CN110832088A - 组织老化的标志物及其用途 - Google Patents

Abstract

本文提供了检测或确定组织的老化和/或氧化性损伤的方法，所述组织包括胎盘组织、皮肤、肾和脑组织。一个实施例提供了用于检测或确定身体组织的老化的方法，所述方法包括测量生物样品中醛氧化酶1(AOX1)表达或活性的一种或多种标志物，其中AOX1表达或活性的水平、或所述一种或多种标志物的水平指示所述组织的老化。本文还提供了治疗与一种或多种细胞或组织的老化或氧化性损伤相关的疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者给予AOX1抑制剂。

Description

组织老化的标志物及其用途

技术领域

本披露总体上涉及检测或确定组织诸如胎盘组织、皮肤、肾和脑组织的老化和/或氧化性损伤的方法。本披露还涉及延迟、减缓或预防这种组织的老化和/或氧化性损伤的方法。

背景技术

对组织的累积性随机损伤可影响组织功能并造成老化。代谢过程和细胞生长产生活性氧物质，活性氧物质可对蛋白、脂质和核酸造成损伤。虽然细胞具有抵抗氧化应激的防御机制，例如过氧化氢酶和超氧化物歧化酶等酶，但如果修复机制不足以抵偿活性氧物质的产生，则可能发生组织的损伤和老化。

生长途径通常与氧化应激增加相关。由于胎盘在促进胎儿生长方面的作用，因此在胎盘中可以发现氧化性损伤的指示物不足为奇，尤其是接近妊娠结束在胎儿迅速生长时。发明人假设死产可能与老化胎盘维持胎儿的能力降低有关(Smith等人2013,Placenta[胎盘],34:310-313)。支持这一观点的有：与足月时不明原因的宫内死亡病例相关的胎盘组织病理学研究，其揭示91％显示母体螺旋动脉壁增厚，54％含有胎盘梗塞，10％具有钙化区域，并且13％展示出血管闭塞；与其他器官老化相关的变化。发明人证明了来自延迟分娩或有死产的女性的胎盘具有老化和氧化应激的生化迹象。

不明原因的胎儿死亡是发达国家的妊娠常见并发症，每200例妊娠中大约有1例发生，而在发展中国家更为常见。不明原因的胎儿死亡比婴儿猝死综合征常见40倍，但引起的关注却少得多，而对于所涉及的家庭来说，该事件是毁灭性的。虽然尚未确定原因，但死产可能与胎儿生长受限、先天性异常、产前出血、围产期感染、先兆子痫和母体因素(如母体身高和年龄、肥胖、高血压、糖尿病、吸烟、双亲血缘、种族和出生国家)相关。虽然存在死产的风险因素，但许多病例的原因仍然不明。

在一些产前病例中，在死产之前可能会发生胎动不足，但是可能没有警示征兆。对死产原因缺乏了解，使得难以预测妊娠期间的风险。死产可定义为在妊娠期大于或等于20周时在生产前或在生产期间的胎儿死亡或出生体重大于或等于400g的胎儿死亡(Perinatal Society of Australia and New Zealand Clinical Practice Guidelinefor Perinatal Mortality[澳大利亚和新西兰围产期学会围产期死亡率临床实践指南]；第二版,2.2版,2009年4月)。确定死产风险的指标可以为孕妇提供进行预防性剖腹产或引产以降低胎儿风险的机会。因此，死产风险的预后生物标志物在预防死产方面将非常有益。

妊娠的最佳长度可能因个体而异。虽然婴儿在早产时可以存活，但是如果尚未在子宫内进行充分发育，则可能会有并发症。一般而言，较长的妊娠期(最长约41周)与婴儿的解剖和生理系统的更好发育相关。实际上，41周妊娠期出生的婴儿在以后的生活中比在37周妊娠期出生的婴儿需要接受特殊教育的可能性更低。然而，延长妊娠期可导致过度成熟症状，其中胎儿继续生长并需要额外营养供给。过度成熟综合征是一种见于晚产婴儿的病症，这些晚产婴儿显示出妊娠晚期营养不良的迹象。足月出生的正常人类婴儿体脂含量为12-14％，而过度成熟综合征则与婴儿出生相关，由于皮下脂肪减少而引起皮肤严重皱缩。过度成熟综合征在现代产科实践中很少见，其中如果尚未自发娩出，则通常在42周妊娠期之前使用引产术或剖腹产术来影响分娩。值得注意的是，死产风险在过期妊娠中显著增加，随着妊娠期超过38周，死产率呈指数级增长。因此，妊娠中似乎存在最佳妊娠期窗口，但是这个窗口可能因个体而异。目前无法确定个体妊娠的理想妊娠期窗口。虽然胎盘老化可能指示已经到了合适的分娩时间，但目前还没有方法以对胎儿风险最小的方式确定孕妇胎盘的氧化状态。

发明内容

本披露以发明人的惊人发现为基础，即醛氧化酶1(AOX1)表达和活性(及其标志物诸如4-羟基壬烯醛即4HNE的水平)与包括胎盘和肾在内的多个组织中的组织老化和氧化性损伤相关。发明人还证明，通过给予AOX1抑制剂诸如雷洛昔芬(raloxifene)，或G蛋白偶联的雌激素受体1(GPER1)激动剂诸如G1，可以减少胎盘中的氧化应激。如本文例示的，AOX1的抑制防止胎盘组织中的氧化和溶酶体变化。

因此，发明人已经鉴定了一种有效的生物标志物，该生物标志物可以非侵入性地取样，以给出胎盘氧化应激的指示，从而指示妊娠可能有死产的风险。与胎盘中观察到的那些相似的氧化和溶酶体变化也可以在与老化相关的疾病(例如阿尔茨海默氏病、亨廷顿病)中发现。因此，AOX1还提供了多种组织类型中氧化性损伤和老化的标志物以及治疗或预防氧化性损伤和老化的靶标。

本披露的第一方面提供了一种用于检测或确定身体组织的老化的方法，所述方法包括测量从受试者获得的生物样品中醛氧化酶1(AOX1)表达或活性的一种或多种标志物，其中正如通过所述一种或多种标志物的水平所测定的AOX1表达或活性的水平指示所述组织的老化。

在一个实施例中，所述组织选自胎盘组织、皮肤、肾或脑组织。

在一个示例性实施例中，所述受试者处于妊娠期并且所述组织是胎盘组织。

所述生物样品可以是例如相关组织的样品，或体液样品，诸如血液(全血、血浆或血清)、尿液、唾液或羊水。在受试者处于妊娠期的实施例中，所述样品可包括例如母体血液、胎儿血液、尿液、唾液或羊水。在受试者处于妊娠期的实施例中，所述生物样品典型地来源于母体，任选地来源于母体血液。在受试者处于妊娠期的其他实施例中，所述生物样品可包括来自所述妊娠受试者、胎盘组织和/或胎儿的样品的衍生物，诸如源自母体血液的总RNA，其中所述总RNA可以是母体、胎盘或胎儿来源的。

可以由从老化组织释放到血液中的材料测量AOX1表达或活性的所述一种或多种标志物。在受试者处于妊娠期的实施例中，可以由从老化胎盘组织释放到母体血液中的材料测量AOX1表达或活性的所述一种或多种标志物。因此，可以在母体血液中测量所述一种或多种标志物。在示例性实施例中，所述一种或多种标志物源自所述生物样品中存在的游离RNA或DNA、胎盘细胞片段、外来体或微粒。

可以在mRNA或基因水平，或在多肽或蛋白质水平上测量AOX1的表达。在示例性实施例中，AOX1表达或活性的合适标志物可包括AOX1 mRNA。在其他实施例中，AOX1表达或活性的合适标志物可包括AOX1下游的分子，诸如脂质过氧化产物。示例性脂质过氧化产物是4-羟基壬烯醛(4HNE)和丙二醛(MDA)。可以测量的其他氧化性损伤产物包括8-羟基-脱氧鸟苷(8OHdG)、8-羟基鸟苷(8HOG)。在示例性实施例中，可以组合方式测定或测量AOX1表达或活性的任两种或更多种标志物。例如，AOX1 mRNA可以与脂质过氧化产物诸如4HNE组合测量。

典型地，将通过所述一种或多种标志物测定的受试者中AOX1的表达或活性水平与其中不存在氧化性损伤的组织中的AOX1表达或活性、或其一种或多种标志物的一个或多个参考值进行比较。可以从一个或多个对照或参考个体获得或得到参考值。替代性地，可以从在不同时间点从受试者获得的一个或多个生物样品获得参考值，所述参考值可以用作可以与来自受试者的另外的生物样品进行比较的基线值。本领域技术人员熟悉确定和选择适当参考样品的方法。

典型地，与参考值相比，来自受试者的生物样品中AOX1表达或活性的水平、或其一种或多种标志物的水平增加指示组织中的氧化应激和/或老化。在示例性实施例中，所述组织是胎盘组织，并且所述生物样品是母体血液。

在特定实施例中，还可以在所述生物样品或另外的生物样品中测量氧化应激(诸如胎盘或胎儿氧化应激)的附加标志物。此类附加氧化性损伤或应激标志物的非限制性实例可包括AOX1蛋白、谷胱甘肽或蛋白羰基。

在受试者处于妊娠期的实施例中，所述方法可以在妊娠期间的任何时间，尤其是在妊娠后半期，诸如在人类受试者的情况下从大约20周妊娠期开始进行一次或多次。在特定实施例中，所述方法可以在过期妊娠中进行，例如在人类受试者的情况下在40周妊娠期之后进行。

本披露的方法的具体应用是检测妊娠受试者胎盘的老化以便预测死产风险，其中与一个或多个参考值相比，生物样品中AOX1表达或活性的水平、或其一种或多种标志物的水平增加指示胎盘老化和死产风险。胎盘老化可能与胎盘和/或胎儿氧化性损伤、胎儿健康降低和死产风险增加相关。胎盘氧化应激和胎盘老化也可能与营养物向胎儿的转移不足相关。所述方法还可用于诊断妊娠受试者的先兆子痫或诊断胎儿的宫内生长受限。所述方法还可用于预测过期妊娠的风险或与之相关的风险。

