CN110823854A - 一种微生物的荧光光谱检测系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微生物的荧光光谱检测系统，包括激光光源向透光平台上承载的待测微生物样品上发射激光，激发荧光染料发出荧光；透光平台设置在显微透镜组的焦平面上；显微透镜组将透光平台透射的荧光光线放大形成平行光；滤光件对平行光进行滤光；第一聚光透镜组将平行光聚光形成荧光图像，并由积分视场单元分割成若干个图像单元，通过光谱仪对若干个图像单元进行色散；探测器检测获得的光谱分布信息。本申请无需对显微透镜组的视场内的荧光光线进行逐个位置扫描，实现显微透镜组的视场内的荧光光线的同步色散，提高了对微生物样品荧光检测的观测效率，有利于对微生物中细胞或细胞器瞬时变化情况的捕捉，提高对微生物研究的准确率。

Description

一种微生物的荧光光谱检测系统

技术领域

本发明涉及微生物观测技术领域，特别是涉及一种微生物的荧光光谱检测系统。

背景技术

荧光成像是生物学研究不可或缺的工具，特别是在细胞研究中。通过用各种荧光团染色细胞或细胞器，并在显微镜下放大成像，可以定量表征大量的颜色编码过程，基于染色体动力学实现对细胞基因表达的研究。荧光团通过将高量子产率荧光染料和多重染色方法引入该领域，极大地改善了细胞研究。这使得研究人员能够在相同的FOV(视场)中同时研究几种细胞器及其相互作用，同时具有高对比度。

具有高时间分辨率的高光谱荧光显微镜由于可以用于捕获瞬态场景，其通常是细胞动力学研究的关键要求，所以其在生物显微技术中越来越重要。但目前大多数可用的高光谱荧光显微镜都需要经历扫描过程，这限制了住了它们的时间分辨率，继而限制了它们在实时成像中的潜在用途。

发明内容

本发明的目的是提供一种微生物的荧光光谱检测系统，提高了微生物荧光光谱的检测效率和基于荧光检测对微生物进行分析研究的准确性。

为解决上述技术问题，本发明提供一种微生物的荧光光谱检测系统，包括激光光源、透光平台、显微透镜组、滤光件、第一聚光透镜组、积分视场单元、光谱仪以及探测器；

其中，所述激光光源用于向所述透光平台上发射激光，激发所述透光平台上承载的待测微生物样品携带的荧光染料发出荧光；

所述透光平台设置在所述显微透镜组的焦平面上；

所述显微透镜组用于将经过所述透光平台透射的荧光光线放大扩散成平行光；

所述滤光件用于对所述平行光进行滤光，其中，滤光光波为除所述荧光染料发出荧光波段之外的波段光波；

所述第一聚光透镜组用于将过滤后的光线进行聚光成像；

所述积分视场单元用于将所述第一聚光透镜组聚光成像的荧光图像分割为若干个阵列图像单元，并通过光谱仪对每个阵列图像单元内的光谱进行色散；

所述探测器用于检测经过所述光谱仪色散获得的光谱分布信息。

可选地，还包括设置在所述滤光件和所述第一聚光透镜组之间的分光镜；以及还包括第二聚光透镜组和成像装置；

所述分光镜用于将经过所述滤光件过滤后的光线分成两束光线，其中，一束光线入射至所述第一聚光透镜组，另一束光线入射至所述第二聚光透镜组并通过所述成像装置成像。

可选地，所述分光镜为半透半反射镜，用于将经过所述滤光件过滤后的光线入射至所述半透半反射镜，形成一束反射光线和一束投射光线。

可选地，所述滤光件包括多个可对不同波段的光波进行滤光的滤光片；且各个所述滤光片可在光路中切换。

可选地，所述滤光件包括支座以及和所述支座相连接的滤光片轮，各个所述滤光片环绕所述中心轴设置在所述滤光片轮上，所述滤光片轮可沿所述滤光片轮的中心轴旋转，以实现各个所述滤光片在光路中的切换。

