CN110834411B - 负载细胞的三维泡状石墨烯-PEGDA-GelMA光固化生物材料、制备方法和应用 - Google Patents

负载细胞的三维泡状石墨烯-PEGDA-GelMA光固化生物材料、制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种负载细胞的三维泡状石墨烯‑PEGDA‑GelMA光固化生物材料、制备方法和应用，所述制备方法包括以下步骤：将PEGDA、GelMA和光引发剂加入至细胞培养基中，混合均匀；将悬浮的细胞加入到得到的混合液中，得到含有细胞的水凝胶培养基混合液；安装样品槽，开启3D光固化打印设备的水浴加热系统，给样品槽加热，将三维泡状石墨烯加入样品槽中并固定，将含有细胞的水凝胶培养基混合液加入到样品槽中，得到打印混合液；调节3D光固化打印设备工作参数，执行打印程序，完成光固化打印，得到所述光固化生物材料，该材料具有良好的生物相容性和导电性、结构稳定、机械强度高，细胞负载量高。

Description

负载细胞的三维泡状石墨烯-PEGDA-GelMA光固化生物材料、 制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物材料领域，涉及一种负载细胞的三维泡状石墨烯-PEGDA-GelMA光固化生物材料、制备方法和应用。
背景技术
通过紫外光/可见光(蓝光)光固化制备特定形状结构的水凝胶，固化过程可在材料溶液中混合培养基和活细胞，实现细胞和水凝胶基质的固化成型。通过改变固化的材料、固化的光强、固化的光照时间，可以一定程度改变固化后材料的机械性能(硬度)。
通过化学气相沉积(CVD)在特定形状的金属模板材料(铜、镍等)表面制备单层/多层石墨烯，后期通过化学腐蚀去除金属模板获得纯的石墨烯材料；材料经过消毒处理可作为细胞贴附的培养基质。
现在常用于光固化的生物材料主要有：GelMa、PEGDA。
聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA，如式I所示)是由下为乙二醇单体聚合为聚乙二醇(PEG)后在PEG大分子链两端修饰上丙烯酸分子获得的。PEGDA相比原本的PEG分子带上了碳碳双键结构，在特定的光引发剂(如苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂(LAP)，如反应式(1)所示，LAP在合适波长的光激发下均裂为两个自由基，可作为碳碳双键基团之间交联的引发剂)的催化下发生分子间交联，形成超分子交联网络，对于低n值(n＝～200-2000)的PEGDA，在发生交联后能由液态转化为固态，实现光固化。而在发生交联后，不同分子量(n值)、浓度的PEGDA拥有不同的吸水性和机械硬度；交联后，通常分子量小的PEGDA硬度高，浓度高的PEGDA溶液硬度高，因而PEGDA可作为调整3D打印成品硬度的调控因素。不过，PEGDA由于分子内部主要为烃链，存在一定的疏水作用，材料虽无细胞毒性但是对细胞的生物相容性较差；通过在PEGDA一端修饰RGD短肽可以改善这一问题，但由于RGD的化学修饰会占用PEGDA一端的碳碳双键，PEGDA-RGD的容许掺入比例很低，掺入RGD对材料整体生物相容性的改善程度极其有限，而且会造成材料固化后硬度的下降，不能很好地在不影响材料的机械性能的情况下改善其生物相容性。
Figure BDA0002277974320000021
甲基丙烯酸酐-明胶(GelMA)通常由天然提取纯化的天然细胞外基质——明胶(Gelatin)通过化学修饰加上甲基丙烯酸酐(MA)制备。由于明胶在动物皮肤、肌膜等组织中广泛存在，是一种广泛存在的天然细胞外基质，具备良好的生物相容性，可作为神经干细胞(NSC)、间充质干细胞(MSC)等多种干细胞的培养基质。而在修饰为GelMA后，GelMA分子可以通过光引发剂催化与其他含有碳碳双键的大分子(如GelMA和PEGDA)交联形成含GelMA的水凝胶。GelMA和PEGDA混合进行3D打印，既能保障固化后材料的机械强度，且可通过PEGDA的比例和分子量对固化后硬度进行调节，获得不同硬度的生物材料；同时，GelMA的混入为材料整体提供了较好的生物相容性。
