CN110869767A - 用于内毒素检测的匣 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可用于检测和/或定量微生物污染物、包括内毒素的方法、组合物和装置。在一些实施方式中，提供了包含干燥的组合物的匣，其可用于基于吸光度的试验并可与便携式读取器/装置组合。该匣包括泵机构如双位注射器，其中第一位置造成真空以引导样品进入匣的流体进口端口和管道，且第二位置提供从管道至光学样品孔的传输，该光学样品孔含有干燥的血细胞裂解物组合物和干燥的显色底物。

Description

用于内毒素检测的匣
发明领域
本发明涉及可用于检测和/或定量微生物污染物、包括内毒素的方法、组合物和装置。在一些实施方式中，提供了包含干燥的组合物的匣，其可用于基于吸光度的试验并可与便携式读取器/装置组合。
背景技术
微生物污染，包括来自革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、酵母、真菌和霉菌的污染，可导致严重疾病，甚至在某些情况下可导致人的死亡。制药、医疗器械、和食品产业经常需要对这样的微生物污染物存在与否进行频繁、准确且灵敏的测试，以符合某些标准，例如美国食品药品监督管理局(USFDA)或环境保护署强制的标准。
需要一种方便、快速的方法，通过紧凑、便携式的装置来分析样品中是否存在微生物污染物，适当地，该装置可以轻松地用于各种情况。本发明解决了这些需要。
发明概述
在一些实施方式中，本文提供了一种用于确定样品中微生物污染物存在与否和/或量的匣。在一些实施方式中，所述匣包括壳体、与壳体相关联且流体连通到流体进口端口和管道的泵机构、以及包含干燥在光学样品孔上的血细胞裂解物的干燥的组合物；所述壳体包括光学样品孔、流体进口端口、和流体连通流体进口端口与光学样品孔的管道。
在其它实施方式中，所述壳体包括四个光学样品孔，每个包括包含血细胞裂解物的干燥的组合物且还包含干燥在光学样品孔上的显色底物，并且其中四个光学样品孔中的两个还包含干燥在光学样品孔上的代表微生物污染物的试剂。
适当地，所述壳体包括流体连通到光学样品孔的液体不可渗透膜，且所述壳体可以包括彼此机械连接的顶部和底部。
在一些实施方式中，所述泵机构是双位注射器，其中第一位置造成真空以引导样品进入流体进口端口和管道，且第二位置提供从管道至光学样品孔的传输。
适当地，所述血细胞裂解物是鲎变形细胞裂解物，并且代表微生物污染物的试剂是细菌内毒素。
本文还提供用于检测样品中的微生物污染物存在与否和/或量的匣，所述匣包括具有第一光学样品孔和第二光学样品孔的壳体、流体连通流体进口端口与第一光学样品孔和第二光学样品孔的流体进口端口和管道、附接至壳体且流体连通到流体进口端口与管道的双位注射器、其中第一位置造成真空以引导样品进入流体进口端口和管道、且第二位置提供从管道至第一光学样品孔和第二光学样品孔的传输、包括干燥在第一光学样品孔和第二光学样品孔中的每个上的血细胞裂解物和显色底物的干燥的组合物、和干燥在第二光学样品孔上的代表微生物污染物的试剂。
还提供用于检测样品中微生物污染物存在与否的方法，所述方法包括引导样品进入本文所述匣的流体进口端口并将样品传输至管道，将样品从管道传输至光学样品孔，并测定光学样品孔中的样品的光学性质，其中光学性质的变化指示样品中的微生物污染物的存在。
在所述方法的一些实施方式中，测定光学性质是指在预选的波长下光的吸光度的变化。适当地，引导样品包括通过双位注射器造成真空以将样品引导到流体进口端口和管道内。在另一些实施方式中，传输包括通过双位注射器将样品从管道运输到光学样品孔，并且其中运输被流体连通到光学样品孔的液体不可渗透膜停止，以使得每个样品孔中样品的最终体积变化少于约10％。
下面参考附图详细描述另一些实施方式、实施方式的特征和优势、以及各个实施方式的结构和操作。
附图简述
图1A-1B示出了根据本文实施方式的用于内毒素检测的匣。
图1C示出了根据本文实施方式的光学样品孔。
图1D示出了将样品引导到根据本文实施方式的用于内毒素检测的匣内。
图2示出了液体可渗透膜在根据本文实施方式的用于内毒素检测的匣中的使用。
图3示出了根据本文实施方式的用于内毒素检测的匣的顶部和底部。
图4A示出了根据本文实施方式的用于内毒素检测的匣的安装装置。
图4B-4F示出了根据本文实施方式的用于内毒素检测的匣的其它安装装置。
图5A-5D示出了根据本文实施方式的其它用于内毒素检测的匣。
图6A-6B示出了根据本文实施方式的读取装置。
图6C示出了根据本文实施方式的其它读取装置。
图7示出了根据本文实施方式的读取装置的组件。
具体实施方式
应当理解，这里示出和描述的特定实施方式是示例，并且不旨在以任何方式限制本申请的范围。
本文提及的公开的专利，专利申请，网站，公司名称和科学文献在此通过引用其全文并入，其程度如同每个具体和单独地指出通过引用并入。本文引用的任何参考文献与本说明书的具体教导之间的任何冲突都应以有利于后者的方式解决。同样，本领域理解的单词或短语的定义与本说明书中具体教导的单词或短语的定义之间的任何冲突都应以有利于后者的方式解决。
如在本说明书中所使用的，单数形式“一种”、“一个”和“该”具体地还包括它们所指的术语的复数形式，除非内容另有明确说明。本文所用术语“约”表示近似于、在某范围内、大致、或在周围。当术语“约”与数值范围联用时，其通过延伸所示数值的上下边界来修改该数值范围。通常，本文所用术语“约”通过20％的变化对所列数值进行向上或向下修改。
除非另外定义，否则本文使用的技术和科学术语具有本申请所属领域的技术人员通常理解的含义。这里参考本领域普通技术人员已知的各种方法和材料。
发明内容
1.用于检测样品中的微生物污染物存在与否和/或量的匣，所述匣包括：
a.壳体，其包括至少一个光学样品孔、流体进口端口和流体连通流体进口端口与至少一个光学样品孔的至少一个管道；
b.泵机构，其与壳体相关联、且流体连通到流体进口端口和至少一个管道；和
c.干燥的组合物，其包含干燥在至少一个光学样品孔上的血细胞裂解物。
2.如项目1所述的匣，所述匣还包括：
a.干燥在至少一个光学样品孔上的显色底物，和/或
b.干燥在至少一个光学样品孔上的代表微生物污染物的试剂。
3.如项目1或2所述的匣，其中，所述壳体包括四个光学样品孔，每个包括包含血细胞裂解物的干燥的组合物且还包含干燥在光学样品孔上的显色底物，并且其中四个光学样品孔中的两个还包含干燥在光学样品孔上的代表微生物污染物的试剂。
4.如项目1～3中任一项所述的匣，其中，所述壳体包括流体连通到至少一个光学样品孔的至少一个液体不可渗透膜。
5.如项目1～4中任一项所述的匣，其中，所述壳体包括彼此机械连接的顶部和底部。
6.如项目1～5中任一项所述的匣，其中，所述泵机构是双位注射器，其中第一位置造成真空以引导样品进入流体进口端口和至少一个管道，且第二位置提供从至少一个管道至至少一个光学样品孔的传输。
7.如项目1～6中任一项所述的匣，其中，所述血细胞裂解物是鲎变形细胞裂解物(LAL)。
8.如项目7所述的匣，其中，所述LAL是基本上没有凝固蛋白原的LAL。
9.如项目7所述的匣，其中，所述LAL是澄清的LAL。
10.如项目1～6中任一项所述的匣，其中，所述血细胞裂解物是中国鲎(Tachypleus)变形细胞裂解物或圆尾鲎(Carcinoscorpius)变形细胞裂解物。
11.如项目2～10中任一项所述的匣，其中，所述代表微生物污染物的试剂是细菌内毒素。
12.如项目1～11中任一项所述的匣，其中，所述干燥的组合物包含约1μg至约50μg血细胞裂解物、和任选的约0.1μg至5μg显色底物。
13.用于检测样品中的微生物污染物存在与否和/或量的匣，所述匣包括：
a.壳体，其至少包括第一光学样品孔和一个第二光学样品孔、流体进口端口和至少一个管道，所述管道流体连通流体进口端口与第一光学样品孔和第二光学样品孔；
b.双位注射器，其附接至壳体且流体连通到流体进口端口和至少一个管道，其中第一位置造成真空以引导样品进入流体进口端口和管道，且第二位置提供从管道至第一光学样品孔和第二光学样品孔的传输；
c.干燥的组合物，其包括干燥在第一光学样品孔和第二光学样品孔中的每个上的血细胞裂解物和显色底物；和
d.干燥在第二光学样品孔上的代表微生物污染物的试剂。
14.如项目13所述的匣，其中，所述壳体包括四个光学样品孔，每个包括干燥在光学样品孔上的干燥的组合物，并且其中四个光学样品孔中的两个包含干燥在光学样品孔上的代表微生物污染物的试剂。
15.如项目13或14所述的匣，其中，所述壳体包括流体连通到光学样品孔的至少一个液体不可渗透膜。
16.如项目13～15中任一项所述的匣，其中，所述壳体包括彼此机械连接的顶部和底部。
17.如项目13～16中任一项所述的匣，其中，所述血细胞裂解物是鲎变形细胞裂解物。
18.如项目17所述的匣，其中，所述LAL是基本上没有凝固蛋白原的LAL。
19.如项目17所述的匣，其中，所述LAL是澄清的LAL。
20.如项目13～16中任一项所述的匣，其中，所述血细胞裂解物是中国鲎(Tachypleus)变形细胞裂解物或圆尾鲎(Carcinoscorpius)变形细胞裂解物。
21.如项目1～20中任一项所述的匣，其中所述代表微生物污染物的试剂是细菌内毒素。
22.如项目13～21中任一项所述的匣，其中，所述干燥的组合物包含约1μg至约50μg血细胞裂解物、和约0.1μg至5μg显色底物。
23.一种用于检测样品中的微生物污染物存在与否的方法，所述方法包括：
a.引导样品进入项目1～12的匣的流体进口端口并将样品传输至管道；
b.将样品从至少一个管道传输至至少一个光学样品孔；和
c.测定至少一个光学样品孔中的样品的光学性质，其中光学性质的变化指示样品中的微生物污染物存在与否。