可选地，所述积分视场单元设置于调整台上；

所述调整台可带动所述积分视场单元沿所述第一聚光透镜组的光轴方向移动，且可带动所述积分视场单元以所述第一聚光透镜组的光轴为中心旋转。

可选地，所述积分视场单元包括像切分器、微透镜阵列、以及微透镜阵列连接光纤阵列结构中的任意一种结构。

可选地，所述光谱仪为棱镜-光栅光谱仪。

可选地，所述显微透镜组为视场大小可调的放大镜组。

本发明所提供的微生物的荧光光谱检测系统，包括激光光源、透光平台、显微透镜组、滤光片、第一聚光透镜组、积分视场单元、光谱仪以及探测器；其中，激光光源用于向透光平台上发射激光，激发透光平台上承载的待测微生物样品携带的荧光染料发出荧光；透光平台设置在显微透镜组的焦平面上；显微透镜组用于将经过透光平台透射的荧光光线放大扩散成平行光；滤光件用于对平行光进行滤光，其中，滤光光波为除荧光染料发出荧光波段之外的波段光波；第一聚光透镜组用于将过滤后的光线进行聚光成像；积分视场单元用于将第一聚光透镜组聚光成像的荧光图像分割为若干个阵列图像单元，并通过光谱仪对每个阵列图像单元内的光谱进行色散；探测器用于检测经过光谱仪色散获得的光谱分布信息。

本申请中在显微透镜组和光谱仪之间设置了积分视场单元，可将显微镜组的整个视场分割成若干个小视场阵列，使得各个小视场内的荧光同时通过光谱仪进行色散，进而使得显微透镜组的整个视场内的荧光光线可以在实现同一时间内通过光谱仪进行色散观察，并且，在显微透镜组和积分视场单元之间还设置有滤光件，将除荧光光线波段之外的光波进行过滤，避免了积分视场单元中各个小视场的光线经过光谱仪色散后，相邻的小视场对应的色散光谱出现重叠的情况，从而提高了对样品的荧光光谱观测的准确度。

本申请相对于现有技术而言，无需对显微透镜组的视场内的荧光光线进行逐个位置扫描色散，实现了显微透镜组的视场内的荧光光线的同步色散，提高了对微生物样品荧光检测的观测效率，有利于对微生物中细胞或细胞器瞬时变化情况的捕捉，提高对微生物研究的准确率。

附图说明

为了更清楚的说明本发明实施例或现有技术的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为现有技术中对显微镜视场进行扫描色散的示意图；

图2为本申请实施例提供的微生物的荧光光谱检测系统的光路示意图；

图3为本实施例提供的滤光件的结构示意图；

图4为本申请实施例提供的调整台的结构示意图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如图1所示，图1为现有技术中对显微镜视场进行扫描色散的示意图。传统的微生物样品研究观测中，高显微镜的视场中可显示放大透光平台中的荧光图像，并将该荧光图像中的荧光光线通过光谱仪进行色散，从而分辩出视场中各个位置点的荧光图案的种类。但考虑到光谱在进行色散时，会将一个点的荧光色散成一个色散面区域，也就是说荧光图案中每个位置点的光谱图占用空间面积都会增大扩散，那么相邻较近的荧光团，通过光谱仪色散后，就会产生重叠，导致光谱图可观察性低。

为此在现有技术中，会在光谱仪和高显微镜之间设置细缝02，该细缝02对高显微镜的视场01进行扫描，每次仅仅允许高显微镜的视场01中正对细缝02部分的荧光图案可透射至光谱仪实现光谱色散，该细缝02依次扫描高显微镜的视场01的各个位置，使得高显微镜的视场01内的荧光图案上，各个位置按照先后顺序依次扫描，并经过光谱仪依次色散成像，进而避免了距离较近的荧光光线对应的光谱出现重叠的情况。

尽管现有技术中的技术方案能够避免光谱图的重叠，避免微生物样品观测在空间上受限，但是对高显微镜的视场01内各个位置点存在先后顺序，使得对整个视场01的观察存在时间上的限制，而不具有同时性。如果某个位置点的细胞或细胞器发生瞬时变化，而该位置点又恰好不在当前观察位置范围内，也就无需对这一瞬时变化进行观测研究，进而降低对微生物观测的准确性。

