CN110859971B - 一种携ir-780的靶向声释氧纳米微聚体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种携IR‑780的靶向声释氧纳米微聚体及其制备方法和应用，以纳米微泡为载体，以O2为内核，以IR‑780碘化物为声敏剂，制备携IR‑780的靶向声释氧纳米微聚体，使其具有声动力治疗和超声‑荧光多模态成像的多重功能。通过超声靶向微泡破坏技术(UTMD)介导氧气靶向投递，造成组织局部富氧环境，促进SDT诱导ROS产生，提高声动力治疗效能，还可进行实时监控，实现肝癌的靶向声动力治疗的可视化、精确化和高效性，为肝癌热消融治疗提供一种新手段。
Description
技术领域
本发明涉及一种携IR-780的靶向声释氧纳米微聚体及其制备方法和应用，特别涉及一种基于IR-780碘化物、且具备超声-荧光双模态成像功能的肝癌靶向声释氧微聚体治疗剂及其制备方法和应用。
背景技术
肝癌是威胁人类健康的一大杀手，被称为“癌中之王”。发病率呈逐年上升趋势，据统计，每年全球肝癌发病率位居恶性肿瘤发病率的第五位，约55％发生在中国，而其平均生存时间仅为6-16个月。目前肝癌以手术治疗为主，但只有9％-29％的患者能够手术切除。
热消融是治疗肝癌的一种重要手段，声动力治疗(Sonodynamic therapy，SDT)作为一种非侵入性热消融技术，是一种治疗肿瘤的新疗法，可实现癌细胞的选择性杀伤，降低对正常细胞和组织的损伤。与传统光动力治疗中使用的激光或微波相比，超声具有适当的组织衰减系数、可聚焦性、穿透性和照射部位的选择性，对治疗肿瘤特别是深部有较强的靶向性和安全性。声动力治疗通过诱导声敏剂产生大量氧自由基，从而降低线粒体膜电位从而影响许多重要的细胞内生理作用，最终达到诱导细胞凋亡的目的。因此，选择一种安全、高效的声敏剂、以及改善肿瘤缺氧微环境是提高声动力治疗效能的两个关键因素。
IR-780碘化物是脂溶性的阳离子七甲川菁染料，对近红外光有很强的吸收。IR-780不需要与肿瘤特异性分子连接，自身即可选择性地高效蓄积在肿瘤细胞的线粒体中，在低频低强度超声的辐照下，可在线粒体内产生氧自由基，降低线粒体膜电位从而精准杀伤肿瘤细胞。鉴于IR-780具备以上独特优势，本发明将其作为声敏剂，实现SDT的精准治疗，进一步提高治疗效能。
微泡既可以作为超声显像的造影剂，又可以作为药物或基因的载体，实现药物和基因的靶向递送，是一种无创性、具有组织和器官特异性的药物运载工具。低频超声靶向照射特定区域内的微泡，可使之破坏、爆破，释放其携带的药物或基因，使局部药物或基因含量增多。本发明使微泡包裹氧气内核，通过低频低强度超声辐照使其爆破释放氧气，造成组织局部富氧环境，促进SDT诱导活性氧(Reactive oxygen species，ROS)产生，提高声动力治疗效能。
发明内容
本发明以O2为内核，以IR-780碘化物为声敏剂，以磷脂为原料，制备携IR-780的靶向声释氧纳米微聚体(IR-780@O2NP)，使其具有声动力治疗和超声-近红外荧光成像双重功能，可用于制备肝癌靶向声动力治疗剂。联合低频低强度超声辐照介导IR-780的靶向递送、靶向释放，利用空化效应和声孔效应进一步促进IR-780进入肿瘤组织和细胞内部，在局部富氧环境的条件下，提高声动力治疗能效，以实现肝癌声动力治疗的可视化、精准化和高效性。
具体地，本发明提供一种携IR-780的靶向声释氧纳米微聚体，由以下步骤制备得到：
(1)载氧纳米微泡的制备
(1.1)精密称取15-20mg二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、0.7-1.5mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)和0.7-1.5mg生物素化二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000-Biotin)置于装有5-20ml体积比为1：2-4甲醇与二氯甲烷混合物的圆底烧瓶中，室温下搅拌充分至其完全溶解；