石墨烯拥有良好的导电性和化学、生物稳定性，可作为人工细胞外基质。以二维石墨烯平面作为细胞培养基质对神经元等需要通过生物电进行细胞间交流的细胞的诱导培养有一定优势，但缺乏真实生理环境的三维结构，三维泡状石墨烯的发明和发展对这一问题提供了解决方案。前期在国外杂志上已发表的一些研究说明了相对二维石墨烯平面，三维泡状石墨烯(3DGF)在神经干细胞(10.1038/srep01604)和小胶质细胞(j.biomaterials.2014.05.002)培养方面的独特优势；尤其是对小胶质细胞，3DGF对其炎症反应有着明显的生物学调控作用，是多种炎症相关病理学研究的良好模型。但是3DGF仍存在一定的限制，如生物相容性不足(石墨烯表面疏水)；3DGF结构易碎、机械强度不足；相对传统的生物材料(如PEGDA和GelMA)所能负载细胞的密度较低。
因此，在本领域中，期望开发一种具有高细胞负载密度并且具有良好的生物相容性以及机械性能的光固化生物材料。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种负载细胞的三维泡状石墨烯-PEGDA-GelMA光固化生物材料、制备方法和应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种负载细胞的三维泡状石墨烯-PEGDA-GelMA光固化生物材料的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将PEGDA、GelMA和光引发剂加入至细胞培养基中，混合均匀，得到水凝胶培养基混合液；
(2)将悬浮的细胞加入到水凝胶培养基混合液中，得到含有细胞的水凝胶培养基混合液；
(3)安装样品槽，开启3D光固化打印设备的水浴加热系统，给样品槽加热，将三维泡状石墨烯加入样品槽中，并将三维泡状石墨烯固定至样品槽中(在本发明中使用75％酒精消毒的塑料卡环或其他能够实现同样功能的零件即可实现固定)，将含有细胞的水凝胶培养基混合液加入到样品槽中，得到打印混合液；
(4)调节3D光固化打印设备的工作参数，执行打印程序，完成光固化打印后，得到负载细胞的三维泡状石墨烯-PEGDA-GelMA光固化生物材料。
在本发明中，利用了石墨烯、PEGDA、GelMA三种材料的各自的优势性能(石墨烯的导电性、炎症调节能力；PEGDA的机械硬度调节的便利性；GelMA等材料的生物相容性)，制造出了具有特定结构的石墨烯-PEGDA-GelMA复合材料，通过3D打印构造的多材料、多硬度的含有细胞的适于生理、病理模拟的生物医学研究模型和组织工程可移植材料，且本发明材料构造方式简便，容易实现。
PEGDA和GelMA可以任意比例共混并在光引发剂催化下交联固化，两者混合后既提高了只有PEGDA时的细胞亲和性，又提升了GelMA欠缺的机械性能，并且可通过加入的PEGDA的分子量和比例调节机械强度的高低；PEGDA与石墨烯分子结构有较好的相容性，而三维泡状石墨烯虽有良好的生物学功能，单细胞负载能力低，机械性能差，不适合多细胞共培养环境体外模型的构建，通过与PEGDA-GelMA水凝胶体系结合，使得三维泡状石墨烯等石墨烯材料有了更好的物理机械性能和更广的生物运用途径。
薄层石墨烯(二维/三维)本身有良好的透光性，但机械强度低，在本发明的打印过程中，其可在三维石墨烯结构的间隙通过光致交联方式使PEGDA等材料在石墨烯结构附近固化，提高石墨烯材料结构整体的机械性能，使无法在石墨烯表面的细胞在水凝胶中与石墨烯材料相接近，提高细胞的负载率。
在本发明中，三维泡状石墨烯具有独特的三维拓补结构，可以调节黏附于其上的细胞的生物学功能，在水凝胶中加入三维泡状石墨烯后能在更多样的基质环境(由PEGDA和GelMA组成)下实现石墨烯的生物学功能，使得不同硬度基质环境中的细胞生物学行为也受到石墨烯材料的调节，同时这种结合也增加单位体积的石墨烯对于细胞的负载密度。