24.如项目17所述的方法，其中，测定光学性质是指在预选的波长下光的吸光度的变化。
25.如项目18所述的方法，其中，将预选的波长下光的吸光度的变化与标准曲线进行比较。
26.如项目19所述的方法，其中，所述标准曲线是存档标准曲线。
27.如项目16～22中任一项所述的方法，其中，引导样品包括通过泵机构造成真空以将样品引导到流体进口端口和至少一个管道内。
28.如项目23～27中任一项所述的方法，其中，传输包括通过泵机构将样品从至少一个管道运输到至少一个光学样品孔，并且其中运输被流体连通到至少一个光学样品孔的至少一个液体不可渗透膜停止。
29.一种用于检测样品中的微生物污染物存在与否的方法，所述方法包括：
a.引导样品进入项目13～22的匣的流体进口端口并将样品传输至至少一个管道；
b.将样品从管道传输到光学样品孔；和
c.测定多个光学样品孔中的样品的光学性质，其中光学性质的变化指示样品中的微生物污染物存在与否。
30.如项目29所述的方法，其中，测定光学性质是指在预选的波长下光的吸光度的变化。
31.如项目30所述的方法，其中，将预选的波长下光的吸光度的变化与标准曲线进行比较。
32.如项目31所述的方法，其中，所述标准曲线是存档标准曲线。
33.如项目29～32中任一项所述的方法，其中，引导样品包括通过双位注射器造成真空以将样品引导到流体进口端口和管道内。
34.如项目29～32中任一项所述的方法，其中，传输包括通过双位注射器将样品从管道运输到光学样品孔，并且其中运输被流体连通到光学样品孔的液体不可渗透膜停止，以使得每个样品孔中样品的最终体积变化少于约10％。
测试微生物污染物
已经开发了各种试验来检测测试样品中的微生物污染物的存在与否和/或量。通常使用由甲壳类动物(例如鲎)的血淋巴制备的血细胞裂解物。这些试验通常以这样或那样的方式利用血细胞裂解物暴露于微生物污染物时发生的凝血级联反应。血细胞裂解物的实例包括产自鲎(horseshoe crab)(美洲鲎(Limulus polyphemus)、南方鲎(Tachypleusgigas)、中国鲎(Tachypleus tridentatus)、和圆尾鲎(Carcinoscorpius rotundicauda))的血淋巴的变形细胞裂解物(AL)。产自美洲鲎(Limulus)、中国鲎(Tachypleus)和圆尾鲎(Carcinoscorpius)种的血淋巴的变形细胞裂解物分别称为鲎变形细胞裂解物(LAL)，中国鲎变形细胞裂解物(TAL)、和圆尾鲎变形细胞裂解物(CAL)。
使用LAL的试验例如包括凝胶凝块试验、终点比浊试验、动力学比浊试验和终点显色试验(之前的(1990)“鲎变形细胞裂解物测试的临床应用(Clinical Applications ofthe Limulus Amoebocyte Lysate Test)”CRC出版社28-34)。然而，这些试验具有一个或多个缺点，包括试剂费用、测定速度和有限的灵敏度范围。而且，这些试验通常要求将样品发送到远离被测样品的来源的测试设施。
用于内毒素检测的匣
在一些实施方式中，本文提供了一种用于确定样品中微生物污染物存在与否和/或量的匣。
如图1A所示，在一些实施方式中，匣100包括壳体102，其提供对于匣的结构支持。如本文所述，“匣”是指用于接收并持有用于测试微生物污染物的存在和/或量的样品的独立的元件。
壳体102可以由任何合适的材料制成，包括各种塑料或玻璃。壳体102包含光学样品孔104。图1C示出了光学样品孔104的侧视图，示出了孔壁130，其在壳体102的上表面和下表面之间形成了容器或安瓿。光学样品孔104适当地由塑料或玻璃材料构成，且适当地在光学上透明或清晰，以允许光穿过光学样品孔的底和顶，从而使光接触到光学样品孔中包含的样品。在一些实施方式中，光学样品孔104、以及壳体102的剩余部分可以由黄色玻璃或聚合物制备，其适当地阻挡约400nm至约450nm的光通过(即405nm)，但允许其他波长通过。这样的实施方式减少串扰和杂散光来减少穿过光学样品孔104的光的量，减少串扰并增加本文描述的方法的灵敏度。
匣100的壳体102还包含流体进口端口106和管道108。流体进口端口106适当地为壳体102的长的或细长的部分，其中收纳了导管108，并且其在尖端112处具有适于接触样品112的开口。流体进口端口106被设计为允许样品在样品引入方向114上被向上抽吸进入流体进口端口。管道108流体连通流体进口端口106和光学样品孔104。也就是说，管道108在流体进口端口106的尖端112和光学样品孔104之间提供管状或微流体连接，以允许液体样品在被抽吸到端口后通过管道108在流体进口端口和光学样品孔104之间传输。在一些实施方式中，导管108可以形成为切入壳体102的表面中的通道，或者可以形成为由如聚苯乙烯等各种聚合物的管或微管。
如图1A所示，在引导样本进入流体进口端口106中后，样本会移动到导管108内的初始位置，在将样本转移到光学样品孔104之前，样本在此处被保存并保持。
在一些实施方式中，匣100还包括与壳体102相关联的泵机构110。泵机构110适当地为双位注射器，其包括筒118和可在筒内滑动的柱塞116。泵机构110可通过适当的机构(例如，胶水、粘合剂、机械带、包装纸或钉书钉等)与壳体102直接附接，或可以是作为壳体102的整合部分(例如壳体的顶部)准备的元件。泵机构110被流体连通到流体进口端口106和管道108，这样在泵机构110驱动时，样品可被抽入流体进口端口106，并然后进入管道108，例如如图1A所示，其中114指示了样品引入方向。
图1A示出了泵机构110的驱动，适当地第一位置124的双位注射器使得样品传输到流体进口端口106和管道108，但保留在管道108而不进一步进入光学样品孔104。例如，双位注射器可造成真空以通过尖端112引导或抽吸样品进入流体进口端口106，然后进入管道108。该真空适当地用真空管道122(图1B)造成，其位于光学样品孔104的下游。然而，在另一些实施方式中，真空可产生在管道108和样品孔104之间，其允许将样品初始引导到管道中。
图1B示出了泵机构110在第二位置126的驱动，其提供了样品从管道108到光学样品孔104的运输。在一些实施方式中，第二位置126可进一步造成真空，例如通过真空管道122形成，以通过样品流动方向128将样品从管道108抽吸到光学样品孔104中。
将样品引导或抽吸到流体进口端口106，然后是管道108，并在泵机构110处于第一位置124的情况下将样品保持在管道108中，如图1A所示，这允许在采样地(例如，装配线、工厂、设施、样品桶或储罐)准备具有样品的匣100，并然后在检测或测定之前保持就绪状态。该设计的一个优势是进行样品的测定之前、样品可在匣100中保持一段时间(适当地为数分钟(例如，10-30分钟)至约1-2小时、或更长)，这样就可以提取多种不同的样品，而无样品质量下降之虞。另外，如果在取样后需要进一步的活动，则可以进行这些活动，然后在以后的时间中对样品进行分析。
如本文所述适当地为双位注射器的泵机构110可如图1D所示做好准备(即，拉出以创造真空源)，以产生真空，该真空在柱塞116驱动到第一位置124时，通过例如通过真空管道122将样品170抽吸入样品进口端口106(参见图1A)来将样品170引导入流体进口端口106和管道108。在将柱塞116驱动到第二位置126(参见图1B)时，适当地通过真空管道122的真空作用，样品170被运输到光学样品孔400。
在一些实施方式中，管道108的长度可包括从流体进口端口106的尖端112起到第一位置124中样品的位置的末端的长度，约为1cm至约5cm，更适当地为约1cm至约3cm。管道108可以包括单个通道或段，这些通道或段的长度约为0.2mm至约1.5mm，并连接到中心源点，构成管道108的全长。在其它实施方式中，管道108可为从流体进口端口106的尖端112起延伸到第一位置124中样品的位置的末端的连续单通道。例如，管道的段的长度、或管道的全长为约0.2mm至约1.0mm、约0.2mm至约0.8mm、约0.2mm至约0.7mm、约0.4mm至约0.6mm、或约0.3mm约0.4mm、约0.5mm、约0.6mm、约0.7mm、约0.8mm、约0.9mm或约1.0mm。管道108的直径或横截面宽度适当地为约0.1mm至约1mm、约0.5mm至约1mm、约0.5mm至约0.8mm、或约0.1mm、约0.2mm、约0.3、约0.4mm、约0.5mm、约0.6mm、约0.7mm或约0.8mm。采用约0.5mm的管道108横截面宽度有助于减少芯吸并防止样品损失。在一些实施方式中，如图1A所示，管道108可包括弯曲或对折图案(或其他类似的方向，可最大程度地增加管道108的长度，同时最大程度地减少表面积)，并在另一些实施方式中，管道108可从尖端112起到第一位置124中样品的位置的末端为基本上笔直的通道。在另一些实施方式中，可以存在一个以上的管道，如2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多管道。
使用长度约为0.2mm至约1mm的管道108的部分有助于减少芯吸、气穴形成和样品损失，同时准备样品以供分析，包括本文所述的装置/读取器。
可在测定和分析之前被保持在管道108中的样品尺寸适当地为约25μl至约200μl，更适当地为约50μl至约150μl、约50μl至约100μl、约50μl至约80μl、或约40μl、约50μl、约60μl、约65μl、约70μl、约75μl、约80μl、约90μl、或约100μl。
在一些实施方式中，光学样品孔104包括一个或多个样品孔表面上的干燥的组合物132。在一些实施方式中，如图1C所示，干燥的组合物132可干燥于光学样品孔104的底部136，在另一些实施方式中，干燥的组合物可干燥于光学样品孔104的顶部138、孔壁(侧边)130、和/或底部136。
