CN110856720A - Ezh2异常相关癌症的治疗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于治疗受试者中的EZH2异常相关癌症的方法、药物组合和试剂盒。

Description

EZH2异常相关癌症的治疗
技术领域
本发明涉及EZH2异常相关癌症的治疗。
背景技术
在催化组蛋白H3的赖氨酸27(H3K27)的甲基化方面起到关键 作用的Polycomb抑制复合体2(PRC2)的酶亚基EZH2的酶活已成 为癌症治疗的靶点之一。两种先导化合物，EPZ-6438和GSK126，在 部分携带EZH2基因突变的血液恶性肿瘤中表现出初步疗效，包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和滤泡性淋巴瘤(Italiano等，2018； Kurmasheva等，2017；McCabe等，2012b)。EZH2突变导致组成型 激活的EZH2酶活性，继而驱动H3K27甲基化(H3K27me)依赖性 细胞生长，类似于意义明确的致癌驱动因子(Brach等，2017；Huet 等，2017；McCabe等，2012a；Morin等，2010)。然而，EZH2突 变出现在非常小的亚组的血液肿瘤中。在大多数实体瘤中，EZH2以 过表达的野生型形式存在，其类似地携带H3K27me催化活性。然而， 尚不清楚过表达的野生型EZH2是否也可以在功能上导致H3K27me 的生长依赖性。在这个方面的洞见可以扩展EZH2抑制剂对广谱实体 瘤的治疗益处(Bachmann等，2006；Bracken等，2003；Kim和Roberts， 2016；McCabe等，2012b；Sun等，2016；Varambally等，2002)。
人们最近还努力寻找除了携带EZH2基因突变的那些之外可以敏 锐响应EZH2抑制的癌症亚组(Kim等，2015)。已经证实SWI-SNF 复合体(部分地拮抗PRC2复合体的催化功能的染色质重塑调节因子) 的功能障碍使癌细胞在体外和体内都对EZH2抑制剂治疗敏感；SWI-SNF复合体亚基(主要是BRG1，Arid1A，SMARCA4或INI1) 的功能丧失使多种类型实体瘤的癌细胞在体外和体内响应于EZH2抑 制剂(Bitler等，2015；Chan-Penebre等，2017；Fillmore等，2015)。 PRC2还拮抗脱甲基酶JMJD3/UTX的组蛋白修饰，并调节TrxG和 p300/CBP复合体的转录水平。然而，尚不清楚这些相对立的复合体 如何合作地维持表观遗传调控的内在平衡，以及这些复合体和相关组 蛋白修饰之间的相互作用是否对于对EZH2抑制的响应是重要的。
在本研究中，发明人利用综合性且大规模的方法解决EZH2抑制 如何调节全局表观遗传特征，以及更重要地，如何可以将新的洞见转 化为在各种各样的实体瘤中,以扩展EZH2抑制剂的临床应用。
发明内容
组蛋白甲基转移酶EZH2的突变或异常上调经常在人类癌症中出 现，但EZH2靶向治疗仅在血液恶性肿瘤中显示非常有限的临床益处。 发明人在本文中报告，在EZH2抑制后，MLL1与p300/CBP复合体 相互作用，所述p300/CBP复合体将H3K27me丢失引导至H3K27ac修饰获得。这种组蛋白修饰重塑导致了转录重编程，其限制了对EZH2 抑制的治疗响应。H3K27甲基化和乙酰化的同时抑制导致了大量癌症 亚组中对MAPK信号传导途径的转录抑制和生长依赖性。在包含广 谱EZH2异常实体瘤的临床前模型中，EZH2和BRD4抑制剂的组合或者还包括MAPK抑制的三重组合表现出具有可耐受毒性的稳健功 效，特别是在肝癌和胰腺癌中。发明人的研究结果启示了基于固有 MLL1表达和反馈MAPK的激活水平、制定针对EZH2异常肿瘤病人 的有吸引力的精确治疗和患者分群策略。
在患有EZH2异常相关癌症的受试者中，H3K27甲基化修饰增加。 这样的受试者对于减少H3K27甲基化修饰的EZH2抑制剂具有不同 敏感性。发明人发现，具有低MLL1表达的受试者对EZH2抑制剂敏 感，而具有高MLL1表达的受试者对EZH2抑制剂耐药。在具有高MLL1表达的受试者中，MLL1与p300/CBP复合物相互作用，导致 H3K27乙酰化修饰增加并激活肿瘤依赖性癌基因表达，从而对EZH2 抑制剂耐药。发明人发现，通过对这样的受试者施用H3K27乙酰化 修饰抑制剂，减少H3K27乙酰化修饰产生或阻止H3K27乙酰化修饰 发挥作用，可以使受试者对EZH2抑制剂敏感，从而显著改善EZH2 抑制剂的治疗效果，产生协同效应。进一步地，发明人发现，在施用 EZH2抑制剂和H3K27乙酰化修饰抑制剂的组合之后，一些受试者表 现出MAPK信号传导通路激活，使得没有获得最佳治疗效果。而通 过施用EZH2抑制剂、H3K27乙酰化修饰抑制剂和MAPK信号传导 通路阻断剂的三元组合，可以进一步显著增强治疗效果，产生协同效 应。
因此，在一个方面，本发明提供了一种治疗受试者中的EZH2异 常相关癌症的方法，其包括：
(1)测定所述受试者的MLL1水平并与参比MLL1水平相比较； 和/或
(2)向所述受试者施用EZH2抑制剂，并在施用之前和之后， 测定所述受试者的H3K27乙酰化；
其中当所述受试者的MLL1水平高于所述参比MLL1水平和/或 所述受试者的H3K27乙酰化在施用所述EZH2抑制剂之后增加时， 向所述受试者施用EZH2抑制剂和H3K27乙酰化抑制剂的药物组合。
根据本发明的一个方面的方法还包括：
(1)测定所述受试者的ERK水平并与参比ERK水平相比较； 和/或
(2)在向所述受试者施用所述EZH2抑制剂和H3K27乙酰化抑 制剂的药物组合之前和之后，测定所述受试者的ERK水平；
其中当所述受试者的ERK水平高于所述参比ERK水平和/或所述 受试者的ERK水平在施用所述EZH2抑制剂和H3K27乙酰化抑制剂 的药物组合之后增加时，向所述受试者施用EZH2抑制剂，H3K27乙 酰化抑制剂，和MAPK信号传导通路阻断剂的药物组合。
在另一个方面，本发明提供了一种用于治疗EZH2异常相关癌症 的药物组合，其包含EZH2抑制剂和H3K27乙酰化抑制剂。
根据本发明的一个方面的药物组合还包含MAPK信号传导通路 阻断剂。
在又一个方面，本发明提供了一种患有EZH2异常相关癌症的受 试者的分群方法，其包括：
(1)测定所述受试者的MLL1水平并与参比MLL1水平相比较； 和/或
(2)向所述受试者施用EZH2抑制剂，并在施用之前和之后， 测定所述受试者的H3K27乙酰化；
其中当所述受试者的MLL1水平高于所述参比MLL1水平和/或 所述受试者的H3K27乙酰化在施用所述EZH2抑制剂之后增加时， 将所述受试者标记为MLL1阳性。
根据本发明的一个方面的方法还包括：
(1)测定所述标记为MLL1阳性的受试者的ERK水平并与参比 ERK水平相比较；和/或
(2)向所述标记为MLL1阳性的受试者施用EZH2抑制剂和 H3K27乙酰化抑制剂的药物组合，并在施用之前和之后，测定所述受 试者的ERK水平；
其中当所述标记为MLL1阳性的受试者的ERK水平高于所述参 比ERK水平和/或所述标记为MLL1阳性的受试者的ERK水平在施 用所述EZH2抑制剂和H3K27乙酰化抑制剂的药物组合之后增加时， 将所述标记为MLL1阳性的受试者标记为MLL1+ERK双阳性。
在又一个方面，本发明提供了一种用于患有EZH2异常相关癌症 的受试者的分群的试剂盒，其包括：
(1)用于测定所述受试者的MLL1水平的试剂；和/或
(2)用于测定所述受试者的H3K27乙酰化的试剂。
根据本发明的一个方面的试剂盒，其还包括用于测定所述受试者 的ERK水平的试剂。
在又一个方面，本发明提供了包含EZH2抑制剂和H3K27乙酰 化抑制剂的药物组合在制备用于在受试者中治疗EZH2异常相关癌症 的药物中的用途，优选地所述受试者是MLL1阳性受试者。
在又一个方面，本发明提供了包含EZH2抑制剂，H3K27乙酰化 抑制剂和MAPK信号传导通路阻断剂的药物组合在制备用于在受试 者中治疗EZH2异常相关癌症的药物中的用途，优选地所述受试者是 MLL1阳性受试者，更优选地所述受试者是MLL1+ERK双阳性受试者。
在又一个方面，本发明提供了一种用于治疗受试者中的EZH2异 常相关癌症的试剂盒，其包括：
(1)用于测定所述受试者的MLL1水平的试剂；和/或
(2)用于测定所述受试者的H3K27乙酰化的试剂；和
(3)包含EZH2抑制剂和H3K27乙酰化抑制剂的药物组合。
根据本发明的一个方面的试剂盒还包括：
(1)用于测定所述受试者的ERK水平的试剂；和
(2)MAPK信号传导通路阻断剂。
附图说明
图1.H3K27乙酰化上调与对EZH2抑制的抗性相关。
(A)组蛋白修饰分析。EPZ-6438处理的细胞中与DMSO处理 的细胞中相比，6种癌细胞系(从不敏感到敏感细胞系，1-6：U2932， SMMC-7721，T47D，SU-DHL-4，KARPAS-422和Pfeiffer)中的全 局组蛋白翻译后修饰的倍数变化通过基于SILAC的质谱法检测。
(B)主成分分析。基于(A)中细胞的组蛋白修饰定量比，通 过主成分分析(PCA)分析具有不同EPZ-6438敏感性的细胞系。
(C)癌细胞中H3K27ac激活相对于EPZ-6438敏感性之间的关 联。用梯度浓度的EPZ-6438处理细胞6天，并使用SRB测定法或 CCK-8测定法测量IC 50。通过免疫印迹法检测H3K27乙酰化。左垂 直轴：不同癌细胞系的IC50。右垂直轴：EPZ-6438相对于对照组的H3K27ac水平比。横轴：不同癌细胞系。
(D)相关性分析。(C)中描述的癌细胞中H3K27ac上调水平 与EPZ-6438的IC50之间的相关性。
(E)癌细胞中EZH2抑制剂诱导的H3K27ac水平的变化。分别 用1μM EPZ-6438和1μMGSK126处理细胞6天。通过免疫印迹法 检测H3K27乙酰化。将来自各细胞系的裂解物单独进行印迹。
另见图8。
“EPZ”代表EPZ-6438。
图2.MLL1促进p300催化的H3K27ac升高。
(A)H3K27乙酰化变化。将用指定的siRNA或非靶向对照(NC) 转染的SMMC-7721细胞暴露于EPZ-6438(1μM)72小时。通过免 疫印迹法检查H3K27乙酰化和敲低功效。组蛋白H3被印迹作为组蛋 白H3修饰变化的内部对照。
(B)H3K27乙酰化变化。用EPZ-6438(1μM)单独或与组蛋 白乙酰转移酶抑制剂C646(5μM)或SGC-CBP30(5μM)组合处理 SMMC-7721细胞6天。通过免疫印迹法检查H3K27乙酰化。
(C)通过免疫印迹法分析检查的敏感细胞和不敏感细胞系中的 MLL1表达水平。
(D)来自全细胞裂解物的p300，CBP和MLL1的共免疫沉淀 (co-IP)。将用指定的siRNA或非靶向对照(NC)转染72小时的 SMMC-7721细胞暴露于EPZ-6438(1μM)另外72小时。将细胞裂 解物与抗p300或IgG抗体一起温育。用指定的抗体对免疫沉淀物进 行免疫印迹。
(E)H3K27乙酰化变化。将用指定的siRNA或非靶向对照(NC) 转染72小时的SMMC-7721细胞暴露于EPZ-6438(1μM)另外72 小时。通过免疫印迹法检查H3K27乙酰化和敲低功效。
(F)细胞生长测定。将用指定的siRNA或非靶向对照(NC)转 染48小时的SMMC-7721细胞暴露于EPZ-6438(5μM)另外6天。 通过SRB测定法测量细胞生长抑制率。n＝5次重复
(G)H3K27乙酰化变化。用Myc-MLL1质粒或模拟物转染24 小时的细胞进一步用siMLL1转染或暴露于EPZ-6438(1μM)72小 时。通过免疫印迹法检查H3K27乙酰化和过表达功效。
(H)癌细胞系中MLL1表达水平与EZH2抑制剂的敏感性之间 的相关性。
误差棒代表平均值±SEM。(F)通过非成对双尾t检验进行分析。 **p<0.01，***p<0.001。
另见图9。
“EPZ”代表EPZ-6438。
图3.反馈H3K27乙酰化变化驱动致癌转录重编程。
(A)受到EPZ-6438影响的H3K27ac ChIP-seq数据，RNA-seq 数据和蛋白质组数据的GSEA分析。全局热图显示在U2932， SMMC-7721和Pfeiffer细胞系中，EPZ-6438处理的与DMSO处理的 相比，来自MSigDB的致癌特征中的富集通路。颜色是根据FDR q 值。
(B-C)维恩图分别显示基于RNA-seq数据(B)和蛋白质组数 据(C)的不敏感细胞系(U2932，SMMC-7721)中统计学地(FDR q 值<0.05)富集的通路的重叠。
(D-F)U2932和SMMC-7721细胞系中，EPZ-6438处理与DMSO 处理相比，H3K27acChIP-seq(D)，RNA-seq(E)和蛋白质组(F) 数据中的致癌特征富集图(使用来自MolecularSignatures Database的 致癌“c6”)。图表明EPZ-6438处理后致癌特征的显著(FDR q值<0.05) 上调。
(G)使用H3K27ac抗体的ChIP-seq实验的基因组快照。用 EPZ-6438(1μM)处理SMMC-7721细胞6天。
(H)CTNNB1mRNA水平的变化。如(G)中处理的细胞进行 RT-qPCR测定。通过未处理组的进行标准化而获得mRNA倍数水平 变化。n＝3次重复。
(I)β-连环蛋白水平变化。用EPZ-6438(1μM)或GSK126(1 μM)处理细胞6天。通过免疫印迹法分析蛋白质水平。