(1.2)使用旋转蒸发仪蒸干有机溶剂，再使用去离子水离心洗涤3次，去除残留的二氯甲烷与甲醇及其他杂质，制备磷脂薄膜；
(1.3)向圆底烧瓶中加入5ml去离子水，45-60℃水浴3分钟，之后使用超声分散均质仪乳化5分钟，使之形成磷脂乳化液；
(1.4)将步骤1.3得到的磷脂乳化液装入真空密封瓶中，充入过量医用氧气，使用超声震荡仪震荡1分钟，静置，收集上层浮集微泡，再使用去离子水离心洗涤3次，除去过量的磷脂混合物与其他杂质，得到载氧纳米微泡溶液，4℃保存备用；
(2)经生物素化聚乙二醇2000修饰的IR-780碘化物的制备
(2.1)精密称取25-35mg IR-780碘化物溶于1ml二甲基亚砜(DMSO)中；
(2.2)精密称取35-60mg的生物素化聚乙二醇2000(PEG2000-Biotin)，溶于5-20ml体积比为1：2-4甲醇与二氯甲烷混合物中；
(2.3)将步骤2.1得到的IR-780碘化物溶液与步骤2.2得到的生物素化聚乙二醇2000溶液混合，使用超声分散均质仪乳化20-30分钟，使其螯合成淡绿色乳化液，再向乳化液中加入20ml去离子水，45-60℃水浴10分钟，再使用去离子水洗涤离心3次，得到经生物素化聚乙二醇2000修饰的IR-780碘化物溶液，4℃保存备用；
(3)携IR-780的靶向声释氧纳米微聚体(IR-780@O2NP)的制备
(3.1)将步骤1得到的载氧纳米微泡溶液置于含有200nm滤膜的磷脂挤压器中，反复挤压20次以上，使其变为澄清状；
(3.2)向步骤3.1得到的载氧纳米微泡溶液中加入过量亲和素，室温孵育1小时，之后逐滴加入过量的由步骤2得到的经生物素化聚乙二醇2000修饰的IR-780碘化物溶液，轻微吹打使其混匀，室温下涡旋30min；
(3.3)使用去离子水离心洗涤，清除残留的亲和素和IR-780碘化物，吸取上层淡绿色纳米微泡，得到携IR-780的靶向声释氧纳米微聚体溶液；
(3.4)将步骤3.2得到的携IR-780的靶向声释氧纳米微聚体溶液置于真空冷冻干燥机中冻干至粉末状，收集携IR-780的靶向声释氧纳米微聚体冻干粉，充入医用纯氧气体，将其密封置于4℃冰箱中保存。
优选的，步骤(1.1)中所述二硬脂酰磷脂酰胆碱的用量为18mg。
优选的，步骤(1.1)中所述二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000的用量为1mg。
优选的，步骤(1.1)中所述生物素化二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000的用量为1mg。
优选的，步骤(1.1)中所述甲醇与二氯甲烷混合物的用量为15ml，甲醇与二氯甲烷的体积比为1：2。
优选的，步骤(1.3)中所述的水浴温度为60℃。
优选的，步骤(2.1)中所述IR-780碘化物的用量为32mg。
优选的，步骤(2.2)中所述生物素化聚乙二醇2000的用量为50mg。
优选的，步骤(2.2)中所述甲醇与二氯甲烷混合物的用量为15ml，甲醇与二氯甲烷的体积比为1：2。
优选的，步骤(2.3)中所述的乳化时间为30分钟。
优选的，步骤(2.3)中所述的水浴温度为60℃。
本发明还提供了制备所述携IR-780的靶向声释氧纳米微聚体的制备方法，包括以下步骤：
(1)载氧纳米微泡的制备
(1.1)精密称取15-20mg二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、0.7-1.5mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)和0.7-1.5mg生物素化二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000-Biotin)置于装有5-20ml体积比为1：2-4甲醇与二氯甲烷混合物的圆底烧瓶中，室温下搅拌充分至其完全溶解；