光学样品孔104的尺寸以及因此适当地可由该孔保持的体积由孔的孔壁130的高度以及顶部136和底部138的直径决定。适当地，光学样品孔104将具有约100μm至约20mm的高度、更适当地为约100μm至约10mm或约100μm至约5mm，以及约100μm至约20mm的直径、更适当地为约100μm至约10mm或约100μm至约5mm。在一些实施方式中，光学样品孔104适当地持有约1μL至约5mL的样品，或约1μL至约1mL或约1μL至约500μL，约1μL至约50μL，约1μL至约20μL，约1μL至约10μL，或约1μl，约2μl，约3μl，约4μl，约5μl，约6μl，约7μl，约8μl，约9μl，约10μl，约11μl，约12μl，约13μl，约14μl，或约15μl。
在一些实施方式中，干燥的组合物132包含血细胞裂解物，其干燥于光学样品孔104上。如本文所用，“干燥的组合物”包含冷冻干燥、冻干或玻璃化的物质，以在光学孔104的表面上形成干燥的饼、粉末、晶体或膜。冻干或玻璃化的方法为本领域所公知。在示例性的实施方式中，每个光学样品孔中的干燥的组合物的量是相同的，或彼此相差约1-30％，适当地小于10％或小于5％，以提供一致量的干燥组合物，从而提供一致量的再水合组合物，如本文所述。
如本文所用，术语“血细胞裂解物”意指任何裂解物或其一部分或组分，由(i)从甲壳类或昆虫中提取和/或(ii)从宿主中提取后体外培养的血细胞(例如，变形细胞和血淋巴细胞)的溶解和/或膜通透性产生。通过与膜透化剂如Ca2+离子载体等接触而从血淋巴细胞中挤出(即，通过裂解以外的方式挤出)的血细胞细胞物质或以其他未经细胞裂解的方式而提取的血细胞细胞物质也被认为是血细胞裂解物。
示例性的血细胞裂解物是由甲壳类动物如鲎或北黄道蟹(Jonah crab)的血液制成的变形细胞裂解物。如本文所用，术语“变形细胞裂解物”理解为意指通过从来自提取自甲壳类动物(例如，鲎)的变形细胞的细胞内容物中裂解、挤压或提取而生产的任何裂解物或其部分或组分。变形细胞裂解物包含至少一个包含酶促级联反应的组分，和/或在酵母或霉菌产生的内毒素(例如，革兰氏阴性细菌内毒素)和/或葡聚糖(例如(1→3)-β-D葡聚糖)的存在下生产凝块。示例性的变形细胞裂解物可源自鲎，其包括属于鲎属(Limulus genus)的蟹(crab)、例如美洲鲎(Limulus polyphemus)，东方鲎属(Tachypleus genus)、例如方鲎(Tachypleus gigas)、中国鲎(Tachypleus tridentatus)，以及蝎鲎属(Carcinoscorpiusgenus)、例如圆尾鲎(Carcinoscorpius rotundicauda)。
鲎变形细胞裂解物(LAL)由于其灵敏度、特异性、和相对容易避免样品中可能存在的其它组分的干扰而在许多细菌内毒素试验中被用作变形细胞裂解物的选择。当LAL与含有细菌内毒素和任选的LAL底物的样品结合时，其会与样品中的内毒素反应以产生可检测的产物，如凝胶、浊度升高、或(在为合成的显色底物的情况下)有色或发光的产物。产物例如可肉眼或使用光学探测器检测。
当细菌内毒素与LAL接触，内毒素启动一系列在本领域中称为C因子途径的酶促反应，其可涉及称为C因子、B因子、和凝固酶原的三个丝氨酸蛋白酶酶原。暴露于内毒素后，作为内毒素敏感因子的C因子被激活。激活的C因子随后水解并激活B因子，然后激活的B因子激活凝固酶原以产生凝固酶。然后凝固酶水解特定位点，例如凝固蛋白原(无脊椎动物、纤维蛋白原样的可凝结蛋白)的Arg18-Thr19和Arg46-Gly47，以产生凝固素凝胶。参见例如，美国专利第5,605,806号。
用于增强针对内毒素的血细胞裂解物的灵敏度的方法例如包括但不限于老化粗血红细胞裂解物，调整pH，调整二价阳离子的浓度，调整凝固蛋白原的浓度，氯仿萃取，添加血清白蛋白、生物相容性缓冲液和/或生物洗涤剂。
例如，在一些实施方式中，用于本文所述的干燥的组合物中的血细胞裂解物可为基本上没有凝固蛋白原的澄清的血细胞裂解物。在另一个实施方式中，基本上没有凝固蛋白原的血细胞裂解物是基本上没有凝固蛋白原的LAL。在阅读本公开后，本领域技术人员将理解，不同量的凝固蛋白原的减少将导致显色测定(例如LAL测定)中的速度、灵敏度和/或间隔水平的增加。在一些实施方式中，术语“基本上没有”是指通过蛋白质染色的SDS-PAGE测量并通过Western印迹确认，相对于血细胞裂解物中的总蛋白质，血细胞裂解物具有小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％、小于2％、小于1％或小于0.5％(wt/wt)的凝固蛋白原。在一些实施方式中，术语“基本上没有”是指通过蛋白质染色的SDS-PAGE测量并通过Western印迹确认，相对于LAL中的总蛋白质，LAL具有小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％、小于2％、小于1％或小于0.5％(wt/wt)的凝固蛋白原。在一些实施方式中，术语“基本上没有”是指通过蛋白质染色的SDS-PAGE测量并通过Western印迹确认，相对于LAL中的总蛋白质，澄清的LAL具有小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％、小于2％、小于1％或小于0.5％(wt/wt)的凝固蛋白原。
在一些实施方式中，术语“基本上没有”是指通过SDS-PAGE测量并通过Western印迹确认，相对于血细胞裂解物中的总蛋白质，血细胞裂解物具有小于10％或小于5％(wt/wt)的凝固蛋白原。在一些实施方式中，术语“基本上没有”是指通过SDS-PAGE测量并通过Western印迹确认，相对于LAL中的总蛋白质，LAL具有小于10％或小于5％(wt/wt)的凝固蛋白原。在一些实施方式中，术语“基本上没有”是指通过SDS-PAGE测量并通过Western印迹确认，相对于LAL中的总蛋白质，澄清的LAL具有小于10％或小于5％(wt/wt)的凝固蛋白原。
在一些实施方式中，术语“基本上没有”是指血细胞裂解物具有浓度小于约20μg/μL、小于约15μg/μL、小于约10μg/μL、小于约5μg/μL、小于约4μg/μL、小于约3μg/μL、小于约2μg/μL、或小于约1μg/μL的凝固蛋白原。在一些实施方式中，术语“基本上没有”是指LAL具有浓度小于约20μg/μL、小于约15μg/μL、小于约10μg/μL、小于约5μg/μL、小于约4μg/μL、小于约3μg/μL、小于约2μg/μL、或小于约1μg/μL的凝固蛋白原。在一些实施方式中，术语“基本上没有”是指澄清的LAL具有浓度小于约20μg/μL、小于约15μg/μL、小于约10μg/μL、小于约5μg/μL、小于约4μg/μL、小于约3μg/μL、小于约2μg/μL、或小于约1μg/μL的凝固蛋白原。
在一些实施方式中，术语“基本上没有”是指血细胞裂解物具有浓度为20μg/μL至0.001μg/μL、15μg/μL至0.01μg/μL、10μg/μL至0.1μg/μL、5μg/μL至0.5μg/μL、4μg/μL至0.5μg/μL、3μg/μL至0.5μg/μL、2μg/μL至0.5μg/μL、或小于1μg/μL的凝固蛋白原。在一些实施方式中，术语“基本上没有”是指LAL具有浓度为20μg/μL至0.001μg/μL、15μg/μL至0.01μg/μL、10μg/μL至0.1μg/μL、5μg/μL至0.5μg/μL、4μg/μL至0.5μg/μL、3μg/μL至0.5μg/μL、2μg/μL至0.5μg/μL、或小于1μg/μL的凝固蛋白原。在一些实施方式中，术语“基本上没有”是指澄清的LAL具有浓度为20μg/μL至0.001μg/μL、15μg/μL至0.01μg/μL、10μg/μL至0.1μg/μL、5μg/μL至0.5μg/μL、4μg/μL至0.5μg/μL、3μg/μL至0.5μg/μL、2μg/μL至0.5μg/μL、或小于1μg/μL的凝固蛋白原。
在一些实施方式中，术语“基本上没有”是指血细胞裂解物具有浓度为10μg/μL至1μg/μL、5μg/μL至1μg/μL、4μg/μL至1μg/μL、3μg/μL至1μg/μL、2μg/μL至1μg/μL、或小于1μg/μL的凝固蛋白原。在一些实施方式中，术语“基本上没有”是指LAL具有浓度为10μg/μL至1μg/μL、5μg/μL至1μg/μL、4μg/μL至1μg/μL、3μg/μL至1μg/μL、2μg/μL至1μg/μL、或小于1μg/μL的凝固蛋白原。在一些实施方式中，术语“基本上没有”是指澄清的LAL具有浓度为10μg/μL至1μg/μL、5μg/μL至1μg/μL、4μg/μL至1μg/μL、3μg/μL至1μg/μL、2μg/μL至1μg/μL、或小于1μg/μL的凝固蛋白原。凝固蛋白原的浓度例如可以使用吸收光谱法、SDS-PAGE凝胶条带或Western印迹条带的定量、或任何其它已知的测定凝固蛋白原浓度的方法来确定。在一些实施方式中，“基本上没有凝固蛋白原的血细胞裂解物”或“基本上没有凝固蛋白原的LAL”或“澄清的LAL”中测定的凝固蛋白原的浓度由于其在最小检测量的误差容许量内而不能使用常规检测方法准确测定。本领域技术人员可以理解，可以使用不同的方法从血细胞裂解物例如LAL中除去凝固蛋白原。这些方法中的每一种可以在效率、纯化速率、成本和工作量方面不同，但是在本领域技术人员的知识范围内。在一些实施方式中，血细胞裂解物例如LAL基本上没有凝固蛋白原，其中组合物通过包括以下步骤的方法制成：(a)获得源自裂解的美洲鲎变形细胞的溶液；(b)合并(a)的溶液和缓冲液；(c)将来自(b)的合并物注入使用20kDa至50kDa膜滤器的连续切向流过滤(TFF)以产生渗余物；并且(d)以高于20,000×g离心来自(c)的渗余物超过25分钟以产生上清，其中所述上清是基本上没有凝固蛋白原的澄清的LAL。