优选地，步骤(1)所述PEGDA的数均分子量为250-20000，例如250、400、500、600、800、1000、1300、1500、1800、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、10000、12000、14000、16000、18000或20000等，优选250-10000。
优选地，步骤(1)所述水凝胶培养基混合液中PEGDA的质量体积浓度(w/v)为10％以上，例如10％、12％、15％、18％、20％、23％、25％、28％、30％等。
优选地，步骤(1)所述水凝胶培养基混合液中GelMA的质量体积浓度(w/v)为10％以上，例如10％、12％、15％、18％、20％、23％、25％、28％、30％等。
优选地，步骤(1)所述PEGDA和GelMA均为消毒处理过的无菌的样品。
优选地，步骤(1)所述光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂(LAP)。在本发明中特定选择LAP作为引发剂，LAP可在405nm的可见光波段获得较好的催化效果，且LAP的细胞毒性小。其他一些光引发剂如I2959，需要在紫外波段下激活，但是紫外照射会杀伤细胞，不适用于本发明的含有细胞的材料固化。
优选地，步骤(1)所述光引发剂在水凝胶培养基混合液中的质量体积浓度为0.1-0.5％(w/v)，例如0.1％、0.15％、0.18％、0.2％、0.23％、0.25％、0.28％、0.3％、0.35％、0.38％、0.4％、0.43％、0.45％、0.48％或0.5％。
在本发明中，步骤(1)所述细胞培养基包括但不限于小鼠小胶质细胞系BV2细胞培养基、人脐静脉内皮细胞培养基、人宫颈癌细胞系培养基或小鼠神经干细胞培养基。在本发明中，针对很多类型的贴壁细胞就可以用于本发明，因此可以选择这些众多类型的贴壁细胞的培养基。
在本发明中，所述培养基选用所述细胞的已知现有技术存在的培养基成分。
在本发明中，所用的细胞培养基的体积用量是由样品槽的体积决定的，对于特定体积的打印目标成品，可选用或另外制作相应大小的合适容器，如细胞培养板(皿)，可实现0.2mL-100mL体积的材料打印。
优选地，步骤(1)所述将PEGDA、GelMA和光引发剂加入至细胞培养基中是在无菌环境中进行的；
优选地，步骤(1)所述混合在37℃水浴或金属浴中进行。此时可以使得GelMA融化，且使细胞处于生理温度环境下。
步骤(1)所述的水凝胶培养基混合液在37℃保存待用。
在本发明中，步骤(2)所述细胞为但不限于小鼠小胶质细胞系BV2细胞、人脐静脉内皮细胞、人宫颈癌细胞系HeLa细胞或小鼠神经干细胞。
优选地，步骤(2)所述含有细胞的水凝胶培养基混合液中细胞终浓度为9×108个/mL以下，例如9×108个/mL、5×108个/mL、3×108个/mL、1×108个/mL、9×107个/mL、7×107个/mL、5×107个/mL、1×107个/mL、8×106个/mL、4×106个/mL、1×106个/mL、5×105个/mL、1×105个/mL等，优选1×107-9×108个/mL。
优选地，步骤(3)在所述安装样品槽前对样品槽进行灭菌处理，并对3D打印设备及其操作空间进行紫外消毒。
优选地，步骤(3)所述给样品槽加热为使样品槽达到37℃。
优选地，步骤(3)中，相对于1mL含有细胞的水凝胶培养基，加入9cm2×0.2cm的三维泡状石墨烯。
优选地，步骤(3)所述三维泡状石墨烯的杨氏模量为6-10kPa，例如6kPa、6.3kPa、6.5kPa、6.8kPa、7kPa、7.3kPa、7.5kPa、7.8kPa、8kPa、8.3kPa、8.5kPa、8.8kPa、9kPa、9.3kPa、9.5kPa、9.8kPa或10kPa。
优选地，在步骤(4)所述调节3D光固化打印设备的工作参数前，调节样品槽和打印平台至需要的位置，将要3D打印的投影面数据导入3D光固化打印设备软件。