(1.2)使用旋转蒸发仪蒸干有机溶剂，再使用去离子水离心洗涤3次，去除残留的二氯甲烷与甲醇及其他杂质，制备磷脂薄膜；
(1.3)向圆底烧瓶中加入5ml去离子水，45-60℃水浴3分钟，之后使用超声分散均质仪乳化5分钟，使之形成磷脂乳化液；
(1.4)将步骤1.3得到的磷脂乳化液装入真空密封瓶中，充入过量医用氧气，使用超声震荡仪震荡1分钟，静置，收集上层浮集微泡，再使用去离子水离心洗涤3次，除去过量的磷脂混合物与其他杂质，得到载氧纳米微泡溶液，4℃保存备用；
(2)经生物素化聚乙二醇2000修饰的IR-780碘化物的制备
(2.1)精密称取25-35mg IR-780碘化物溶于1ml二甲基亚砜(DMSO)中；
(2.2)精密称取35-60mg的生物素化聚乙二醇2000(PEG2000-Biotin)，溶于5-20ml体积比1：2-4甲醇与二氯甲烷混合物中；
(2.3)将步骤2.1得到的IR-780碘化物溶液与步骤2.2得到的生物素化聚乙二醇2000溶液混合，使用超声分散均质仪乳化20-30分钟，使其螯合成淡绿色乳化液，再向乳化液中加入20ml去离子水，45-60℃水浴10分钟，再使用去离子水洗涤离心3次，得到经生物素化聚乙二醇2000修饰的IR-780碘化物溶液，4℃保存备用；
(3)携IR-780的靶向声释氧纳米微聚体(IR-780@O2NP)的制备
(3.1)将步骤1得到的载氧纳米微泡溶液置于含有200nm滤膜的磷脂挤压器中，反复挤压20次以上，使其变为澄清状；
(3.2)向步骤3.1得到的载氧纳米微泡溶液中加入过量亲和素，室温孵育1小时，之后逐滴加入过量的由步骤2得到的经生物素化聚乙二醇2000修饰的IR-780碘化物溶液，轻微吹打使其混匀，室温下涡旋30min；
(3.3)使用去离子水离心洗涤，清除残留的亲和素和IR-780碘化物，吸取上层淡绿色纳米微泡，得到携IR-780的靶向声释氧纳米微聚体溶液；
(3.4)将步骤3.2得到的携IR-780的靶向声释氧纳米微聚体溶液置于真空冷冻干燥机中冻干至粉末状，收集携IR-780的靶向声释氧纳米微聚体冻干粉，充入医用纯氧气体，将其密封置于4℃冰箱中保存。
优选的，步骤(1.1)中所述二硬脂酰磷脂酰胆碱的用量为18mg。
优选的，步骤(1.1)中所述二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000的用量为1mg。
优选的，步骤(1.1)中所述生物素化二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000的用量为1mg。
优选的，步骤(1.1)中所述甲醇与二氯甲烷混合物的用量为15ml，甲醇与二氯甲烷的体积比为1：2。
优选的，步骤(1.3)中所述的水浴温度为60℃。
优选的，步骤(2.1)中所述IR-780碘化物的用量为32mg。
优选的，步骤(2.2)中所述生物素化聚乙二醇2000的用量为50mg。
优选的，步骤(2.2)中所述甲醇与二氯甲烷混合物的用量为15ml，甲醇与二氯甲烷的体积比为1：2。
优选的，步骤(2.3)中所述的乳化时间为30分钟。
优选的，步骤(2.3)中所述的水浴温度为60℃。
本发明还提供了所述的携IR-780的靶向声释氧纳米微聚体在制备肝癌靶向声动力治疗剂中的应用。
相较于现有技术，本发明的有益效果在于：
IR-780碘化物其最大吸收波长在780nm，由于其具有强荧光、良好的稳定性及嗜肿瘤性，可作为理想的肿瘤活体成像的荧光探针，而且进入生物体后，可高效富集在肿瘤组织内部，荧光信号可保持较长时间(超过20天)，而存在于血液循环中的化合物在短期内可被机体完全排出体外。并且，IR-780碘化物不仅可以作为理想的声动力介导剂，还可以作为荧光示踪剂用于声动力疗效的分子影像学评价。