在一些实施方式中，血细胞裂解物例如LAL可使用切向流过滤制造。切向流过滤(TFF)是指交叉流过滤，其中大部分进料流切向地穿过过滤器的表面，而不是进入过滤器。通过使用TFF，在过滤过程中基本上洗掉包含大部分LAL蛋白(其可污染过滤器)的渗余物，并将凝固蛋白原过滤到渗透物中。在一些实施方式中，TFF是连续过程，即，连续切向流过滤或连续TFF，而不同于分批死端过滤。在一些实施方式中，连续TFF包括以与产生渗透物相同的速率向样品中添加渗滤溶液、即水或缓冲液，因此样品体积保持恒定，同时可在过滤器中自由渗透的组分被洗去。在一些实施方式中，渗滤是切向流过滤的一种。渗滤是指通过膜或过滤器洗涤较小分子并在渗余物中留下较大分子而不最终改变体积的分级过程。渗滤体积、或DV是添加渗滤溶液前的样品体积。在一些实施方式中，在切向流过滤中使用更多的渗滤体积会导致更多的渗透物的去除。
在一些实施方式中，血细胞裂解物是澄清的鲎变形细胞裂解物。术语基本上没有凝固蛋白原的“澄清的鲎变形细胞裂解物”(或“澄清的LAL”)是指上文讨论的基本上没有凝固蛋白原的LAL，其已进一步处理以除去产生LAL混浊外观的组分。在一些实施方式中，澄清的LAL通过对基本上没有凝固蛋白原的LAL进行离心来得到。在一些实施方式中，术语“澄清的LAL”是指已经以大于1800g(即1800×重力)、大于2200g、大于2600g、大于3000g、大于3400g、大于3800g、大于4200g、大于4600g、大于5000g、大于5400g、大于5800g、大于6000g、大于6100g或大于6200g离心一段时间的LAL，所述时间足够明显地澄清LAL而没有破坏酶。在一些实施方式中，术语“澄清的LAL”是指以1800至8000g、2200g至7600g、2600g至7200g、3000g至7200g、3400g至7200g、3800g至7200g、4200g至7200g、4600g至7200g、5000g至7200g、5400g至7200g、5800g至7200g、或6100g至7200g离心一段时间的LAL，所述时间足够明显地澄清LAL而没有破坏酶。
在一些实施方式中，术语基本上没有凝固蛋白原的“澄清的鲎变形细胞裂解物”(或“澄清的LAL”)是指上文讨论的基本上没有凝固蛋白原的LAL，其通过以高于20,000×g，高于22,000×g、高于24,000×g、高于25,000×g、高于26,000×g、高于28,000×g、高于30,000×g、高于35,000×g、高于40,000×g、高于45,000×g或高于50,000×g对基本上没有凝固蛋白原的LAL进行离心，已进一步处理以除去产生LAL混浊外观的组分。在一些实施方式中，基本上没有凝固蛋白原的LAL以高于20,000-50,000×g、20,000-40,000×g、25,000-50,000×g、25,000-40,000×g、或30,000-40,000×g被离心。在一些实施方式中，基本上没有凝固蛋白原的LAL被离心大于20分钟、大于30分钟、大于40分钟或大于60分钟。在一些实施方式中，基本上没有凝固蛋白原的LAL被离心20-120分钟、20-90分钟、20-60分钟、20-40分钟或约30分钟。
在一些实施方式中，术语“澄清的LAL”是指已经离心大于3分钟、大于4分钟、大于5分钟、大于6分钟、大于7分钟、大于8分钟、大于9分钟、或大于10分钟的LAL。在一些实施方式中，术语“澄清的LAL”是指已经离心3分钟至30分钟、4分钟至25分钟、4分钟至20分钟、5分钟至15分钟或5分钟至10分钟的LAL。本领域技术人员能够理解，较低的离心速度可能需要较长的离心时间，并将相应地调整时间和/或速度以减少LAL的视觉混浊。在一些实施方式中，术语“澄清的LAL”是指以约5000g至约7000g离心约3分钟至约10分钟、或以约6120g离心5分钟的基本上没有凝固蛋白原的LAL。在一些实施方式中，通过在4℃下以2,000rpm(980g)离心来自美洲鲎(Limuluspolyphemus)的裂解的变形细胞的溶液8分钟来制备基本上没有凝固蛋白原的澄清的LAL。离心后在上清中发现澄清的LAL。在一些实施方式中，然后将所得的上清与缓冲液合并；然后对所得的上清与缓冲液的合并物进行使用30kDa膜滤器的切向流过滤以产生渗余物；并且在4℃下以5,000rpm(6120g)对渗余物离心5分钟以产生上清，其中所述上清是基本上没有凝固蛋白原的澄清的LAL。在一些实施方式中，来自美洲鲎(Limuluspolyphemus)的裂解的变形细胞的溶液是多个美洲鲎(Limulus polyphemus)的裂解的变形细胞的集合。
在一些实施方式中，干燥在光学样品孔上的血细胞裂解物获自源自美洲鲎的裂解的变形细胞的溶液。在一些实施方式中，然后将溶液与缓冲液合并；然后对所得的溶液与缓冲液的合并物进行使用20kDa至50kDa膜滤器的连续切向流过滤(TFF)以产生渗余物；并且在4℃下以高于20,000×g对渗余物离心超过25分钟以产生上清，其中所述上清是基本上没有凝固蛋白原的澄清的LAL。在一些实施方式中，裂解物来自源自美洲鲎(Limuluspolyphemus)的裂解的变形细胞或多个美洲鲎(Limulus polyphemus)的裂解的变形细胞的集合。在一些实施方式中，连续TFF包含至少四个渗滤体积(DV)。在一些实施方式中，连续TFF包含至少五个渗滤体积。在一些实施方式中，连续TFF包含至少六个渗滤体积。在一些实施方式中，连续TFF包含至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、或至少15个渗滤体积。
在一些实施方式中，通过利用本文描述的技术特征的任何组合的方法产生根据本发明的基本上没有凝固蛋白原的澄清的LAL。因此，本领域技术人员可以使用任何列出的过滤器、过滤器尺寸、过滤器流速、缓冲液、离心速度、离心温度、离心时间等以足以使LAL基本上没有凝固蛋白原。例如，在一些实施方式中，LAL(i)以高于20,000×g、高于22,000×g、高于24,000×g、高于25,000×g、高于26,000×g、高于28,000×g、高于30,000×g、高于35,000×g、高于40,000×g、高于45,000×g或高于50,000×g离心，(ii)以2℃至10℃、2℃至8℃、或4℃的温度离心，(iii)以20-120分钟、20-90分钟、20-60分钟、20-40分钟或约30分钟离心，(iv)以高于500mL/分钟、例如500mL/分钟至2000mL/分钟、800mL/分钟至1500mL/分钟、或1000mL/分钟至1200mL/分钟的流速进行TFF，(v)使用50kDa滤器、45kDa滤器、40kDa滤器、35kDa滤器、30kDa滤器、25kDa滤器、或20kDa滤器进行TFF，(vii)使用至少4个DV、至少5个DV、至少6个DV、至少7个DV、或至少8个DV进行TFF，等等。
本申请还提供血细胞裂解物，例如LAL或澄清的LAL，其中组合物通过包括以下步骤的方法制成：在4℃下以2000rpm离心来自美洲鲎(Limuluspolyphemus)的裂解的变形细胞的溶液8分钟以产生上清；将来自(a)的上清与缓冲液合并；对来自(b)的合并物进行使用30kDa膜滤器的切向流过滤以产生渗余物；和在4℃下将来自(c)的渗余物以5000rpm(例如6120g)离心5分钟以产生上清，其中所述上清是基本上没有凝固蛋白原的澄清的LAL。
在一些实施方式中，干燥在光学样品孔上的血细胞裂解物通过以下方法制造，该方法包括在2至10℃下以1000至3000rpm离心来自例如美洲鲎(Limuluspolyphemus)的裂解的变形细胞的溶液2至15分钟，产生第一上清(“第一次离心”)；将上清与缓冲液合并；使用20kDa至50kDa过滤器过滤合并物，产生渗余物；在2至10℃下以3000至7000rpm离心渗余物2至10分钟，产生第二上清(“第二次离心”)，其中所述第二上清包括澄清的血细胞裂解物例如LAL，其基本上没有凝固蛋白原。在一些实施方式中，过滤是将血细胞裂解物例如LAL进行TFF。在一些实施方式中，在TFF之前将血细胞裂解物例如LAL置于缓冲液中。在一些实施方式中，缓冲液是Tris缓冲液或MES缓冲液。在一些实施方式中，缓冲液的pH为约6.0至约9.0，或约7.0至约8.0。在一些实施方式中，第一次离心包括以2000rpm离心。在一些实施方式中，第一次离心包括离心8分钟。在一些实施方式中，第一次离心包括在4℃下离心。在一些实施方式中，第二次离心包括以5000rpm离心。在一些实施方式中，第二次离心包括离心5分钟。在一些实施方式中，第二次离心包括在4℃下离心。
在TFF中可以使用各种膜。不同孔径的过滤器可用于TFF，这取决于所得渗余物中待减少的所需蛋白质的大小。在本公开中，已知C因子、B因子、G因子和凝固酶原参与血细胞裂解物例如LAL的凝固级联反应体系，导致凝固蛋白原转化为不溶性凝固素凝胶。出于本文提供的公开的目的，可以使用任何TFF程序(和伴随的过滤器孔径，孔类型和缓冲系统)，其导致减少凝固蛋白原，并且保留C因子、B因子、G因子和凝固酶原。因此，在一些实施方式中，TFF程序使用50kDa滤器、45kDa滤器、40kDa滤器、35kDa滤器、30kDa滤器、25kDa滤器、或20kDa滤器。在一些实施方式中，使用40kDa至25kDa滤器。在一些实施方式中，膜是10至80kDa过滤器、或20至50kDa过滤器。在一些实施方式中，所述滤器是30kDa滤器。
