CN110820049A - DNA编码化合物库构建中On-DNA芳基碘代物的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种DNA编码化合物库构建中On‑DNA芳基碘代物的合成方法，是将On‑DNA芳胺化合物与亚硝酸盐、酸类试剂和碘化盐混合反应得到On‑DNA芳基碘代物。本发明提供的合成方法反应条件温和、原料易得、成本低、操作方便、收率高，适合于多孔板进行的DNA编码化合物库的合成。
Description
技术领域
本发明属于DNA编码化合物库技术领域，具体涉及一种DNA编码化合物库中由DNA芳胺化合物制得On-DNA芳基碘代物的方法。
背景技术
美国Scripps研究院的Sydney Brenner和Richard Lerner教授于1992年提出了DNA编码化合物库(DNA Encoded Library，简称DEL)的概念(参考文献：Proc.Natl.Acad.Sci.,1992,89,5381)，该方法通过将一个有机小分子试剂与一段独特序列的DNA在分子水平进行连接，利用组合化学的“组合-拆分”策略通过两个至多个循环快速地构建数量巨大的化合物库，该化合物库中每一个化合物都由不同有机小分子试剂残基组成，并由相应的唯一碱基序列的DNA标识，将少量的DNA编码化合物库与靶标进行亲和筛选，与靶标没有吸附的库分子先被洗掉，留下与靶标有吸附的库分子再洗脱下来，这时得到的库分子浓度很低，常规手段难以分析和识别，通过DNA独有的聚合酶链式反应(PolymeraseChain Reaction，简称PCR)可以把得到的与靶标有吸附的库分子中的DNA部分进行复制扩增直至得到的DNA量可以被DNA测序仪识别，测序后的数据再通过构建DNA编码化合物库时创建的小分子试剂与DNA碱基序列之间的关系表来解码，进而找到具有潜在活性分子相对应的具体化合物对应的小分子试剂，再通过传统的有机合成方法把这些小分子试剂组合在一起得到筛选的目标分子，检测并确认其对靶标的生物活性。
DNA编码化合物库的构建方法主要有三种，第一种是以美国Ensemble公司为主利用DNA模板技术得到的DNA导向分子库(DNA-Templated Chemical Library Synthesis，简称DTCL)，第二种是以美国GSK公司，X-Chem公司和国内的成都先导为主利用DNA标记技术得到的DNA记录分子库(DNA-Recorded Chemical Library，简称DRCL)，第三种是以瑞士Philogen公司为主基于片段的药物设计(Fragment-based drug discovery，简称FBDD)技术得到的编码自组装分子库(Encoded Self-Assembling Chemical Libraries，简称ESAC)，目前工业上被大量运用的构建DNA编码化合物库的方法主要是第二种，该方法操作简单，成本更低，能更快速地利用组合化学方法得到含有海量的化合物的DNA编码化合物库。
除了DNA起始片段(详见本公司发明专利：CN108070009A,CN109868268A)外，需要有大量的DNA标签和可以按照一定顺序进行反应的有机小分子试剂。DNA标签的编码可以通过一定的计算机程序来获得(详见本公司发明专利：CN107958139A)，再通过DNA合成仪得到具体的DNA碱基序列的引物。有机小分子试剂的获得，可以使用一定的计算机程序来对获得的试剂清单进行筛选得到(详见本公司发明专利：CN108959855A)。
DEL库领域目前最主要的工作之一是DNA上化学反应的开发，简称on-DNA化学反应。因为DNA必须在一定的水相中、pH、温度、金属离子浓度和无机盐浓度下才能保持稳定，因此，对DNA损伤小、有较好的回收率和底物适应性广的on-DNA化学反应，才是大规模应用于DNA编码化合物库的合成所需要的。目前公开报道的on-DNA化学反应种类近60种，每种的反应条件少则一种，多则十几种，可以说，在其他情况一样的情况下，on-DNA化学反应的种类越多，条件越丰富，在DNA编码化合物库的设计时的选择性才越多，最终DNA编码化合物库的合成成功率才越高，得到的DNA编码化合物库的多样性才越丰富。
表1可用于DRCL构建的On-DNA化学反应种类和具体条件
