460、H1299、H1703、和PC9以及胶质瘤细胞U87MG和U251细胞的增殖，具有降低肿瘤细胞糖酵解过程中的葡萄糖消耗和乳酸生成从而抑制肿瘤细胞的异常糖酵解的独特作用机理，在制备治疗肿瘤疾病药物方面具有应用前景。
本发明提供的青霉倍半萜内酯A(Penicisesquiterpenoid A)是从海洋朱黄青霉Penicillium minioluteum ZZ1657的代谢产物中分离得到的一个结构新颖的倍半萜内酯类化合物,对多种不同的肺癌和胶质瘤细胞的增殖具有强的抑制作用,具有独特的降低肿瘤细胞葡萄糖消耗和乳酸生成从而抑制肿瘤细胞异常糖酵解代谢途径的作用机理。
本发明的有益之处在于，(1)海洋朱黄青霉在所述的培养条件下可以产生抗肿瘤活性化合物青霉倍半萜内酯A；(2)青霉倍半萜内酯A为一新化合物，现有抗肿瘤药物中没有该结构类型的化合物；(3)青霉倍半萜内酯A显著抑制多种不同肿瘤细胞的增殖并具有独特抑制肿瘤细胞异常糖酵解代谢的作用机制，青霉倍半萜内酯A在制备抗肿瘤药物方面具有应用前景，可为包括肺癌和胶质瘤在内的肿瘤治疗提供一种新的药物分子。
附图说明
图1是朱黄青霉Penicillium minioluteum ZZ1657的菌落图。
图2是青霉倍半萜内酯A的高分辨质谱图。
图3是青霉倍半萜内酯A的氢谱。
图4是青霉倍半萜内酯A的碳谱。
图5～7是青霉倍半萜内酯A的HMQC谱
图8～9是青霉倍半萜内酯A的HMBC谱。
图10是青霉倍半萜内酯A的单晶X-射线衍射的结构图。
图11是青霉倍半萜内酯A的HMBC相关示意图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述。但是,本发明不限于这些实施例。
实施例1
1.朱黄青霉的分离培养
将从浙江省舟山市枸杞岛附近海域(30°29′9"N和122°59′52"E)获得的海底沉积物在28℃的条件下干燥8天。取干燥的沉积物1克，用灭菌自来水配成浓度为1×10-2g/mL的样品溶液。取200μL样品液均匀分散到含有马铃薯葡萄糖琼脂(Potato Dextrose Agar，PDA，杭州微生物试剂有限公司)固体培养基的培养皿中，在28℃的条件下培养15天时间后,将不同的菌落分别转移到另一含有PDA固体培养基的培养皿中，在28℃的条件下继续培养6天。最后将生长良好的ZZ1657单一菌落接种到PDA固体斜面培养基培养后，置4℃冰箱保存备用。
2.朱黄青霉的菌种鉴定
使用内转录间隔区(ITS)DNA序列分析方法鉴定所获得菌株ZZ1657的种类。
2.1实验试剂及仪器
PCR试剂：PrimeSTAR Max DNA Polymerase(TaKaRa)，引物(Invitrogen合成)，引物序列是:
Figure BDA0002281692600000041
Marker：DL2000
实验仪器：离心机，电泳仪，PCR仪，ABI 3730XL测序仪。
2.2实验步骤
使用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒(生工)。
电泳检测
PCR扩增
a.PCR反应体系
Figure BDA0002281692600000042
b.PCR反应条件
Figure BDA0002281692600000051
c.电泳检测
160V恒压20min，DL2000marker 4ul，PCR产物4ul
d.测序:切胶纯化测序
e.分析结果:拼接序列。
2.3实验结果
拼接后的序列为：
Figure BDA0002281692600000052
以上获得的ITS rDNA序列与美国NIH的NCBI GenBank数据库比较,其结果表明:菌株ZZ1657的ITS rDNA序列与GenBank库中的朱黄青霉菌Penicillium minioluteumvoucher CV383的ITS rDNA序列有100％的相似性(登录号:JF910284.1)。因此,本发明所获得的海洋朱黄青霉ZZ1657的分类命名为Penicillium minioluteum ZZ1657(附图1)，该菌株已被中国典型培养物保藏中心保藏,保藏编号:CCTCC NO：M 2019906，保藏日：2019.11.8；保藏地址：中国.武汉.武汉大学。