在本文公开的方法中使用的膜可包括但不限于改性聚醚砜(mPES)，聚砜(PS)和聚醚砜(PES)。在一些实施方式中，使用改性聚醚砜(mPES)膜过滤器，采用TFF进行制备基本上没有凝固蛋白原的血细胞裂解物例如LAL。可以调节血细胞裂解物例如LAL穿过膜的流速以优化从血细胞裂解物例如LAL中去除凝固蛋白原。在一些实施方式中，TFF以200mL/分钟至800mL/分钟、300mL/分钟至600mL/分钟、或350mL/分钟至500mL/分钟的流速进行。在一些实施方式中，TFF以高于500mL/分钟，例如500mL/分钟至2000mL/分钟、800mL/分钟至1500mL/分钟、或1000mL/分钟至1200mL/分钟的流速进行。在一些实施方式中，TFF以1000mL/分钟、1100mL/分钟、1200mL/分钟、1300mL/分钟或1400mL/分钟进行。在一些实施方式中，TFF以1100mL/分钟进行。
干燥的组合物中还可包括已知可促进血细胞裂解物的凝固酶原的激活的二价金属盐、以及避免可能会使凝固酶失活的极端pH值的缓冲液。可以使用本领域已知与变形细胞裂解物系统相容的各种缓冲液和盐。典型的配方添加剂可包括但不限于NaCl(约100-300mM NaCl)、约10-100mM二价阳离子(例如，Mg2+或Ca2+)，生物相容性缓冲液例如Tris(三(羟基)氨基甲烷)，以得到约6.0至约8.0的最终pH。
另外，为了促进裂解物的干燥，可以加入各种稳定剂如糖(例如甘露醇、蔗糖、海藻糖、右旋糖酐等)以帮助冻干或玻璃化。
合成的显色底物已被用于测定由中国鲎和美洲鲎的血淋巴制备的LAL中内毒素激活的凝固酶原的水平(Iwanaga等(1978)Hemostasis 7：183-188)。在使用显色底物的LAL试验中，LAL中的凝固酶原(丝氨酸蛋白酶)被内毒素激活并在精氨酸的羧基侧切割底物的肽链，从而从底物释放显色基团，从而释放出一种可容易地通过例如分光光度法被检测的标记化合物。在LAL试验中使用合成显色底物来代替常规的LAL凝胶测试的一个优势是激活的凝固酶的量可被定量并与样品中的内毒素水平相关联。
被血细胞裂解物的凝固酶切割的任何显色底物均可用于本文所述的匣、方法和组合物。美国专利第5,310,657号，例如描述了具有式R1-A1-A2-A3-A4-B-R2的示例性显色底物，其中R1代表氢、封闭的芳族烃或酰基；A1代表选自Ile、Val或Leu的L或D-氨基酸；A2代表Glu或Asp；A3代表Ala或Cys；A4代表Arg；B代表选自酯和酰胺的键；R2代表显色或荧光基团，其通过B键共价连接至精氨酸的C-羧基末端，荧光或显色部分能够从显色底物的其余部分上裂解而产生发色团或荧光团。示例性显色底物具有乙酸酯-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA的共有序列，其中pNA表示对硝基苯胺基。美国专利第4,188,264号描述了一种肽底物，其结构由序列为R1-Gly-Arg-R2的L-氨基酸组成，其中R1代表一个N封闭的氨基酸，R2是可以通过酶促水解而释放并生成有色化合物HR2的基团。美国专利第4,510,241号公开了一种显色肽底物，与先前的底物不同之处在于，Gly部分在序列上被Ala或Cys取代。或者，显色底物可能包含荧光团，例如7-氨基-4-甲基香豆素、7-氨基-4-三氟甲基香豆素和4-甲氧基-2-萘胺。
可使用各种浓度的显色底物。在一些实施方式中，显色底物具有0.1g/l至0.5g/l、0.1g/l至0.4g/l、0.2g/l至0.4g/l、0.2g/l至0.3g/l或0.2g/l至0.25g/l的浓度。
当测试样品中的物质干扰血细胞裂解物反应时，就会抑制或增强试验。抑制作用会导致更长的反应时间，这表明与测试样品中实际存在的微生物相比，其污染程度更低。增强作用会导致更短的反应时间，这表明与测试样品中实际存在的微生物相比，其污染程度更高。
可干燥在光学样品孔上的血细胞裂解物、显色底物和/或代表微生物污染物的试剂的示例性的量在本文中描述或以其他方式由本领域普通技术人员容易地确定。在一些实施方式中，干燥的组合物包含一定量的组分，以提供约30％至50％的血细胞裂解物和10％至30％的显色底物(v/v)的比例。在一些实施方式中，干燥的组合物包含一定量的组分，以提供约35％至约45％的血细胞裂解物和15％至25％的显色底物(v/v)、或约40％的血细胞裂解物和20％的显色底物(wt/wt)的比例。在一些实施方式中，干燥的组合物包含一定量的组分，以提供约30％至50％的基本上没有凝固蛋白原的LAL和10％至30％的显色底物(v/v)的比例。在一些实施方式中，干燥的组合物包含一定量的组分，以提供约35％至约45％的基本上没有凝固蛋白原的LAL和15％至25％的显色底物、或约40％的基本上没有凝固蛋白原的LAL和20％的显色底物(wt/wt)的比例。在其它实施方式中，干燥的组合物包含一定量的组分，以提供约30％至50％的澄清的LAL和10％至30％的显色底物(v/v)的比例。在一些实施方式中，干燥的组合物包含一定量的组分，以提供约35％至约45％的澄清的LAL和15％至25％的显色底物、或约40％的澄清的LAL和20％的显色底物(wt/wt)的比例。
在一些实施方式中，干燥的组合物包含约1μg至约50μg的血细胞裂解物和约0.1μg至5μg的显色底物、约1μg至约30μg的血细胞裂解物和约0.5μg至4.0μg的显色底物、或约2μg至约20μg的血细胞裂解物和约1.0μg至约3.0μg的显色底物、或约4μg至约25μg的血细胞裂解物和约1.0μg至约2μg的显色底物。在一些实施方式中，干燥的组合物包含约1μg至约50μg的基本上没有凝固蛋白原的LAL和约0.1μg至约5μg的显色底物、或约1μg至约30μg的基本上没有凝固蛋白原的LAL和约0.5μg至约5μg的显色底物、或约2μg至约20μg的基本上没有凝固蛋白原的LAL的约1.0μg至约3.0μg的显色底物、或约1μg至约30μg的基本上没有凝固蛋白原的LAL和约1.0μg至约2.0μg的显色底物，其中显色底物是Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA。在一些实施方式中，干燥的组合物包含约4μg至约25μg的基本上没有凝固蛋白原的LAL和约1μg至约1.5μg的显色底物，其中显色底物是Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA。在一些实施方式中，干燥的组合物包含约1μg至约50μg的澄清的LAL和约0.1μg至约5μg的显色底物、或约1μg至约30μg的澄清的LAL和约0.5μg至约5μg的显色底物、或约2μg至约20μg的澄清的LAL和约1.0μg至约3.0μg的显色底物、或约1μg至约30μg的澄清的LAL和约1.0μg至约2.0μg的显色底物，其中显色底物是Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA。在一些实施方式中，干燥的组合物包含约4μg至约25μg的澄清的LAL和约1μg至约1.5μg的显色底物，其中显色底物是Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA。在一些实施方式中，微生物污染物对照为约0.1EU/ml至1EU/ml。在一些实施方式中，微生物污染物是浓度约0.1EU/ml至1EU/ml的细菌内毒素，其中使用1μl至10μl。
在合适的实施方式中，冻干以产生干燥的组合物之前，包含约10％至约60％血细胞裂解物或约20％至约50％血细胞裂解物或约30％至约40％血细胞裂解物、或约10％至约60％基本上没有凝固蛋白原的LAL或约20％至约50％基本上没有凝固蛋白原的LAL或约30％至约40％基本上没有凝固蛋白原的LAL的制剂被沉积在光学样品孔104上。在一些实施方式中，冻干以产生干燥的组合物之前，包含约10％至约60％澄清的LAL或约20％至约50％澄清的LAL或约30％至约40％澄清的LAL的制剂被沉积在光学样品孔104上。在冻干前沉积的血细胞裂解物、基本上没有凝固蛋白原的LAL制剂、或澄清的LAL制剂的体积通常为约1μL至约10μL。在另一些实施方式中，所述制剂可包括约20％至约30％、或约25％至约30％血细胞裂解物或基本上没有凝固蛋白原的LAL，沉积体积为约3μL至约10μL、或约3μL至约8μL、或约3.5μL至约7μL。在另一些实施方式中，所述制剂可包括约20％至约30％、或约25％至约30％澄清的LAL，沉积体积为约3μL至约10μL、或约3μL至约8μL、或约3.5μL至约7μL。在一些实施方式中，沉积在每个孔中的澄清的LAL的体积在孔与孔之间合适地在约10％(以体积计)之内、在孔与孔之间合适地小于约5％内进行变化。
匣100还可包括pH指示剂105、如pH试纸或其他合适的化合物或组合物，其可用于直接确定样品的pH。如图1B所示(图1A中未显示pH指示剂105，以便于观看)，在一些实施方式中，pH指示剂105与光学样品孔104直接相关联，但也可以与管道108相关联，具体取决于匣100的方向。在任一实施方式中，pH指示剂105可以容易地用于测定样品pH。匣100还可以包括一个条形码120，用于识别匣，以便于存储和自动数据收集等。
在其它实施方式中，例如如图1A-1B所示，壳体102包括四个光学样品孔，但也可以使用其它或另外数量的光学样品孔，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10等。适当地，每个光学样品孔包括含有血细胞裂解物的干燥的组合物。如本文所述，每个光学样品孔适当地进一步作为干燥的组合物的元素包含干燥在光学样品孔上的显色底物。