为此，本申请提供了一种微生物的荧光光谱检测系统，能够避免荧光光谱空间上的限制的情况下，实现对显微镜整个视场的同步观测，避免了荧光光谱检测在时间上的限制。

如图2所示，图2为本申请实施例提供的微生物的荧光光谱检测系统的光路示意图，该微生物的荧光光谱检测系统可以包括：

激光光源1、透光平台2、显微透镜组3、滤光件4、第一聚光透镜组5、积分视场单元6、光谱仪7以及探测器8；

其中，激光光源1用于向透光平台2上发射激光，激发透光平台2上承载的待测微生物样品携带的荧光染料发出荧光；

透光平台2设置在显微透镜组3的焦平面上；

显微透镜组3用于将经过透光平台2透射的荧光光线放大扩散成平行光；

滤光件4用于对平行光进行滤光，其中，滤光光波为除荧光染料发出荧光波段之外的波段光波；

第一聚光透镜组5用于将过滤后的光线进行聚光成像；

积分视场单元6用于将第一聚光透镜组5聚光成像的荧光图像分割为若干个阵列图像单元，并通过光谱仪7对每个阵列图像单元内的光谱进行色散；

探测器8用于检测经过光谱仪7色散获得的光谱分布信息。

具体地，如图1所示，激光光源1发出的激光照射至承载有待测样品的透光平台2上。该激光光源1具体可以是超稳光源，例如，汞灯或其他元素灯的线谱光源，经过激光器产生激光光源，该激光光源发出的激光向透光平台2上照射。

该透光平台2上的待测样品中不同细胞和不同细胞器携带有不同的荧光团，激光照射到该待测样品后，激发各种不同的荧光团产生不同波段的荧光光线，该荧光光线入射至显微透镜组3内，荧光光线形成的荧光图案被显微透镜组3放大。并且该透光平台2设置在显微透镜组3的焦平面上，那么经过显微透镜组3放大后的荧光图案后出射的光线即为平行光线，成像位置在无穷远处。具体地，该显微透镜组3可以是高显微透镜或者其他显微镜，在实际应用过程中可以采用视场大小可调的显微镜，以满足用户对视场大小的不同需求。

经过显微透镜组3出射的平行光线入射至滤光件4，该滤光件4对平行光线中特定波段的光线进行过滤，避免背景光波对荧光团的检测产生干扰。例如，对待测样品中的细胞进行标记的荧光团所发出的荧光波段分别为300nm、350nm、400nm、450nm、500nm等，那么该滤光件4可过滤的波段即可是小于300nm和大于500nm波段的光波。

经过滤光件4过滤后的平行光线入射至第一聚光透镜组5后，即可重新成像，形成透光平台2上待测样品的放大的荧光图像。此时再将积分视场单元6设置在第一聚光透镜组5的焦平面上，该积分视场单元6将通过第一聚光透镜组5形成的荧光图像分割成无数个小的图像单元，每个图像单元经过积分视场单元6中一个小视场投射到光谱仪7，也就是荧光图像的各个位置点经过积分视场单元6的各个小视场同时投射到光谱仪7上，并分别进行色散，进而实现了显微透镜组3的视场内各个位置点荧光团的光谱在光谱仪7上同时进行色散，也即是同时获得显微透镜组3整个视场范围内所有的色散光谱。该光谱仪7具体可以采用棱镜-光栅光谱仪。

因为进行色散之前，采用滤光件4进行了滤光作用，在很大程度上减小了各个位置点的色散光谱的波段宽度，进而减小各个位置点的色散光谱图占用空间的面积，进而避免了相邻位置点的光谱重叠的问题，使得对微生物的荧光检测既不存在空间上的限制也不存在时间上的限制，加快了对微生物检测的效率。

本申请中采用积分视场单元实现对显微透镜组整个视场内的荧光光线进行分割并同时入射至光谱仪中，实现了对透明平台上的微生物待测样品同步跟踪检测；并且在对荧光光线进行色散检测之前，还通过滤光件过滤掉不必要的背景光波，减小了各个位置点对应的色散区域的宽度，尽可能的减小了不必要的背景光波在色散时产生重叠而影响色散光谱的观测，并能够连续在较长时间对微生物样品连续观测，可以用于捕获瞬态场景，进行实时成像，其不需要对微生物样品进行精准的定位，可用于活细胞光谱成像。