此外，本发明设计制备包裹O2的纳米微聚体，通过声动力控制纳米微聚体在HCC肿瘤周围释放O2，改善肿瘤缺氧微环境，提高声动力诱导ROS产生的能力。同时利用低频低强度超声联合含氧靶向纳米微聚体，提高肿瘤微环境含氧量的同时，对声敏剂进行精准靶向递送，实现肝癌的精准声动力治疗。
总体而言，本发明以纳米微泡为载体，以O2为内核，以IR-780碘化物为声敏剂，制备携IR-780的靶向声释氧纳米微聚体，使其具有声动力治疗和超声-荧光多模态成像的多重功能。通过超声靶向微泡破坏技术(UTMD)介导氧气靶向投递，造成组织局部富氧环境，促进SDT诱导ROS产生，提高声动力治疗效能，还可进行实时监控，实现肝癌的靶向声动力治疗的可视化、精确化和高效性，为肝癌热消融治疗提供一种新手段。
附图说明
图1为光学显微镜下IR-780@O2NP的图片；
图2为激光共聚焦显微镜下IR-780@O2NP近红外荧光的图片；
图3为透射电镜下IR-780@O2NP的图片。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1
通过以下步骤制备携IR-780的靶向声释氧纳米微聚体：
(1)载氧纳米微泡的制备
(1.1)精密称取18mg二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、1mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)和1mg生物素化二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000-Biotin)置于装有15ml体积比为1：2甲醇与二氯甲烷混合物的圆底烧瓶中，室温下搅拌充分至其完全溶解；
(1.2)使用旋转蒸发仪蒸干有机溶剂，再使用去离子水离心洗涤3次，去除残留的二氯甲烷与甲醇及其他杂质，制备磷脂薄膜；
(1.3)向圆底烧瓶中加入5ml去离子水，60℃水浴3分钟，之后使用超声分散均质仪乳化5分钟，使之形成磷脂乳化液；
(1.4)将步骤1.3得到的磷脂乳化液装入真空密封瓶中，充入过量医用氧气，使用超声震荡仪震荡1分钟，静置，收集上层浮集微泡，再使用去离子水离心洗涤3次，除去过量的磷脂混合物与其他杂质，得到载氧纳米微泡溶液，4℃保存备用；
(2)经生物素化聚乙二醇2000修饰的IR-780碘化物的制备
(2.1)精密称取32mg IR-780碘化物溶于1ml二甲基亚砜(DMSO)中；
(2.2)精密称取50mg的生物素化聚乙二醇2000(PEG2000-Biotin)，溶于15ml体积比为1：2甲醇与二氯甲烷混合物中；
(2.3)将步骤2.1得到的IR-780碘化物溶液与步骤2.2得到的生物素化聚乙二醇2000溶液混合，使用超声分散均质仪乳化30分钟，使其螯合成淡绿色乳化液，再向乳化液中加入20ml去离子水，60℃水浴10分钟，再使用去离子水洗涤离心3次，得到经生物素化聚乙二醇2000修饰的IR-780碘化物溶液，4℃保存备用；
(3)携IR-780的靶向声释氧纳米微聚体(IR-780@O2NP)的制备
(3.1)将步骤1得到的载氧纳米微泡溶液置于含有200nm滤膜的磷脂挤压器中，反复挤压20次以上，使其变为澄清状；
(3.2)向步骤3.1得到的载氧纳米微泡溶液中加入过量亲和素，室温孵育1小时，之后逐滴加入过量的由步骤2得到的经生物素化聚乙二醇2000修饰的IR-780碘化物溶液，轻微吹打使其混匀，室温下涡旋30min；
(3.3)使用去离子水离心洗涤，清除残留的亲和素和IR-780碘化物，吸取上层淡绿色纳米微泡，得到携IR-780的靶向声释氧纳米微聚体溶液；
(3.4)将步骤3.2得到的携IR-780的靶向声释氧纳米微聚体溶液置于真空冷冻干燥机中冻干至粉末状，收集携IR-780的靶向声释氧纳米微聚体冻干粉，充入医用纯氧气体，将其密封置于4℃冰箱中保存。
实施例2