在一些实施方式中，四个光学样品孔中的两个进一步包含干燥在光学样品孔上的代表微生物污染物的试剂，其可以用作对照以验证本文所述方法是否正确运行，以及各种底物、裂解物等。在另一些实施方式中，壳体102可包括2个光学样品孔，其中一个样品孔用作对照且另一个用作测试孔，或可包括4、6、8、10、12、14个等，其中一部分光学样品孔(例如2、4、6、8个等)用作对照，其它光学样品孔用作测试孔。
为了验证没有抑制作用或增强作用，对照光学样品孔合适地用已知量的代表待测微生物污染物的试剂“加标”。适当地，该微生物污染物峰值会在标准曲线中最高和最低标准的微生物浓度之间，以对数为单位，在接近中点的位置产生样品中的最终的微生物浓度。例如，在标准曲线范围从50个内毒素单位(EU)/mL到0.005EU/mL的测定中，可以加标样品以包含约0.5EU/mL的最终微生物污染物浓度。在标准曲线范围从1EU/mL到0.01EU/mL的测定中，微生物污染物的峰值可得到约为0.1EU/mL的最终微生物污染物浓度。
适当地，将“加标”或已知量的代表待测微生物污染物的试剂干燥在光学样品孔上与干燥组合物不同的孔的部分或区域中。例如，如图1C所示，干燥的组合物132可在光学样品孔104的底部136，而代表微生物污染物的试剂134在光学样品孔的顶部138。
加标样品与未加标样品或测试样品进行平行测定。然后计算、比较未加标的样品中所得的微生物污染物浓度和加标样品中回收的微生物污染物。回收的微生物污染物在约25％的范围内合适地等于峰值的已知浓度。如果发现样品(或稀释液)抑制或增强了反应，则可能需要进一步稀释样品，直至克服抑制或增强作用。最初，可能希望通过测试样品的10倍稀释来筛选抑制或增强作用。
在另外的实施方式中，干燥的组合物132可包括各种其它试剂/反应物，以使得本文所述的匣可被用于其它反应。在这样的实施方式中，将样品引入包括预定量的所需反应物(例如，缓冲液、酶、稳定剂等)作为冻干或玻璃化的干燥组合物的光学样品孔104的能力为内毒素检测之外的各种其他测试机会提供了平台。
在一些实施方式中，如图2所示，壳体102包括液体不可渗透膜202，其有助于填充和保持光学样品孔104中的样品体积。如本文所用，“液体不可渗透膜”是指允许空气通过、但在很大程度上对液体而言不可渗透的基材，并且合适地不允许任何液体通过膜。这种膜的例子包括各种橡胶和聚合物，例如包括聚丙烯膜、聚四氟乙烯(PTFE)膜、其他含氟聚合物等。适当地，液体不可渗透膜202流体连通到光学样品孔104，以使得填充光学样品孔的液体样品与液体不可渗透膜接触，并在其撞击液体不可渗透膜时停止流动，并因此保持每个光学样品孔中样品的体积并使它们相同(或在相同体积的约1-10％以内)，以便可以将每个样品相互比较。
壳体102适当地由两个独立的部分(顶部302和底部304)制成，这两部分彼此机械连接以形成匣100。利用两个连接在一起的部分，允许更轻松地准备匣100的各个零件以及进行组装。例如，可以将构成管道108，流体进口端口106以及光学样品孔104的通道，微通道或管道预先成型或预先放置在顶部和/或底部，然后将它们连接在一起以形成成品匣100。用于机械连接顶部302和底部304部分的方法包括各种粘合剂或胶水、激光焊接、超声焊接机械螺钉或自安装连接器、以及带子或夹子。在其它实施方式中，机械连接可以通过两个部分之间的热熔或热粘合来进行。在一些实施方式中，壳体102的顶部302和底部304部分可以注塑成型，然后彼此热粘合或熔融粘合，从而适当地封闭管道108、光学样品孔104和流体进口端口106。在另一些实施方式中，壳体102的顶部302和底部304之一可以使用不透明塑料来制备，这减少了在测定中穿过壳体的不需要的光，从而减少了串扰。
在另外的实施方式中，本文提供了用于确定样品中微生物污染物存在与否和/或量的匣。匣100适当地包括具有第一和第二光学样品孔104、流体进口端口106、和流体连通流体进口端口与第一和第二光学样品孔的管道108的壳体102。
所述匣还适当地包括附接至壳体102并流体连通流体进口端口106与管道108的双位注射器。如本文所述，在一些实施方式中，第一位置造成真空以引导样品进入流体进口端口106和管道108，并且第二位置提供从管道108至光学样品孔104的运输。匣中还包括干燥的组合物132，其包括干燥在每个光学样品孔上的血细胞裂解物(合适地为鲎变形细胞裂解物)和显色底物，以及干燥在第二光学样品孔上的代表微生物污染物的试剂。
在一些实施方式中，壳体102包括四个光学样品孔，每个包括干燥在光学样品孔上的干燥的组合物，并且四个光学样品孔中的两个包含干燥在光学样品孔上的代表微生物污染物的试剂。如本文所述，这两个光学样品孔包括微生物污染物(例如，细菌内毒素)的“加标”，以用作确定微生物污染物的存在和/或量的对照。
如本文所述，在一些实施方式中，壳体102包括流体连通到每个光学样品孔的液体不可渗透膜202。液体不可渗透膜202提供了停止填充在光学样品孔中的样品流动的机制，从而保持每个光学样品孔的样品的体积，使它们相同(或在相同体积的约1-10％以内)，以便可以将每个样品相互比较。如全文所述，适当地，壳体202包括顶部302和底部304，其彼此机械连接以形成匣。
本文还提供了用于检测样品中微生物污染物的存在的方法。在一些实施方式中，所述方法适当地包括引导样品进入本文所述的匣的流体进口端口。例如，如图1D所示，样品170可被保存在容器中、或者可以直接从反应过程或批次或药物溶液中提取。适当地，通过泵机构110(适当地为双位注射器)造成真空，由样品引入方向114引入样品170，以引导样品进入流体进口端口。在该初始过程中，样品也被适当地通过泵机构产生的真空传输到管道108，例如通过将双位注射器放置在第一位置124中。如图1A所示，样品170被传输至管道108，这样，它几乎可以将整个管道108填充到初始位置，但不会开始填充光学样品孔104。
然后，置于第二位置126的泵机构(适当地为双位注射器)将样品170从管道108传输至光学样品孔104，如图1B所示。如本文所述，样品的运输被流体连通到光学样品孔的液体不可渗透膜202停止。如本文所述，停止运输使得每个光学样品孔填充了基本相等的体积(使得体积在彼此的大约10％之内变化，适当地大约5％或大约1％)，以使得光学样品孔之间允许比较。
所述方法还包括测定光学样品孔中的样品的光学性质。在检测微生物污染物存在与否的方法中，光学性质的变化指示样品中的微生物污染物存在与否。
如本文所述，光学性质合适地是样品在预先选择的光波长下的吸光度，而光学性质的变化是吸光度的变化。所测定的光学性质可以是特定波长处的吸光度、特定波长处的透射率、特定波长处的荧光或光密度的变化(例如，增加或减少)。例如，光学性质可以是在约200nm至约700nm的范围内的波长处的吸光度或透射率的变化，并且更合适地在约350nm至约450nm的范围内、或约400nm至约410nm的范围内、或约405nm。
图5A示出了根据本文描述的实施方式的另外的匣100配置。如本文所述，壳体102适当地由两个独立的部分(顶部302和底部304)制成，这两部分彼此连接以形成匣100。匣100的底部304包括光学样品孔104的底部136，其中干燥了干燥的组合物132。顶部302包括形成孔壁130的开口，而上板502(适当地为由聚苯乙烯或其他聚合物材料制成的透明聚合物元件)包括样品孔104的顶部138，其中，代表微生物污染物的试剂134干燥在顶部138(参见图1C中的配置)。
适当地邻近样品孔104的顶部302包括凹进部分506，液体不可渗透的膜202可以坐入该凹进部分中，并与样品孔104流体连通，以便在孔从管道108填充时阻止液体流入样品孔104，如本文所述。(参见图5C，在该实施方式的匣100中管道108的位置以及样品孔104的方向适当地与匣100的主轴对齐。参见图3，样品孔104的另一种方向垂直于匣的主轴。)还包括硅胶背衬504，当将上板502添加到匣中时，该硅胶背衬可提供额外的密封和集成。图5B示出了匣100的组装图，其中上板502的位置密封在匣100的底部304上，并且坐入顶部302内。
图5A显示了流体进口端口106以及泵机构110的位置，其中包括直接集成在匣100顶部302上的筒118，可以在其中插入柱塞116(参见图5B，其中显示了将柱塞116插入到筒118中)。
图5D示出了根据本文描述的实施方式的又一的匣100配置。如本文所述，壳体102适当地由两个独立的部分(顶部302和底部304)制成，这两部分彼此连接以形成匣100。匣100的底部304包括光学样品孔104的底部136，其中干燥了干燥的组合物132。顶部302包括形成孔壁130的开口，而上板502(适当地为由聚苯乙烯或其他聚合物材料制成的透明聚合物元件)包括样品孔104的顶部138，其中，代表微生物污染物的试剂134干燥在顶部138(参见图1C中的配置)。
适当地邻近样品孔104的顶部302还可以包括一个凹进部分506。在一些实施方式中，利用液体不可渗透膜(以各个不渗透膜520的形式)并流体连通到样品孔104，以便在孔从管道108填充时阻止液体流入样品孔104，如本文所述。(参见图5C，在这样的实施方式的匣100中管道108的位置以及样品孔104的方向适当地与匣100的主轴对齐。参见图3，样品孔104的另一种方向垂直于匣的主轴。)使用例如以2-10个、合适地为4个圆形或类似形状的盘的形式的单个不可渗透膜520作为可以被单独地压入孔壁130中的液体不可渗透膜，提供了紧密配合和对液体流动的良好控制。各个不可渗透膜合适地为聚四氟乙烯(PTFE)膜，其尺寸为直径约数毫米，厚度约数毫米，适当地为厚度约1mm×直径约2mm。