(J)TCF转录活性。在用EPZ-6438预处理4天后，用TCF/LEF1 荧光素酶报道构建体转染细胞48小时。荧光素酶活性通过载体组的 进行标准化。n＝4次重复。
(K)β-连环蛋白水平变化。用EPZ-6438(1μM)，JQ1(0.25μM) 单独或组合处理细胞6天。通过免疫印迹法分析蛋白质水平。
误差棒代表平均值±SEM。(H)和(J)通过非成对双尾t检验 进行分析。**p<0.01，***p<0.001。
另见图10。“EPZ”代表EPZ-6438。
图4.H3K27乙酰化信号的干预使癌细胞对EZH2抑制敏感。
(A)体外协同抗癌功效。用梯度浓度的EPZ-6438，JQ1或组合 处理细胞6天，并通过SRB或CCK-8测定法测量细胞生长。联合指 数(CI)由CalcuSyn Demo Version 2.0软件计算。协同功效：CI<0.8。 n＝2个重复。
(B-D)体内协同抗癌功效。携带U2932异种移植物(B)或PDX 模型0842(C)和0055(D)的小鼠用EPZ-6438(200mg/kg)和BRD4 抑制剂(OTX015)每天单独或组合处理指定的天数。通过免疫印迹 法检测瘤内水平的H3K27me3和H3K27ac。
(E)EZH2和BRD4组合抑制相对于EZH2抑制的治疗效果。红 色：在指定的异种移植模型中，EZH2-BRD4抑制剂组合的终点肿瘤 生长抑制(TGI)率指示肿瘤响应。蓝色：每个模型中的单独EPZ-6438 的TGI率。白线表示60％TGI率的截止值。
误差棒表示平均值±SEM，(B-D)每组n≥5只小鼠。(B-D)通 过非成对双尾t检验进行分析。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
另见图11。
“EPZ”代表EPZ-6438；“OTX”代表OTX015。
图5.H3K27乙酰化信号的阻断环境依赖性地激活MAPK通路。
(A)GSEA分别突出了与DMSO处理的细胞相比，在U2932和 SMMC-7721细胞中，EPZ-6438处理和EPZ-6438-JQ1共处理的蛋白 质组学数据的致癌通路的组。颜色是根据FDR q值。维恩图分别显示 在U2932和SMMC-7721细胞中，EPZ-6438处理和EPZ-6438-JQ1共 处理后统计学地(FDR q值<0.05)富集的致癌通路的重叠。
(B)SMMC-7721和U2932细胞系中富集的KEGG通路的热图。 分层聚类热图显示与DMSO处理的细胞相比，在SMMC-7721和 U2932细胞系中，通过EZP-6438和JQ1共处理的调节的磷蛋白的显 著富集的KEGG通路。上调的KEGG通路以红色显示，下调的KEGG 通路以蓝色显示。
(C-D)Erk和RSK磷酸化变化。(C)用EPZ-6438(2μM)处 理3天的细胞暴露于单独或组合的JQ1(0.5μM)另外3天。(D) 用非靶向对照(NC)或MAPK3-siRNA转染细胞3天。通过免疫印 迹法检查Erk和RSK激活。
(E-F)MAPK3mRNA水平改变。(E)将用EPZ-6438(2μM) 预处理3天的细胞暴露于JQ1(1μM)处理另外24小时。(F)用非 靶向对照(NC)或BRD4-siRNA转染细胞3天。对样品进行RT-qPCR 测定。
(G)MAPK3蛋白水平变化。如(F)处理的细胞以及蛋白质通 过免疫印迹法检测。
误差棒表示平均值±SEM，(E-F)n＝2重复。(E-F)通过非成 对双尾t检验进行分析，统计比较是对于对照。*p<0.05，**p<0.01， ***p<0.001。
另见图12。
“EPZ”代表EPZ-6438。
图6.EZH2、BRD4和MEK组合抑制在实体瘤中显示突出的抗癌 作用
(A)EZH2-BRD4抑制剂组合处理后的MLL1表达和Erk激活 的状态。
(B-E)体内协同抗癌功效。PDX模型PDX-0809(B)，PDX-0273 (C)，PDX-0309(D)和PDX-3527(E)用EZH2抑制剂(EPZ-6438)， BRD4抑制剂(OTX015)和Erk抑制剂(GDC-0994)每天以指定剂 量单独或以指定组合处理指定天数。通过免疫印迹法检测H3K27me， H3K27ac和其他指定蛋白质的瘤内水平。
误差棒表示平均值±SEM，(B-E)每组n≥5只小鼠。(B-E)通 过非成对双尾t检验进行分析。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
另见图13。
“EPZ”代表EPZ-6438；“OTX”代表OTX015；“GDC”代表 GDC-0994。
图7.显示指导EZH2靶向治疗的路线图的方案。
图8，与图1有关。癌细胞中反馈H3K27ac改变与细胞对EZH2 抑制的敏感性相关。
(A)通过免疫印迹法在正常细胞和癌细胞系之间EZH2和MLL1 表达水平的差异。
(B)细胞对EZH2抑制剂的敏感性。用梯度浓度的EPZ-6438 或GSK126处理细胞6天，并使用SRB测定法或CCK-8测定法测量 IC 50。
(C)细胞生长测定。用非靶向对照(NC)或EZH2-siRNA转染 细胞48小时，然后再增殖6天；通过SRB测定法测量细胞生长变化。 在用对照或EZH2靶向siRNA诱导72小时后癌细胞的免疫印迹法分 析。β-肌动蛋白用作上样对照。
(D)H3K27乙酰化变化。细胞用SUZ12-siRNA、非靶向对照(NC) 转染或暴露于EZH2抑制剂(1μM)或PCR2抑制剂(1μM)72小 时。
(E)DLBCL异种移植模型的肿瘤生长曲线。Pfeiffer异种移植 模型每天用EPZ-6438(50mg/kg)或GSK126(25mg/kg)处理28 天。U2932异种移植模型每天用EPZ-6438(200mg/kg)处理18天。 通过免疫印迹法检测H3K27甲基化和乙酰化。
(F)SWI/SNF或BAP1WT/Mut癌细胞系中H3K27ac激活与 EPZ-6438敏感性之间的关联。如(B)中所述用EPZ-6438处理细胞。 通过免疫印迹法检测H3K27乙酰化。
误差棒表示平均值±SEM，(C)n＝3个重复，(E)n＝6-12个小 鼠。(C)和(E)通过单因素方差分析和Dunnett多重比较检验进行 分析。***p<0.001。
图9，与图2有关。组蛋白乙酰转移酶p300的转录上调导致H3K27 乙酰化的升高。
(A)H3K27乙酰化变化。将用指示的p300，CBP siRNA或非 靶向对照(NC)转染的细胞暴露于EPZ-6438(1μM)72小时。通过 免疫印迹法检查H3K27乙酰化和敲低功效。组蛋白H3被印迹作为组 蛋白H3修饰变化的内部对照。
(B)H3K27乙酰化变化。用EPZ-6438(1μM)单独或与组蛋 白乙酰转移酶抑制剂C646(5μM)或SGC-CBP30(5μM)组合处理 细胞6天。通过免疫印迹法检查H3K27乙酰化。
(C)细胞生长测定。将用指定的siRNA或非靶向对照(NC) 转染48小时的U2932和SMMC-7721细胞暴露于EPZ-6438(1μM) 另外6天。通过SRB测定法测量细胞生长抑制率。n≥3个重复。
(D)细胞生长测定。通过计数细胞数量，测量用组蛋白乙酰转 移酶抑制剂C646或SGC-CBP30单独或组合EPZ-6438处理6天的 U2932细胞。将单独用EPZ-6438或与组蛋白乙酰转移酶抑制剂 SGC-CBP30组合处理的SMMC-7721和AsPC-1细胞以低密度接种在 标准六孔板中约2周；通过结晶紫染色使群落可见；该测定代表两个 或三个独立实验的重复。
(E)通过免疫印迹法分析检查的敏感细胞和不敏感细胞系中的 其他组蛋白乙酰化相关蛋白表达水平。
(F)来自全细胞裂解物的p300，CBP和MLL1的共免疫沉淀 (co-IP)。将用指定的siRNA或非靶向对照(NC)转染72小时的 细胞暴露于EPZ-6438(1μM)另外72小时。将细胞裂解物与抗p300， 抗MLL1或IgG抗体一起温育。用指定的抗体对免疫沉淀物进行免疫 印迹法。
(G)H3K27乙酰化变化。将用指定的siRNA或非靶向对照(NC) 转染72小时的细胞暴露于EPZ-6438(1μM)另外36小时。通过免 疫印迹法检查H3K27乙酰化和敲低功效。
(H)细胞生长测定。将用指定的siRNA或非靶向对照(NC) 转染72小时的细胞暴露于EPZ-6438(5μM)另外7天。通过SRB 测定法测量细胞生长抑制率。n＝3次重复。
(I)H3K27乙酰化变化。用Myc-MLL1质粒或模拟物转染24 小时的细胞进一步用siMLL1转染或暴露于EPZ-6438(1μM)72小 时。通过免疫印迹法检查H3K27乙酰化和过表达功效。
误差棒表示平均值±SEM，(C，H)n≥3个重复，(D)n≥2个重 复。(C)、(D)和(H)通过非成对双尾t检验进行分析。*p<0.05， **p<0.01，***p<0.001。
图10，与图3相关，H3K27乙酰化导致癌蛋白的转录激活，其 对于对EZH2抑制的抗性是关键性的。
(A)受到EPZ-6438影响的H3K27ac ChIP-seq数据，RNA-seq 数据和蛋白质组数据的GSEA分析。热图显示与DMSO处理的相比， 用EPZ-6438处理的U2932和Pfeiffer中的富集的通路的选择。颜色 是根据FDR q值。
(B-D)在U2932和SMMC-7721细胞系中，EPZ-6438处理相对 DMSO处理，在H3K27acChIP-seq(B)，RNA-seq(C)和蛋白质组 (D)数据中的致癌特征富集图(使用来自MolecularSignatures Database的致癌“c6”)。图表明EPZ-6438处理后致癌特征的显著(FDR q值<0.05)上调。
(E)在WNT11，TGM2和NPC1L1启动子中的组蛋白H3K27乙 酰化，MLL1和p300积累。将SMMC-7721细胞用EPZ-6438(1μM) 处理6天，然后分别使用抗-乙酰基-组蛋白H3K27(H3K27ac)，MLL1 或p300抗体进行ChIP测定，然后使用靶向指定的WNT11，TGM2 和NPC1L1启动子区域的引物进行qRT-PCR分析。n≥2个重复。
(F)CTNNB1启动子中的组蛋白H3K27乙酰化和三甲基化。将 SMMC-7721细胞用EPZ-6438(1μM)处理6天，然后使用抗-乙酰 基-组蛋白H3K27(H3K27ac)或抗-三甲基-组蛋白H3K27(H3K27me3) 抗体进行ChIP测定，然后使用靶向指定的CTNNB1启动子区域的引 物进行qRP-PCR分析。n≥2个重复。
(G)CTNNB1蛋白水平变化。用非靶向对照(NC)或EZH2-siRNA 转染细胞6天。通过免疫印迹法检测蛋白质水平。
误差棒代表平均值±SEM。(E)和(F)通过非成对双尾t检验 进行分析。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图11，与图4有关，H3K27乙酰化的阻断使癌细胞对EZH2抑 制剂敏感。
(A)体外协同抗癌功效。将U2932和SU-DHL-5细胞用EPZ-6438 (10μM)和JQ1(1μM)单独或以指定组合处理6天。通过计数细 胞数量，测量细胞生长变化。其他细胞用EPZ-6438(1μM)和JQ1 单独或组合处理约2周，并通过群落形成测定法测量细胞生长变化。
(B)体内协同抗癌功效。小鼠每天用EPZ-6438(200mg/kg) 和BRD4抑制剂(JQ1或OTX015)单独或组合处理指定天数。
(C)通过IHC在CDX和PDX模型中EZH2和MLL1表达水平 的差异。比例尺，50μM
误差棒代表平均值±SEM，(A)n≥2个重复，(B)每组n＝6-12 个小鼠。(A-B)通过非成对双尾t检验进行分析。*p<0.05，**p<0.01， ***p<0.001。
图12，与图5有关，MAPK信号传导的抑制改善了表观遗传靶 向组合疗法的治疗潜力。
(A)火山图显示了与DMSO处理的细胞相比，SMMC-7721和 U2932细胞中EZP-6438和JQ1的共处理中磷酸盐(phosphosite)的 倍数变化。在三个生物学重复中计算相应的调整的p值。上调的磷蛋 白以红色显示，下调的磷蛋白以蓝色显示，统计学不显著的蛋白以灰色显示。
(B)示意图显示SMMC-7721和U2932细胞中通过EPZ-6438 和JQ1的处理影响的MAPK通路中的磷酸盐。将用EPZ-6438(2μM) 预处理3天的SMMC-7721或U2932细胞暴露于EPZ-6438(2μM) 和JQ1(0.5μM)另外3天，然后进行MS分析。通过MaxQuant分 析磷酸盐变化并标准化为蛋白质表达水平。红色，上调的磷酸盐。蓝 色，下调的磷酸盐。
(C-D)使用具有高置信度(combined_score>0.7)并通过 Cytoscape可视化的STRING数据库，通过EZP-6438和JQ1的共处理 改变的磷酸化蛋白质组相互作用网络。使用基于蛋白质相互作用水平 的算法MCODE对相互作用网络进行聚类分析。簇用不同的颜色代表。基于KEGG通路富集分析手动注释每个簇。
(E)Erk和RSK磷酸化变化。用GSK126(1μM)处理细胞3 天。通过免疫印迹法检查Erk和RSK激活。
图13，与图6相关，ERK和H3K27ac的协同阻断使肝癌，胰腺 癌和肺癌对EZH2和BRD4抑制敏感。