本披露的又一个实施例包括从妊娠受试者获得生物样品并测量所述生物样品中胎盘AOX1表达或活性的一种或多种标志物，以便确定进行干预以预防妊娠死产的需要，其中与一个或多个参考值相比，AOX1表达或活性增加、或其一种或多种标志物的水平增加指示可能需要干预。此类干预可包括预防性剖腹产、引产和/或给予治疗以预防或延迟胎盘老化或延长胎儿在子宫内的存活期。因此，在一个实施例中，所述方法可以通过确定胎盘氧化应激是否处于胎儿有死产风险的水平，而用于确定合适的分娩时间。与一个或多个参考值相比，AOX1表达或活性、或其一种或多种标志物的水平增加可以提示或指示已经到了合适的分娩时间。

在一个实施例中，本披露的方法可以通过测量随时间推移从受试者获得的一个或多个生物样品中AOX1表达或活性的一种或多种标志物，来检测或确定胎盘组织的老化，而用于监测妊娠期间死产的风险。在这样的方法中，在妊娠期间的多个时间点，例如每两周、每周或每天从妊娠受试者获得生物样品，并且在来自每个时间点的每个生物样品中测量胎盘AOX1表达或活性的一种或多种标志物。AOX1表达或活性、或其一种或多种标志物的水平随时间的增加可以指示死产风险增加，从而可以指示需要干预以预防死产。

本披露的第二方面提供了一种用于检测胎盘老化的方法，所述方法包括从妊娠受试者获得生物样品并测量所述生物样品中胎盘AOX1表达或活性的一种或多种标志物，其中AOX1表达或活性的水平、或其所述一种或多种标志物的水平指示胎盘老化。

典型地，与一个或多个参考值相比，AOX1表达或活性、或其一种或多种标志物的水平增加指示所述胎盘的老化。可以从来自一个或多个个体的组织的样品得到或获得合适的参考值，在所述个体中胎盘组织未表现出氧化性损伤的征兆，或者可以在妊娠期间的较早时间点从受试者得到或获得合适的参考值。

胎盘老化可能与死产风险增加、先兆子痫、胎儿宫内生长受限、和/或过期妊娠风险增加相关。

本披露的第三方面提供了一种用于预测妊娠中的死产风险的方法，所述方法包括从妊娠受试者获得生物样品并测量所述生物样品中胎盘AOX1表达或活性的一种或多种标志物，其中AOX1表达或活性的水平、或其所述一种或多种标志物的水平指示死产风险。

可以直接或间接确定死产风险。例如，AOX1表达或活性的水平、或其所述一种或多种标志物的水平可以指示先兆子痫、胎儿宫内生长受限、和/或过期妊娠风险增加，这些中的每一项都是与死产风险增加相关的指标或因素。

典型地，与一个或多个参考值相比，AOX1表达或活性、或其所述一种或多种标志物的水平增加指示死产风险。可以从一个或多个对照或参考个体获得或得到参考值。可以从来自一个或多个个体的组织的样品得到或获得合适的参考值，在所述个体中胎盘组织未表现出氧化性损伤的征兆，或者可以在妊娠期间的较早时间点从受试者得到或获得合适的参考值。

因此，本披露的第四方面提供了一种用于确定进行干预以预防过期妊娠或妊娠中死产的需要的方法，所述方法包括从妊娠受试者获得生物样品并测量所述生物样品中胎盘醛氧化酶1(AOX1)表达或活性的一种或多种标志物，其中AOX1表达或活性的水平、或其所述一种或多种标志物的水平指示对干预的需要。

干预可包括以下的至少一种：预防性剖腹产、引产和/或给予治疗以延迟胎盘老化或延长胎儿在子宫内的存活期。在胎儿太过早产而无法安全分娩或过于发育不足而无法生存的情况下，干预可包括治疗受试者以减少氧化应激、或AOX1表达或活性，如本披露的另外的方面和实施例中所讨论的。

本披露的第五方面提供了一种用于检测胎盘氧化应激的方法，所述方法包括从妊娠受试者获得生物样品并测量所述生物样品中胎盘AOX1表达或活性的一种或多种标志物，其中AOX1表达或活性的水平、或其所述一种或多种标志物的水平指示胎盘氧化应激。

典型地，与一个或多个参考值相比，AOX1表达或活性、或其所述一种或多种标志物的水平增加指示胎盘氧化应激。可以从一个或多个对照或参考个体获得或得到参考值。可以从来自一个或多个个体的组织的样品得到或获得合适的参考值，在所述个体中胎盘组织未表现出氧化性损伤的征兆，或者可以在妊娠期间的较早时间点从受试者得到或获得合适的参考值。

本披露的第六方面提供了一种用于在妊娠过程中监测胎盘老化、胎盘氧化应激、或过期妊娠或死产风险的方法，所述方法包括：(i)在妊娠过程期间的第一时间点从妊娠受试者获得生物样品；(ii)测量所述生物样品中胎盘AOX1表达或活性的一种或多种标志物；(iii)在所述妊娠期间的一个或多个后期时间点从所述受试者获得一个或多个另外的生物样品；以及(iv)测量所述一个或多个另外的生物样品中胎盘AOX1表达或活性的一种或多种标志物，其中AOX1表达或活性的水平、或其所述一种或多种标志物的水平随时间推移而增加指示胎盘老化、胎盘氧化应激、或过期妊娠或死产的风险。

对所述一种或多种标志物的测量可以例如在妊娠中期开始。在一个示例性实施例中，生物样品可以从约20周妊娠期获得。时间点之间的间隔可以由本领域的技术人员确定，并且可以是每天、每周、每两周、每月或由从业者确定的另一适当时间段。在整个妊娠过程中，特别是在孕龄晚期，时间点的频率可以增加。

在本披露的第七方面，提供了一种减缓或预防一种或多种细胞或组织的老化或氧化性损伤的方法，所述方法包括将所述一种或多种细胞或组织暴露于AOX1抑制剂。

抑制剂可以直接或间接作用于AOX1。在一个示例性实施例中，AOX1抑制剂是雷洛昔芬或G蛋白偶联的雌激素受体1(GPER1)激动剂。示例性GPER1激动剂是G-1((1-[4-(6-溴苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-3a,4,5,9b-四氢-3H-环戊[c]喹啉-8-基]-乙酮)。

在示例性实施例中，所述组织是胎盘组织。因此，将AOX1抑制剂向妊娠受试者给予。

在又一个示例性实施例中，所述组织是皮肤、肾或脑组织。

在本披露的第八方面，提供了一种治疗与一种或多种细胞或组织的老化或氧化性损伤相关的疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者给予AOX1抑制剂。

在本披露的第九方面，提供了一种用于预防或降低过期妊娠或死产风险的方法，所述方法包括向妊娠受试者给予AOX1抑制剂。

另外的方面提供了AOX1抑制剂在制备用于减缓或预防老化或氧化性损伤、用于治疗与老化或氧化性损伤相关的疾病或病症、或用于预防或降低过期妊娠或死产风险的药物中的用途。

附图说明

参考以下附图，本文仅通过非限制性举例的方式描述了本披露的多个方面和实施例。

图1：醛氧化酶调节胎盘中与死产相关的氧化性损伤。脂肪酸的氧化性损伤可以通过与改变的溶酶体和/或自噬体功能相关的4-羟基壬烯醛(4HNE)得以证明。氧化性损伤还可以改变细胞中的核酸(DNA和/或RNA)，这可以通过8-羟基-脱氧鸟苷(8OHdG)或8-羟基鸟苷(8HOG)的存在得以证明。4HNE、8OHdG和8HOG可以指示胎盘的老化。醛氧化酶可受雷洛昔芬抑制，并且可以通过使用激动剂G1与G蛋白偶联的雌激素受体1相互作用而受到抑制。

图2：死产与持续妊娠数量的关系。持续妊娠数量随孕龄变化的卡普兰迈尔(Kaplan Myer)线图以及每1000例持续妊娠中不明原因的死产的线图；数据来自Omigbodun和Adewuyi(1997)(J Natl Med Assoc[美国医学会杂志],89:617)以及Sutan等人(2010)(JPerinatol[围产期学杂志],30:311-318)。线图显示死产风险随时间而增加，与Johnson等人(1999)(Cell[细胞]，96:291-302)提出的关于老化的操作性定义一致，并且到第41周有死产风险的妊娠数量相对较小是由于提前分娩。

图3：过期胎盘和死产胎盘中的DNA/RNA氧化。该图表说明与足月胎盘相比，过期胎盘和死产胎盘具有增加的核8OHdG/8HOG染色强度(对于过期胎盘而言，p<0.0001，对于死产胎盘而言，p＝0.0005，曼惠特尼检验)。空心圆圈和实心圆圈分别表示足月剖腹产非娩出胎盘(n＝10)和足月阴道分娩娩出胎盘(n＝8)。空心方块和实心方块分别表示过期剖腹产娩出胎盘(n＝5)和过期阴道分娩娩出胎盘(n＝13)。实心三角形表示妊娠末三个月阴道分娩娩出的不明原因的死产胎盘(n＝4)。图表中的每个点表示以100倍放大倍数和1.4光学分辨率拍摄的每个胎盘的6个图像中60个核的8OHdG/8HOG的平均强度。

图4：在过期胎盘和死产胎盘中脂质过氧化增加。4HNE的强度在过期胎盘(p<0.0001，曼惠特尼检验)和死产胎盘(p＝0.0013，曼惠特尼检验)中显著增加。空心圆圈和实心圆圈分别表示足月剖腹产非娩出胎盘(n＝21)和足月阴道分娩娩出胎盘(n＝14)。空心方块和实心方块分别表示过期剖腹产娩出胎盘(n＝10)和过期阴道分娩娩出胎盘(n＝18)。实心三角形表示妊娠末三个月阴道分娩娩出的不明原因的死产胎盘(n＝4)。图表中的每个点表示为每个单独的胎盘获得的以100倍放大倍数和1.4光学分辨率拍摄的6个图像的每单位面积的平均强度。

图5：来自早期(n＝17)、晚期(n＝26)、先兆子痫(PE，n＝22)和胎儿宫内生长受限(IUGR，n＝24)病例的母体血浆中的4HNE水平。晚期、PE和IUGR组的4HNE水平显著高于早期。早期相对于晚期，p＝0.0016；早期相对于PE，p＝0.0017；早期相对于IUGR，p＝0.0016。