优选地，步骤(4)所述调节3D光固化打印设备的工作参数包括调节光源波长为405nm，曝光功率为10-100mW/cm2(例如10mW/cm2、15mW/cm2、18mW/cm2、20mW/cm2、25mW/cm2、30mW/cm2、35mW/cm2、40mW/cm2、50mW/cm2、60mW/cm2、70mW/cm2、80mW/cm2、90mW/cm2或100mW/cm2)，曝光时间为0.2-1s(例如0.2s、0.3s、0.4s、0.5s、0.6s、0.7s、0.8s、0.9s或1s)，固化温度为37℃水浴。
优选地，步骤(4)所述光固化打印通过控制3D光固化打印设备的空间光调制器(DMD)的预设形状实现特定形状的固化。
本发明目前虽然无法实现在三维石墨烯材料内的逐层光固化3D打印，但可通过Z轴方向激光透射固化整个Z轴材料，而在X-Y平面上通过控制DMD实现特定形状的固化。在脱离石墨烯材料的激光投影平面，则可不受石墨烯材料影响实现Z轴变化的逐平面逐层打印。
在本发明步骤(4)所述完成光固化打印后，将得到的负载细胞的三维泡状石墨烯-PEGDA-GelMA光固化生物材料取出，用PBS洗去多余的材料和细胞，浸没于新鲜培养基等环境进行进一步培养和实验研究。
在本发明中，所述三维泡状石墨烯是通过现有的制备方法制备得到的，例如所述制备方法为：
在所述方法中，使用的多孔Ni模板为购置材料，通过修剪得到所需大小；CVD(化学气相沉积)过程须使用现有技术中特制的CVD系统(即主要组成设备包括裂开式管式炉；BROOKS 5850E质量流量计；Reborn真空计)，制备过程需要氩气(Ar)、氢气(H2)、甲烷(CH4)三种气源，主要包括以下具体制备步骤：
(1)多孔Ni模板通过丙酮-乙醇超声清洗取出粉尘杂质，静置晾干。
(2)在CVD系统玻璃管中放置清洗好的多孔Ni模板，将玻璃管密封，调节Ar、H2、CH4气体总进气压力为0.2MPa；打开机械泵开关抽真空至10Pa以下，调节通入速度Ar＝300sccm，用Ar去除残留空气；按H2＝300sccm、Ar＝300sccm通入，使管内气压在10kPa左右，设定加热程序，30min达到975℃；管内温度达到975℃后，调节H2＝400sccm、Ar＝200sccm进行15min的Ni模板还原；15min后调节H2＝200sccm、Ar＝300sccm、CH4＝100sccm(三种气源的流量依不同实验室环境和设备可以进行选择和调节)，开始10min的石墨烯生长过程；10min后，关闭气源、加热、真空泵，保持管内气压在10kPa左右，使管内温度以约2℃/min的速度降温；管内温度降至室温后，充Ar至大气压，打开玻璃管，取出生长好的石墨烯。
(3)将生长好的石墨烯放置于玻璃皿中，用无水乙醇浸没15min排除气泡。
(4)倒弃乙醇，加入过量0.81mol/L FeCl3/浓HNO3溶液，静置腐蚀20h。
(5)倒弃腐蚀液，加入适量浓HNO3溶液洗涤两次，再加入过量浓HNO3溶液浸泡腐蚀24h。
(6)倒弃腐蚀液，加入适量稀HNO3溶液洗涤两次，再加入过量稀HNO3溶液浸泡腐蚀24h。
(7)倒弃腐蚀液，加入适量双蒸水洗涤两次，于过量双蒸水静置浸泡24h；24h后重复洗涤和浸泡24h。
(8)洗涤完成后，倒弃皿中的水，用适量无水乙醇浸润腐蚀剩余的石墨烯，除去水分，晾干，即得到三维泡状石墨烯。
(9)三维泡状石墨烯使用前，用75％乙醇浸没消毒，用PBS去除乙醇，浸没于PBS中待用于细胞培养和材料制备。
另一方面，本发明提供了如上所述的制备方法制备得到的负载细胞的三维泡状石墨烯-PEGDA-GelMA光固化生物材料。
优选地，所述负载细胞的三维泡状石墨烯-PEGDA-GelMA光固化生物材料的细胞负载量为9×108个/cm3以下，例如9×108个/cm3、7×108个/cm3、5×108个/cm3、3×108个/cm3、1×108个/cm3、5×107个/cm3、3×107个/cm3、1×107个/cm3、6×106个/cm3、3×106个/cm3、1×106个/cm3、5×105个/cm3、3×105个/cm3、1×105个/cm3等，优选1×107-9×108个/cm3。
本发明可以根据需要使用不同的细胞浓度，进而实现不同的细胞负载量，尤其是能够实现高至1×107-9×108个/cm3的高细胞负载量。