(A-D)肿瘤生长曲线。携带SMMC-7721(A)，BxPC-3(B)， AsPC-1(C)或NCI-H23(D)异种移植物的小鼠每天用EZH2抑制 剂(EPZ-6438)，BRD4抑制剂(JQ1或OTX015)和ERK抑制剂(GDC-0994)以指定剂量单独或以指定组合处理指定天数。通过免 疫印迹法检测H3K27me3，H3K27ac和其他指定蛋白质的瘤内水平。
(E)EZH2，BRD4和ERK组合抑制相对于EZH2和BRD4组合 抑制的治疗效果。红色：在指定的异种移植模型中，通过 EZH2-BRD4-ERK抑制剂组合的终点肿瘤生长抑制(TGI)率指示肿 瘤响应。蓝色：每种模型中EZH2-BRD4抑制剂组合的TGI率。黑线 表示60％TGI率的截止值。
(F-M)异种移植物的体重变化。
误差棒表示平均值±SEM，(A-D)每组n≥3只小鼠。(A-D)通 过非成对双尾t检验进行分析。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
具体实施方式
组蛋白修饰是重要的表观遗传特征，其决定基因表达状态，癌症 中的细胞身份，和药物对治疗的响应(Jin等，2017；Pasini等，2010)。 在本研究中，发明人显示对单一表观遗传酶如EZH2的干预可以调节 一组表观遗传酶，由此影响自身或邻位修饰。该二级表观遗传影响可 以导致在组蛋白修饰中不断传播的波动，并限定最终的组蛋白修饰模 式。先前的研究已经报道，NSD2活性变化可以影响众多组蛋白修饰 (Jaffe等，2013)。发明人现在报道，EZH2抑制可以导致组蛋白标 记的整体重塑。例如，当在单细胞系中测试时，45种组蛋白标记改变 超过2倍。在全局改变的组蛋白标记中，注意到H3K27me-H3K27ac 之间的特定相互影响，并且显示其对于癌细胞体系对EZH2抑制的响 应是关键性的，表明组蛋白修饰串扰的固有倾向。例如，发明人已经 显示，H3K27me损失不导致转换到在同一残基上发生的其他类型的 组蛋白修饰，例如H3K27pr(图1A)，进一步支持存在特别地联系 H3K37me损失与H3K27ac的独特调节机制。
先前已经报道，H3K37me和H3K27ac串扰是同一H3K27残基上 的拮抗性转换。发明人通过显示MLL1与p300形成复合体并在PRC2 抑制后促进p300催化的H3K27ac，在机制方面实质性地扩展了早先 的观察结果。MLL1的耗尽未能使从H3K37me转换到H3K27ac。所 有这些共同表明严格地需要MLL1的组蛋白修饰的“开-关”转换。
通常据信MLL1存在于多种表观遗传复合体中，并涉及各种各样 类型的组蛋白标记的修饰。据报道，MLL1同源物存在于控制基因转 录的“开-关”转换的TrxG复合体中。先前的研究表明MLL1单甲基化 的组蛋白H3K4可以促进H3K27乙酰化(Tie等，2014)。发明人的发现通过显示MLL1的固有存在作为与p300(其将H3K27me损失引 导至H3K27ac修饰获得，而不管H3K4me状态如何)复合的衔接蛋 白起作用，而使这种理解得以前进。固有MLL1水平在不同癌症之间 存在差异(数据未显示)，这可以在很大程度上解释H3K27ac响应 的差异性，尽管均存在相似的H3K27me抑制。
ChIP-seq数据显示H3K27ac修饰的基因簇在不同细胞系中高度 多样化，对癌基因具有优先的影响。这进一步得到不同细胞环境中的 转录输出的支持，例如，HCC细胞中的Wnt/β-连环蛋白和TGF-β以 及乳腺癌细胞中的mTOR途径和EGFR信号传导(数据未显示)。BRD4抑制关闭激活的癌途径并使癌症再次对EZH2抑制敏感，证明 H3K27ac上调是肿瘤途径的激活的原因。所有这些数据总的来说表 明，H3K27ac相关转录输出激活众多肿瘤途径并导致对EZH2抑制的 抗性。
De Raedt等的先前工作(De Raedt等，2014)显示，PRC2功能 的丧失导致具有PRC2(SUZ12/EED)丧失和NF1突变的恶性外周神 经鞘瘤(MPMST)的亚组中的RAS-MAPK信号传导激活。在发明人 的当前研究中，对更广泛的癌症环境的探索允许发明人获得在PRC 功能丧失后的RAS信号传导激活的更完整的全景。至少存在三种主 要情况。在一些细胞如Pfeiffer细胞中，RAS/MAPK信号传导在EZH2 抑制后不增加。U2932细胞代表与De Raedt的发现相呼应的另一种情 况，其中Ras/MAPK信号传导通过EZH2i诱导的H3K27ac上调而激活，并且H3K27ac的抑制可以阻断其激活。除了这两种情况之外， 还存在表现得更常出现的另一种可能性，其中H3K27ac与PRC2的同 时抑制可以通过不同的机制如减少ERK1转录而导致Ras/MAPK信号 传导的反馈激活。这些发现提供了证实肿瘤途径在表观遗传调节后的 差异性响应的例子，凸显了机制的深入挖掘及剖析对癌症治疗的重要 性。
总的来说，本研究中揭示的表观遗传相互影响使发明人能够将 EZH2抑制剂的治疗潜力从血液恶性肿瘤扩展到实体瘤。在实体瘤中， 显示出EZH2抑制驱动的转录变化对于H3K27me调节的转录网络不 是必要的。相反，MLL1/P300依赖性H3K27ac对于确定最终和环境 依赖性转录输出是必要的。值得注意的是，在该环境中H3K27ac的 阻断可以通过ERK1的转录抑制而产生对MAPK途径的细胞生长依 赖性(图7A)。这些洞见揭示，EZH2抑制介导的H3K27me和H3K27ac 的串扰促成的转录脆弱性是潜在的癌症治疗突破口。
因此，EZH2过表达患者可以按照基于EZH2的疗法而分为三种 亚型，即EZH2单一疗法，其与BRD4抑制剂或p300抑制剂的组合， 以及加上MAPK途径抑制剂的三重组合。在临床实践中，提出了由 固有MLL1表达和后续的ERK反馈激活情况指导不同的用药策略(图 7B)。发明人的发现为EZH2异常患者提供了基于MLL1引导的组合 疗法的恰当患者分群的可能方案，其可以快速转换为临床试验。近期 Tazemetostat试验作为治疗EZH2突变型DLBCL患者的单药疗法的失 败(NCT01897571)实际上强调了对组合疗法的合理整合和识别可能 响应者的生物标志物的同时开发的需要，其可以扩大EZH2抑制剂在 临床中的癌症治疗中的转化途径。
因此，在一个方面，本发明提供了一种治疗受试者中的EZH2异 常相关癌症的方法，其包括：
(1)测定所述受试者的MLL1水平并与参比MLL1水平相比较； 和/或
(2)向所述受试者施用EZH2抑制剂，并在施用之前和之后， 测定所述受试者的H3K27乙酰化；
其中当所述受试者的MLL1水平高于所述参比MLL1水平和/或 所述受试者的H3K27乙酰化在施用所述EZH2抑制剂之后增加时， 向所述受试者施用EZH2抑制剂和H3K27乙酰化抑制剂的药物组合。
根据本发明的一个方面的方法还包括：
(1)测定所述受试者的ERK水平并与参比ERK水平相比较； 和/或
(2)在向所述受试者施用所述EZH2抑制剂和H3K27乙酰化抑 制剂的药物组合之前和之后，测定所述受试者的ERK水平；
其中当所述受试者的ERK水平高于所述参比ERK水平和/或所述 受试者的ERK水平在施用所述EZH2抑制剂和H3K27乙酰化抑制剂 的药物组合之后增加时，向所述受试者施用EZH2抑制剂，H3K27乙 酰化抑制剂，和MAPK信号传导通路阻断剂的药物组合。
在另一个方面，本发明提供了一种用于治疗EZH2异常相关癌症 的药物组合，其包含EZH2抑制剂和H3K27乙酰化抑制剂。
根据本发明的一个方面的药物组合还包含MAPK信号传导通路 阻断剂。
在又一个方面，本发明提供了一种患有EZH2异常相关癌症的受 试者的分群方法，其包括：
(1)测定所述受试者的MLL1水平并与参比MLL1水平相比较； 和/或
(2)向所述受试者施用EZH2抑制剂，并在施用之前和之后， 测定所述受试者的H3K27乙酰化；
其中当所述受试者的MLL1水平高于所述参比MLL1水平和/或 所述受试者的H3K27乙酰化在施用所述EZH2抑制剂之后增加时， 将所述受试者标记为MLL1阳性。
根据本发明的一个方面的方法还包括：
(1)测定所述标记为MLL1阳性的受试者的ERK水平并与参比 ERK水平相比较；和/或
(2)向所述标记为MLL1阳性的受试者施用EZH2抑制剂和 H3K27乙酰化抑制剂的药物组合，并在施用之前和之后，测定所述受 试者的ERK水平；
其中当所述标记为MLL1阳性的受试者的ERK水平高于所述参 比ERK水平和/或所述标记为MLL1阳性的受试者的ERK水平在施 用所述EZH2抑制剂和H3K27乙酰化抑制剂的药物组合之后增加时， 将所述标记为MLL1阳性的受试者标记为MLL1+ERK双阳性。
在又一个方面，本发明提供了一种用于患有EZH2异常相关癌症 的受试者的分群的试剂盒，其包括：
(1)用于测定所述受试者的MLL1水平的试剂；和/或
(2)用于测定所述受试者的H3K27乙酰化的试剂。
根据本发明的一个方面的试剂盒，其还包括用于测定所述受试者 的ERK水平的试剂。
在又一个方面，本发明提供了包含EZH2抑制剂和H3K27乙酰 化抑制剂的药物组合在制备用于在受试者中治疗EZH2异常相关癌症 的药物中的用途，优选地所述受试者是MLL1阳性受试者。
在又一个方面，本发明提供了包含EZH2抑制剂，H3K27乙酰化 抑制剂和MAPK信号传导通路阻断剂的药物组合在制备用于在受试 者中治疗EZH2异常相关癌症的药物中的用途，优选地所述受试者是 MLL1阳性受试者，更优选地所述受试者是MLL1+ERK双阳性受试者。
在又一个方面，本发明提供了一种用于治疗受试者中的EZH2异 常相关癌症的试剂盒，其包括：
(1)用于测定所述受试者的MLL1水平的试剂；和/或
(2)用于测定所述受试者的H3K27乙酰化的试剂；和
(3)包含EZH2抑制剂和H3K27乙酰化抑制剂的药物组合。
根据本发明的一个方面的试剂盒还包括：
(1)用于测定所述受试者的ERK水平的试剂；和
(2)MAPK信号传导通路阻断剂。
如本文所用，术语“EZH2抑制剂(EZH2i)”是指对EZH2可以起 到抑制作用的试剂。
适用于本发明的EZH2抑制剂可以选自CPI-1205(组蛋白赖氨酸 甲基转移酶EZH2的抑制剂)、EPZ-6438(E7438)(选择性EZH2抑 制剂)、EPZ011989(口服活性的EZH2抑制剂)、PF-06726304(选 择性EZH2抑制剂)、EI1(有效的选择性EZH2抑制剂)、GSK503 (特异性EZH2甲基转移酶抑制剂)、GSK343(选择性EZH2抑制 剂)、UNC1999(具有口服活性的EZH2和EZH1选择性抑制剂)、 EPZ005687(选择性EZH2抑制剂)、GSK126(高选择性EZH2methyltransferase抑制剂)、CPI-169(有效的选择性EZH2抑制剂， 作用于EZH2 WT，EZH2Y641N)。优选地，EZH2抑制剂可以选自 EPZ-6438(E7438)和CPI-169。
如本文所用，术语“H3K27乙酰化抑制剂”是指对H3K27乙酰化 可以起到抑制作用的试剂，包括但不限于作用于H3K27乙酰化的形 成和/或功能的试剂。
适用于本发明的H3K27乙酰化抑制剂可以选自MLL抑制剂、 CBP/P300抑制剂和BRD4抑制剂。优选地，H3K27乙酰化抑制剂是 BRD4抑制剂。
适用于本发明的MLL抑制剂可以选自OICR-9429 (WDR5-MLL)、MI-463(Menin-MLL抑制剂)、MM-102(多肽模 拟的MLL1抑制剂)、MI-503(Menin-MLL抑制剂)、MI-3(Menin-MLL抑制剂)、MI-2(Menin-MLL抑制剂)、MI-136(抑制DHT)。
适用于本发明的CBP/P300抑制剂可以选自CPI-637(CBP/EP300 溴结构域蛋白抑制剂)、SGC-CBP30(CREBBP/EP300抑制剂)、 PF-CBP1HCl(CREBBP溴区结构域抑制剂)、ICG-001(拮抗 Wnt/β-catenin/TCF介导的转录)、C646(histone acetyltransferase抑 制剂，抑制p300)、Curcumin(p300histone acetylatransferase和Histone deacetylase的抑制剂)、Anacardic Acid(p300及p300/CBP相关因子 histone acetyltranferases的抑制剂)。
适用于本发明的BRD4抑制剂可以选自BRD4770(G9a抑制剂)、 CPI-0610(BET溴结构域蛋白抑制剂)、PFI-1(PF-6405761)(高度 选择性的BET(包含溴结构域蛋白)抑制剂，作用于BRD4和BRD2)、 CPI203(BET bromodomain抑制剂，其作用于BRD4)、MS436(BETbromodomain抑制剂，其作用于BRD4)、Bromosporine(广谱bromodomains抑制剂，作用于BRD2，BRD4，BRD9和CECR2)、 OTX015(BET bromodomain抑制剂)、Mivebresib(ABBV-075)(BET family bromodomain抑制剂)、I-BET151(GSK1210151A)(BET抑制 剂，作用于BRD2)、JQ1(BET bromodomain抑制剂，作用于 BRD4(1/2))、SGC-CBP30(强效的CREBBP/EP300抑制剂)、AZD5153 (BET/BRD4溴区抑制剂)、I-BRD9(GSK602)(选择性BRD9抑制 剂，也针对BRD4)、GSK1324726A(I-BET726)(BET家族蛋白的高 选择性抑制剂，作用于BRD2,BRD3,和BRD4)、SF2523(高度选 择性的PI3K抑制剂)。优选地，BRD4抑制剂可以选自OTX015和 JQ1。