图6：过期胎盘和死产胎盘中溶酶体分布的变化。LAMP2(一种溶酶体标志物)的免疫组织化学显示，溶酶体主要定位于足月胎盘的顶面(A)，而在过期胎盘(B)和死产胎盘(C)中溶酶体分布延伸至合胞体滋养层的核周和基底面(例如白色线条所示)。合胞体滋养层的强度计算显示LAMP2在过期胎盘(n＝5，图5F)和不明原因的死产胎盘(n＝4，图5G)中的分布转移到核周和基底面，而足月剖腹产胎盘(n＝5，图5D)和足月阴道分娩胎盘(n＝5，图5E)中的溶酶体分布保持在合胞体滋养层的顶端区域。DAPI染色鉴定细胞核。在图5D至图5G中，每条彩色线条表示单个胎盘上的结果，并且显示了对于每个胎盘的6个单独图像而言，每个图像5个随机位点处的合胞体滋养层上的LAMP2的平均强度(实例由5A、5B和5C中的浅绿色线条表示)。图像是以100倍放大倍数和1.4光学分辨率拍摄的。比例尺20μm。

图7：在过期胎盘和死产胎盘中出现更大的自噬体。使用NIS元素软件对自噬体大小定量，并且以1000-3000的任意强度范围、0.2-1μm的直径范围和0.5-1的圆形度范围测量直径。分析显示，与足月胎盘相比，过期胎盘和死产胎盘具有显著更大(分别为p＝0.012和p＝0.0019，曼惠特尼检验)的自噬体。空心圆圈和实心圆圈分别表示足月剖腹产非娩出胎盘(n＝11)和足月阴道分娩娩出胎盘(n＝10)。空心方块和实心方块分别表示过期剖腹产娩出胎盘(n＝8)和过期阴道分娩娩出胎盘(n＝15)。实心三角形表示不明原因的死产胎盘(n＝4)。图中的每个点表示对每个胎盘获得的六个图像中的LC3B颗粒的平均直径。

图8：过期胎盘的自噬体内的氧化脂质。代表性的双标记荧光免疫染色显示LC3B(一种自噬体标志物)与脂质过氧化的标志物4HNE共定位。点(如C中箭头所指)指示共定位。DAPI染色指示细胞核。原始放大倍数100倍；比例尺20μm。

图9：RNA测序数据显示，过期胎盘的AOX1 mRNA表达显著高于足月胎盘。

图10：醛氧化酶1(AOX1)在4HNE的产生中的作用。在过期(A-C)和死产(D-F)胎盘中的代表性双标记荧光免疫染色显示AOX1阳性颗粒与4HNE共定位。点(如C和F中的箭头所指)指示共定位程度。细胞核用DAPI染色。实时PCR显示，与足月胎盘(G)相比，在过期(p＝0.0097)和死产(p＝0.012)胎盘中AOX1 mRNA的表达增加。原始放大倍数100倍；比例尺20μm。

图11：对胎盘中的4HNE产生和GPER1表达的药理学抑制。用雷洛昔芬(一种AOX1抑制剂)(A)和G1(一种膜雌激素受体GPER1激动剂)(B)处理胎盘外植体后，4HNE的产生(通过血清饥饿诱导)显著减少。数据是平均值±SEM，*p<0.05(N＝6)。

图12：在剥夺血清的培养基中培养的胎盘外植体中的自噬体大小的变化。免疫组织化学分析显示，与0小时相比，血清饥饿后24小时自噬体(LC3B阳性颗粒)的大小增加。数据表示为±SEM，***p＝0.0002(N＝13)。

图13：通过实时PCR和蛋白质印迹分析对不同组织中GPER1的检测。实时qPCR数据显示GPER1的mRNA在足月胎盘中的表达量高于羊膜、绒毛膜和蜕膜(A)。在这些组织中GPER1的mRNA表达量具有以下顺序：蜕膜<绒毛膜<羊膜<胎盘(A)。从乳腺癌细胞系MCF-7、足月胎盘、足月子宫肌层、足月羊膜、足月绒毛膜和足月蜕膜中提取蛋白质并进行蛋白质印迹分析(B)。胎盘、子宫肌层和MCF-7细胞系表达的GPER1量高于羊膜、绒毛膜或蜕膜(B)。蛋白质印迹分析数据显示所有组织均表达糖基化GPER1(由**或***表示)和非糖基化新生GPER1(由*表示)。相同PVDF膜的sypro-ruby染色用作内部上样对照(C)。

图14：与足月妊娠相比，在死产的情况下，在总母体血液中AOX1 mRNA增加。

图15：来自66岁受试者(A)和来自21岁受试者(B)的肾组织中的4HNE的免疫染色。除非另有说明，否则所有图像均为20倍放大倍数。

具体实施方式

除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语均具有与本披露所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。虽然与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或试验中，但描述的是典型方法和材料。

冠词“一”和“一个(种)”在本文中用于指该冠词的一个或一个以上(即，至少一个)语法宾语。举例来说，“一个要素”意指一个要素或一个以上的要素。

除非上下文另有要求，否则在本说明书和随后的权利要求书全篇，词语“包含”以及变型应当被理解为暗指包括所陈述的整数或步骤或者多个整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤或者多个整数或步骤的组。

如本文所用，术语“受试者”包括任何哺乳动物，诸如人、非人灵长类动物、家畜动物(例如绵羊、猪、牛、马、驴、山羊)、实验室试验动物(例如小鼠、兔子、大鼠、豚鼠、其他啮齿类动物)和伴侣动物(例如狗、猫)。在典型的实施例中，受试者是人。类似地，术语“个体”包括任何哺乳动物，诸如人、非人灵长类动物、家畜动物(例如绵羊、猪、牛、马、驴、山羊)、实验室试验动物(例如小鼠、兔子、大鼠、豚鼠、其他啮齿类动物)和伴侣动物(例如狗、猫)。在典型的实施例中，个体是人。

术语“死产”在本文中是指在妊娠期大于或等于约20周时在生产前或在生产期间的胎儿死亡或出生体重大于或等于约400g的胎儿死亡(Perinatal Society of Australiaand New Zealand Clinical Practice Guideline for Perinatal Mortality[澳大利亚和新西兰围产期学会围产期死亡率临床实践指南]；第二版，2.2版，2009年4月)。

术语“过期”是指妊娠超出预期妊娠期时间。在本披露的上下文中，当提及人类妊娠时，术语“过期”用于指示妊娠期大于40周整的妊娠。过期妊娠也可称为过预产期妊娠。

如本文所用，术语“氧化应激”可与术语“氧化性损伤”互换使用，并且是指活性氧物质与抗氧化机制之间的不平衡以及由这种不平衡引起的损伤。氧化性损伤的非限制性实例包括核酸(诸如DNA或RNA)氧化和脂质氧化，核酸氧化可以通过例如分析或测量8-羟基-脱氧鸟苷或8-羟基鸟苷(8OHdG或8HOG)在样品中检测到，脂质氧化可以通过例如测量烯醛诸如4-羟基壬烯醛(4HNE)在样品中检测到。具体而言，本文中术语“胎盘氧化应激”是指胎盘中发生的氧化应激。虽然不希望受理论束缚，但发明人提出胎盘中增加的氧化应激与胎盘的老化有关，并且可导致胎盘充分维持胎儿的能力不足。发明人假设胎盘中的氧化应激因此可能与死产风险增加相关。

如本文所用的术语“生物标志物”是指天然存在的生物学功能化合物或分子，诸如基因、核酸序列、蛋白质或其片段，或其他代谢物，这种化合物或分子具有用于诊断多种身体组织(诸如胎盘、皮肤、肾和大脑)中的组织老化，诊断先兆子痫，诊断子宫内生长受限，以及诊断和评估过期妊娠和死产风险的预测价值。测定生物样品中标志物的水平或活性可包括检测和定量标志物本身或其前体、衍生物或代谢物。术语“生物标志物”和“标志物”在本文中可互换使用。

在本披露的上下文中，生物标志物可以是RNA或其他核酸序列。在评估胎盘组织老化及有关病症和影响的实施例中，mRNA可以源自胎盘并在母体血液中进行测量。同样根据本披露的实施例，测定本文鉴定的生物标志物的前体、衍生物、变体、类似物和功能片段的表达。生物标志物的变体包括表现出变体对应的生物标志物的至少一些功能活性的分子。

在本披露的上下文中，提及给定样品中标志物的表达增加意指样品中所讨论的标志物的表达水平，典型地在与一个或多个对照或参考样品中的表达水平相比较时或在与同一受试者中的样品的基线测量值相比较时增加。本文中可使用对照或参考样品来指示从一个或多个个体获得的样品，所述个体没有氧化应激或组织老化的征兆和/或在妊娠个体的情况下，没有过期妊娠或死产的风险。

一方面，本披露提供了一种用于检测或确定身体组织的老化的方法，所述方法包括测量从受试者获得的生物样品中醛氧化酶1(AOX1)表达或活性的一种或多种标志物，其中正如通过所述一种或多种标志物的水平所测定的AOX1表达或活性的水平指示所述组织的老化。

本披露的又一方面提供了一种用于检测胎盘老化的方法，所述方法包括从妊娠受试者获得生物样品并测量所述生物样品中胎盘AOX1表达或活性的一种或多种标志物，其中AOX1表达或活性的水平、或其所述一种或多种标志物的水平指示胎盘老化。又一方面提供了一种用于预测妊娠中的死产风险的方法，所述方法包括从妊娠受试者获得生物样品并测量所述生物样品中胎盘AOX1表达或活性的一种或多种标志物，其中AOX1表达或活性的水平、或其所述一种或多种标志物的水平指示死产风险。

如本文所披露和例示的发明人的新发现，在一些实施例中，提供了用于预测过期妊娠或死产风险的准确的、具有成本效益的快速方法。因此，在示例性实施例中，本文披露了有助于预测死产风险和确定针对风险妊娠的治疗性防治或预防方案的一种简单的生物化学试验。

如本文所披露和例示的发明人的新发现，在一些实施例中，还提供了在一系列身体组织(包括例如胎盘、皮肤、肾和脑组织)中用于检测或确定组织老化以及用于检测或确定组织氧化性损伤的准确的、具有成本效益的快速方法。