另一方面，本发明提供了如上所述的三维泡状石墨烯-PEGDA-GelMA光固化生物材料在制备组织工程可移植材料中的应用或者在制备生理或病理模拟材料中的应用。
本发明所述的三维泡状石墨烯-PEGDA-GelMA光固化生物材料可以通过在制备过程中调节加入的PEGDA的分子量以及加入的PEGDA和GelMA的量来调节通过光固化形成的生物材料的硬度，并且该材料保留了PEGDA高精度固化的特性，又具有良好的生物相容性，使得制备得到的材料可用于不同结构、不同硬度、不同导电性的生理环境模拟，构建各种生物研究模型。
如神经炎症导致神经纤维化硬化，造成神经组织中局部或整体弹性模量的变化，这种变化可通过神经细胞、小胶质细胞在本发明材料体系中不同的导电性和材料硬度的变化进行模拟；石墨烯材料的结构和加入方式可对体系内的细胞行为进行调控；同时通过3D打印也可以制造特定的材料内部结构如血管、组织坏死的空腔或硬度变化的组织块，贴近病理实际。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明利用石墨烯、PEGDA、GelMA三种材料通过3D打印，得到负载细胞的三维泡状石墨烯-PEGDA-GelMA光固化生物材料，该光固化生物材料不仅结合了石墨烯、PEGDA、GelMA三种材料各自的优势，克服了各自材料单独使用时的不足，使得复合材料具有良好的生物相容性、结构稳定、机械强度高，具有良好的导电性，并且提高了细胞的负载量。
附图说明
图1为本发明负载细胞的三维泡状石墨烯-PEGDA-GelMA光固化生物材料的设计以及制备流程图。
图2为通过控制3D光固化打印设备的空间光调制器(DMD)的预设形状实现特定形状的固化成胶形状的示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
在以下实施例中，PEGDA、LAP来源于购置，GelMA来源于自行合成；细胞培养基按照特定细胞的培养基进行选择；光固化打印平台使用定制的
Figure BDA0002277974320000101
PμLSE(面投影微立体光刻)3D打印设备(深圳摩方材料，405nm光源)，配套37℃循环水浴系统；3D打印设备的数据输入为拟打印的3D模型的x-y平面的2D切片图像，3D模型通过Solidworks等三维绘图软件绘制，通过三维模型分析和切片软件转换为3D打印设备所需的二维图像。
实施例1
在本实施例中，以10％PEGDA混合10％GelMA负载小鼠小胶质细胞系BV2细胞为例，培养基使用DMEM高糖+10％FBS的细胞培养基，配置制备负载细胞的三维泡状石墨烯-PEGDA-GelMA光固化生物材料。
其设计和制备流程如图1所示，主要包括首先设计最终打印形状参数，包括设计石墨烯CVD模板形状、设计水凝胶打印硬度、准备细胞和培养基以及涉及水凝胶的打印形状。通过依据石墨烯CVD模板形状制备金属模板，利用化学气相沉积(CVD)或者化学腐蚀的方法制备得到石墨烯材料(即三维泡状石墨烯)；根据设计的水凝胶打印硬度，配置含有PEGDA和GelMA的混合液，进而将PEGDA和GelMA的混合液与准备的细胞以及培养基以及石墨烯材料组成含有细胞的生物墨水，而后利用该生物墨水根据由设计的水凝胶打印形状转换得到的DMD上的二维曝光图案序列进行光固化打印得到最终的打印形状。
三维泡状石墨烯-PEGDA-GelMA光固化生物材料的具体制备步骤包括：
(1)提前从冰箱中取出保存的消毒处理过的无菌的PEGDA和GelMA，室温静置待PEGDA彻底熔解为液体；配置细胞培养基(DMEM高糖+10％FBS，过滤除菌)；称量0.2g LAP、10g PEGDA-700与10g GelMA，在无菌环境中混合于100mL的细胞培养基中(水凝胶培养基混合液)，37℃水浴加热使GelMA融化混合均匀，得到水凝胶培养基混合液，并于37℃保存。
(2)准备用于3D打印的BV2细胞，将悬浮的细胞加入到水凝胶培养基混合液中，使细胞终浓度为2×108个/mL。