如本文所用，术语“MAPK信号通路抑制剂”是指对MAPK信号 通路的部分或整体可以起到抑制作用的试剂。
MAPK信号通路抑制剂可以选自p38MAPK抑制剂、JNK抑制 剂、ERK抑制剂、Raf抑制剂、MEK抑制剂、TOPK抑制剂、MNK 抑制剂。
适用于本发明的p38MAPK抑制剂可以选自SB203580、 Doramapimod(BIRB 796)、SB202190(FHPI)、Ralimetinib (LY2228820)、VX-702、UM-164、PH-797804、VX-745、TAK-715、 Pamapimod(R-1503,Ro4402257)、SB239063、Skepinone-L、 Losmapimod(GW856553X)、Asiatic acid、BMS-582949、Pexmetinib (ARRY-614)。
适用于本发明的JNK抑制剂可以选自SP600125、JNK-IN-8、 Vacquinol-1、Anisomycin、JNK inhibitor IX、Tanzisertib(CC-930)、 DTP3、BI-78D3。
适用于本发明的ERK抑制剂可以选自SCH772984、DEL-22379、 VX-11e、ERK5-IN-1、XMD8-92、LY3214996、Ulixertinib(BVD-523, VRT752271)、FR 180204、GDC-0994、Pluripotin(SC1)。优选地，ERK 抑制剂可以选自GDC-0994。
适用于本发明的Raf抑制剂可以选自Vemurafenib(PLX4032, RG7204)、SorafenibTosylate、PLX-4720、Dabrafenib(GSK2118436)、 GDC-0879、Dabrafenib Mesylate、Regorafenib、RAF709、Lifirafenib (BGB-283)、RAF265(CHIR-265)、AZ 628、NVP-BHG712、SB590885、 ZM 336372、Sorafenib、GW5074、TAK-632、Raf265衍生物、 CEP-32496、Encorafenib(LGX818)、BAW2881(NVP-BAW2881)、 CCT196969、PLX7904(PB04)、LY03009120、RO5126766(CH5126766)、 MLN2480。
适用于本发明的MEK抑制剂可以选自Selumetinib(AZD6244)、 PD0325901、Trametinib(GSK1120212)、U0126-EtOH、PD184352 (CI-1040)、PD98059、BIX02189、Pimasertib(AS-703026)、BIX 02188、 TAK-733、AZD8330、Binimetinib(MEK162,ARRY-162,ARRY-438162)、PD318088、Honokiol、SL-327、Refametinib(RDEA119, Bay 86-9766)、Myricetin、BI-847325、Cobimetinib(GDC-0973, RG7420)、GDC-0623、APS-2-79HCl。
适用于本发明的TOPK抑制剂可以选自OTS514hydrochloride、 OTS964。
适用于本发明的MNK抑制剂可以选自CGP 57380、eFT-508 (eFT508)。
在一些实施方式中，本文所述的药物组合可以包含一种或多种上 文提到的抑制剂。如本文所用，术语“多种”可以是多于一种，例如， 两种，三种，四种，五种或更多种。
在一些实施方式中，本文所述的药物组合包含有效量的上文提到 的抑制剂。如本文所用，术语“有效量”是指本文所述的药物组合中的 组分作为整体实现有效治疗的量，例如有效抑制癌细胞增殖的量。在 一些实施方式中，本文所述的药物组合以有效量施用于受试者。
在一些方面，本文所述的药物组合以按受试者重量计的剂量施 用。在一些实施方式中，本文所述的药物组合包含按受试者重量计的 量的上文提到的抑制剂。
在一些实施方式中，按受试者重量计，本文所述的药物组合中的 上文提到的抑制剂的量在约1.0至约50.0mg/kg或更高，优选约5.0 至40.0mg/kg，更优选约10.0至30.0mg/kg，最优选约12.5至25.0 mg/kg的范围中。在一些实施方式中，按受试者重量计，本文所述的 药物组合中的上文提到的抑制剂量为约1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、 10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、 16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、20.5、21.0、21.5、22.0、22.5、23.0、23.5、24.0、24.5、25.0、25.5、26.0、26.5、 27.0、27.5、28.0、28.5、29.0、29.5、30.0、30.5、31.0、31.5、32.0、 32.5、33.0、33.5、34.0、34.5、35.0、35.5、36.0、36.5、37.0、37.5、 38.0、38.5、39.0、39.5、40.0、40.5、41.0、41.5、42.0、42.5、43.0、 43.5、44.0、44.5、45.0、45.5、46.0、46.5、47.0、47.5、48.0、48.5、 49.0、49.5、50.0mg/kg或更高，或者任意前述值作为端点构成的范 围或其中的任意值，例如约1.1至1.4mg/kg等或约1.1、1.2、1.3、 1.4mg/kg等。
在另一些方面，本文所述的药物组合以固定剂量施用。在一些实 施方式中，本文所述的药物组合包含固定量的上文提到的抑制剂。
在一些实施方式中，本文所述的药物组合中的上文提到的抑制剂 的量各自独立地是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、 44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、 95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、 155、160、165、170、175、180、185、190、195、200mg或更高， 或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值，例如约1.1至 1.4mg等或约1.1、1.2、1.3、1.4mg等。
在又一些方面，本文所述的药物组合中的部分组分以如上所述的 按受试者重量计的剂量施用，而其他组分以如上所述的固定剂量施 用。在一些实施方式中，本文所述的药物组合中的部分组分的量是如 上所述的以受试者重量计的量，而其他组分是如上所述的固定量。
在一些实施方式中，本文所述的药物组合中的上文提到的抑制剂 的重量比为x：y(：z)，其中x和y(和z)各自独立地是约1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20。
受试者中的MLL1水平、H3K27乙酰化和/或ERK水平可以通过 本文描述的方法和/或试剂或者本领域已知的方法和/或试剂测定。例 如，可以使用本领域公知的免疫组织化学的方法测定。
在一些情况下，患有EZH2异常相关癌症的受试者中的MLL1水 平、H3K27乙酰化和/或ERK水平定性或定量地高于参比或高于接受 相关治疗之前的受试者。在一些实施方式中，患有EZH2异常相关癌 症的受试者中的MLL1水平、H3K27乙酰化和/或ERK水平比参比或接受相关治疗之前的受试者各自独立地高约5至1000％或更多，例如 约至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、 55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、150％、 200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％、600％、650％、700％、750％、800％、850％、900％、950％、1000％或更多， 或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值，例如约7％至 约28％等或约7％、14％、21％、28％等。
在一些实施方式中，受试者是哺乳动物。在一个实施方式中，受 试者是小鼠。在另一个实施方式中，受试者是人。
如本文所用，术语“治疗”一般是指获得需要的药理和/或生理效 应。该效应根据完全或部分地预防疾病或其症状，可以是预防性的； 和/或根据部分或完全稳定或治愈疾病和/或由于疾病产生的副作用， 可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖了对患者疾病的任何治疗， 包括：(a)预防易感染疾病或症状但还没诊断出患病的患者所发生 的疾病或症状；(b)抑制疾病的症状，即阻止其发展；或(c)缓解 疾病的症状，即，导致疾病或症状退化。
适用于本发明的癌症可以是EZH2异常相关癌症，所述EZH2异 常包括，但不限于，如本文中所述的EZH2突变或过表达(突变型或 野生型)。EZH2异常相关癌症可以包括，但不限于，血液恶性肿瘤， 例如白血病(例如慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血 病(ALL)、或慢性髓性白血病(CML))、淋巴瘤(例如，大B细 胞淋巴瘤，套细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或霍奇金淋巴瘤)或多发 性骨髓瘤，或者实体瘤，如胃肠道、乳腺、卵巢、前列腺、肝、肺、 肾癌，或其组合癌。优选地，EZH2异常相关癌症可以是实体瘤，更 优选地所述实体瘤可以选自乳腺癌，肝癌，胰腺癌和肺癌。
癌症的实例包括但不限于白血病(例如，急性白血病、急性淋巴 细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性成髓细胞白血病、急性早幼粒 细胞白血病、急性骨髓单核细胞性白血病、急性单核细胞白血病、急 性红白血病、慢性白血病、慢性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病)、 真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如，何杰金氏病、非何杰金氏病)、 沃尔登斯特伦氏(Waldenstrom's)巨球蛋白血症、重链病和实体瘤例 如肉瘤和癌(例如，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨 原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮 肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠 癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、 腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、 支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎 性癌、成肾细胞瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、 膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽 管瘤、室管膜细胞瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶 质细胞瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤及成视网膜细 胞瘤)。淋巴增生性障碍也视为增生性疾病。
如前所述，本发明的药物组合有效抑制癌细胞。在一些实施方式 中，本发明的药物组合的癌细胞抑制率可以为约5％至100％，例如约 至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、 55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任 意值，例如约7％至约28％等或约7％、14％、21％、28％等。在一些 优选实施方式中，本发明的药物组合的癌细胞抑制率可以为约至少 40％，50％，60％，70％，80％或90％。