基于上述实施例，在本申请的另一可选地实施例中，还可以进一步地包括：

设置在滤光件4和第一聚光透镜组5之间的分光镜9；以及还包括第二聚光透镜组10和成像装置11；

分光镜9用于将经过滤光件4过滤后的光线分成两束光线，其中一束光线入射至第一聚光透镜组5，另一束光线入射至第二聚光透镜组10并通过成像装置11成像。

具体地，第二聚光透镜组10和第一聚光透镜组5的功能相同，均是为了将经过过滤后的平行光线汇聚成像，但是经过第二聚光透镜组10汇聚后的荧光图像是直接通过成像装置11获得荧光图像的。具体地该成像装置11可以包括面阵探测器或者CCD相机等，通过成像装置11获得荧光图像，基于该荧光图像成像的清晰度，可以对透光平台2和显微透镜组3之间的相对距离进行验证调节；当通过成像装置11获得的荧光图像不清晰时，则说明透光平台2不是位于显微透镜组3的焦平面上，由此可以对透光平台2和显微透镜组3的相对位置进行调节，直到成像装置11获得的荧光图像变清晰，同时该成像装置11也可以实现待测样品的荧光图像变化的实时记录，给微生物的研究分析提供依据。

另外，对于第一聚光透镜组5和第二聚光透镜组10而言，二者作用相同，甚至二者在光路上可以合并为一个聚光镜透镜组，同时将分光镜9设置在该聚光透镜组之后，使得滤光后的平行光线，先经过聚光透镜组再通过分光镜9分光。但是基于积分视场单元6需要设置在第一聚光透镜组5的焦平面，且成像装置11也需要设置在第二聚光透镜组10的焦平面上，因此，将第一聚光透镜组5和第二聚光透镜组10合并为一个聚光透镜组时，各个光学部件的布局会存在困难，因此更为优选的方式是采用两个聚光透镜组。

另外，对于分光镜9，具体可以采用半透半反射镜。具体地，如图2所示，经过滤光件4出射的平行光以45度入射角入射至半透半反射镜，该半透半反射镜将入射的光线分成相互垂直的一束反射光线和一束透射光线。两束光线分别入射至两个聚光透镜组，但是对于反射光线是入射至第一聚光透镜组5还是入射至第二聚光透镜组10，本实施例中不做具体要求，理论上而言，反射光线和透射光线是等效的。

另外，理论上而言，本申请中整个光路的光轴可以在同一直线上，但鉴于实际空间的限制，可以根据实际需求在光路中增加若干个反射镜等部件改变光路传播方向，但因为对微生物的荧光检测分析不存在实际影响，因此在本实施例中不做过多说明。

基于上述实施例，在本申请的一种可选地的实施例中，还可以进一步地包括：

滤光件4包括多个可对不同波段的光波进行滤光的滤光片；且各个滤光片可在光路中切换。

在实际的微生物细胞研究中，可能需要反复进行大量的荧光检测实验，每次实验采用的荧光团的波段各不相同，那么相应地每次对显微透镜组放大后形成的平行光线进行滤光用到的滤光片也就不同。为了便于用户使用，可以采用对滤光片进行随时切换的滤光件4，使得用户可以根据实际需要更换光路中的滤光片。

具体地，可以参考图3，图3为本实施例提供的滤光件的结构示意图。该滤光件4包括：

支座43以及和支座43相连接的滤光片轮41，各个滤光片42环绕中心轴设置在滤光片轮41上，滤光片轮41可沿滤光片轮41的中心轴旋转，以实现各个滤光片42在光路中的切换。

如图3所示，滤光片轮41的中心和支座43顶部连接，且滤光片轮41上环绕设置一圈滤光片42，每个滤光片42的滤光波段各不相同，通过旋转该滤光片轮41，即可改变各个滤光片42的位置，进而使得不同的滤光片42进入光路过滤。