(3)提前对盛装生物墨水的样品槽进行灭菌处理，并对3D打印设备及其操作空间进行紫外消毒；安装样品槽，开启3D打印设备的水浴加热系统，使样品槽达到37℃；将制备、消毒完毕的9cm2×0.2cm的三维泡状石墨烯，轻轻放入样品槽并固定；将1mL含有细胞的水凝胶培养基混合液加入到样品槽中，使之与打印区域的三维泡状石墨烯混合，得到打印混合液。
(4)调节样品槽和打印平台至需要的位置，将要3D打印投影面数据导入设备软件，调节光源波长为405nm，曝光功率为20mW/cm2，曝光时间为1s，固化温度为37℃水浴，执行打印程序，通过控制3D光固化打印设备的空间光调制器(DMD)的预设形状实现特定形状的固化，本实施例中，DMD预设图案如图2中所示，经过光固化打印后，形成与DMD预设图案对应的成胶形状，得到负载细胞的三维泡状石墨烯-PEGDA-GelMA光固化生物材料，所述光固化生物材料中细胞的负载量为2×108个/cm3。
实施例2
在本实施例中，以10％PEGDA混合10％GelMA负载人脐静脉内皮细胞HUVEC细胞为例，培养基使用EGM2培养基，配置制备负载细胞的三维泡状石墨烯-PEGDA-GelMA光固化生物材料，其设计和制备流程如图1所示。
其制备方法如下：
(1)提前从冰箱中取出保存的消毒处理过的无菌的PEGDA和GelMA，室温静置待PEGDA彻底熔解为液体；配置细胞培养基(EGM2培养基，过滤除菌)；称量0.3g LAP、15gPEGDA-700与10g GelMA，在无菌环境中混合于100mL的细胞培养基中(水凝胶培养基混合液)，37℃金属浴加热使GelMA融化混合均匀，得到水凝胶培养基混合液，并于37℃保存。
(2)准备用于3D打印的HUVEC细胞，将悬浮的细胞加入到水凝胶培养基混合液中，使细胞终浓度为5×108个/mL。
(3)提前对盛装生物墨水的样品槽进行灭菌处理，并对3D打印设备及其操作空间进行紫外消毒；安装样品槽，开启3D打印设备的水浴加热系统，使样品槽达到37℃；将制备、消毒完毕的9cm2×0.2cm的三维泡状石墨烯，轻轻放入样品槽并固定；将1mL含有细胞的水凝胶培养基混合液加入到样品槽中，使之与打印区域的三维泡状石墨烯混合，得到打印混合液。
(4)调节样品槽和打印平台至需要的位置，将要3D打印投影面数据导入设备软件，调节光源波长为405nm，曝光功率为10mW/cm2，曝光时间为1s，固化温度为37℃水浴，执行打印程序，通过控制3D光固化打印设备的空间光调制器(DMD)的预设形状实现特定形状的固化，本实施例中，DMD预设图案如图2中所示，经过光固化打印后，形成与DMD预设图案对应的成胶形状，得到负载细胞的三维泡状石墨烯-PEGDA-GelMA光固化生物材料，所述光固化生物材料中细胞的负载量为5×108个/cm3。
实施例3
在本实施例中，以10％PEGDA混合10％GelMA负载人宫颈癌细胞系HeLa细胞为例，培养基使用DMEM+10％FBS的细胞培养基，配置制备负载细胞的三维泡状石墨烯-PEGDA-GelMA光固化生物材料，其设计和制备流程如图1所示。
其制备方法如下：
(1)提前从冰箱中取出保存的消毒处理过的无菌的PEGDA和GelMA，室温静置待PEGDA彻底熔解为液体；配置细胞培养基(DMEM+10％FBS，过滤除菌)；称量0.5g LAP、10gPEGDA-700与15g GelMA，在无菌环境中混合于100mL的细胞培养基中(水凝胶培养基混合液)，37℃水浴加热使GelMA融化混合均匀，并于37℃保存。
(2)准备用于3D打印的HeLa细胞，将悬浮的细胞加入到水凝胶培养基混合液中，使细胞终浓度为7×108个/mL。
(3)提前对盛装生物墨水的样品槽进行灭菌处理，并对3D打印设备及其操作空间进行紫外消毒；安装样品槽，开启3D打印设备的水浴加热系统，使样品槽达到37℃；将制备、消毒完毕的9cm2×0.2cm的三维泡状石墨烯，轻轻放入样品槽并固定；将1mL含有细胞的水凝胶培养基混合液加入到样品槽中，使之与打印区域的三维泡状石墨烯混合，得到打印混合液。