如前所述，本发明的药物组合相对于例如采用EZH2抑制剂的单 药疗法显著有效地改善治疗效果。在一些实施方式中，本发明的药物 组合相对于单药疗法改善约5％至1000％或更多，例如约至少5％、 10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、 65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、150％、200％、 250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％、600％、650％、 700％、750％、800％、850％、900％、950％、1000％或更多，或者任 意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值，例如约7％至约28％ 等或约7％、14％、21％、28％等。
向患有EZH2异常相关癌症的受试者施用本发明的药物组合可以 有效抑制癌细胞增殖，并延长受试者的生存期。在一些实施方式中， 被施用本发明的药物组合的受试者的生存期可以延长在约1％至 1000％或更多，例如约至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、 40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、 95％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、 500％、550％、600％、650％、700％、750％、800％、850％、900％、 950％、1000％或更多，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的 任意值，例如约7％至约28％等或约7％、14％、21％、28％等。
向受试者施用本发明的药物组合可以有效减少H3K27乙酰化和/ 或降低MAPK信号传导通路的活动水平。在一些实施方式中，在施 用本发明的药物组合后，受试者中的H3K27乙酰化和/或MAPK信号 传导通路的活动水平相对于相关治疗前各自独立地减少和/或降低约 1至100％，例如约1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、 30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、 85％、90％、95％或99％或100％，或者任意前述值作为端点构成的范 围或其中的任意值，例如约7％至约28％等或约7％、14％、21％、28％ 等。
本发明的药物组合中的组分可以各自分开配制，或者其中的部分 或全部共同配制。在一个实施方式中，本发明的药物组合可以配制成 适合于单次或多次施用的药物组合物。
本发明的药物组合中的组分可以各自单独施用，或者其中的部分 或全部共同施用。本发明的药物组合中的组分可以基本上不同时施 用，或者其中的部分或全部基本上同时施用。
本发明的药物组合中的组分可以各自独立地以适合的各种途径 施用，包括，但不限于，口服或肠胃外(通过静脉内、肌内、局部或 皮下途径)。在一些实施方式中，本发明的药物组合的组分可以各自 独立地口服施用或注射施用，例如静脉注射或腹腔注射。
本发明的药物组合中的组分可以各自独立地是适合的剂型，包 括，但不限于，片剂、含片、丸剂、胶囊剂(例如硬胶囊、软胶囊、 肠溶胶囊、微囊剂)、酏剂、颗粒剂、糖浆剂、注射剂(肌肉内、静 脉内、腹腔内)、颗粒剂、乳剂、悬浮液、溶液、分散剂和用于口服 或非口服给药的缓释制剂的剂型。
本发明的药物组合中的组分可以各自独立地含有药学上可接受 的载体和/或赋形剂。
本发明的药物组合中的组分可以各自独立地每1天、每2天、每 3天、每4天、每5天、每6天，每周、每2周、每3周或每月或以 更低的频率施用。
本发明的药物组合中的组分可以各自独立地每天施用1次、2次、 3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次或更多次。
本发明的药物组合中的组分可以各自独立地连续1天、2天、3 天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13 天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天或30天或更久 施用。
本发明的药物组合中的组分中的一种组分可以在另一种组分之 前或之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10 天或更多天施用。例如，在一个实施方式中，在第1天施用本发明的 药物组合中的组分1，并在2天后(即，第3天)施用本发明的药物 组合中的组分2，和在又3天后(即，第6天)施用本发明的药物组 合中的组分1。
本发明的药物组合还可以包含另外的治疗剂。在一个实施方式 中，所述另外的治疗剂是本领域已知的癌症治疗剂。
在本申请中出现一系列列举数值的所有地方，应理解任意所列举 的数值可以是数值范围的上限或下限。还应理解本发明涵盖所有这样 的数值范围，即具有数值上限和数值下限的组合的一个范围，其中上 限和下限各自的数值都可以是本发明中列举的任意数值。本发明提供 的范围应理解为包括该范围内的所有值。例如，1-10应理解为包括值 1、2、3、4、5、6、7、8、9和10中的全部，并视情况包括分数值。 表达为“至多(up to)”某个值(例如至多5)的范围应理解为所有值 (包括该范围的上限)，例如0、1、2、3、4和5，并视情况包括分数值。至多一周或在一周内应理解为包括0.5、1、2、3、4、5、6或 7天。类似地，由“至少”限定的范围应理解为包括所提供的较低值和 所有更高的值。
除非另有指出，所有百分比形式是重量/重量。
如本发明所用，“约”应理解为包括在平均值的三个标准偏差内或 特定领域中的标准公差范围内。在某些实施方式中，约应理解为不超 过0.5的变异。“约”修饰其后所有列举的值。例如，“约1、2、3”表示 “约1”、“约2”、“约3”。
冠词“一(a)”和“一个(an)”在本发明中用以指一个或超过一个 (即，至少一个)该冠词的语法客体。举例来说，“一个要素”指一个 要素或超过一个要素。
术语“包括”在本发明中用以指短语“包括但不限于”并可与其互换 地使用。
除非上下文另有明确指出，术语“或”在本发明中包含性地用以指 术语“和/或”并可与其互换地使用。
术语“例如”在本发明中用以指短语“例如但不限于”并可与其互换 地使用。
本领域技术人员应理解，上文在各个实施方式中记载的技术特征 可以单独或组合地与本发明的各个方面的技术方案组合使用。
本发明的一些实施方式通过下文的非限制性实施例说明。
实施例
细胞系
将细胞维持在供应商建议的适当培养基中。
体内肿瘤模型
本发明中使用CDX(细胞系依赖性异种移植物)和PDX(患者 依赖性异种移植物)模型。将癌细胞或患者组织片段皮下植入Balb/c 裸鼠或SCID雌性/雄性小鼠(4至8周龄)的胁腹区域，小鼠由中国 科学院上海实验动物中心，上海SIPPR BK实验动物有限公司和上海凌昌生物科技有限公司提供。这些研究是根据上海药物研究所的机构 动物护理和使用委员会指南进行的。此外，所有HCC PDX模型均由 WuXi Pharma Tech严格按照NIH实验动物护理和使用指南进行。并 且BxPC-3和NCI-H727CDX模型由PharmaLegacy Laboratories(Shanghai)进行。本部分中与动物处理，护理和治疗相关的所有程 序均按照Pharmalegacy机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的 指南进行，并遵循实验动物关怀评估和认证协会(AAALC)的指导)。
方法细节
基于SILAC(细胞培养中氨基酸稳定同位素标记)的细胞培养
细胞在SILAC标记培养基中生长。Roswell Park Memorial Institute 培养基1640(RPMI 1640)补充有2mM L-谷氨酰胺，100U/mL青霉 素，0.1mg/ml链霉素和10％透析的胎牛血清(FBS)(Invitrogen Corp.)，并分别用13C6-Lys和13C6-15N4-Arg(重)以及12C6-Lys和12C6-14N4-Arg(轻)重建。将细胞分到作为重的和轻的的6cm培养皿 中，并在5％CO2供应、37℃下生长至少6倍。通过质谱法测定，在“重” 培养基中培养的细胞中13C6-Lys和13C6-15N4-Arg的掺入效率均大于 98％。对于组蛋白修饰丰度分析，将在重的中培养的细胞用1μMEPZ-6438处理6天，而用DMSO处理轻细胞作为对照。通过5％胰蛋 白酶处理收获细胞，并用冰冷的Dulbecco's PBS(Mediatech Inc., Manassas,VA)洗涤三次。
组蛋白提取和凝胶内消化
将重细胞和轻细胞以1:1的比率混合，并通过酸提取法提取核心 组蛋白(Shechter等，2007)。简而言之，用3倍体积的提取缓冲液 (10mM HEPES pH 7.0，10mM KCl，1.5mM MgCl2，0.34M蔗糖， 0.5％NP-40和1X蛋白酶抑制剂混合物)裂解细胞。离心后，用不含 NP-40的提取缓冲液洗涤沉淀，然后在4℃下在0.2M H2SO4中重悬 浮过夜。离心后，收集上清液用于三氯乙酸辅助沉淀。然后用含有0.1％ (v/v)HCl的冷却(-20℃)丙酮洗涤沉淀物，然后用冰冷的100％丙 酮洗涤两次。通过SDS-PAGE分离沉淀物，并通过考马斯亮蓝染色显 现。切下组蛋白的条带(H2A，H2B，H3和H4)并切成1mm3切片。 胰蛋白酶用于在37℃下消化组蛋白过夜，并提取胰蛋白酶肽用于质 谱分析。
组蛋白修饰位点的鉴定和定量
所有获得的MS原始文件由Proteome Discoverer软件(版本1.4， Thermo FisherScientific，Waltham，MA)转换为MGF格式，然后所 有MGF文件由Mascot软件(版本2.3.01，Matrix Science Ltd.，London， UK)针对从UniProt数据库(2014年9月24日更新)生成的人组蛋 白序列数据库(94个序列，14,024个残基)进行分析。如下使用两组 参数搜索组蛋白修饰。1)对于轻组蛋白肽，乙酰基(K)，甲基(KR)， 二甲基(KR)，三甲基(K)，丙酰基(K)，丁酰基(K)，丙二 酰基(K)，琥珀酰基(K)，巴豆酰基(K)，泛素基(K)，ADP 核糖基化(K)，2-羟基异丁酰基化(K)和磷酰基(STY)基团被指 定为可变修饰。2)对于重组蛋白肽，标签：13(6)(K)，标签： 13(6)(K)15N(4)R，标签：13(6)+乙酰基(K)，标签：13 (6)+甲基(KR)，标签：13(6)+二甲基(KR)，标签：13(6) +三甲基(K)，标签：13(6)+丙酰基(K)，标签：13(6)+丁酰 基(K)，标签：13(6)+丙二酰基(K)，标签：13(6)+琥珀酰 基(K)，标签：13(6)+巴豆酰基(K)，标签：13(6)+泛素基 (K)标签：13(6)+ADP核糖基化(K)和标签：13(6)+2-羟基 异丁酰基(K)被指定为可变修饰。用于所有分析的其他参数如下所 述。母离子的质量误差为±10ppm，碎片离子的质量误差为±0.5Da。 酶被指定为胰蛋白酶，最多有5个错过的切割。肽离子评分截止值为 20，并且根据先前报道的标准手动检查所有鉴定的肽的光谱以确保肽 鉴定的准确性(Chen等，2005；Nie等，2017；Xie等，2012)。使 用Qual Browser版本3.0.63(Thermo FisherScientific)手动定量所鉴 定的携带修饰的肽。为每个前体m/z值构建提取的离子色谱图，质量 公差为10ppm，质量精度至多四位小数。计算具有相同保留时间间隔 的一对重肽和轻肽的峰面积(Jung等，2010)。未修饰肽的SILAC 比率用于蛋白质表达水平的标准化。对每种细胞系(U2932， SMMC-7721，T47D，SU-DHL-4，KARPAS-422，Pfeiffer)进行两次 技术重复。学生t检验用于确定组蛋白标记的显著变化。至少2倍的 变化和p值<0.05被认为是显著性差异。
用于串联质量标签(TMT)标记的样品制备
将细胞进行DMSO对照处理或用EPZ-6438处理6天。通过处理 5％胰蛋白酶收获细胞，用冰冷的Dulbecco's PBS(Mediatech Inc., Manassas,VA)洗涤三次，收集在冷冻裂解缓冲液(两份0.1M NH4HCO3和一份0.1M NaHCO3(v/v)中的8.0M尿素，含有1×蛋白 酶抑制剂和1×磷酸酶抑制剂)中，并在冰上孵育半小时。将裂解物 在4℃下以20,000g离心5分钟。将上清液转移到另一管中，通过BCA (二喹啉甲酸)测定法测定蛋白质浓度。将二硫苏糖醇加入到蛋白质 溶液(200μg蛋白质)中至终浓度为5mM，然后将裂解物在56℃ 温育30分钟，然后在室温下在黑暗中与15mM碘乙酰胺一起温育30 分钟。烷基化反应在室温下用30mM半胱氨酸猝灭另外30分钟。将 蛋白质溶液用100mM NH4HCO3(pH 8.0)稀释4倍，然后用测序级 胰蛋白酶以1:50(w/w)的胰蛋白酶-蛋白质比率在37℃处理16小时。 然后在37℃下以1:100(w/w)的胰蛋白酶与蛋白质比率加入胰蛋白 酶另外4小时以完成消化循环。通过SepPakC18柱将胰蛋白酶肽脱 盐并在TMT标记之前真空干燥。
TMT标记，基本反相分馏和质谱分析