如本文所述，用于密封匣100的顶部302和底部304的示例性机制包括激光焊接和超声波焊接。如图5A所示，顶部302适当地由聚合材料如聚苯乙烯制成，其中包含少量(例如0.5-10重量％，适当地2-5重量％)的炭黑。顶部302中包含炭黑，可以将顶部302激光焊接到底部304，底部304适当地是透明聚合材料，例如聚苯乙烯。进行激光焊接的方法在本领域中是已知的，例如，如在Klien，“塑料的激光焊接(Laser Welding of Plastics)”，Wiley-VCH，德国(2012)中所公开的，其全部内容通过引用纳入本文。激光焊接的使用减少了与液体不可渗透膜的热致降解有关的担忧，无论是单个膜202还是单个不可渗透膜520。
超声焊接的方法在本领域中是公知的，例如，如Shoh，“通过超声焊接热塑性塑料(Welding of thermoplastics by ultrasound)”，Ultrasonics 14：209-217(1976)中所公开的，其全部内容通过引用纳入本文。超声焊接的使用减少了与液体不可渗透膜的热致降解有关的担忧，无论是膜202还是单个不可渗透膜520。
在示例性的实施方式中，在光学样品孔104中包含样品的本文所述的匣可被插入测定装置或读取装置602，如图6A所示。应当注意，图6A中的读取装置602仅用于说明目的，并不限制本发明的范围，包括本文所述的匣如何读取或分析。
在合适的实施方式中，匣100被插入到读取装置602(或本文所述的其它读取装置)中，并由安装装置400保持，例如如图4A所示(420代表读取装置602内部，422代表读取装置602外部)。安装装置400可以包括各种组件，如基座402、下部加热器404、上部加热器406和安装架408。安装架408可以是各种可移动部分、运动学安装架、斜面(例如，斜面/支撑平台410)、销、弹簧或活塞，可以插入匣100，同时可以控制6个自由度的移动，然后固定在适当位置进行分析和测定。例如，球形螺丝可以用作安装架408，并在在匣100的表面上模制或以其他方式提供的圆锥形、凹槽或平坦特征，从而当匣被插入读取装置602中时，其会以精确且可重复的定位移动。
另一个实施方式示于图4B-4F，示出了可以在图6A或6C、或者如本文另外描述的读取装置中使用的另一安装装置450。图4B-4D显示了安装装置450的剖视图，并在每个图中添加了其他组件。可以通过斜面454(参见图4B)或滑动机构将匣100提升到安装销、例如安装销452上，以使安装销452然后穿过匣中的对齐孔(未图示)将匣固定到位。这种可重复的定位对于确保通过读取装置602的内部组件(包括各种光学组件和光源)以及读取器(例如光电二极管)的准确读数非常重要。如图4C所示，安装装置450可以包括弹簧板456，使得在将匣100插入安装装置450之后，弹簧板456可以将匣保持在适当的位置。弹簧板456还可以包括遮光罩458，以覆盖样品孔104的位置。安装装置450还适当地还包括盖460，如果需要，该盖可以用作加热设备，并将安装装置450的其余部件保持在一起。
图4E示出了在斜面454上滑之前并且在与安装销452啮合或就位之前安装装置450的横截面和匣100的位置。可以看到弹簧板456的遮光罩458的部分在安装装置顶部上方延伸，随着弹簧板456向上移动以允许插入匣100。到达斜面454的末端时，匣掉落/接合到安装销452上，以将匣固定在位置100(参见图4F)。弹簧板456也下降以为安装装置450中的匣100提供进一步的稳定性。由于安装销452与盒中的对准孔啮合，因此不再可见。
如图所示，安装装置400适当地包括下部加热器404和上部加热器406，它们为光学样品孔提供加热并将样品加热至合适的温度，以使本文所述的酶促反应发生。通常，用于优化样品与血细胞裂解物之间反应的温度为约25℃至约40℃，或约30℃至约40℃。样品的加热时间通常为约10-30分钟，以使反应发生并测量和记录样品的光学性质。
安装装置，包括安装架408，在确定样品的光学性质之前还可用于摇动或混合光学样品孔104中的样品。流体流、包括湍流可用于促进光学样品孔104中样品的混合。在其它实施方式中，超声发生器、真空装置、或其它装置也可用于提供对样品的搅拌以帮助混合。
图6B示出了插入到读取装置602中的匣100的图示，使得可以进行样品的光学性质的确定。如图所示，读取装置602是适当的手持式或随身携带装置，可将其带入各种实验室或临床环境中，并通过简单的触摸屏命令轻松进行操作和控制。
图6C示出了插入到另外的读取装置604中的匣100的图示，使得可以进行样品的光学性质的确定。如图所示，另外的读取装置604是适当的手持式或随身携带装置，可将其带入各种实验室或临床环境中，并通过简单的触摸屏命令轻松进行操作和控制。另外的读取装置604可以容纳整个长度的匣100的插入，从而在测定之前将匣完全包含在读取装置中。尺寸为示例性的，以毫米为单位。如图所示，适当地执行盒100的插入，使得首先插入盒的包含样品孔的部分，并且因此将其完全容纳在装置内。这种插入方向还有助于将双位置的注射器移入第二位置，以提供从管道108到光学样品孔104的运输。
图7示出了读取装置602(或另外的读取装置604)的示例性组件，其可被用于样品光学性质的测定。在一些实施方式中，读取装置602/604可包括光源702，适当地为LED光源，其能够产生约350nm至约450nm、或约400nm至约410nm、或约405nm的波长的光。读取装置602/604中还包括光面板704(例如光导、镜子、棱镜等)，该光面板704为每个光学样品孔104提供照明，以提供信号通道708，可以由检测器710读取，适当地为一个光电二极管阵列。提供另一个参考通道706作为对照，以确定是否提供了正确的光强度和波长。如图所示，匣100位于为匣100提供加热的上部加热器406和下部加热器404之间，适当地加热至约25℃至约40℃，以促进酶促反应。示例性加热器可以由聚酰亚胺的柔性薄膜(例如DUPONT
Figure BDA0002341338480000291
)和硅橡胶制成。信号通道708和检测器710的方向取决于盒100中样品孔104的方向。
读取装置602/604的各种其他组件，例如用于进行吸光度的确定和/或定量的计算机电路，在本领域中是众所周知的，并且可以很容易地集成到这种装置中。
将匣100插入到读取装置602/604中时，可通过上部加热器406和下部加热器404进行加热，以促进所需的酶促反应。来自光源702的光通过包含样品的光学样品孔104提供，并且在检测器710(适当地是光电二极管)处读取吸光度。然后比较各种光学样品孔的吸光度，并适当地以一个或多个光学样品孔的吸光度作对照，其中包含一种微生物污染物。样品中内毒素的存在和/或量例如可以通过将样品中的含量与对照中的含量与标准校准曲线进行比较来确定。普通技术人员可以使用已知量的内毒素吸光度轻松地制备此类标准校准曲线。在其他实施方式中，读取装置602/604也可以提供存档(即，最初在读取装置602或另外的读取装置604上维护并提供)的或预定的标准曲线，操作员可以使用它们确定测试样品中内毒素的量。可以为各种内毒素提供此类存档或预定的标准曲线，并可以根据用户的需要进行更新，例如，从维护数据库中下载标准曲线等。如图6A-6C所示，可将多个匣100插入读取装置602或另外的读取装置604中并同时读取，从而可以同时确定许多不同样品中微生物的存在与否和/或数量。
对于相关领域的普通技术人员来说显而易见的是，在不脱离任何实施例的范围的情况下，可以对这里描述的方法和应用进行其他合适的修改和调整。
应当理解，虽然本文已说明和描述了某些实施例，但权利要求不限于所描述和示出的部件的特定形式或布置。在说明书中，已经公开了说明性实施例，并且虽然采用了特定术语，但它们仅用于一般性和描述性意义，而不是用于限制的目的。根据上述教导，实施方式的修改和变化是可能的。因此，应该理解，实施方式可以不同于具体描述的方式实施。
本说明书中提到的所有发表物、专利和专利申请通过引用纳入本文，就好像将各篇单独的发表物、专利或专利申请专门和单独地通过引用纳入本文那样。

Claims (28)

1.用于检测样品中的微生物污染物存在与否和/或量的匣，所述匣包括：
a.壳体，所述壳体包括光学样品孔、流体进口端口、和流体连通流体进口端口与光学样品孔的管道；
b.泵机构，其与壳体相关联、且流体连通到流体进口端口和管道；和
c.包含干燥在光学样品孔上的血细胞裂解物的干燥的组合物。
2.如项目1所述的匣，所述匣还包括：
a.干燥在光学样品孔上的显色底物，和/或
b.干燥在光学样品孔上的代表微生物污染物的试剂。
3.如项目1或2所述的匣，其中，所述壳体包括四个光学样品孔，每个包括包含血细胞裂解物的干燥的组合物且还包含干燥在光学样品孔上的显色底物，并且其中四个光学样品孔中的两个还包含干燥在光学样品孔上的代表微生物污染物的试剂。
4.如项目1～3中任一项所述的匣，其中，所述壳体包括流体连通到光学样品孔的液体不可渗透膜。
5.如项目1～4中任一项所述的匣，其中，所述壳体包括彼此机械连接的顶部和底部。
6.如项目1～5中任一项所述的匣，其中，所述泵机构是双位注射器，其中第一位置造成真空以引导样品进入流体进口端口和管道，且第二位置提供从管道至光学样品孔的传输。
7.如项目1～6中任一项所述的匣，其中，所述血细胞裂解物是鲎变形细胞裂解物。
8.如项目1～6中任一项所述的匣，其中，所述血细胞裂解物是中国鲎(Tachypleus)变形细胞裂解物或圆尾鲎(Carcinoscorpius)变形细胞裂解物。
9.如项目2～8中任一项所述的匣，其中所述代表微生物污染物的试剂是细菌内毒素。
10.用于检测样品中的微生物污染物存在与否和/或量的匣，所述匣包括：
a.壳体，其包括第一光学样品孔和第二光学样品孔、流体进口端口和管道，所述管道流体连通流体进口端口与第一光学样品孔和第二光学样品孔；