基于上述任意实施例，在本申请的另一具体实施例中，还可以进一步地包括：

积分视场单元6设置于调整台上；

调整台可带动积分视场单元6沿第一聚光透镜组5的光轴方向移动，且可带动积分视场单元6以第一聚光透镜组5的光轴为中心旋转。

具体地，如图4所示，图4为本申请实施例提供的调整台的结构示意图。如图4所示，在调整台上包括一个环形转台61，该环形转台61的中心位置处设置有积分视场单元6，第一聚光透镜组5的光轴垂直于该环形转台61，且穿过积分视场单元6的中心。环形转台61固定的移位台62上，沿光轴方向移动该移位台62，即可实现积分视场单元6沿光轴方向移动，使得积分视场单元6可移动至第一聚光透镜组5的焦平面上。通过环形转台61可以带动积分视场单元6以第一聚光透镜组5的光轴为中心旋转；通过旋转积分视场单元6，可以使得积分使得积分视场单元6上各个小视场产生色散时的色散方向发生改变，进一步减小各个小视场的色散区域重叠的可能性。

具体地，本申请中所涉及的积分视场单元6具体可以是像切分器、微透镜阵列或者是微透镜阵列与光纤结合的结构中的任意一种，对此本申请中不做具体限定。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其它实施例的不同之处，各个实施例之间相同或相似部分互相参见即可。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (9)

1.一种微生物的荧光光谱检测系统，其特征在于，包括激光光源、透光平台、显微透镜组、滤光件、第一聚光透镜组、积分视场单元、光谱仪以及探测器；

其中，所述激光光源用于向所述透光平台上发射激光，激发所述透光平台上承载的待测微生物样品携带的荧光染料发出荧光；

所述透光平台设置在所述显微透镜组的焦平面上；

所述显微透镜组用于将经过所述透光平台透射的荧光光线放大扩散成平行光；

所述滤光件用于对所述平行光进行滤光，其中，滤光光波为除所述荧光染料发出荧光波段之外的波段光波；

所述第一聚光透镜组用于将过滤后的光线进行聚光成像；

所述积分视场单元用于将所述第一聚光透镜组聚光成像的荧光图像分割为若干个阵列图像单元，并通过光谱仪对每个阵列图像单元内的光谱进行色散；

所述探测器用于检测经过所述光谱仪色散获得的光谱分布信息。

2.如权利要求1所述的微生物的荧光光谱检测系统，其特征在于，还包括设置在所述滤光件和所述第一聚光透镜组之间的分光镜；以及还包括第二聚光透镜组和成像装置；

所述分光镜用于将经过所述滤光件过滤后的光线分成两束光线，其中，一束光线入射至所述第一聚光透镜组，另一束光线入射至所述第二聚光透镜组并通过所述成像装置成像。

3.如权利要求2所述的微生物的荧光光谱检测系统，其特征在于，所述分光镜为半透半反射镜，用于将经过所述滤光件过滤后的光线入射至所述半透半反射镜，形成一束反射光线和一束投射光线。

4.如权利要求1所述的微生物的荧光光谱检测系统，其特征在于，所述滤光件包括多个可对不同波段的光波进行滤光的滤光片；且各个所述滤光片可在光路中切换。

5.如权利要求4所述的微生物的荧光光谱检测系统，其特征在于，所述滤光件包括支座以及和所述支座相连接的滤光片轮，各个所述滤光片环绕滤光片轮的中心轴设置在所述滤光片轮上，所述滤光片轮可沿所述滤光片轮的中心轴旋转，以实现各个所述滤光片在光路中的切换。

6.如权利要求1至5任一项所述的微生物的荧光光谱检测系统，其特征在于，所述积分视场单元设置于调整台上；

所述调整台可带动所述积分视场单元沿所述第一聚光透镜组的光轴方向移动，且可带动所述积分视场单元以所述第一聚光透镜组的光轴为中心旋转。

7.如权利要求6所述的微生物的荧光光谱检测系统，其特征在于，所述积分视场单元包括像切分器、微透镜阵列、以及微透镜阵列连接光纤阵列结构中的任意一种结构。

8.如权利要求6所述的微生物的荧光光谱检测系统，其特征在于，所述光谱仪为棱镜-光栅光谱仪。

9.如权利要求6所述的微生物的荧光光谱检测系统，其特征在于，所述显微透镜组为视场大小可调的放大镜组。

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