如前所述进行TMT标记(Paulo等，2015a)。对于每种条件， 用TMT试剂标记50μg肽。DMSO对照样品用126，128和130标记； EPZ-6438处理的样品用127，129和131标记。在室温下孵育1小时 后，用羟胺淬灭反应至终浓度为0.5％(v/v)。通过差异TMT修饰测 定，肽的标记效率>97％。将TMT标记的样品以1:1的比率在所有样 品中合并，随后真空离心至接近干燥并进行Sep-Pak C18脱盐。
使用Waters XBridge Peptide BEH C18柱(
Figure BDA0001774158450000321
5μM，4.6×250 mm，WatersCorp.，Milford，MA)，使用从2％至95％的缓冲液B (10mM甲酸铵/80％ACN，pH 8.5)的90分钟梯度，流速为1mL/min， 通过高pH反相HPLC分离TMT标记的肽(300μg)。将样品收集到 80个级分中，合并成20个级分，并真空干燥用于质谱分析。
将干燥的肽样品溶解在缓冲液A(0.1％甲酸水溶液，v/v)中。 使用基于MS2的方法，进行从8％至45％乙腈的70分钟梯度，在 Orbitrap Fusion(Thermo Scientific)上对每个级分进行分析。对于全 扫描，AGC目标为100万，最大注射时间为200毫秒；对于MS/MS扫描，AGC目标为5000，最大注射时间为50毫秒。在Orbitrap中获 得调查全扫描MS谱(从m/z450到1500)，在m/z 400处分辨率 R＝120,000，随后是3秒最高速度与32％的高碰撞解离(HCD)能量 的MS/MS碎裂。
如前所述，使用TiO2(二氧化钛)富集TMT标记的磷酸化肽(Paulo 和Gygi，2015；Paulo等，2015b)。简而言之，将1mg 6-plex TMT 标记的肽重悬于上样缓冲液(6％TFA，80％ACN，1M乳酸)中，然 后与二氧化钛珠(Titansphere，GL Sciences，Japan)在室温下一起孵育30分钟。用上样缓冲液和洗涤缓冲液(0.5％TFA，50％ACN)洗 涤珠。用15％NH3H2O洗脱富集的磷酸化肽，并真空离心至干。
将干燥的磷酸化肽样品脱盐，然后溶解在缓冲液A(0.1％甲酸水 溶液，v/v)中。使用基于MS2的方法，进行从2％至36％乙腈的110 分钟梯度，在Orbitrap Fusion上分析每个级分。对于全扫描，AGC目 标为100万，最大注射时间为200毫秒；对于MS/MS扫描，AGC目 标为为5000，最大注射时间为50毫秒。在Orbitrap中获得调查全扫 描MS光谱(从m/z 350到1500)，在m/z 400处分辨率R＝120 000， 随后是3秒最高速度与32％的高碰撞解离(HCD)能量的MS/MS碎 裂。
细胞活力测定
将细胞接种在96孔板中过夜，并用指定的药物处理。在孵育6 天后进行SRB或CCK8测定(Life Technologies)。在ELISA板读数 器上，对于CCK8，在450nm的波长处读取吸光度(光密度，OD)； 对于SRB，在515nm的波长处读取吸光度。使用四参数方法通过浓 度-响应曲线拟合计算IC 50值。
免疫印迹法分析
对于免疫印迹法，使用预热的2％SDS裂解细胞，然后煮沸30分 钟。使用BCA测定法(Thermo Scientific)测定蛋白质浓度。通过十 二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质，并转 移到硝酸纤维素膜(General Electric)上。将膜在室温下用在1×Tris 缓冲盐水Tween-20(TBST)(25mM Tris，150mM NaCl，2mM KCl， pH 7.4，补充有0.2％Tween-20)的5％牛奶封闭1小时并在4℃下用 指定一抗过夜探测。在用TBST洗涤三次30分钟后，将膜与过氧化 物酶缀合的二抗在室温下孵育1小时。将膜用TBST洗涤三次并用化 学发光(Thermo Scientific)显色。从多个实验中显示了代表性的印迹。 图1C，图2E，图3K中的条带强度通过ImageJ定量，并使用β-肌动 蛋白，GAPDH或组蛋白H3作为管家蛋白进行标准化。
如下进行Co-IP或IP实验：将细胞在裂解缓冲液(NP-40，1×蛋 白酶抑制剂混合物(Roche)和磷酸酶抑制剂(Roche))中在冰上裂 解30分钟。将粗裂解物在4℃下以12,000×g离心15分钟。将上清 液与合适的抗体(例如p300，Active Motif)一起孵育，在4℃下摇 动12小时。加入蛋白A/G加琼脂糖(Santa Cruz Biotechnology)， 然后在4℃摇动6小时至过夜。用裂解缓冲液洗涤珠三次。通过在 1×SDS运行缓冲液中煮沸而洗脱蛋白质，并进行SDS-PAGE进行免 疫印迹法。
RNA分离和RT-qPCR分析
使用Trizol提取(Invitrogen)分离来自细胞系的RNA。使用 HiScript II 1stStrand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)(Vazyme) 制备cDNA。按照ChamQ SYBR qPCRMaster Mix(Vazyme)和V7 实时PCR系统(Applied Biosystems)的说明进行RT-qPCR。使用ΔΔCT 方法计算相对于对照的表达值。β-肌动蛋白用作管家基因用于标准 化。结果表示为倍数表达。用于qPCR分析的引物序列如下列出。
Figure BDA0001774158450000341
ChIP-seq和ChIP-qPCR
H3K27ac ChIP-seq数据由Active Motif的表观遗传服务团队生 成。在10cm培养皿中铺板的U2932，SMMC-7721和MCF-7细胞未 经处理或分别用1μM EPZ-6438处理6天。然后将细胞用1％甲醛在 室温下固定10分钟。为了终止反应，在室温下添加5分钟甘氨酸至 终浓度为0.125M。刮下细胞并用每个培养皿的内容物转移到50ml 管中。在剩余的程序中，样品保持在冰上。在冷冻离心机中以800×g 离心管10分钟以沉淀细胞。将固定的细胞用10ml冷冻PBS-1％NP40 洗涤2次，最后用10ml冷冻PBS-1％NP40-PMSF(PMSF终浓度将为 1mM)洗涤。将细胞沉淀在液氮中快速冷冻10分钟，储存在-80℃， 然后在干冰上运送到ActiveMotif进行H3K27ac ChIP-seq测定。
根据制造商提供的程序，使用SimpleChIP Plus Enzymatic Chromatin IP Kit(Magnetic Beads)(Cell Signaling Technology，# 9005)进行ChIP测定。用于ChIP的抗体如下：抗免疫球蛋白G(Cell Signaling，#2729)，抗组蛋白H3(Cell Signaling，#4620)，抗组 蛋白H3K27me3(Cell Signaling，#9733)，抗组蛋白H3K27ac(活 性Motif，#39133)，anti-p300(Active Motif，#61401)和anti-MLL1 (Cell Signaling，#14197)。然后使用包含基因的启动子区域的引物， 将最终的ChIP DNA用作qPCR反应中的模板。引物的序列如下：
Figure BDA0001774158450000361
Figure BDA0001774158450000371
荧光素酶报告分析
使用Lipofectamine 2000试剂(Life Technologies，#11668019)， 用TCF荧光素酶报告质粒转染用1μM EPZ-6438预处理4天的细胞 48小时。使用DualLuciferaseReporter Assay System(Promega)分析 荧光素酶活性。将数据标准化为海肾荧光素酶活性。
克隆形成试验
将细胞以每孔500-1000个细胞的浓度接种到6孔板中。24小时 后，用指定化合物处理细胞约2周。将群落用固定溶液(10％甲醇+10％ 乙酸)在室温下固定15分钟，然后用甲醇中的1％结晶紫染色5分钟。
siRNA转染
对于siRNA转染，将细胞以约40％汇合铺板于OPTI-MEM无血 清培养基中，并根据制造商的说明使用Lipofectamine RNAiMAX Reagent Agent(Life Technologies，#13778-150)用特异性siRNA双 链体转染48小时。siRNA作为RPHPLC纯化的双链体订购自GenePharma。本研究中使用的siRNA序列如下所示。
Figure BDA0001774158450000372
Figure BDA0001774158450000381
RNA-seq
RNA-seq数据由Novogene compony生成。在10cm培养皿中铺 板的U2932，SMMC-7721和Pfeiffer细胞未经处理或分别用1 μMEPZ-6438处理6天。然后用PBS洗涤细胞3次，然后在室温下用 Trizol裂解。样品被送到Novogene compony。每样品3μg RNA的总 量被用作RNA样品制备的输入材料。根据制造商的推荐使用
Figure BDA0001774158450000382
UltraTM RNA LibraryPrep it for
Figure BDA0001774158450000383
(NEB，USA) 产生测序文库，并将索引代码添加到每个样品的属性序列中。根据制 造商的说明，使用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS(Illumia)在cBotCluster Generation System上进行索引编码样本的聚类。在簇生成后， 文库制备物在Illumina平台上测序，并产生125bp/150bp的配对末端 读数。
免疫组化(IHC)
通过石蜡包埋由4％多聚甲醛固定的肿瘤。IHC测定由上海佐诚 生物有限公司进行。EZH2 1:100(CST，#9005)和MLL1 1:200(CST， #14197)
联合治疗和体外协同作用的标准
如上所述在96孔板中进行组合疗法(细胞活力测定)。用梯度 浓度的EPZ-6438，JQ1或组合处理细胞6天，并通过SRB或CCK-8 测定法测量细胞生长。为了确定可能的协同效应的存在，通过 CalcuSyn Demo Version 2.0软件计算联合指数(CI)。联合指数CI<0.8 表示协同作用，CI>1.2表示拮抗作用。
体内药物治疗
已建立的PDX和CDX模型用于药物治疗。所有实验均根据上海 药物研究所动物护理和使用委员会，WuXi AppTec和Green Valley批 准的动物护理制度伦理指南进行。将肿瘤小鼠随机分组并在平均肿瘤 体积达到50-100mm3时开始给药。每天口服给予EPZ-6438(200 mg/kg，0.5％CMCNa+0.1％Tween80)，OTX015(50-70mg/kg， 1％DMSO+30％PEG300+1％Tween80+ddH2O)和GDC-0994(15-50 mg/kg，0.5％CMCNa+0.1％Tween80)且每天腹膜内给予JQ1(30-60 mg/kg，1％DMSO+5％葡萄糖)指定天数。对于联合治疗，同时给予 药物。使用公式(长×宽×宽)/2，使用卡尺每周两次或三次测量肿瘤 大小而监测肿瘤生长。每周测量体重两次或三次。在最后一次给药后 6小时将小鼠安乐死并收集肿瘤组织准备用于免疫印迹法或免疫组织 化学染色。对于全身毒性分析，在最终给药后6小时通过心脏穿刺采 集血样(500-800μL)，EDTA-2K作为抗凝血剂(500-800μL全血至 5μl 0.5M EDTA-2K中)。如下计算个体相对肿瘤体积(RTV)： RTV＝Vt/V0，其中Vt是每天的体积，V0是治疗开始时的体积。使用以 下公式测量TGI率：TGI(％)＝[1-(处理组中的Vt-V0)/(载体组中 的Vt-V0)]×100。
量化和统计分析
统计分析
使用GraphPad Prism软件(版本5.0)进行统计学分析。所有数 据均以平均值±SEM表示。使用非成对双尾学生t等方差性检验，或 者使用具有方差异质性的Welch校正的t检验，进行两个样本的分析 (图2A，图2F，图3G-H，图3J，图4B-D，图5E-F，图6A-D，图 8E，图9C-D，图9H，图11A-B和图13A-D)。在图10F中使用具 有Dunnnett多重比较检验的单因素方差分析。倍数富集值代表三种生 物学重复的平均值。使用BH调整的p值计算倍数富集的显著性。当 p值小于0.05时，差异被认为是统计学显著的。
蛋白质组学和磷酸化蛋白质组数据分析
所有原始数据文件都是使用MaxQuant(1.5.3.8)，蛋白质、肽和 修饰水平的FDR为<1％，针对Uniprot(2015年9月29日更新)的 人类数据库检索到。将酶特异性设定为胰蛋白酶，允许N-末端切割 成脯氨酸。对于蛋白质组数据分析，将乙酰基(蛋白质N-端)和氧 化(M)设定为可变修饰。对于磷酸化蛋白质组学数据分析，将乙酰 基(蛋白质N-端)，氧化(M)和磷酰基(STY)设定为可变修饰。 将赖氨酸残基和肽N-端(+229.163Da)上的TMT标记和半胱氨酸残 基的氨甲酰甲基化(+57.021Da)设定为固定修饰。允许最多两次错 过的切割，并且所需的最小肽长度为7个氨基酸。为了量化响应于 EPZ6438或JQ1处理而上调或下调的磷酸盐，通过中值中心化(即将 中值比设定为1)对重复的强度进行标准化，并计算每个重复的处理/ 对照比率。具有高于0.75的定位概率的磷酸化事件被认为位于相应的 S/T/Y残基上。在每个生物学重复中具有Benjamini-Hochberg(BH) 调整的p值<0.05的磷酸肽被定义为被显著性调节。用火山图可视化 来自生物重复的平均比率和相应的p值，并选择>1.5的倍数变化作为 显著性截止值。所有原始数据，检索参数和结果均可通过PRIDE数 据库(PXD008097)在Proteome-Xchange上获得。