3.朱黄青霉培养物的制备
挑取PDA固体斜面培养基上的朱黄青霉,接种到含有250mL马铃薯葡萄糖液体培养基(土豆200g,葡萄糖20g,水1L)的500mL三角烧瓶中，将含有ZZ1657菌种的培养液在28℃条件下旋转(180rpm)振摇培养2天后得到菌种液。将10mL菌种液转入到含有大米固体培养基(大米40克和3.5％海盐水60毫升)的500mL三角烧瓶中,在28℃条件下静置培养30天,得到含有抗肿瘤活性物质青霉倍半萜内酯A的培养物。本实验总计制备了400瓶菌株ZZ1657的大米培养物。
4.青霉倍半萜内酯A的提取分离纯化
将上述实验获得的400瓶菌株ZZ1657的大米培养物分别用乙酸乙酯提取3次，将乙酸乙酯提取液合并，减压浓缩得到总提取物300.6克。将总提取物先用硅胶(3000克)柱层析分离，用环己烷和乙酸乙酯混合溶剂(10:1，5:1，2:1，1:1,体积比，各3500mL)梯度洗脱，每500mL收集为一组分，用高效液相色谱(HPLC)检测各组分，合并含有相同成分的组分，得到四个组分(A～D)。组分D(30克)再用十八烷基硅烷键合硅胶(ODS，600克)柱层析分离,分别用1500mL的60％、70％和80％的甲醇洗脱，得到D1～D3三个组分。最后，组分D2(300mg)用安捷伦1260型高效液相色谱仪分离纯化(Zorbax SB-C18色谱柱:280×9.4mm,5μm；流动相：乙腈/水,53/47；检测波长：210nm；流速：1.0mL/min)，得到纯化合物青霉倍半萜内酯A(80mg,保留时间tR 32.1min)。
5.青霉倍半萜内酯A的结构鉴定
青霉倍半萜内酯A(Penicisesquiterpenoid A):无色单斜晶体；分子式C15H22O4；熔点.210～211℃；[α]D 20+56°(c 0.02,MeOH)；紫外光谱：UV(MeOH)λmax(logε)214(3.87)nm；红外光谱：IR(MeOH)νmax 3173,2981,2902,1751,1705,1423,1356,1232,1196,1092,1051,981,902,758cm–1；高分辨质谱(附图2)：HRESIMS m/z[M+Na]+289.1413(计算值C15H22NaO4,289.1416)，[2M+Na]+555.2926(计算值C30H44NaO8,555.2934)。通过化合物的1H谱(附图3)、13C谱(附图4)、HMQC谱(附图5～7)、HMBC谱(附图8～9)和X射线单晶衍射(附图10)分析，确定了青霉倍半萜内酯A的化学结构，为一个新化合物，其13C和1H核磁共振信号归属见表一。它的HMBC相关示意图见附图11。
Figure BDA0002281692600000061
表1、青霉倍半萜内酯A的13C和1H NMR数据(溶剂：氘代二甲基亚砜DMSO-d6)
Figure BDA0002281692600000062
Figure BDA0002281692600000071
a,b标有相同字母a和b的13C和1H NMR数据可能会互换。
6.青霉倍半萜内酯A的抗肿瘤活性
6.1青霉倍半萜内酯A对肿瘤细胞增殖的抑制作用
用磺酰罗丹明B(SRB)法测定青霉倍半萜内酯A对肺细胞A549、H157、H460、H1299、H1703、和PC9以及胶质瘤细胞U87MG和U251细胞的增殖的抑制作用。肺癌和胶质瘤细胞分别用顺铂和阿霉素(Doxorubicin,DOX)做阳性对照。所有肺癌细胞均用含有10％FBS以及1％青霉素和链霉素的1640完全培养基在37℃和CO2饱和湿度的培养箱内培养，而胶质瘤U87-MG和U251细胞分别用含有10％FBS的RPMI-1640和DMEM培养基在37℃和5％二氧化碳的孵化箱中培养，经过三代培养的细胞用于本发明的实验研究。肿瘤细胞接种于96孔板中，贴壁24h后加入不同浓度的青霉倍半萜内酯A。药物处理72h后用SRB染色，用酶标仪测定515nm处的吸收光度值，检测肿瘤细胞的存活率，计算青霉倍半萜内酯A抑制肿瘤细胞增殖的IC50值。实验结果表明：青霉倍半萜内酯A显著抑制肿瘤细胞的增殖，其抑制肺癌细胞增殖的IC50值为1.83-2.80μM，抑制胶质瘤细胞增殖的IC50值为4.49-10.9μM(表2)。