发明人在本文中证明，在38至41周妊娠期之间，胎盘的生物化学和生理学方面发生明显变化。具体而言，对DNA和脂质的氧化性损伤增加，在合胞体滋养层的核周和基底面积聚的溶酶体的位置改变，形成与氧化脂质相关的较大自噬体，并且酶AOX1的表达增加。在与死产相关的胎盘中观察到相同的变化。在失去生长因子的胎盘外植体中发生在脂质氧化、溶酶体定位和自噬体大小方面的类似变化，并且可以通过抑制AOX1来阻断这些变化。

发明人还在本文中证明在41周时胎盘的生理功能显示出下降的迹象，这种下降的迹象具有许多其他组织老化的特征。因此，在38周妊娠期后发生的不明原因的宫内死亡的已知指数级增长可能是胎盘老化以及充分发挥功能以满足生长胎儿不断增长的需求的能力降低的结果。这些知识可能会影响产科实践，以确保婴儿在胎盘老化到出现严重问题之前出生。

如上所述，死产风险随着孕龄而增加，尤其是随着妊娠期超过38周而呈指数级上升。类似地，随着胎盘老化，氧化性损伤的征兆也会增加。然而，本领域技术人员将认识到胎盘老化的征兆以及因此氧化性损伤的征兆可能在不同时间出现，并且在不同个体中以不同的速率进展。因此，不能规定应该启动本发明的方法或开始启动本发明的方法的具体孕龄，也不能规定妊娠期间应该采用方法的次数。例如，在人类受试者的情况下，本披露的方法可以从大约18周、19周、20周、21周、22周、23周、24周、25周、26周、27周、28周、29周、30周、31周、32周、33周、34周、35周、36周、37周、38周、39周、40周或41周妊娠期开始进行。所述方法可以在妊娠期间进行一次或多次，例如每周或每两周一次。使用本文披露的方法进行试验和监测的频率可以随着孕龄的增加而增加。根据本披露内容启动试验和监测的适当时机以及适当的频率可由技术人员在没有过度负担或对进一步发明的需要的情况下根据具体情况确定。

本发明人还在本文中证明他们的发现延伸到除胎盘组织以外的组织，从而提供AOX1在肾中引起氧化性损伤的证据。

不希望受理论束缚，发明人提出组织(诸如胎盘、皮肤、肾或大脑)中的AOX1表达或活性增加引起组织的氧化性损伤和氧化应激，并造成组织老化(图1，在胎盘的情况下)。在胎盘组织的情况下，胎盘的老化可能导致缺乏适当营养物向胎儿递送，从而引起子宫内生长受限和/或死产。发明人已经证实可以在母体血液中测量胎盘氧化应激的指示物，诸如胎盘醛氧化酶，从而以对胎儿风险最低的方式提供可以非侵入性测定的胎盘完整性的生物标志物。因此，本文披露了使用胎盘氧化应激的生物标志物(诸如AOX1表达)来测定妊娠中的死产风险的合适方法。发明人还证明，可以通过AOX1抑制来预防这种氧化应激。

发明人还注意到胎盘老化的指标，诸如氧化性损伤和溶酶体定位，是与其他病理诸如阿尔茨海默氏病共有的，并且表明老化和氧化应激通常可能与AOX1相关，并且也可通过AOX1抑制得以延迟或预防。

在本披露的具体实施例中，所述方法包括测量母体血液中的胎盘AOX1 mRNA。另外的胎盘氧化应激生物标志(作为AOX1表达或活性的替代物)包括但不限于：指示脂质的氧化性损伤的脂质过氧化产物，诸如4-羟基壬烯醛(4HNE)和其他羟基烯醛；指示核酸的氧化性损伤的8-羟基脱氧鸟苷(8OHdG)和8-羟基鸟苷(8HOG)；以及其他指示氧化应激的标志物，诸如丙二醛(MDA)、异前列腺素、氧固醇或增加的蛋白质羰基浓度。

本披露的实施例包括用于检测和测定过期妊娠和死产风险的方法，其中AOX1mRNA、或AOX1表达或活性的其他标志物增加高于基线(典型地由如前文所述的一个或多个参考值确定)指示胎盘氧化应激以及过期妊娠或死产的风险增加。由于死产可以在妊娠的任何阶段发生(按照定义在人类中妊娠期超过20周或400g)，因此本文披露的方法考虑在妊娠的不同时间点监测总母体血液中本文披露的氧化应激标志物在的存在和水平。在人类中可以例如从20周妊娠期开始，在妊娠过程中以1、2、3或4周的间隔检测和测量此类标志物。AOX1mRNA、或AOX1表达或活性的标志物相比于基线的增加将指示过期妊娠或死产的风险增加。

可以利用本领域已知的任何方法进行用于根据本文披露的实施例测定生物标志物水平的生物化学试验，并且本披露不因对测定生物标志物水平的方法的提及而受限制。生物标志物水平的测定可以包括检测和/或定量，并且可用于此类测定的方法和技术是本领域技术人员熟知的。典型地，如果生物标志物是mRNA，则本披露的测定将是定量实时PCR。本说明书的检测生物标志物的其他方法包括但不限于PCR、DNA阵列、微阵列、连接酶链反应、寡核苷酸连接测定、cDNA微阵列、下一代测序、RNA印迹分析、原位杂交和用于测定个体中的差异性表达的另外的统计分析。

用于测量蛋白质生物标志物的合适的方法和技术也可包括但不限于使用光谱分析、柱色谱法、凝胶电泳、质谱法和蛋白质点鉴定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、图像采集和分析(诸如磁共振成像(MRI)光谱法和单光子发射计算机断层扫描术(SPECT))、免疫染色、HPLC、LC/MA。用于根据本文披露的实施例测定生物标志物水平的生物化学试验可以用于任何合适的环境或条件中，诸如医院、诊所、外科或医学实践或病理学实验室。

此类生物化学试验可以并入到一个或多个能够分析所需生物标志物的装置中，从而允许试验过程一定程度或完全自动化。合适的装置典型地能够接收生物样品，分析所述样品中的一种或多种生物标志物水平并实时提供关于所述生物标志物水平的数据，从而促进从实验台到病床和即时的分析、诊断、风险评估和/或治疗。应当理解，提及测定标志物的表达水平或标志物的水平意在提及使用任何合适的技术，所述技术将提供与受试者相关组织中所需标志物的表达水平或所需标志物的水平有关的信息。因此，这些技术包括体内技术，诸如使用磷线圈的MRI成像，以及应用于从受试者提取的生物样品的体外技术。其他氧化应激标志物(诸如4HNE、8OHdG或8HOG)可通过本领域熟知的方法检测，诸如通过荧光检测、免疫组织化学或色谱法诸如HPLC。

从个体获得的用于测定氧化应激标志物水平的生物样品可以源自任何合适的体液或组织。典型地，在本披露的方法中，样品可包括血液(诸如红细胞、白细胞、全血、血浆或血清)、尿液、羊水、唾液或组织。如果受试者处于妊娠期，则生物样品可以来源于母体、胎盘或胎儿。在一个实施例中，生物样品是母体总血液。

本领域已知的是，胎儿细胞或核酸可存在于母体血液中。因此，可以在样品中测量到在本披露的方法中测量的生物标志物，诸如从胎盘释放到母体循环中的游离DNA或游离RNA、胎盘细胞、胎盘细胞片段、外来体或微粒。

如果在自然发生娩出之前检测到AOX1 mRNA或生物标志物水平增加，则医师可以考虑降低死产风险的可用选择。此类选择包括例如如果胎儿处于出生时很可能存活的阶段，则引产或剖腹产。如果在认为婴儿早产的孕龄检测到增加的AOX1 mRNA或生物标志物水平，则可以考虑选择延迟胎盘老化或延长妊娠期。如本文所披露和例示的，选择可包括例如用抗氧化剂治疗或一种或多种AOX1抑制剂治疗妊娠母体。如下文进一步讨论的，适当的AOX1抑制剂的实例包括雷洛昔芬或G蛋白偶联雌激素受体1(GPER1)的激动剂，诸如G-1。

本披露的实施例规定：可以与作为组织老化的进一步指标的一种或多种临床评估相结合来测定或测量AOX1表达或活性的标志物。例如，在妊娠受试者中，临床评估，诸如改变的胎动、胎儿生长的度量、或者改变的胎盘动脉、胎盘静脉或胎儿脑动脉多普勒研究结果，可与AOX1表达或活性标志物组合使用以评估胎盘老化、死产风险、对进行干预以预防死产的需要以及胎盘氧化应激。适于上下文的临床评估可以由本领域技术人员容易地确定。

本披露还提供适合根据本披露的方法使用的试剂盒。此类试剂盒包括例如用于测定生物样品的预后试剂盒，该预后试剂盒包含用于检测本文披露的区别性生物标志物(诸如AOX1 mRNA、4HNE、8HOG和8OHdG)的表达水平的试剂。根据本披露的试剂盒还可以包括进行本披露的方法所需的其他组分，诸如缓冲剂和/或稀释剂。试剂盒典型地包括用于容纳各种组分的容器以及在本披露的方法中使用试剂盒组分的说明书。

本披露还考虑给予治疗剂以阻止氧化性损伤或组织老化。在一些实施例中，在经鉴定处于高死产风险的妊娠中，包括在极度早产而使分娩不可能时，在有胎盘氧化性损伤或胎盘老化的情况下可以在妊娠期间给予合适的治疗剂。不希望受理论的束缚，发明人提出胎盘可以提供在9个月的时间段内唯一老化的人类组织的易处理的老化模型。在本文中，发明人展示了胎盘氧化应激标志物和溶酶体定位的变化，这些变化类似于在老化疾病诸如阿尔茨海默氏病和亨廷顿病中的变化(参见实例)。在胎盘老化与神经退行性疾病中的老化之间的氧化性损伤和溶酶体分布的相似性表明在这些情况下可能存在类似的老化机制。因此，在本披露中考虑，可以给予AOX1抑制剂(诸如GPER1激动剂或雷洛昔芬)和其他AOX1抑制剂或如本文所考虑的GPER1激动剂来预防、延迟或治疗由于氧化应激导致的老化以及其中氧化性损伤是病理性的疾病和病症。