KEGG通路分析
DAVID生物信息学功能注释工具用于识别富集的KEGG通路术 语。使用BH调整的p值<0.05计算倍数富集的显著性。 (http://david.abcc.ncifcrf.gov/)。
基因集富集分析
使用来自MSigDB的基因集集合“c6”(致癌特征)作为生物信息 学功能注释工具进行GSEA(基因集富集分析)。对于H3K27ac ChIP-seq数据分析，基因的单样品GSEA分析和启动子峰数差异被用 于三种细胞系(SMMC7721，U2932和Pfeiffer)(Mertins等，2016)。 然后将这些ChIP-seq特征用于基于前秩(pre-rank-based)的单样品 GSEA测试，以确定它们在由EPZ-6438处理的启动子峰数差异数据 中的富集。对于RNA-seq数据分析，将原始数据在用于GSEA分析 的三次重复中标准化。EPZ-6438处理的相对于DMSO处理的样品的 信噪比数据被用于测定RNA-seq富集通路。蛋白质组学数据被过滤以 除去具有缺失值的蛋白质并通过使用中值标准化组合以获得 EPZ-6438处理(或EPZ-6438-JQ1组合)与DMSO比较的比率。然后 将这些蛋白质特征用于基于前秩的GSEA测试，以确定它们在 EPZ-6438处理的(或EPZ-6438-JQ1组合)相对于DMSO处理的样品 比率数据中的富集。所有测试通路的热图如图3A所示。图10A显示 了H3K27ac ChIP-seq，RNA-seq和蛋白质组中选定的致癌通路的富 集。EPZ-6438处理和EPZ-6438-JQ1共处理后蛋白质组的富集的致癌 通路如图5A所示。R包'Heatmap'用于绘图。
数据和软件可用性
蛋白质组学原始数据已上传至ProteomeXchange Consortium (Vizcaino等，2016)，数据集标识符PXD008097(用户名： reviewer10003@ebi.ac.uk密码：BzRY5wCW)。本文报道的ChIP-seq 数据已经以GEO：GSE106441存放在NCBI。
实施例1
H3K27乙酰化上调与对EZH2抑制的抗性相关
为了更加系统地理解人类癌症中细胞对EZH2抑制剂的响应，发 明人首先使用一组源自实体瘤和血液肿瘤中不同癌症类型的83种癌 细胞系调查细胞对EZH2抑制的敏感性，其中大多数呈现EZH2高表 达(图8A)。两种在临床开发中经过充分验证的EZH2抑制剂，EPZ-6438和GSK126，被用于检测细胞对EZH2抑制的敏感性。如所 预期的，血液肿瘤细胞系通常对EZH2抑制剂更敏感。20种血液癌细 胞系中的11种显示低于1μM的IC50(半数最大抑制浓度)，而实 体瘤细胞系相对较不敏感(图8B)。该观察结果还使用两种独立的EZH2siRNA证实。尽管在这些癌细胞中类似地均抑制了H3K27甲基 化，但大多数癌细胞没有表现出明显的生长抑制(图8C)。
EZH2和PRC2复合体主要以其在调节表观遗传特征(特别是 H3K27甲基化)方面的必要作用而闻名(Di Croce和Helin，2013)。 发明人在敏感和不敏感细胞系之间，比较了EZH2抑制对全局翻译后 组蛋白修饰的模式的影响。使用基于细胞培养中氨基酸稳定同位素标 记(SILAC)的质谱分析，检查了组蛋白修饰变化的系统性定量分析。 总体上，发明人识别了属于13种类型的组蛋白修饰的111种组蛋白 标记(图1A)。在EZH2抑制后，广谱组蛋白标记在敏感细胞系(Pfeiffer 和KARPAS-422细胞)和不敏感细胞系(U2932，SMMC-7721，T47D 和SU-DHL-4细胞)两类中改变。虽然H3K27三甲基化(H3K27me3) 水平在所有测试细胞中类似地降低，但是一些组蛋白修饰在敏感和不 敏感细胞之间区别性地受到影响(图1A)。其中，H3K27乙酰化(H3K27ac)水平在敏感细胞中略微减少或未改变，在不敏感细胞中 剧烈增加(图1A和1B)。此外，敲低PRC2复合体的SUZ12亚基 或者使用EED靶向抑制剂可以类似地诱导H3K27ac上调，表明PRC2 复合体依赖性功能(图8D)。
为了进一步确定H3K27ac的反馈增加是否可以与对EZH2抑制的 响应相关，发明人检查了H3K27ac在43种代表性癌细胞系中的改变； 在这些细胞系中EPZ-6438的IC50覆盖从4nM至100μM的宽范围。 总体而言，细胞对EZH2抑制的敏感性与H3K27ac的改变密切相关；在药物处理后具有更高水平的H3K27ac的那些倾向于对EZH2抑制剂 更具抗性(图1C，1D和1E)。该发现在体内异种移植模型中同样被 验证(图8E)。有趣的是，在具有SWI/SNF或BAP1突变的癌细胞 中(LaFave等，2015；Schoumacher等，2016)，H3K27ac的增加也 与对EPZ-6438的抗性相关(图8F)。
这些结果显示，H3K27ac反馈改变与细胞对EZH2抑制的响应性 相关，表明H3K27ac上调可能促进细胞对EZH2抑制的抗性。
实施例2
MLL1促进p300催化的H3K27ac升高
已经报道胚胎干(ES)细胞中H3K27甲基化和乙酰化之间的串 扰(Ferrari等，2014；Pasini等，2010)，但潜在机制大部分是未知 的。已知H3K27ac由p300/CBP复合体催化。因此，发明人使用针对 p300或/和其结合配偶体CBP的siRNA损害p300复合体的功能。p300 和CBP的缺乏几乎完全逆转EPZ-6438诱导的H3K27ac积累(图2A 和9A)。使用靶向p300/CBP复合体的两种抑制剂C646或SGC-CBP30 获得了类似的结果(图2B和9B)。此外，p300干预使抗性细胞对 EZH2抑制敏感(图9C，9D)。这些结果表明，H3K27ac反馈上调 是p300驱动的。
值得注意的是，响应性细胞表现出与抗性细胞相似的p300水平。 令人费解的是，为什么H3K27me损失(预期其增加p300对H3K27 残基的可及性)仅导致H3K27ac在抗性细胞中的增加。已知p300需 要通过其结合配偶体如CBP，MLL家族，UTX，CBX2和CBX6蛋 白适当募集到组蛋白尾部(Choi等，2016；Lai等，2017；Vincenz 和Kerppola，2008；Wang等，2017)，并且对p300结合蛋白的质谱 分析揭示更少的CBP在敏感细胞中结合p300。发明人怀疑可能存在 其他p300结合配偶体涉及调控H3K27me-H3K27ac反馈交换。因此， 发明人检查了以报道的p300结合配偶体在不同癌细胞系中的表达水 平。有趣的是，UTX，DUX4，CBX2和CBX6等等的固有表达水平 与敏感性的相关性差(图9E)。在所测试的蛋白质中，MLL1表达在 敏感和不敏感细胞之间引人注目地不同，其显得与H3K27ac对EZH2 抑制的响应相关联(图2C)。发明人还发现p300和CBP之间的相互 作用受到MLL1敲低的影响(图2D)。此外，MLL1，P300和CBP 形成复合体，对任一组分的干预都扰乱它们的相互作用(图9F)。
更重要的是，敲低MLL1降低了固有H3K27ac水平并逆转了由 EZH2抑制剂的处理诱导的H3K27ac的反馈增加(图2E和9G)，表 明MLL1在促进p300催化的H3K27ac方面的必要作用。一致地，MLL1 干预使抗性细胞对EZH2抑制敏感(图2F和9H)。与这些结果一致， MLL1的重建在EZH2抑制后增加了H3K27ac并损害了细胞对EZH2 抑制的处理的响应(图2G和9I)。这解释了在Pfeiffer，KARPAS-422 和WSU-DL-CL2细胞中H3K27ac增加的缺乏，源于其中几乎未检测 到MLL1的表达(图2H)。
这些数据总体上表明，p300在EZH2抑制后催化H3K27ac上调， 并且该过程需要MLL1的存在。MLL1的固有表达差异是不同癌细胞 系中对EZH2抑制介导的H3K27ac响应差异性的最接近原因。
实施例3
反馈H3K27乙酰化变化驱动致癌转录重编程
已知H3K27me和H3K27ac维持基因转录的两种相反状态。从 H3K27me到H3K27ac的转换可能指示从沉默状态到激活状态的转录 重编程。
U2932和敏感性Pfeiffer细胞显示在图10A中。
为了系统地检查受到EPZ-6438影响的细胞途径，发明人对用 EPZ-6438处理的敏感(Pfeiffer)和不敏感细胞系(U2932， SMMC-7721)两者相对于DMSO处理的对照，进行了H3K27ac ChIP-seq，RNA-seq和蛋白质组学分析。通过分别进行ChIP-seq， RNA-seq和蛋白质组数据的基因集富集分析(GSEA)和单样本(ss) GSEA，发明人发现更多的致癌特征在不敏感细胞系(U2932， SMMC-7721)中相对于敏感细胞系(Pfeiffer)统计学地富集(FDR q 值<0.05)(图3A)。富集的致癌特征在不敏感U2932细胞和敏感 Pfeiffer细胞之间的更详细比较在图10A中显示。
发明人接下来在两种不敏感细胞系U2932和SMMC-7721之间比 较了显著富集的致癌特征。结果显示，53种和22种常见致癌特征分 别在RNA-seq数据和蛋白质组数据中富集(图3B和3C)。例如， KRAS.300_UP.V1_UP，MEK_UP.V1_UP在RNA-seq数据中进行统计 学地富集，并且MEK_UP.V1_UP在蛋白质组数据中富集。此外，一 些致癌特征仅在某些癌细胞系中富集。例如，来自RNA-seq的101 种和12种特征分别在U2932和SMMC-7721中统计学地富集(图3B)。 在蛋白质组数据中，42种和23种特征分别在U2932和SMMC-7721 细胞中富集(图3C)。在这两种不敏感细胞系中，一些代表性致癌 特征如MYC_UP.V1_UP，MEK_UP.V1_UP在U2932细胞系中统计学 地富集，并且KRAS.50_UP.V1_UP，WNT_UP.V1_UP在SMMC-7721 细胞系中统计学地富集(图3D-3F和10B-10D)。值得注意的是，基 因中H3K27ac富集的启动子区域也同样存在MLL1和p300的富集增 加(图10E)。这与MLL1诱导的p300/CBP功能积累一致。
在致癌特征中，Wnt信号传导途径因其在HCC发展中经过充分 验证的作用而被注意到(Cancer Genome Atlas Research Network. Electronic address and CancerGenome Atlas Research，2017；Monga， 2015)。发明人使用它作为代表性模型证明H3K27ac修饰和途径激 活之间的联系。SMMC-7721细胞中使用H3K27ac抗体的ChIP-seq分 析确定了在EZH2抑制后，CTNNB1基因(其编码β-连环蛋白)(Wnt 途径的关键组成)的TSS区域中H3K27ac的增加(图3G)。该结果 通过使用覆盖6个CTNNB1启动子区域的引物的ChIP-qPCR分析而 确认。与甲基化水平的降低并行的，这些区域中的H3K27ac水平通 过EZH2抑制而显著增加(图10F)。因此，发明人检测到CTNNB1 的mRNA水平增加约5倍(图3H)，以及EZH2抑制后蛋白质水平 增加(图3I和10G)。EZH2抑制对Wnt途径的功能性激活还使用 TCF荧光素酶报告体试验而确认(图3J)。此外，施加损害H3K27ac 介导的转录的BRD4抑制剂可以在EZH2抑制后大大削减β-连环蛋白 的增加(图3K)，表明EZH2抑制增加的H3K27ac是激活的Wnt途 径的原因。
总的来说，这些结果证实EZH2抑制造成的H3K27ac上调导致以 细胞环境依赖性方式转录激活多个癌通路，这可能强调对EZH2抑制 的抗性。
实施例4
H3K27乙酰化的干预使癌细胞对EZH2抑制敏感
为了证明H3K27ac干预是否可以克服对EZH2抑制的抗性，发明 人测试了BRD4抑制剂(Filippakopoulos和Knapp，2014；Wang和 Filippakopoulos，2015)和EZH2抑制剂在各种细胞环境中对H3K27 乙酰化识别的同时药理学干预的效力。与BRD4抑制剂的组合 (EZH2-BRD4抑制剂组合)显著改善了EPZ-6438在血液肿瘤和实体 肿瘤的超过11种细胞系中的功效。组合指数(CI)值的测量清楚地 表明EPZ-6438和JQ1在11种抗性细胞系中的协同效应(图4A和 11A)。
发明人接下来将发明人的研究扩展到异种移植模型以确认这种 体内治疗潜力。在U2932异种移植模型中，采用至多200mg/kg的 EPZ-6438的每日单次治疗几乎不具有治疗效果，肿瘤生长抑制(TGI) 率低于10％。与上述发现一致，对H3K27ac的瘤内水平的分析显示， EPZ-6438处理使H3K27ac明显增加。相比之下，EZH2-BRD4抑制剂 组合显著抑制肿瘤生长，显示约86.4％的TGI率(图4B)。
发明人还测试了EZH2-BRD4抑制剂组合在患者来源的异种移植 (PDX)模型(Tentler等，2012)中的益处。在两个HCC PDX模型 中，单独的EPZ-6438几乎不抑制肿瘤生长，很大程度上吻合了EZH2 靶向治疗的临床结果。类似地观察到EPZ-6438刺激的H3K27ac水平 在肿瘤组织中的增加。采用EPZ-6438和BRD4抑制剂(OTX015)的 组合治疗几乎完全阻断肿瘤生长(图4C-D)。