表2、青霉倍半萜内酯A对肿瘤细胞增殖的抑制活性(IC50:μM)
Figure BDA0002281692600000072
PSTA:青霉倍半萜内酯A(Penicisesquiterpenoid A)；DOX:阿霉素(Doxorubicin)。
6.2青霉倍半萜内酯A对肿瘤细胞糖酵解途径的葡萄糖消耗和乳酸生成的影响
正常细胞葡萄糖绝大部分在糖酵解环节降解成丙酮酸后进入三羧酸循环,在线粒体内氧化磷酸化产生能量物质ATP。但是肿瘤细胞糖酵解发生重编程而导致异常糖酵解，其产生的丙酮酸大部分直接转化为乳酸，而非产生ATP。葡萄糖高消耗和乳酸的大量生成是肿瘤异常糖酵解的重要特性，活性物质对肿瘤细胞葡萄糖消耗和乳酸生成的改变可反映其对肿瘤细胞代谢途径的影响。因此，本实验测试了青霉倍半萜内酯A对肺癌细胞糖酵解过程葡萄糖消耗和乳酸生成的影响，用2-去氧糖(2-DG)做阳性对照。取对数生长期的肺癌A549和PC9细胞，以6000/孔的密度接种于96孔板中，细胞贴壁24小时后给药。药物设置浓度为：青霉倍半萜内酯A(PSTA：0.2μM、1.0μM和5.0μM)，2-去氧糖(2-DG：0.4mM)，药物孵育细胞24小时后，取出上清液，置于-80℃冰箱，用于葡萄糖和乳酸的测定。葡萄糖和乳酸的检测方法按照试剂盒说明书上的方法进行操作。不含细胞的培养基中葡萄糖的含量减去对照组或者给药组培养基中葡萄糖的含量既为葡萄糖的消耗量；对照组或者给药组培养基中乳酸的含量减去不含细胞的平行培养基中乳酸的含量既为乳酸的生成量。实验结果(表3)表明：三种不同浓度的青霉倍半萜内酯A均能显著降低肺癌A549和PC9细胞的葡萄糖消耗量和乳酸的生成量，而且随着浓度的增加，其作用也大大增强，浓度在5.0μM的青霉倍半萜内酯A降低肺癌PC9细胞的葡萄糖消耗量和乳酸的生成量分别高达81.9％和94.1％。
表3、青霉倍半萜内酯A对肿瘤细胞葡萄糖消耗和乳酸生成的影响
Figure BDA0002281692600000081
PSTA:青霉倍半萜内酯A(Penicisesquiterpenoid A)；2-DG:2-去氧糖。
以上实验结果充分说明，青霉倍半萜内酯A显著地抑制多种不同肿瘤细胞株的细胞增殖，具有显著降低肿瘤细胞的葡萄糖消耗和乳酸生成从而抑制肿瘤细胞的异常糖酵解代谢的独特作用机理。因此，青霉倍半萜内酯A在制备治疗肿瘤药物方面具有良好的应用潜力。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 海洋青霉倍半萜内酯抗肿瘤活性物质及制备和用途
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 1
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 2
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 3
<211> 570
<212> DNA
<213> 朱黄青霉(Penicillium minioluteum ZZ1657)
<400> 3
cctgcggaag gatcattact gagtgcgggc ccctcgcggg tccaacctcc cacccgtgtc 60
tcttgaatac cctgttgctt tggcgggccc accgggccac ccccggtcgc cggggggcac 120
tgcgcccccg ggcccgcgcc cgccagagcg cctctgaacc ctaatgaaga aggactgtct 180