因此，在其他实施例中，可以给予合适的治疗剂来预防、延迟、减缓、延缓或治疗皮肤、肾或脑组织的老化和氧化应激或损伤。此类组织中的氧化应激和损伤可以仅仅是老化过程的结果，或者可由一系列其他因素引起、加速或加剧。仅举例来说，皮肤的氧化性损伤和老化可能与长期暴露于阳光或与晒伤相关，肾脏的氧化性损伤和老化可能与急性或慢性肾损伤或疾病、吸烟和药物滥用、高血压、血脂异常、肥胖和炎症性病症相关，大脑的氧化性损伤和老化可能与脑损伤或创伤或神经退行性病症诸如记忆丧失、阿尔茨海默氏病和帕金森病相关。

根据本披露的方法，根据本披露使用的治疗剂包括例如AOX1抑制剂，包括但不限于雷洛昔芬和G蛋白偶联受体1(GPER1)激动剂。例如，在本披露的实施例中，GPER1的激动剂可用于减少或预防胎盘的氧化应激。根据本披露使用的一种特别合适的GPER1激动剂是G-1即(1-[4-(6-溴苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-3a,4,5,9b-四氢-3H-环戊[c]喹啉-8-基]-乙酮)。G-1是一种可透过细胞的非类固醇二氢喹啉化合物，该化合物充当高亲和力GPER激动剂。

然而，本领域技术人员将认识到，本披露的范围不限于此，并且可以采用任何其他AOX1抑制剂或者能够直接或间接激活GPER1受体或其下游途径的药剂。也适用于本披露的方法的其他AOX1抑制剂可以例如包括他莫昔芬、雌二醇、乙炔雌二醇、吩噻嗪、三环抗抑郁药、三环非典型抗精神病药、二氢吡啶类钙通道阻滞剂、氯雷他定(loratidine)、环苯扎林(cyclobenzaprine)、阿莫地喹(amodiaquine)、马普替林(maprotiline)、昂丹司琼(ondansetron)、普罗帕酮(propafenone)、多潘立酮(domperidone)、奎纳克林(quinacrine)、酮康唑(ketoconazole)、维拉帕米(verapamil)、他克林(tacrine)和沙美特罗(salmeterol)。

可以与靶向GPER1或AOX1的治疗性化合物联合使用或替代所述治疗性化合物的其他治疗剂包括抗氧化分子、化合物或治疗剂，例如硫醇、抗坏血酸或酚(诸如多酚)、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物氧化还原酶、硫氧还蛋白、谷胱甘肽、胡萝卜素、α-生育酚、白藜芦醇和类黄酮。

出于本披露的目的，供给予的包含治疗剂的组合物可以通过本领域技术人员熟知的方法制备。因此，该组合物可包含药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂和/或佐剂。载体、稀释剂、赋形剂和佐剂就与该组合物的其他组分相容而言必须是“可接受的”，并且对于接受该组合物的受试者无害。要使用的药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂和/或佐剂可取决于该组合物的预期给予途径，并且将是本领域技术人员熟知的。组合物可以通过任何方便或合适的途径给予，包括例如局部、口服、鼻腔或其他粘膜途径，或肠胃外，诸如皮下、肌肉内或动脉内途径。给予途径将取决于许多因素，包括治疗所针对的组织。类似地，给予组合物的形式或媒介物将取决于许多因素，包括治疗所针对的组织。示例性形式可包括用于局部给予的注射用溶液或混悬液、洗剂、搽剂、凝胶、乳膏、软膏、泡沫、油、粉末等，以及用于口服给予的片剂、锭剂、胶囊、酏剂、混悬液、糖浆、糯米纸囊剂、颗粒、粉末、凝胶、糊剂、溶液、混悬液、可溶性小袋、囊片、糖锭、泡腾片、咀嚼片、多层片剂等。

在给予用于治疗、预防、减缓、延缓或延迟皮肤老化或皮肤氧化性损伤的组合物的一个示例性实施例中，可将如本文所披露的合适的AOX1抑制剂或GPER激动剂配制成用于局部给予于皮肤的搽剂、凝胶、乳膏、软膏、泡沫、油等。这样的制剂可以直接施用于皮肤，或者可以通过将制剂添加到浴中来施用。该制剂还可包含例如遮光剂、维生素E或其他合适的成分，以最小化UV辐射的影响和/或有助于皮肤保湿和/或修复。

药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂和佐剂的实例包括但不限于脱矿质水或蒸馏水；生理盐水；植物油，诸如花生油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、芝麻油，诸如花生油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、芝麻油、花生油或椰子油；硅酮油，包括聚硅氧烷，诸如甲基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷和甲基苯基聚硅氧烷；挥发性硅酮；矿物油，诸如液体石蜡、软石蜡或角鲨烷；纤维素衍生物，诸如甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素；低级烷醇，例如乙醇或异丙醇；低级芳烷醇；低级聚亚烷基二醇或低级亚烷基二醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯，诸如棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；琼脂；角叉菜胶；黄蓍胶或阿拉伯树胶和凡士林。

本说明书中对任何在先公开文件(或从其中所得到的信息)的提及或者对任何已知的事物的提及不是并且不应当被理解为这样一种承认或准许或任何形式的暗示，即该在先公开文件(或从其中得到的信息)或已知的事物形成了在本说明书所涉及的研究领域内的公知常识的一部分。

现在将参考以下具体实例描述本披露，所述实例不应当解释为以任何方式限制本披露的范围。

实例

以下实例说明本披露并且不应当解释为以任何方式限制贯穿本说明书而描述的披露内容的一般性质。

一般方法

组织的伦理、收集和处理

该研究得到了亨特新英格兰卫生服务中心(Hunter New England HealthServices)和澳大利亚新南威尔士州纽卡斯尔大学(University of Newcastle,NSW,Australia)的人类研究伦理委员会的批准。在助产士获得患者的书面知情同意后，收集人体胎盘。胎盘是从38-39周妊娠期(足月)的正在接受剖腹产以进行早先剖腹产和正在进行正常阴道分娩的女性，以及妊娠41+周正在接受剖腹产和正在进行正常阴道分娩的女性，以及有死胎正在进行阴道分娩的女性收集的。在分娩后立即收集胎盘并进行处理，不再拖延。从多个部位取样绒毛组织，并准备进行组织学分析和RNA提取。对于每个胎盘，从胎盘的至少5个不同区域且在绒毛膜板下4-5mm获得组织。将来自每个单独胎盘的样品立即在液氮下冷冻并储存在-80℃下直至进行后续实验。对于组织学实验，将组织在2％甲醛中固定24小时，在室温(RT)下储存在50％乙醇中并包埋在石蜡中。为了形成胎盘卷，从胎盘外围切下2cm的绒毛膜羊膜细条，保持少量胎盘附着于膜上。将细条绕在镊子上滚动，在圆柱形辊的中心留下残留的胎盘。然后垂直于圆柱轴切割圆柱形辊，得到4mm厚的切片。然后将组织在福尔马林中固定并封固在石蜡块中。将来自有感染、糖尿病、先兆子痫、前置胎盘、子宫内生长受限或中断的患者的胎盘排除在外。

胎盘外植体培养

对于体外实验，从正常单胎妊娠，没有任何娩出症状的女性，在选择性(计划重复)剖腹产后获得人体足月胎盘(38-39周妊娠期)。在分娩后立即收集胎盘并准备进行外植体培养。从胎盘的不同区域，在绒毛膜板下4-5mm随机取样胎盘的绒毛组织。将组织在无菌条件下用杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水(DPBS)洗涤几次以去除过量的血液。解剖～2mm3的绒毛外植体并置于含有25ml补充了2mM L-谷氨酰胺、1％丙酮酸钠、1％青霉素/链霉素(100X)溶液并添加了10％(v/v)胎牛血清(FBS)的杜尔贝科改良伊戈尔培养基(DMEM)的100X 20mm培养皿中(30片/个培养皿)，在37℃的温度下并保持95％空气(20％氧气)和5％CO₂的细胞培养室中培养24小时。第2天，将绒毛外植体转移到30ml新鲜生长培养基中并在细胞培养室中温育90分钟。此后，将组织在不含FBS的DMEM(称为“无血清培养基”或“生长因子缺乏型培养基”)中洗涤。接下来，将6-7片重约400mg的绒毛组织转移到含有6ml无血清培养基的培养皿(60X 15mm)中进行长达24小时的后续温育，所述培养皿中添加或未添加药理学试剂，例如雷洛昔芬(1nM)和GPER1激动剂G1(1nM)。在24小时结束时，将一些组织在2％甲醛中固定，进行常规组织学处理并包埋在石蜡中，并立即将一些组织在液氮中冷冻且储存在-80℃直至进行后续实验。对于每次胎盘外植体培养，还在“0(零)”小时时，即在无血清培养基中温育之前收集样品，并进行福尔马林固定且在-80℃下冷冻储存直至进行进一步实验。

蛋白质印迹分析

根据Maiti,K等人(2011,Endocrinology[内分泌学],152:2448-2455)进行蛋白质印迹分析。在液氮下将胎盘样品(1g)碾碎。将100mg胎盘组织的等分试样在1mL裂解缓冲液(磷酸盐缓冲盐水(PBS)、1％Triton-X-100、0.1％Brij-35、1X蛋白酶抑制剂、1X磷酸酶抑制剂，pH 7.4)中匀化。使用BCA蛋白测定试剂盒测量每种胎盘提取物的蛋白浓度，并且将40μg胎盘提取物通过在NuPage bis-tris预制12孔凝胶中在恒定200V下电泳50分钟而分离。然后使用Novex转移系统将分离的蛋白转移到硝酸纤维素膜上保持70分钟，并用溶于含有0.1％吐温-20的tris缓冲盐水(TBST)的1％牛血清白蛋白(BSA)封闭过夜。然后将膜与一抗一起在溶于TBST的1％BSA中温育2小时，然后用TBST洗涤三次，然后与HRP缀合的二抗一起在溶于TBST的1％BSA中温育一小时。在用TBST进一步洗涤三次后，在Luminata试剂中使免疫反应性条带显影，并使用Intelligent Dark Box LAS-3000成像仪(日本东京富士胶卷公司(Fuji Photo Film,Tokyo,Japan))检测。

母体血浆中的4HNE的检测

为了检测和定量母体血浆中的4HNE蛋白加合物，发明人使用了OxiSelect^TM HNE加合物竞争性ELISA试剂盒(细胞生物学实验室公司(Cell Biolabs Inc)，STA-838)。该测定基于HNE缀合物与抗HNE抗体之间对HNE-蛋白的竞争。在该测定中，首先将HNE缀合物包被在ELISA板上。然后将未知的HNE蛋白样品或HNE-BSA标准品添加到HNE缀合物再吸收的ELISA板中。短暂温育后，添加抗HNE抗体，然后添加二抗(HRP缀合的)。由预先确定的HNE-BSA标准曲线估计未知样品中HNE蛋白加合物的量。