在on-DNA化学反应中，缓冲液的选择十分重要，我们确定了几种常用的缓冲液的配制和质检方法(详见本公司发明专利：CN109456368A)，并提供了在该缓冲液条件下的几种具体的On-DNA化学反应(详见本公司发明专利：CN109680342A)。目前DNA编码化合物库构建中最常使用的成键化学反应有：形成酰胺键反应、其他胺的盖帽反应(还原氨化、取代、(硫)脲的形成、氨基甲酸酯的形成、磺酰化等)、Suzuki偶联反应、Sonogashira偶联反应、Heck偶联反应、Buchwald偶联反应、Ullmann偶联反应等(参考文献：Angew.Chem.Int.Ed.,2019,58,10.1002/anie.201902489)。
其中，Pd催化的on-DNA芳基卤代物的交叉偶联反应是DNA编码化合物库合成中一类重要的反应，对扩大DNA编码化合物库分子的多样性具有重要的意义。该类反应一般都需要先得到带有芳卤的小分子片段的DNA编码化合物分子，大多数文献表明，on-DNA芳基碘代物在交叉偶联中的转化率较高，具有较大的应用价值。但是目前on-DNA芳基碘代物一般通过on-DNA化合物与带有芳基碘和与on-DNA化合物的功能团互补功能团的二元小分子试剂反应来制备，由于该类试剂较少，使得通过该方法获得on-DNA芳基碘代物受到了一定的限制。若能在on-DNA化合物分子上通过功能团转化直接获得on-DNA芳基碘代物将大大扩大获得on-DNA芳基碘代物的范围。
为了解决如上问题，我们希望开发一种可以原位获得on-DNA芳基碘代物的方法，以便扩大on-DNA芳基碘代物的数量和多样性，以便适应大批量多孔板的DNA编码化合物库生产的需求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一，在于提供一种用于DNA编码化合物库合成中的on-DNA芳胺化合物转化成on-DNA芳基碘代物的方法，该方法不需要金属催化剂参与、常温下即可以原位得到on-DNA芳基碘代物。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：
一种用于DNA编码化合物库合成中on-DNA芳基碘代物的合成方法，将摩尔浓度为0.1～2.0mM的on-DNA芳胺化合物水溶液与50～500摩尔当量的亚硝酸盐、5～100摩尔当量的酸类试剂溶液和10～500摩尔当量的碘化盐溶液混合后，在常温下反应1～24小时一锅法制得on-DNA芳基碘代物；其中，on-DNA芳基胺化合物的结构式为：DNA-Ar-NH2，所制备得到的on-DNA芳基碘代物的结构式如所示：DNA-Ar-I；
其中，结构式中的DNA是由经人工修饰的和/或未修饰的核苷酸单体聚合得到的单链或双链的核苷酸链；
其中，结构式中的Ar是单环或双环的芳香环，所述on-DNA芳基胺化合物的NH2连接于Ar的环上，所述on-DNA芳基碘代物的I连接于Ar的环上；
其中，结构式中的DNA与Ar通过一个化学键或多个化学键连接。一个化学键时，是指结构式中的DNA与Ar直接相连；多个化学键时，指结构式中的DNA与Ar之间间隔多个化学键相连，比如，DNA与Ar之间了通过一个亚甲基(-CH2-)相连，即通过两个化学键连接；或DNA与Ar通过一个羰基(-CO-)连接DNA的氨基，也是通过两个化学键连接；或DNA与Ar通过一个亚甲基羰基(-CH2CO-)连接DNA的氨基，也是通过三个连续的化学键连接。
具体的，Ar可以选自以下基团：
R1为氢、卤素、氨基、硝基、氰基、羟基、巯基、芳基甲酮、烷基甲酮、C1-C12烷基、C1-C6烯烃基、C1-C6炔烃基、C3-C8环烷基、C1-C6烷基氧基、C1-C6烷基氨基中的任意一种至多种的随机组合，Ar上可以有一个或多个R1基团；R2为连接DNA部分的功能团，具体是一个可以与DNA上的功能团互补反应的功能团，可以是氨基、羧基、醛基、芳卤中的任意一种，R2可以直接与Ar相连，也可以间隔多个化学键相连；Y为O、S、NH或烷基取代氨基中的任意一种。
本发明的合成方法简述如下：以DNA模板和含有芳硝基羧酸二元化合物原位缩合生成on-DNA芳硝基化合物，再进一步还原生成on-DNA芳胺化合物做为底物，与重氮化试剂亚硝酸盐、酸试剂和碘化盐在一定溶剂下混合，在室温下反应反应1～24小时，具体反应方程式如下：
其中，所述亚硝酸盐为是亚硝酸钠、亚硝酸钾、亚硝酸叔丁酯、亚硝酸异丁酯，或亚硝酸异戊酯中的一种或几种的混合物；优选地，所述亚硝酸盐为亚硝酸钠；
其中，所述酸类试剂为苯磺酸、对甲基苯磺酸、十二烷基苯磺酸、乙酸、草酸、盐酸，或甲磺酸中的一种或几种的混合物；优选地，所述酸类试剂为对甲基苯磺酸。
其中，所述碘化盐是碘化亚铜、碘化钾、碘化钠中的一种或几种的混合物；优选地，所述碘化试剂为碘化钾；