gagtctacga tataattatc aaaactttca acaatggatc tcttggttcc ggcatcgatg 240
aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga attccgtgaa tcatcgaatc 300
tttgaacgca cattgcgccc cctggcattc cggggggcat gcctgtccga gcgtcatttc 360
tgccctcaag cccggcttgt gtgttgggcg tggtcccccc ggtgtcgggg ggacctgccc 420
caaaggcagc ggcgacgttc cgcctaggtc ctcgagcgta tggggctttg tcacccgctc 480
gggaggggcc tacgggcgtt ggccacccac caattttttt tacggttgac ctcggatcag 540
gtaggagtta cccgctgaac ttaagcatat 570

Claims (3)

1.一种海洋青霉倍半萜内酯抗肿瘤活性物质，其特征在于，所述活性物质为青霉倍半萜内酯A，其化学结构式为：
Figure 10647DEST_PATH_IMAGE002
。
2.权利要求1所述的一种海洋青霉倍半萜内酯抗肿瘤活性物质的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
(1) 朱黄青霉培养物的制备
将海洋朱黄青霉的菌株接种到含有液体培养基的三角烧瓶中，将含有朱黄青霉的菌种培养液在室温条件下振荡培养后得到菌种液，最后将菌种液转入含有固体培养基的三角烧瓶中，室温静置培养后，得到含有活性物质青霉倍半萜内酯A的培养物；所述海洋朱黄青霉，其分类命名为Penicilliumminioluteum ZZ1657，已被中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号: CCTCC NO：2019906，保藏日：2019.11.8；保藏地址：中国.武汉.武汉大学；所述液体培养基为马铃薯葡萄糖培养基：土豆200 g、葡萄糖20 g、水1 L；所述的固体培养基为大米培养基：大米40 克和3.5%海盐水 60毫升；所述的室温为20-30℃；所述液体培养基 培养时间为3-5天，固体培养基培养时间为26-30天；
(2) 青霉倍半萜内酯A的提取分离纯化
将上述步骤(1)获得的培养物用乙酸乙酯提取得到乙酸乙酯提取物，将乙酸乙酯提取物先用硅胶柱层析分离，用环己烷和乙酸乙酯混合溶剂梯度洗脱，收集洗脱液，用高效液相色谱检测各组分，合并含有相同成分的组分，得到A-D四个组分，组分D再用十八烷基硅烷键合硅胶柱层析分离，分别用60%、70%和80%的甲醇洗脱，得到D1-D3三个组分，最后，组分D2用高效液相色谱分离纯化得到青霉倍半萜内酯A纯化合物；所述的硅胶柱层析的硅胶用量与上柱的样品量比例是10-15 g:1.0 g；所述的环己烷和乙酸乙酯混合溶剂体积比为10:1，5:1，2:1，1:1；所述的十八烷基硅烷键合硅胶的用量与上柱的样品量比例是20-30 g:1.0 g；所述的高效液相分离条件是：安捷伦Zorbax SB-C18色谱柱 280×9.4 mm, 5 μm，乙腈和水为流动相体积比为53/47，检测波长210 nm，流速为1.0 mL/min；
(3) 青霉倍半萜内酯A的结构鉴定
根据紫外光谱、红外光谱、一维和二维核磁共振光谱、高分辨质谱数据、和单晶X-射线衍射方法，确定青霉倍半萜内酯A的结构。
3.权利要求1所述的活性物质在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述活性物质为青霉倍半萜内酯A。
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