在该测定中，首先将HNE缀合物包被在96孔板上，并在4℃下温育过夜。去除HNE缀合物，并将孔用1X PBS冲洗两次。向每个孔添加测定稀释剂并在室温下封闭一小时，然后转移至4℃下直至使用。在即将使用前，去除测定稀释剂并添加50μl母体血浆样品和HNE-BSA标准品。然后将板在室温下在定轨摇床上温育10分钟。将稀释的抗HNE抗体添加到每个孔中，并在室温下在定轨摇床上温育2小时。然后将板用1X洗涤缓冲液洗涤3次，每次洗涤之间彻底抽吸。将稀释的HRP缀合的二抗添加到所有孔中，并在室温下在定轨摇床上温育一小时。然后将细条孔用1X洗涤缓冲液再洗涤3次。将底物溶液添加到每个孔中，在室温下在定轨摇床上温育2-5分钟，并监测颜色的变化。将终止溶液添加到每个孔中以终止酶反应。使用450nm作为主波长，在酶标仪(SPECTROstar Nano，BMG实验室科技公司(BMG LABTECH))上读取每个孔的吸光度。通过使用GraphPad Prism软件与预先确定的HNE-BSA标准曲线进行比较，确定未知样品中HNE蛋白加合物的含量。将结果绘图，并使用GraphPad Prism软件进行统计分析。

免疫组织化学分析

将6μm石蜡胎盘切片脱石蜡并水合，然后在微波炉中用tris-EDTA缓冲液(pH 9)加热以进行抗原修复。将切片在室温下用溶于TBST的1％BSA封闭一小时。将切片与一抗一起温育过夜，并用TBST洗涤三次，然后与Alexa缀合的二抗一起温育90分钟。用含DAPI的抗褪色溶液封固切片。图3至图7、图9和图11的荧光照片是在Nikon eclipse 90i共聚焦显微镜上获得的。图10的荧光照片是在Nikon eclipse Ti荧光显微镜上获得的。

RNA分离和实时PCR

将胎盘组织在液氮下碾碎。用Ultra Turrax匀化器将约100mg碾碎的胎盘组织在2ml Trizol试剂中匀化。通过Direct-zol^TM RNA MiniPrep从Trizol提取物中提取总RNA。用DNA酶处理RNA并用RNA Clean&Concentrator^TM-5试剂盒纯化。通过在1X TAE缓冲液中使经过DNA酶处理的样品在含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶中电泳来观测RNA质量。使用

III第一链合成系统试剂盒将纯化的RNA用于制备cDNA。将该cDNA用于通过醛氧化酶1(AOX1)的Taqman引物，和含有内部对照18s核糖体RNA的Taqman基因表达主混合物来运行实时PCR以定量AOX1的mRNA。使用Applied Biosystem 7500PCR系统，将SyBrgreen主混合物用于相对于作为内部对照的β-肌动蛋白来定量G蛋白偶联受体1(GPER1)的mRNA。

GPER1引物是5’-CGTCCTGTGCACCTTCATGT-3’(正向，SEQ ID NO.1)和5’-AGCTCATCCAGGTGAGGAAGAA-3’(反向，SEQ ID NO.2)。AOX1引物获自赛默飞世尔科技公司(Thermo-fisher Scientific)(目录号：4331182，测定号：Hs00154079_m1)。对AOX1TaqMan测定法进行设计以检测来自NM_001159.3(本文的SEQ ID NO.3)的碱基3270，在外显子27/28边界处的84bp扩增子。

统计分析

在各个图的图例中示出了样品编号。通过使用曼惠特尼检验(双向)分析图3、图4、图6、图9和图12中的数据，结果以散点图表示，显示了平均值的中值或标准误差。使用威尔科克森配对符号秩检验分析图10和图11中的数据。所有p值都是使用Graphpad Prism软件计算的。

实例1-死产风险与妊娠期长度之间的关系

为了说明死产风险与妊娠期长度之间的关系，发明人创建了来自Omigbodun和Adewuyi(1997,J Natl Med Assoc[美国医学会杂志],89:617)的关于医疗干预水平相对较低的群体中的人类妊娠期长度的数据的卡普兰迈尔线图并将该线图与来自Sutan等人(2010,J Perinatol[围产期学杂志],30:311-318)的关于每1000例持续妊娠中的死产风险的数据进行比较(图2)。数据说明，死产与Johnson等人(1999,Cell[细胞],96:291-302)定义的老化病因论一致。

实例2-胎盘组织中的DNA/RNA和脂质氧化

由于已在许多老化组织中观察到氧化性损伤，所以发明人寻求通过8-羟基-脱氧鸟苷/8-羟基鸟苷(8OHdG/8HOG)作为DNA/RNA氧化的标志物所测量的胎盘DNA/RNA氧化的证据。在胎盘中针对8OHdG/8HOG进行免疫组织化学(IHC)分析，细胞核/骨架中8OHdG/8HOG染色的平均强度证明在过期和死产相关的胎盘中DNA/RNA氧化显著增加(图3)。

DNA氧化的增加表明自由基损伤，自由基损伤也可能导致脂质过氧化。已经观察到脂质过氧化在阿尔茨海默氏病中增加，如通过4-羟基壬烯醛(4HNE)的形成所测量的(Markesbery和Lovell，1998，Neurobiol Aging[神经生物学老化]，19:33-36)。因此，发明人在过期、死产和足月胎盘组织中对4HNE进行了免疫组织化学分析。这揭示了在过期合胞体滋养层中4HNE染色显著增加，如图4所示在与死产相关的胎盘中也观察到这种增加。在过期和死产胎盘中高水平的8OHdG/8HOG和4HNE表明在这些胎盘中可能发生了胎盘老化。

在早期生产、晚期生产(过期分娩)、先兆子痫和子宫内生长受限(IUGR)的情况下，发明人还使用商业ELISA试剂盒研究了母体血浆中的4HNE水平。与早期相比，发现4HNE水平在每个过期分娩、先兆子痫和IUGR病例中都显著更高(图5)。已知过期分娩、先兆子痫和IUGR全部与死产风险增加相关。

实例3-过期和死产胎盘中溶酶体的运动和群集

错误折叠的蛋白和受损的线粒体通常在自噬体中，在涉及自噬体与含有溶酶体的蛋白水解酶融合的过程中循环。异常蛋白质的积聚被认为在老化中发挥作用，特别是在大脑中，例如阿尔茨海默氏病中的tau和淀粉样蛋白以及亨廷顿病中的突变huntin的积聚。在亨廷顿病中，神经元内溶酶体的分布随着核周溶酶体积聚的增加而改变。发明人使用溶酶体标志物，即溶酶体相关膜蛋白-2(LAMP2)通过免疫组织化学来分析胎盘中溶酶体的分布。这显示溶酶体位于足月胎盘合胞体滋养层的顶面(图6A、图6D和图6E)，而在过期和死产胎盘中溶酶体重新定位到核周和基底面(图6B、图6C、图6F和图6G)。

目前的数据证明，在过期胎盘和与死产相关的胎盘的合胞体滋养层的核周和基底侧，溶酶体标志物LAMP2呈阳性的颗粒明显积聚。

实例4-在过期和死产相关胎盘中出现含有4HNE的较大自噬体

自噬体功能的抑制与溶酶体融合失败导致自噬体大小增加。该过程导致在阿尔茨海默氏病、达农病(Danon’s disease)和神经变性中所见的整体自噬功能抑制。在本研究中，发明人用针对LC3B的抗体，使用免疫组织化学技术检测自噬体。与足月胎盘相比，在过期和死产相关胎盘中观察到自噬体大小的显著增加(图7)。双标记荧光免疫染色显示，过期和死产胎盘的较大自噬体含有脂质过氧化产物4HNE(图8)。

自噬涉及酸性溶酶体与自噬体的融合。目前的数据表明死产和过期胎盘含有比足月胎盘更大的自噬体，这表明在这些胎盘中自噬过程受到抑制。这些数据进一步表明，在融合失败时，自噬体被4HNE形式的氧化脂质包被。在自噬体功能方面的此类干扰可导致异常蛋白的积聚和合胞体滋养层功能的退化。

实例5-醛氧化酶1(AOX1)在胎盘氧化性损伤中的作用

使用本领域技术人员熟知的方法，发明人对分离自六个足月胎盘和六个过期胎盘的RNA进行了测序。对RNA测序数据的分析显示，在胎盘中表达的20111个基因中，醛氧化酶1(AOX1)在过期胎盘中与足月胎盘相比显著增加(图9)。

AOX1是一种钼酸黄素酶(molybdoflavoenzyme)，该酶将一系列醛(包括4HNE)氧化成相应的酸和过氧化物。然后，发明人检验了AOX1涉及在过期和死产相关胎盘中观察到的增加的4HNE产生的假设。双标记荧光IHC显示AOX1在过期胎盘(图10A-C)和死产胎盘(图10D-F)中共定位于4HNE阳性颗粒。另外，使用生命科技公司(Life Technologies)TaqMan测定Hs00154079_m1进行的实时qPCR证实，过期和死产胎盘表达的AOX1的mRNA显著高于足月胎盘(图10G)。这些数据支持AOX1可能在过期和死产相关胎盘中发生的氧化性损伤中起作用的概念。

实例6-使用胎盘外植体培养物对4HNE的产生进行药理学抑制

目前的数据提供了过期和死产胎盘合胞体滋养层中脂质氧化增加、溶酶体-自噬体相互作用失调及AOX1表达增加的明确证据。为了确定这些事件是否因果关联，发明人使用在无血清(生长因子缺乏型)培养基中培养的足月胎盘组织开发了胎盘外植体培养系统。IHC显示在温育24小时后血清剥夺显著增加4HNE的产生(图11A和图11B)。在无血清培养基中温育24小时后也发现自噬体大小显著增加(图12A和图12B)，表明在24小时自噬受到氧化性损伤的抑制，正如在死产和过期胎盘中所观察到的。AOX1的mRNA在24小时增加，表明AOX1参与氧化性损伤。