通过以下步骤制备携IR-780的靶向声释氧纳米微聚体：
(1)载氧纳米微泡的制备
(1.1)精密称取15mg二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、0.7mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)和0.7mg生物素化二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000-Biotin)置于装有5ml体积比为1：2甲醇与二氯甲烷混合物的圆底烧瓶中，室温下搅拌充分至其完全溶解；
(1.2)使用旋转蒸发仪蒸干有机溶剂，再使用去离子水离心洗涤3次，去除残留的二氯甲烷与甲醇及其他杂质，制备磷脂薄膜；
(1.3)向圆底烧瓶中加入5ml去离子水，45℃水浴3分钟，之后使用超声分散均质仪乳化5分钟，使之形成磷脂乳化液；
(1.4)将步骤1.3得到的磷脂乳化液装入真空密封瓶中，充入过量医用氧气，使用超声震荡仪震荡1分钟，静置，收集上层浮集微泡，再使用去离子水离心洗涤3次，除去过量的磷脂混合物与其他杂质，得到载氧纳米微泡溶液，4℃保存备用；
(2)经生物素化聚乙二醇2000修饰的IR-780碘化物的制备
(2.1)精密称取25mg IR-780碘化物溶于1ml二甲基亚砜(DMSO)中；
(2.2)精密称取35mg的生物素化聚乙二醇2000(PEG2000-Biotin)，溶于5ml体积比为1：2甲醇与二氯甲烷混合物中；
(2.3)将步骤2.1得到的IR-780碘化物溶液与步骤2.2得到的生物素化聚乙二醇2000溶液混合，使用超声分散均质仪乳化20分钟，使其螯合成淡绿色乳化液，再向乳化液中加入20ml去离子水，45℃水浴10分钟，再使用去离子水洗涤离心3次，得到经生物素化聚乙二醇2000修饰的IR-780碘化物溶液，4℃保存备用；
(3)携IR-780的靶向声释氧纳米微聚体(IR-780@O2NP)的制备
(3.1)将步骤1得到的载氧纳米微泡溶液置于含有200nm滤膜的磷脂挤压器中，反复挤压20次以上，使其变为澄清状；
(3.2)向步骤3.1得到的载氧纳米微泡溶液中加入过量亲和素，室温孵育1小时，之后逐滴加入过量的由步骤2得到的经生物素化聚乙二醇2000修饰的IR-780碘化物溶液，轻微吹打使其混匀，室温下涡旋30min；
(3.3)使用去离子水离心洗涤，清除残留的亲和素和IR-780碘化物，吸取上层淡绿色纳米微泡，得到携IR-780的靶向声释氧纳米微聚体溶液；
(3.4)将步骤3.2得到的携IR-780的靶向声释氧纳米微聚体溶液置于真空冷冻干燥机中冻干至粉末状，收集携IR-780的靶向声释氧纳米微聚体冻干粉，充入医用纯氧气体，将其密封置于4℃冰箱中保存。
实施例3
通过以下步骤制备携IR-780的靶向声释氧纳米微聚体：
(1)载氧纳米微泡的制备
(1.1)精密称取20mg二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、1.5mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)和1.5mg生物素化二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000-Biotin)置于装有20ml体积比为1：4甲醇与二氯甲烷混合物的圆底烧瓶中，室温下搅拌充分至其完全溶解；
(1.2)使用旋转蒸发仪蒸干有机溶剂，再使用去离子水离心洗涤3次，去除残留的二氯甲烷与甲醇及其他杂质，制备磷脂薄膜；
(1.3)向圆底烧瓶中加入5ml去离子水，60℃水浴3分钟，之后使用超声分散均质仪乳化5分钟，使之形成磷脂乳化液；
(1.4)将步骤1.3得到的磷脂乳化液装入真空密封瓶中，充入过量医用氧气，使用超声震荡仪震荡1分钟，静置，收集上层浮集微泡，再使用去离子水离心洗涤3次，除去过量的磷脂混合物与其他杂质，得到载氧纳米微泡溶液，4℃保存备用；