为了进一步证实这些发现，发明人选择了12种癌细胞系来源的 异种移植模型(U2932，HCC1395，SMMC-7721，AsPC-1，NCI-H1299， NCI-H727，ZIP-177，PSN-1，BxPC-3，PC-9，NCI-H23和NCI-H460) 和8个PDX模型(7个肝癌PDX模型和1个胰腺癌PDX模型)以 测试EZH2-BRD4抑制剂组合的治疗益处(图4E和11B)。在大多 数模型中，BRD4抑制剂的引入显著改善了EPZ-6438的治疗功效， 其中TGI比率增加多至104％。在这些模型中，20个模型中有8个显 示出对EPZ-6438-JQ1组合或EPZ-6438-OTX015组合的显著响应，TGI 率超过60％。这些结果确认，广泛的癌症可以受益于EZH2-BRD4抑 制剂组合疗法，无论其有何种多样化的病理或分子亚型。重要的是， 这些模型中MLL1的瘤内水平的免疫组织化学分析观察到在EZH2抑 制剂响应性和非响应性模型之间的明显差异。在响应性Pfeiffer肿瘤 中，MLL1水平是几乎不可检测的(图11C)，确认了上文所述的 MLL1的作用。
实施例5
H3K27乙酰化信号的阻断环境依赖性地激活MAPK途径
根据发明人的结果，H3K27甲基化和乙酰化的同时干预表现出卓 越的治疗前景，但仍然局限于部分亚组癌症。因此，进行基于定量质 谱的蛋白质组学分析以比较U2932和SMMC-7721细胞中富集的显著 致癌途径的差异。结果显示，多种致癌途径在单独用EPZ-6438处理 的U2932中统计学地富集，但很少的途径在使用EPZ-6438-JQ1组合 处理的样品中富集。相比之下，在SMMC-7721细胞系中，与单独的 EPZ-6438处理相比，显著百分比的致癌途径仍然在EPZ-6438-JQ1组 合处理后富集(图5A)。这些发现为对EZH2-BRD4组合处理的差异 性响应提供了解释。
值得注意的是，在EPZ-6438-JQ1组合处理后，相当一些致癌途 径在SMMC-7721细胞中仍然富集。这些途径中的一些涉及重要的磷 酸化信号传导级联，例如KRAS.DF.V1_UP和AKT_UP.V1_UP(图 5A)。这暗示表观遗传改变和激酶信号传导网络之间的串扰(De Raedt等，2014；Nagaraja等，2017；Scott等，2016)。进行了磷酸化蛋白 质组分析以在EPZ-6438和JQ1共处理后比较U2932和SMMC-7721 细胞。确实，改变的磷酸化蛋白质组基于KEGG数据库的富集分析揭 示，包括FOXO，mTOR，MAPK，胰岛素和ErbB信号传导途径的多 种途径，在两种细胞系中区别性地受到EZH2-BRD4抑制剂组合的影 响(图5B和12A)。特别值得注意的是，MAPK途径中的关键磷酸 位点及其调节蛋白在U2932和SMMC-7721细胞之间被不同地调节(图12B)，表明SMMC-7721细胞中MAPK途径的激活。发明人还 构建了U2932和SMMC-7721中由EZH2-BRD4抑制剂组合处理显著 调节的磷酸化蛋白质组相互作用网络(图12C和12D)。
为了理解MAPK途径如何区别性地受到影响，发明人检查了该 途径中的主要组成在对EZH2单抑制或EZH2-BRD4抑制剂组合显示 不同敏感性的一组癌细胞中的磷酸化和蛋白质表达水平。有趣的是， 在响应于EZH2抑制的Pfeiffer和HT细胞中，发明人观察到与H3K27ac积累并行的磷酸-RSK下调(图12E)。相比之下，在对 EZH2-BRD4抑制剂组合不敏感的体系中，例如SMMC-7721，ZIP-177 和AsPC-1细胞，磷酸-ERK2及其下游效应蛋白磷酸-RSK在处理后普 遍上调，与响应联合的细胞如U2932细胞显著不同(图5C)。
与ERK2激活一起，发明人还观察到ERK1蛋白在所有不敏感细 胞中的减少(图5C)。已经显示ERK1与ERK2拮抗性地竞争结合 上游MEK，并且ERK1的下调可以以细胞环境依赖性方式导致ERK2 的激活(Busca等，2016；Fremin等，2007；Lefloch等，2008；Shin 等，2010)。使用两种独立的siRNA耗尽ERK1编码基因MAPK3， 导致ERK2在SMMC-7721和ZIP-177细胞中的激活(图5D)。而且， JQ1或EZH2-BRD4抑制剂组合降低了SMMC-7721和ZIP-177细胞 中的MAPK3 mRNA水平，表明ERK1的转录下调。相比之下，编码 ERK2的MAPK1的mRNA水平几乎没有改变(图5E)。该结果使 用BRD4 siRNA进一步确认，其类似地降低MAPK3 mRNA水平而不 影响MAPK1(图5F)。一致地，BRD4 siRNA本身可以激活磷酸化 ERK2(图5G)。
这些数据总的来说表明，对H3K27乙酰化的干预可以通过癌细 胞亚组中ERK1的转录下调而导致MAPK信号传导的反馈激活。
实施例6
EZH2、BRD4和ERK组合抑制在实体瘤中显示惊人的抗癌效果
BRD4介导的ERK信号传导的反馈激活表明MAPK的阻断可能 进一步放大治疗益处。这得到EZH2-BRD4抑制剂组合处理后的pRSK 状态的支持，显示为两联不响应CDX或PDX模型中pRSK的增加(图 6A)。发明人因此在表观遗传靶向组合方案中引入了ERK1/2特异性 抑制剂。
在HCC PDX-0273模型中，采用EPZ-6438或OTX015的单独治 疗仅显示对肿瘤生长的部分抑制效果(TGI％，分别为-1.7％和51.6％)。 令人鼓舞的是，EPZ-6438、OTX015和ERK1/2抑制剂GDC-0994的 三重组合几乎完全抑制肿瘤生长(TGI％，99.1％)，而不是 EPZ-OTX015组合疗法(TGI％，67.0％)(图6B)。来自每个治疗 组的代表性肿瘤的Western Blot结果验证了上述机制。具体地，EZH2 抑制增加了H3K27ac的瘤内水平。引入BRD4抑制剂引起ERK信号 传导的反馈激活，其可以被GDC-0994完全阻断(图6C)。类似的 结果在HCC PDX-0809、PDX-0309和CDX SMMC-7721模型中获得， 其中三重组合疗法显著抑制肿瘤生长，分别达到96.5％、85.3％和 74.3％的TGI％(图6C，6D和13A)。
发明人还在胰腺癌和肺癌中测试了这种组合治疗策略。在胰腺癌 PDX-3527肿瘤模型中，EPZ-6438或OTX015或其组合的单独处理对 肿瘤生长仅具有轻微影响。另外引入ERK抑制剂GDC-0994显著改 善了功效(TGI％，114％)(图6E)。类似的结果在胰腺癌(BxPC-3， AsPC-1)和肺癌CDX(NCI-H23)模型中获得，其中一并采用EZH2、 BRD4和ERK抑制剂的组合疗法实现了最大肿瘤生长抑制。三重组合 的TGI％分别为94.4％、82.8％和75.6％，表明卓越的肿瘤生长抑制(图 13B-13E)。这些处理都没有明显的全身毒性或对小鼠体重的显著影 响(图13F-13M)。
总的来说，这些数据表明同时靶向MAPK信号传导可以提供治 疗选择以进一步改善基于表观遗传的疗法的功效，尤其在缺乏有效临 床治疗的HCC和胰腺癌。

Claims (16)

1.一种治疗受试者中的EZH2异常相关癌症的方法，其包括：
(1)测定所述受试者的MLL1水平并与参比MLL1水平相比较；和/或
(2)向所述受试者施用EZH2抑制剂，并在施用之前和之后，测定所述受试者的H3K27乙酰化；
其中当所述受试者的MLL1水平高于所述参比MLL1水平和/或所述受试者的H3K27乙酰化在施用所述EZH2抑制剂之后增加时，向所述受试者施用EZH2抑制剂和H3K27乙酰化抑制剂的药物组合。
2.权利要求1所述的方法，其还包括：
(1)测定所述受试者的ERK水平并与参比ERK水平相比较；和/或
(2)在向所述受试者施用所述EZH2抑制剂和H3K27乙酰化抑制剂的药物组合之前和之后，测定所述受试者的ERK水平；
其中当所述受试者的ERK水平高于所述参比ERK水平和/或所述受试者的ERK水平在施用所述EZH2抑制剂和H3K27乙酰化抑制剂的药物组合之后增加时，向所述受试者施用EZH2抑制剂，H3K27乙酰化抑制剂，和MAPK信号传导通路阻断剂的药物组合。
3.一种用于治疗EZH2异常相关癌症的药物组合，其包含EZH2抑制剂和H3K27乙酰化抑制剂。
4.权利要求3所述的药物组合，其还包含MAPK信号传导通路阻断剂。
5.一种患有EZH2异常相关癌症的受试者的分群方法，其包括：
(1)测定所述受试者的MLL1水平并与参比MLL1水平相比较；和/或
(2)向所述受试者施用EZH2抑制剂，并在施用之前和之后，测定所述受试者的H3K27乙酰化；
其中当所述受试者的MLL1水平高于所述参比MLL1水平和/或所述受试者的H3K27乙酰化在施用所述EZH2抑制剂之后增加时，将所述受试者标记为MLL1阳性。
6.权利要求5所述的方法，其还包括：
(1)测定所述标记为MLL1阳性的受试者的ERK水平并与参比ERK水平相比较；和/或
(2)向所述标记为MLL1阳性的受试者施用EZH2抑制剂和H3K27乙酰化抑制剂的药物组合，并在施用之前和之后，测定所述受试者的ERK水平；
其中当所述标记为MLL1阳性的受试者的ERK水平高于所述参比ERK水平和/或所述标记为MLL1阳性的受试者的ERK水平在施用所述EZH2抑制剂和H3K27乙酰化抑制剂的药物组合之后增加时，将所述标记为MLL1阳性的受试者标记为MLL1+ERK双阳性。
7.一种用于患有EZH2异常相关癌症的受试者的分群的试剂盒，其包括：
(1)用于测定所述受试者的MLL1水平的试剂；和/或
(2)用于测定所述受试者的H3K27乙酰化的试剂。
8.权利要求7所述的试剂盒，其还包括用于测定所述受试者的ERK水平的试剂。
9.包含EZH2抑制剂和H3K27乙酰化抑制剂的药物组合在制备用于在受试者中治疗EZH2异常相关癌症的药物中的用途，优选地所述受试者是MLL1阳性受试者。
10.包含EZH2抑制剂，H3K27乙酰化抑制剂和MAPK信号传导通路阻断剂的药物组合在制备用于在受试者中治疗EZH2异常相关癌症的药物中的用途，优选地所述受试者是MLL1阳性受试者，更优选地所述受试者是MLL1+ERK双阳性受试者。
11.一种用于治疗受试者中的EZH2异常相关癌症的试剂盒，其包括：
(1)用于测定所述受试者的MLL1水平的试剂；和/或
(2)用于测定所述受试者的H3K27乙酰化的试剂；和
(3)包含EZH2抑制剂和H3K27乙酰化抑制剂的药物组合。
12.权利要求11所述的试剂盒，其还包括：
(1)用于测定所述受试者的ERK水平的试剂；和
(2)MAPK信号传导通路阻断剂。
13.前述权利要求中任一项所述的方法、药物组合、试剂盒或用途，其中所述EZH2抑制剂选自EPZ-6438和GSK126。
14.前述权利要求中任一项所述的方法、药物组合、试剂盒或用途，其中所述H3K27乙酰化抑制剂选自MLL抑制剂、CBP/P300抑制剂和BRD4抑制剂，优选地所述BRD4抑制剂选自OTX015和JQ1。
15.前述权利要求中任一项所述的方法、药物组合、试剂盒或用途，其中所述MAPK信号传导通路阻断剂选自p38MAPK抑制剂，JNK抑制剂，ERK抑制剂，Raf抑制剂，MEK抑制剂，TOPK抑制剂和MNK抑制剂，优选地所述ERK抑制剂是GDC-0994。
16.前述权利要求中任一项所述的方法、药物组合、试剂盒或用途，其中所述EZH2异常相关癌症选自血液恶性肿瘤和实体瘤，优选地所述实体瘤选自乳腺癌，肝癌，胰腺癌和肺癌。
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CN113440511A (zh) * 2021-07-07 2021-09-28 天津医科大学总医院 Hotair-prc2阻断剂及其复合制剂在制备治疗子宫内膜癌药物中的用途
WO2022245977A3 (en) * 2021-05-18 2022-12-29 University Of Southern California Methods for the expansion of human granulocytemacrophage progenitors and applications thereof

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022245977A3 (en) * 2021-05-18 2022-12-29 University Of Southern California Methods for the expansion of human granulocytemacrophage progenitors and applications thereof
CN113440511A (zh) * 2021-07-07 2021-09-28 天津医科大学总医院 Hotair-prc2阻断剂及其复合制剂在制备治疗子宫内膜癌药物中的用途
CN113440511B (zh) * 2021-07-07 2023-04-07 天津医科大学总医院 Hotair-prc2阻断剂及其复合制剂在制备治疗子宫内膜癌药物中的用途

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