发明人试图确定在不存在血清和AOX1的情况下培养胎盘外植体时观察到的脂质氧化发展之间的因果关系。使用GPER激动剂G-1抑制醛氧化酶。还使用了有效的AOX1抑制剂雷洛昔芬。选择G-1是因为发明人已在合胞体滋养层的顶面检测到GPER表达(图11C和图11D)，并且已经证实GPER1激动剂会抑制肾中4HNE的产生(Lindsey等人,2011,Hypertension[高血压],58:665-671)。在处理24小时后雷洛昔芬和G1两者均抑制了血清饥饿的胎盘外植体中的4HNE产生(图11A和图11B)，从而证明这些组合物能够阻断对脂质的氧化性损伤以及自噬体大小和溶酶体定位的干扰(图12)。

实例7-合胞体滋养层顶面存在细胞表面雌激素受体GPER1

由于G-1在胎盘外植体培养物中具有明显作用，因此发明人进行了对胎盘组织中GPER1表达的表征。通过荧光免疫组织化学技术检测的胎盘卷切片中的GPER1表达显示，GPER1在胎盘绒毛中表达(数据未显示)，在更高的放大倍数(100倍)下定位于胎盘绒毛的顶面，而足月羊膜、绒毛膜和蜕膜显示出极少的GPER1表达(数据未显示)。用针对LC3B的抗体进行的荧光免疫染色显示出血清饥饿后胎盘外植体中自噬体大小的变化(图12)。

GPER1引物来源于英杰公司(Invitrogen)：GPER1正向引物5’-CGTCCTGTGCACCTTCATGT-3’(SEQ ID NO:1)和GPER1反向引物5’-AGCTCATCCAGGTGAGGAAGAA-3’(SEQ ID NO:2)。GPER1的实时PCR显示胎盘绒毛具有比羊膜、绒毛膜和蜕膜显著更高的GPER1表达(图13A)。GPER1的蛋白质印迹也证实胎盘绒毛组织中的GPER1蛋白质水平高于羊膜、绒毛膜和蜕膜(图13B)。

合胞体滋养层顶端膜上存在细胞表面雌激素受体GPER是一个新发现，并且表明该受体可在调节胎盘内的氧化性损伤中起作用。已经证实，来自携带患有过度成熟综合征的胎儿的孕妇的尿液具有比携带正常胎儿的女性更低的雌激素:肌酐比率(Rayburn等人,1982,Obstet Gynecol[产科学与妇科学],60:148-153)。这些数据支持以下可能性：低雌激素浓度可导致GPER介导的AOX1抑制丧失并因而导致胎盘氧化性损伤和功能受损。

实例8-对母体血液中的AOX1 mRNA的检测

通过本领域技术人员熟知的方法在母体血液中检测胎儿AOX1 mRNA。简言之，将母体血样收集在

血液RNA管中。将血样储存在-30℃下，直至用于RNA分离。使用PAXgene血液miRNA试剂盒和全自动RNA分离系统QIAcube(凯杰公司(Qiagen))分离2.5ml总母体血样中的总RNA。通过使RNA样品在生物分析仪(安捷伦科技公司(AgilentTechnologies))中电泳来检查来自样品的RNA的质量。28S和18S的比值大于1认为从全血中获得优质RNA。在用于制备cDNA之前，用无RNA酶的DNA酶处理总RNA。使用

III第一链合成系统(生命科技公司)由总RNA制备cDNA。使用Taqman基因表达系统和7500Applied Biosystem PCR机，使用人18S核糖体RNA作为内部对照，将所述cDNA用于定量AOX1的mRNA。

母体血液中的大部分AOX1 mRNA源自胎盘，因此母体血液AOX1 mRNA可以用作胎盘氧化应激的指标。发明人在七名足月(妊娠期37-39周整)的母亲中测量了母体血液AOX1mRNA并且在31和36周妊娠期对两名妊娠导致死产血样的女性进行了测量。与足月妊娠相比，死产时母体血液中AOX1 mRNA的平均量显著增加(图14)。

实例9-醛氧化酶介导的肾老化

将来自21岁受试者和66岁受试者的肾组织针对作为由醛氧化酶形成的氧化脂质的标志物的4HNE进行染色。图15所示的结果证明，醛氧化酶在肾中引起氧化性损伤，这是老化的标志。因此，表达醛氧化酶的组织可因氧化性损伤而老化。