(4)调节样品槽和打印平台至需要的位置，将要3D打印投影面数据导入设备软件，调节光源波长为405nm，曝光功率为50mW/cm2，曝光时间为0.5s，固化温度为37℃水浴，执行打印程序，通过控制3D光固化打印设备的空间光调制器(DMD)的预设形状实现特定形状的固化，本实施例中，DMD预设图案如图2中所示，经过光固化打印后，形成与DMD预设图案对应的成胶形状，得到负载细胞的三维泡状石墨烯-PEGDA-GelMA光固化生物材料，所述光固化生物材料中细胞的负载量为7×108个/cm3。
实施例4
在本实施例中，以10％PEGDA混合10％GelMA负载小鼠神经干细胞NSC细胞为例，培养基使用DMEM/F12+2％B27+20ng/mL EGF+20ng/mL FGF-2的细胞培养基，配置制备负载细胞的三维泡状石墨烯-PEGDA-GelMA光固化生物材料，其设计和制备流程如图1所示。
其制备方法如下：
(1)提前从冰箱中取出保存的消毒处理过的无菌的PEGDA和GelMA，室温静置待PEGDA彻底熔解为液体；配置细胞培养基(DMEM/F12+2％B27+20ng/mL EGF+20ng/mL FGF-2，过滤除菌)；称量0.5g LAP、10g PEGDA-700与15g GelMA，在无菌环境中混合于100mL的细胞培养基中(水凝胶培养基混合液)，37℃水浴加热使GelMA融化混合均匀，并于37℃保存。
(2)准备用于3D打印的NSC细胞，将悬浮的细胞加入到水凝胶培养基混合液中，使细胞终浓度为5×107个/mL。
(3)提前对盛装生物墨水的样品槽进行灭菌处理，并对3D打印设备及其操作空间进行紫外消毒；安装样品槽，开启3D打印设备的水浴加热系统，使样品槽达到37℃；将制备、消毒完毕的9cm2×0.2cm的三维泡状石墨烯，轻轻放入样品槽并固定；将1mL含有细胞的水凝胶培养基混合液加入到样品槽中，使之与打印区域的三维泡状石墨烯混合，得到打印混合液。
(4)调节样品槽和打印平台至需要的位置，将要3D打印投影面数据导入设备软件，调节光源波长为405nm，曝光功率为50mW/cm2，曝光时间为0.5s，固化温度为37℃水浴，执行打印程序，通过控制3D光固化打印设备的空间光调制器(DMD)的预设形状实现特定形状的固化，本实施例中，DMD预设图案如图2中所示，经过光固化打印后，形成与DMD预设图案对应的成胶形状，得到负载细胞的三维泡状石墨烯-PEGDA-GelMA光固化生物材料，所述光固化生物材料中细胞的负载量为5×107个/cm3。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (21)

1.一种负载细胞的三维泡状石墨烯-PEGDA-GelMA光固化生物材料的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将PEGDA、GelMA和光引发剂加入至细胞培养基中，混合均匀，得到水凝胶培养基混合液；
(2)将悬浮的细胞加入到水凝胶培养基混合液中，得到含有细胞的水凝胶培养基混合液；
(3)安装样品槽，开启3D光固化打印设备的水浴加热系统，给样品槽加热，将三维泡状石墨烯加入样品槽中，并将三维泡状石墨烯固定至样品槽中，将含有细胞的水凝胶培养基混合液加入到样品槽中，得到打印混合液；
(4)调节3D光固化打印设备的工作参数，执行打印程序，完成光固化打印后，得到负载细胞的三维泡状石墨烯-PEGDA-GelMA光固化生物材料；
步骤(1)所述水凝胶培养基混合液中PEGDA的质量浓度为10％以上；
步骤(1)所述水凝胶培养基混合液中GelMA的质量浓度为10％以上；
步骤(1)所述光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂；