(2)经生物素化聚乙二醇2000修饰的IR-780碘化物的制备
(2.1)精密称取35mg IR-780碘化物溶于1ml二甲基亚砜(DMSO)中；
(2.2)精密称取60mg的生物素化聚乙二醇2000(PEG2000-Biotin)，溶于20ml体积比为1：4甲醇与二氯甲烷混合物中；
(2.3)将步骤2.1得到的IR-780碘化物溶液与步骤2.2得到的生物素化聚乙二醇2000溶液混合，使用超声分散均质仪乳化30分钟，使其螯合成淡绿色乳化液，再向乳化液中加入20ml去离子水，60℃水浴10分钟，再使用去离子水洗涤离心3次，得到经生物素化聚乙二醇2000修饰的IR-780碘化物溶液，4℃保存备用；
(3)携IR-780的靶向声释氧纳米微聚体(IR-780@O2NP)的制备
(3.1)将步骤1得到的载氧纳米微泡溶液置于含有200nm滤膜的磷脂挤压器中，反复挤压20次以上，使其变为澄清状；
(3.2)向步骤3.1得到的载氧纳米微泡溶液中加入过量亲和素，室温孵育1小时，之后逐滴加入过量的由步骤2得到的经生物素化聚乙二醇2000修饰的IR-780碘化物溶液，轻微吹打使其混匀，室温下涡旋30min；
(3.3)使用去离子水离心洗涤，清除残留的亲和素和IR-780碘化物，吸取上层淡绿色纳米微泡，得到携IR-780的靶向声释氧纳米微聚体溶液；
(3.4)将步骤3.2得到的携IR-780的靶向声释氧纳米微聚体溶液置于真空冷冻干燥机中冻干至粉末状，收集携IR-780的靶向声释氧纳米微聚体冻干粉，充入医用纯氧气体，将其密封置于4℃冰箱中保存。
实验例1 IR-780@O2NP的表征检测
1、称取10mg实施例1制备得到的IR-780@O2NP样品粉末，稀释在溶液中(光子数100-500kcps)，使用Brookhaven公司的BI-90Plus激光粒度分析仪进行测量，使用He-Ne激光光源，波长632.8nm，在25℃下测量样品粒径。
2、取实施例1制备得到的IR-780@O2NP样品粉末粘于导电胶的一面上，粘好后撕去另一边，贴在样品台上，用洗耳球吹去粘连不牢固的粉末。然后进行喷金处理，之后再扫描电镜上观察并拍照，分析样品表面的结构特征(加速电压15kV)。
3、取1ml实施例1制备过程中得到的IR-780@O2NP样品溶液，分散于10ml二氯甲烷中，取一滴样品(约20ul)滴在铜网上，待其完全干燥，使用透射电镜进行形貌和衍射图像的观察并拍照，分析样品的内部精细结构(加速电压100kV)。结果参见图3。
实验例2 IR-780@O2NP的多模态成像能力研究
1、采用人肝癌细胞株HepG2和BALB/c裸鼠建立肝癌皮下移植瘤模型，随机分为两组，分别经鼠尾静脉注入商品化造影剂声诺维和实施例1制备过程中得到的IR-780@O2NP样品溶液，应用意大利百盛公司My lab twice彩色多普勒超声诊断仪对造影图像进行定量分析，评价IR-780@O2NP进行体内超声显影效果。
2、使用KODAK公司的In-Vivo Imaging Systems PX PRO(Carestream Health,Inc.Rochester,NY)超高分辨率小动物成像仪对实验裸鼠进行分子荧光成像，激发波长：704nm；滤过波长：740nm；成像时间：2000ms。先后进行X-Ray结构成像和分子荧光功能成像并进行拍照，并计算各组移植瘤内荧光强度。
实验例3 IR-780@O2NP的体外寻靶能力检测
1、培养肝癌细胞株HepG2和正常肝细胞株LO2：细胞株在含10％胎牛血清的DMEM培养液中，5％的CO2、37℃下行常规细胞培养传代。
2、体外靶向实验：实验分三组：靶向组、非靶向组、空白对照组，每组均包含两种细胞系，在三组细胞培养板中分别加入实施例1制备过程中得到的IR-780@O2NP样品溶液、非靶向纳米微泡复合体及相同体积的PBS液，低频率低强度超声辐照30s，37℃孵育2小时，用PBS液洗涤3次，最后采用激光共聚焦显微镜观察肝癌细胞及正常肝细胞的荧光显像情况，分析IR-780@O2NP的肝癌靶向性。