序列表

<110> 纽卡斯尔大学（The University of Newcastle）

<120> 组织老化的标志物及其用途

<130> 35279390

<160> 3

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成的

<400> 1

cgtcctgtgc accttcatgt 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成的

<400> 2

agctcatcca ggtgaggaag aa 22

<210> 3

<211> 4949

<212> DNA

<213> 智人

<400> 3

cgccccactc ggcgggtcgg tgccgccggg tcccaggtgc ccgctacttc ccagaacctc 60

cgcctcccgc tccgggccct cgaaccagcg cggacaccac aatggaccgg gcgtccgagc 120

tgctcttcta cgtgaacggc cgcaaggtga tagaaaaaaa tgtcgatcct gaaacaatgc 180

tgttgcctta tttgaggaag aagcttcgac tcacaggaac taagtatggc tgtggaggag 240

gaggctgtgg tgcttgtaca gtgatgatat cacgatacaa ccccatcacc aagaggataa 300

ggcatcaccc agccaatgcc tgtctgattc ccatctgttc tctgtatggt gctgccgtca 360

ccacagtaga aggcatagga agcacccaca ccagaattca tcctgttcag gagaggattg 420

ccaagtgtca tggcacccag tgtggcttct gcacacctgg gatggtgatg tccatctaca 480

cgctgctcag gaaccaccca gagcccactc tggatcagtt aactgatgcc cttggtggta 540

acctgtgccg ttgcactgga tacaggccca taattgatgc atgcaagact ttctgtaaaa 600

cttcgggctg ctgtcaaagt aaagaaaatg gggtttgctg tttggatcaa ggaatcaatg 660

gattgccaga atttgaggaa ggaagtaaga caagtccaaa actcttcgca gaagaggagt 720

ttctgccatt ggatccaacc caggaactga tatttcctcc tgagctaatg ataatggctg 780

agaaacagtc gcaaaggacc agggtgtttg gcagtgagag aatgatgtgg ttttcccccg 840

tgaccctgaa ggaactgctg gaatttaaat tcaagtatcc ccaggctcct gttatcatgg 900

gaaacacctc tgtggggcct gaagtgaaat ttaaaggcgt ctttcaccca gttataattt 960

ctcctgatag aattgaagaa ctgagtgttg taaaccatgc atataatgga ctcacccttg 1020

gtgctggtct cagcctagcc caggtgaagg acattttggc tgatgtagtc cagaagcttc 1080

cagaggagaa gacacagatg taccatgctc tcctgaagca tttgggaact ctggctgggt 1140

cccagatcag gaacatggct tctttagggg gacacatcat tagcaggcat ccagattcag 1200

atctgaatcc catcctggct gtgggtaact gtaccctcaa cttgctatca aaagaaggaa 1260

aacgacagat tcctttaaat gagcaattcc tcagcaagtg ccctaatgca gatcttaagc 1320

ctcaagaaat cttggtctca gtgaacatcc cctactcaag gaagtgggaa tttgtgtcag 1380

ccttccgaca agcccagcga caggagaatg cgctagcgat agtcaattca ggaatgagag 1440

tcttttttgg agaaggggat ggcattatta gagagttatg catctcatat ggaggcgttg 1500

gtccagccac catctgtgcc aagaattcct gccagaaact cattggaagg cactggaacg 1560

aacagatgct ggatatagcc tgcaggctta ttctgaatga agtctccctt ttgggctcgg 1620

cgccaggtgg gaaagtggag ttcaagagga ctctcatcat cagcttcctc ttcaagttct 1680

acctggaagt gtcacagatt ttgaaaaaga tggatccagt tcactatcct agccttgcag 1740

acaagtatga aagtgcttta gaagatcttc attccaaaca tcactgcagt acattaaagt 1800

accagaatat aggcccaaag cagcatcctg aagacccaat tggccacccc atcatgcatc 1860

tgtctggtgt gaagcatgcc acgggggagg ccatctactg tgatgacatg cctctggtgg 1920

accaggaact tttcttgact tttgtgacta gttcaagagc tcatgctaag attgtgtcta 1980

ttgatctgtc agaagctctc agcatgcccg gtgtggtgga catcatgaca gcagaacatc 2040

ttagtgacgt caactccttc tgctttttta ctgaagctga gaaatttctg gcgacagata 2100

aggtgttctg tgtgggtcag cttgtctgtg ctgtgcttgc cgattctgag gttcaggcaa 2160

agcgagctgc taagcgagtg aagattgtct atcaagactt ggagccgctg atactaacaa 2220

ttgaggaaag tatacaacac aactcctcct tcaagccaga aaggaaactg gaatatggaa 2280

atgttgacga agcatttaaa gtggttgatc aaattcttga aggtgaaata catatgggag 2340

gtcaagaaca tttttatatg gaaacccaaa gcatgcttgt cgttcccaag ggagaggatc 2400

aagaaatgga tgtctacgtg tccacacagt ttcccaaata tatacaggac attgttgcct 2460

caaccttgaa gctcccagct aacaaggtca tgtgccatgt aaggcgtgtt ggtggagcgt 2520

ttggagggaa ggtgttaaaa accggaatca ttgcagccgt cactgcattt gccgcaaaca 2580

aacatggccg tgcagttcgc tgtgttctgg aacgaggaga agacatgtta ataactggag 2640

gccgccatcc ttaccttgga aagtacaaag ctggattcat gaacgatggc agaatcttgg 2700

ccctggacat ggagcattac agcaatgcag gcgcctcctt ggatgaatca ttattcgtga 2760

tagaaatggg acttctgaaa atggacaatg cttacaagtt tcccaatctc cgctgccggg 2820

gttgggcatg cagaaccaac cttccatcca acacagcttt tcgtgggttt ggctttcctc 2880

aggcagcgct gatcaccgaa tcttgtatca cggaagttgc agccaaatgt ggactatccc 2940

ctgagaaggt gcgaatcata aacatgtaca aggaaattga tcaaacaccc tacaaacaag 3000

agatcaatgc caagaaccta atccagtgtt ggagagaatg tatggccatg tcttcctact 3060

ccttgaggaa agttgctgtg gaaaagttca atgcagagaa ttattggaag aagaaaggac 3120

tggccatggt ccccctgaag tttcctgttg gccttggctc acgtgctgct ggtcaggctg 3180

ctgccttggt tcacatttat cttgatggct ctgtgctggt cactcacggt ggaattgaaa 3240

tggggcaggg ggtccacact aaaatgattc aggtggtcag ccgtgaatta agaatgccaa 3300

tgtcgaatgt ccacctgcgt ggaacaagca cagaaactgt ccctaatgca aatatctctg 3360

gaggttctgt ggtggcagat ctcaacggtt tggcagtaaa ggatgcctgt caaactcttc 3420

taaaacgcct cgaacccatc atcagcaaga atcctaaagg aacttggaaa gactgggcac 3480

agactgcttt tgatgaaagc attaaccttt cagctgttgg atacttcaga ggttatgagt 3540

cagacatgaa ctgggagaaa ggcgaaggcc agcccttcga atactttgtt tatggagctg 3600

cctgttccga ggttgaaata gactgcctga cgggggatca taagaacatc agaacagaca 3660

ttgtcatgga tgttggctgc agtataaatc cagccattga cataggccag attgaaggtg 3720

catttattca aggcatggga ctttatacaa tagaggaact gaattattct ccccagggca 3780

ttctgcacac tcgtggtcca gaccaatata aaatccctgc catctgtgac atgcccacgg 3840

agttgcacat tgctttgttg cctccttctc aaaactcaaa tactctttat tcatctaagg 3900

gtctgggaga gtcgggggtg ttcctggggt gttccgtgtt tttcgctatc catgacgcag 3960

tgagtgcagc acgacaggag agaggcctgc atggaccctt gacccttaat agtccactga 4020

ccccggagaa gattaggatg gcctgtgaag acaagttcac aaaaatgatt ccgagagatg 4080

aacctggatc ctacgttcct tggaatgtac ccatctgaat caaatgcaaa cttctggaga 4140

aaacagagtg cctcttccca gatggcaatc tgtcctatct ctgtgctgga agatgctaga 4200

tctgaaagac agagtttcca cagttcagaa atcatcccac agtgttgctt ttctatggag 4260

ctgatttaaa gtattccatt tagatttgat agatatgctt aagcaatcta taaatcattt 4320

tcaatgttat aaacactaat tggtttcctc tagggtgata ttcgtcatta ctctgtctct 4380

tcaatccatc cagctaaatg gaataggtga tgacttgcat gtgactccta cttggcttct 4440

atccaccaac agaaattata ccatatagtg aaaggcaatt ttctaaataa tttcattact 4500

aatatgaact gtgaagttgt cattttttca tttgtccttt tctgctatca ccttcctctt 4560

gtcagaatga atatagacac tgtatctaag tgggaccaaa gaaaaaatag cgaactttca 4620

ccaaagtttt catgaaaacc caaaagcttt aaaagttact atcaagaaat tgaaaggaaa 4680

cccacagaat aggataaaat atttgtaaat catatatttg ataaaagtct tgtaaccaga 4740

tacataaaga gctcttacaa ctcaataaaa ggcaagtaat ttaaaaatag gcaaaagaat 4800

tgctggatgg tatggtagtt ctatttttag tttttaccct aactactctg acttgatcat 4860

ttaacattct gtgtatgtaa caaaatatca catgcataaa tattatgtat caataaaatt 4920

ttttaatggg caaaaaaaaa aaaaaaaaa 4949

Claims (42)

1.一种用于检测或确定身体组织的老化的方法，所述方法包括测量从受试者获得的生物样品中醛氧化酶1(AOX1)表达或活性的一种或多种标志物，其中AOX1表达或活性的水平、或所述一种或多种标志物的水平指示所述组织的老化。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者正处于妊娠期。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述组织是胎盘组织。

4.如权利要求2或3所述的方法，其中所述生物样品包括来自所述妊娠受试者、所述胎盘或胎儿的样品。

5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述生物样品包括血液、羊水、胎盘组织或由其来源的样品。

6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述生物样品包括血液或由其来源的样品。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述生物样品包括全血、血浆或血清。

8.如权利要求2至7中任一项所述的方法，其中所述生物样品来源于母体。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述样品是母体血液。

10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中AOX1表达或活性的所述一种或多种标志物源自所述生物样品中存在的游离RNA或DNA、胎盘细胞片段、外来体或微粒。

11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中AOX1表达的所述一种或多种标志物包括AOX1 mRNA和/或AOX1蛋白。

12.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中AOX1活性的所述一种或多种标志物包括8-羟基-脱氧鸟苷(8OHdG)、8-羟基-鸟苷(8HOG)、4-羟基壬烯醛(4HNE)或丙二醛(MDA)。

13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中测量AOX1表达或活性的两种或更多种标志物的组合。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述两种或更多种标志物包括AOX1 mRNA和/或蛋白和4HNE。

15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中与参考值相比，所述生物样品中AOX1表达或活性的水平、或其所述一种或多种标志物的水平增加指示所述组织中的氧化应激和/或老化。

16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中还在所述生物样品或另外的生物样品中测量一种或多种附加氧化应激标志物。

17.如权利要求2至16中任一项所述的方法，其中在所述妊娠受试者中，与参考值相比，所述生物样品中AOX1表达或活性的水平、或其所述一种或多种标志物的水平增加指示胎盘老化、先兆子痫、宫内生长受限、过期妊娠风险、死产风险、需要进行干预以预防过期妊娠或死产、或合适的分娩时间。

18.如权利要求17所述的方法，其中预防过期妊娠或死产的所述干预包括预防性剖腹产、引产和/或给予治疗以预防或延迟胎盘老化或延长胎儿在子宫内的存活期。

19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中在来自妊娠受试者的、随时间推移从所述受试者获得的一个或多个生物样品中测量AOX1表达或活性的所述一种或多种标志物。

20.如权利要求19所述的方法，当所述方法用于监测妊娠期间死产的风险时。

21.如权利要求20所述的方法，其中每两周、每周或每天从所述妊娠受试者获得所述一个或多个生物样品；其中AOX1表达或活性、或其所述一种或多种标志物的水平随时间推移而增加指示死产风险增加。

22.一种用于检测胎盘老化的方法，所述方法包括从妊娠受试者获得生物样品并测量所述生物样品中胎盘AOX1表达或活性的一种或多种标志物，其中AOX1表达或活性的水平、或其所述一种或多种标志物的水平指示胎盘老化。

23.如权利要求22所述的方法，其中与一个或多个参考值相比，AOX1表达或活性、或其所述一种或多种标志物的水平增加指示所述胎盘的老化。

24.一种用于预测过期妊娠或死产风险的方法，所述方法包括从妊娠受试者获得生物样品并测量所述生物样品中胎盘AOX1表达或活性的一种或多种标志物，其中AOX1表达或活性的水平、或其所述一种或多种标志物的水平指示过期妊娠或死产的风险。

25.如权利要求24所述的方法，其中与一个或多个参考值相比，AOX1表达或活性、或其所述一种或多种标志物的增加指示死产风险。

26.一种用于确定进行干预以预防过期妊娠或死产的需要的方法，所述方法包括从妊娠受试者获得生物样品并测量所述生物样品中胎盘AOX1表达或活性的一种或多种标志物，其中AOX1表达或活性的水平、或其所述一种或多种标志物的水平指示对干预的需要。

27.如权利要求26所述的方法，其中与一个或多个参考值相比，AOX1表达或活性、或其所述一种或多种标志物的水平增加指示需要进行干预以预防死产。

28.如权利要求26或27所述的方法，其中干预包括以下的至少一种：预防性剖腹产、引产和/或给予治疗以延迟胎盘老化或延长胎儿在子宫内的存活期。

29.一种用于检测胎盘氧化应激的方法，所述方法包括从妊娠受试者获得生物样品并测量所述生物样品中胎盘AOX1表达或活性的一种或多种标志物，其中AOX1表达或活性的水平、或其所述一种或多种标志物的水平指示胎盘氧化应激。

30.如权利要求29所述的方法，其中与一个或多个参考值相比，AOX1表达或活性、或其所述一种或多种标志物的水平增加指示胎盘氧化应激。

31.一种用于在妊娠过程中监测胎盘老化、胎盘氧化应激、或过期妊娠或死产风险的方法，所述方法包括：

(i)在妊娠过程期间的第一时间点从妊娠受试者获得生物样品；

(ii)测量所述生物样品中胎盘AOX1表达或活性的一种或多种标志物；

(iii)在所述妊娠期间的一个或多个后期时间点从所述受试者获得一个或多个另外的生物样品；以及

(iv)测量所述一个或多个另外的生物样品中胎盘AOX1表达或活性的一种或多种标志物，

其中AOX1表达或活性的水平、或其所述一种或多种标志物的水平随时间推移而增加指示胎盘老化、胎盘氧化应激、或过期妊娠或死产的风险。

32.如权利要求31所述的方法，其中所述一种或多种标志物的测量开始于妊娠中期。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述生物样品可以是从约20周妊娠期获得的。

34.如权利要求31至33中任一项所述的方法，其中所述时间点之间的间隔为每天、每周、每两周或每月。

35.一种减缓或预防一种或多种细胞或组织的老化或氧化性损伤的方法，所述方法包括将所述一种或多种细胞或组织暴露于AOX1抑制剂。

36.如权利要求35所述的方法，其中所述组织是胎盘、皮肤、肾或脑组织。

37.如权利要求35或36所述的方法，其中将所述AOX1抑制剂向妊娠受试者给予。

38.一种治疗与一种或多种细胞或组织的老化或氧化性损伤相关的疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者给予AOX1抑制剂。

39.一种用于预防或降低过期妊娠或死产风险的方法，所述方法包括向妊娠受试者给予AOX1抑制剂。

40.如权利要求35至39中任一项所述的方法，其中所述AOX1抑制剂是雷洛昔芬或G蛋白偶联的雌激素受体1(GPER1)激动剂。

41.如权利要求40所述的方法，其中所述GPER1激动剂是G-1。

42.AOX1抑制剂在制备用于降低或预防老化或氧化性损伤、用于治疗与组织老化或氧化性损伤相关的疾病或病症、或用于预防或降低过期妊娠或死产风险的药物中的用途。

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