b.双位注射器，其附接至壳体且流体连通到流体进口端口和管道，其中第一位置造成真空以引导样品进入流体进口端口和管道，且第二位置提供从管道至第一光学样品孔和第二光学样品孔的传输；
c.干燥的组合物，其包括干燥在第一光学样品孔和第二光学样品孔中的每个上的血细胞裂解物和显色底物；和
d.干燥在第二光学样品孔上的代表微生物污染物的试剂。
11.如项目10所述的匣，其中，所述壳体包括四个光学样品孔，每个包括干燥在光学样品孔上的干燥的组合物，并且其中四个光学样品孔中的两个包含干燥在光学样品孔上的代表微生物污染物的试剂。
12.如项目10或11所述的匣，其中，所述壳体包括流体连通到光学样品孔的液体不可渗透膜。
13.如项目10～12中任一项所述的匣，其中，所述壳体包括彼此机械连接的顶部和底部。
14.如项目10～13中任一项所述的匣，其中，所述血细胞裂解物是鲎变形细胞裂解物。
15.如项目10～13中任一项所述的匣，其中，所述血细胞裂解物是中国鲎(Tachypleus)变形细胞裂解物或圆尾鲎(Carcinoscorpius)变形细胞裂解物。
16.如项目15所述的匣，其中所述代表微生物污染物的试剂是细菌内毒素。
17.一种用于检测样品中的微生物污染物存在与否的方法，所述方法包括：
a.引导样品进入项目1～9的匣的流体进口端口并将样品传输至管道；
b.将样品从管道传输到光学样品孔；和
c.测定多个光学样品孔中的样品的光学性质，其中光学性质的变化指示样品中的微生物污染物存在与否。
18.如项目17所述的方法，其中，测定光学性质是指在预选的波长下光的吸光度的变化。
19.如项目18所述的方法，其中，将预选的波长下光的吸光度的变化与标准曲线进行比较。
20.如项目19所述的方法，其中，所述标准曲线是存档标准曲线。
21.如项目17～20中任一项所述的方法，其中，引导样品包括通过泵机构造成真空以将样品引导到流体进口端口和管道内。
22.如项目17～21中任一项所述的方法，其中，传输包括通过泵机构将样品从管道运输到光学样品孔，并且其中运输被流体连通到光学样品孔的液体不可渗透膜停止。
23.一种用于检测样品中的微生物污染物存在与否的方法，所述方法包括：
a.引导样品进入项目10～16的匣的流体进口端口并将样品传输至管道；
b.将样品从管道传输到光学样品孔；和
c.测定多个光学样品孔中的样品的光学性质，其中光学性质的变化指示样品中的微生物污染物存在与否。
24.如项目23所述的方法，其中，测定光学性质是指在预选的波长下光的吸光度的变化。
25.如项目24所述的方法，其中，将预选的波长下光的吸光度的变化与标准曲线进行比较。
26.如项目25所述的方法，其中，所述标准曲线是存档标准曲线。
27.如项目23～26中任一项所述的方法，其中，引导样品包括通过双位注射器造成真空以将样品引导到流体进口端口和管道内。
28.如项目23～27中任一项所述的方法，其中，传输包括通过双位注射器将样品从管道运输到光学样品孔，并且其中运输被流体连通到光学样品孔的液体不可渗透膜停止，以使得每个样品孔中样品的最终体积变化少于约10％。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018026941A1 (en) 2016-08-03 2018-02-08 Lonza Walkersville, Inc. Method of detecting an endotoxin using limulus amebocyte lysate substantially free of coagulogen
CN110192110B (zh) 2017-01-11 2023-01-10 隆萨沃克斯维尔股份有限公司 无凝固蛋白原的澄清的鲎阿米巴样细胞裂解物
KR20220045023A (ko) * 2019-08-21 2022-04-12 론자 워커스빌 아이엔씨. 엔도톡신 검출을 위한 혼합 구역을 가지는 카트리지

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5731212A (en) * 1994-12-20 1998-03-24 International Technidyne Corporation Test apparatus and method for testing cuvette accommodated samples
US20040241788A1 (en) * 2003-03-17 2004-12-02 Charles River Laboratories, Inc. Methods and compositions for the detection of microbial contaminants
US20060183181A1 (en) * 2004-12-02 2006-08-17 Wainwright Norman R Methods and compositions for the detection and/or quantification of gram positive bacterial contaminants
WO2017027838A1 (en) * 2015-08-13 2017-02-16 President And Fellows Of Harvard College Microfluidic devices and systems for cell culture and/or assay

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5415797A (en) 1977-06-14 1979-02-05 Seikagaku Kogyo Co Ltd Detection and measurement of toxin in cells
US4510241A (en) 1981-09-03 1985-04-09 Mallinckrodt, Inc. Peptide-type substrates useful in the quantitative determination of endotoxin
ES2098256T3 (es) 1989-10-30 1997-05-01 Biowhittaker Inc Ensayo cinetico para la endotoxina utilizando lisado amebocitico de limulus y sustrato cromogenico.
DE69129365T2 (de) 1990-08-22 1998-10-08 Seikagaku Kogyo K K Seikagaku Testagens für endotoxin
US5578455A (en) * 1993-03-19 1996-11-26 Tanabe Seiyaku Co., Ltd. Method for determining endotoxin and apparatus therefor
US6451610B1 (en) * 1999-04-14 2002-09-17 International Technidyne Corporation Method and apparatus for coagulation based assays
DE602006004553D1 (de) * 2005-01-13 2009-02-12 Charles River Lab Inc Verfahren zur klassifizierung von mikroben in einer biologischen probe
JP5881936B2 (ja) * 2009-04-20 2016-03-09 ソニー株式会社 試料溶液導入キット及び試料溶液注入器
KR101193566B1 (ko) * 2011-08-10 2012-10-22 고려대학교 산학협력단 마이크로칩 기반 혈소판 복합기능 검사 장치

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5731212A (en) * 1994-12-20 1998-03-24 International Technidyne Corporation Test apparatus and method for testing cuvette accommodated samples
US20040241788A1 (en) * 2003-03-17 2004-12-02 Charles River Laboratories, Inc. Methods and compositions for the detection of microbial contaminants
US20060183181A1 (en) * 2004-12-02 2006-08-17 Wainwright Norman R Methods and compositions for the detection and/or quantification of gram positive bacterial contaminants
WO2017027838A1 (en) * 2015-08-13 2017-02-16 President And Fellows Of Harvard College Microfluidic devices and systems for cell culture and/or assay

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