Claims (5)
1.一种携IR-780的靶向声释氧纳米微聚体，其特征在于，由以下步骤制备得到：
(1)载氧纳米微泡的制备
(1.1)精密称取15-20mg二硬脂酰磷脂酰胆碱、0.7-1.5mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和0.7-1.5mg生物素化二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000置于装有5-20ml体积比为1：2-4的甲醇与二氯甲烷混合物的圆底烧瓶中，室温下搅拌充分至其完全溶解；
(1.2)使用旋转蒸发仪蒸干有机溶剂，再使用去离子水离心洗涤3次，去除残留的二氯甲烷与甲醇及其他杂质，制备磷脂薄膜；
(1.3)向圆底烧瓶中加入5ml去离子水，45-60℃水浴3分钟，之后使用超声分散均质仪乳化5分钟，使之形成磷脂乳化液；
(1.4)将步骤1.3得到的磷脂乳化液装入真空密封瓶中，充入过量医用氧气，使用超声震荡仪震荡1分钟，静置，收集上层浮集微泡，再使用去离子水离心洗涤3次，除去过量的磷脂混合物与其他杂质，得到载氧纳米微泡溶液，4℃保存备用；
(2)经生物素化聚乙二醇2000修饰的IR-780碘化物的制备
(2.1)精密称取25-35mg IR-780碘化物溶于1ml二甲基亚砜中；
(2.2)精密称取35-60mg的生物素化聚乙二醇2000，溶于5-20ml体积比为1：2-4甲醇与二氯甲烷混合物中；
(2.3)将步骤2.1得到的IR-780碘化物溶液与步骤2.2得到的生物素化聚乙二醇2000溶液混合，使用超声分散均质仪乳化20-30分钟，使其螯合成淡绿色乳化液，再向乳化液中加入20ml去离子水，45-60℃水浴10分钟，再使用去离子水洗涤离心3次，得到经生物素化聚乙二醇2000修饰的IR-780碘化物溶液，4℃保存备用；
(3)携IR-780的靶向声释氧纳米微聚体的制备
(3.1)将步骤1得到的载氧纳米微泡溶液置于含有200nm滤膜的磷脂挤压器中，反复挤压20次以上，使其变为澄清状；
(3.2)向步骤3.1得到的载氧纳米微泡溶液中加入过量亲和素，室温孵育1小时，之后逐滴加入过量的由步骤2得到的经生物素化聚乙二醇2000修饰的IR-780碘化物溶液，轻微吹打使其混匀，室温下涡旋30min；
(3.3)使用去离子水离心洗涤，清除残留的亲和素和IR-780碘化物，吸取上层淡绿色纳米微泡，得到携IR-780的靶向声释氧纳米微聚体溶液；
(3.4)将步骤3.2得到的携IR-780的靶向声释氧纳米微聚体溶液置于真空冷冻干燥机中冻干至粉末状，收集携IR-780的靶向声释氧纳米微聚体冻干粉，充入医用纯氧气体，将其密封置于4℃冰箱中保存。
2.根据权利要求1所述的携IR-780的靶向声释氧纳米微聚体，其特征在于：
步骤(1.1)中所述二硬脂酰磷脂酰胆碱的用量为18mg，所述二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000的用量为1mg，所述生物素化二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000的用量为1mg；
步骤(1.1)中所述甲醇与二氯甲烷混合物的用量为15ml，甲醇与二氯甲烷的体积比为1：2；
步骤(1.3)中所述的水浴温度为60℃；
步骤(2.1)中所述IR-780碘化物的用量为32mg；
步骤(2.2)中所述生物素化聚乙二醇2000的用量为50mg；
步骤(2.2)中所述甲醇与二氯甲烷混合物的用量为15ml，甲醇与二氯甲烷的体积比为1：2；
步骤(2.3)中所述的乳化时间为30分钟；
步骤(2.3)中所述的水浴温度为60℃。