步骤(1)所述光引发剂在水凝胶培养基混合液中的质量体积浓度为0.1-0.5％。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述PEGDA的数均分子量为250-20000。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述PEGDA的数均分子量为250-10000。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述PEGDA和GelMA均为消毒处理过的无菌的样品。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述细胞培养基为小鼠小胶质细胞系BV2细胞培养基、人脐静脉内皮细胞培养基、人宫颈癌细胞系培养基或小鼠神经干细胞培养基。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述将PEGDA、GelMA和光引发剂加入至细胞培养基中是在无菌环境中进行的。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述混合在37℃水浴或金属浴中进行。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述细胞为小鼠小胶质细胞系BV2细胞、人脐静脉内皮细胞、人宫颈癌细胞系HeLa细胞或小鼠神经干细胞。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述含有细胞的水凝胶培养基混合液中细胞终浓度为9×108个/mL以下。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述含有细胞的水凝胶培养基混合液中细胞终浓度为1×107-9×108个/mL。
11.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)在所述安装样品槽前对样品槽进行灭菌处理，并对3D打印设备及其操作空间进行紫外消毒。
12.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述给样品槽加热为使样品槽达到37℃。
13.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，相对于1mL含有细胞的水凝胶培养基，加入9cm2×0.2cm的三维泡状石墨烯。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述三维泡状石墨烯的杨氏模量为6-10kPa。
15.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(4)所述调节3D光固化打印设备的工作参数前，调节样品槽和打印平台至需要的位置，将要3D打印的投影面数据导入3D光固化打印设备软件。
16.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述调节3D光固化打印设备的工作参数包括调节光源波长为405nm，曝光功率为10-100mW/cm2，曝光时间为0.2-1s，固化温度为37℃水浴。
17.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述光固化打印通过控制3D光固化打印设备的空间光调制器的预设形状实现特定形状的固化。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的制备方法制备得到的负载细胞的三维泡状石墨烯-PEGDA-GelMA光固化生物材料。
19.根据权利要求18所述的负载细胞的三维泡状石墨烯-PEGDA-GelMA光固化生物材料，其特征在于，所述负载细胞的三维泡状石墨烯-PEGDA-GelMA光固化生物材料的细胞负载量为9×108个/cm3以下。
20.根据权利要求19所述的负载细胞的三维泡状石墨烯-PEGDA-GelMA光固化生物材料，其特征在于，所述负载细胞的三维泡状石墨烯-PEGDA-GelMA光固化生物材料的细胞负载量为1×107-9×108个/cm3。
21.根据权利要求18所述的三维泡状石墨烯-PEGDA-GelMA光固化生物材料在制备组织工程可移植材料中的应用或者在制备生理或病理模拟材料中的应用。
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