3.制备如权利要求1所述的携IR-780的靶向声释氧纳米微聚体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)载氧纳米微泡的制备
(1.1)精密称取15-20mg二硬脂酰磷脂酰胆碱、0.7-1.5mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和0.7-1.5mg生物素化二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000置于装有5-20ml体积比为1：2-4甲醇与二氯甲烷混合物的圆底烧瓶中，室温下搅拌充分至其完全溶解；
(1.2)使用旋转蒸发仪蒸干有机溶剂，再使用去离子水离心洗涤3次，去除残留的二氯甲烷与甲醇及其他杂质，制备磷脂薄膜；
(1.3)向圆底烧瓶中加入5ml去离子水，45-60℃水浴3分钟，之后使用超声分散均质仪乳化5分钟，使之形成磷脂乳化液；
(1.4)将步骤1.3得到的磷脂乳化液装入真空密封瓶中，充入过量医用氧气，使用超声震荡仪震荡1分钟，静置，收集上层浮集微泡，再使用去离子水离心洗涤3次，除去过量的磷脂混合物与其他杂质，得到载氧纳米微泡溶液，4℃保存备用；
(2)经生物素化聚乙二醇2000修饰的IR-780碘化物的制备
(2.1)精密称取25-35mg IR-780碘化物溶于1ml二甲基亚砜中；
(2.2)精密称取35-60mg的生物素化聚乙二醇2000，溶于5-20ml体积比为1：2-4甲醇与二氯甲烷混合物中；
(2.3)将步骤2.1得到的IR-780碘化物溶液与步骤2.2得到的生物素化聚乙二醇2000溶液混合，使用超声分散均质仪乳化20-30分钟，使其螯合成淡绿色乳化液，再向乳化液中加入20ml去离子水，45-60℃水浴10分钟，再使用去离子水洗涤离心3次，得到经生物素化聚乙二醇2000修饰的IR-780碘化物溶液，4℃保存备用；
(3)携IR-780的靶向声释氧纳米微聚体的制备
(3.1)将步骤1得到的载氧纳米微泡溶液置于含有200nm滤膜的磷脂挤压器中，反复挤压20次以上，使其变为澄清状；
(3.2)向步骤3.1得到的载氧纳米微泡溶液中加入过量亲和素，室温孵育1小时，之后逐滴加入过量的由步骤2得到的经生物素化聚乙二醇2000修饰的IR-780碘化物溶液，轻微吹打使其混匀，室温下涡旋30min；
(3.3)使用去离子水离心洗涤，清除残留的亲和素和IR-780碘化物，吸取上层淡绿色纳米微泡，得到携IR-780的靶向声释氧纳米微聚体溶液；
(3.4)将步骤3.2得到的携IR-780的靶向声释氧纳米微聚体溶液置于真空冷冻干燥机中冻干至粉末状，收集携IR-780的靶向声释氧纳米微聚体冻干粉，充入医用纯氧气体，将其密封置于4℃冰箱中保存。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：
步骤(1.1)中所述二硬脂酰磷脂酰胆碱的用量为18mg，所述二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000的用量为1mg，所述生物素化二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000的用量为1mg；
步骤(1.1)中所述甲醇与二氯甲烷混合物的用量为15ml，甲醇与二氯甲烷的体积比为1：2；
步骤(1.3)中所述的水浴温度为60℃；
步骤(2.1)中所述IR-780碘化物的用量为32mg；
步骤(2.2)中所述生物素化聚乙二醇2000的用量为50mg；
步骤(2.2)中所述甲醇与二氯甲烷混合物的用量为15ml，甲醇与二氯甲烷的体积比为1：2；
步骤(2.3)中所述的乳化时间为30分钟；
步骤(2.3)中所述的水浴温度为60℃。
5.权利要求1所述的携IR-780的靶向声释氧纳米微聚体在制备肝癌靶向声动力治疗剂中的应用。
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