其中，所述溶剂是含乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜、甲醇、乙醇、叔丁醇、异丙醇、四氢呋喃、无机盐缓冲液、有机酸缓冲液、有机碱缓冲液中的任意一种或几种的含水的混合溶剂；优选地，所述on-DNA芳胺化合物溶于水。
本发明为on-DNA芳基碘代物的合成提供新的方法，不再需要查询并采购大量的含有芳基碘代物的二元试剂，如含羧酸的芳基碘代物二元化合物，直接通过原料更易得、更廉价的胺基保护的氨基酸类试剂原位生成on-DNA芳胺化合物，再通过一步反应原为转化为我们需要的on-DNA芳基碘代物，而on-DNA芳胺化合物也是大部分DNA编码化合物库的合成中间体，这样也扩大了DNA编码化合物库的多样性，为on-DNA芳胺化合物的盖帽提供了新的思路。
本发明不需要金属催化剂参与、反应条件温和、选择性高、产率高、后处理简单，适合大批量多孔板的DNA编码化合物库的生产。
附图说明
图1为本发明方法的原料制备方法，DNA-NH2化合物1与含有芳硝基羧酸二元化合物使用EDCI为缩合剂、s-NHS为缩合活化剂，生成on-DNA芳硝基化合物2，再进一步与B2(OH)4发生还原反应原位生成相应的on-DNA芳胺化合物3的化学反应式。
图2A为本发明方法的两步制备得到的原料on-DNA芳胺化合物3的转化率统计图(。
图2B为图2A中部分具体代表结构式及对应的转化率图(图2B)(转化率以LCMS-LTQ上的TIC峰面积为准)。
图3为本发明用on-DNA芳胺化合物与亚硝酸钠、对甲基苯磺酸和碘化钾混合，原位反应得到相应的on-DNA芳基碘代物的化学反应式。
图4A为本发明用on-DNA芳胺化合物与亚硝酸钠、对甲基苯磺酸和碘化钾混合，原位反应得到相应的on-DNA芳基碘代物的转化率统计图。
图4B为图4A中部分具体代表结构式及其转化率图(转化率以LCMS-LTQ上的TIC峰面积为准)。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1，on-DNA芳胺化合物的合成
1)on-DNA芳基硝基化合物的合成
DNA-NH2化合物1(例如专利CN108070009A的提及的起始头片段)溶于250mM,pH＝9.5的硼酸缓冲液，配制成1mM浓度溶液，分装到96孔板中，与360个含有芳硝基羧酸二元化合物使用EDCI作为缩合剂、s-NHS缩合活化剂反应得到相应的on-DNA芳硝基化合物(参考文献：Nat.Chem.,2015,7,3,241)，该反应完成后只做乙醇沉淀处理，浓缩干燥后得到的on-DNA芳硝基化合物2直接用于下一步的还原反应。
2)on-DNA芳胺化合物的合成
上述on-DNA芳硝基化合物2溶于250mM,pH＝9.5的硼酸缓冲液，配制成1mM浓度溶液，分装到96孔板中，使用B2(OH)4还原剂反应得到原位生成芳基胺化合物3(参考文献：CN109680342A)，该反应完成后只做乙醇沉淀处理，浓缩干燥后直接用作on-DNA芳基叠氮化合物合成的原料(见图1)。
其中转化率超过50％的有198个，为了更好地验证on-DNA芳基碘代物的合成方法，我们只选择转化率超过50％的原位生成的on-DNA芳胺化合物3用于下一步反应(见图2)。
实施例2，on-DNA芳基碘代物4的合成
向上述原位生成的198个on-DNA芳胺化合物3的每个孔(5.0μL,5.0nmol,1mM水溶液)依次加入亚硝酸钠溶液(5.0μL,1000nmol,200mM超纯水,200摩尔当量)和对甲苯磺酸溶液(5.0μL,1000nmol,200mM超纯水，200摩尔当量)，离心，让溶液沉底，涡旋混匀，再次离心后，放置于20℃下震荡5分钟，离心，加入碘化钾(5.0μL,1000nmol,200mM超纯水,200摩尔当量)，96孔板在震荡仪器中20℃下反应16小时(见图3)。
加入乙醇沉淀：
向96孔板的反应孔加入总反应液体积10％的5M氯化钠溶液，封膜，振荡混匀后，加入总体积3倍的在-20℃储存的冷无水乙醇，于-80℃冰箱冷冻2小时，之后拿出在4℃以4000G的离心力离心30分钟，吸除上清液，沉淀用去离子水溶解后于-40℃真空冻干，得到产物4，通过酶标仪检测OD确认回收率，同时检测LC-MS确认每个小分子的转化率，在原位转化率>50％的on-DNA芳胺化合物得到on-DNA芳基碘化物的转化率>50％的占比达到30％，底物普适性较好，相关代表结构及其转化率见图4。
综上所述，上述各实施例及附图仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。
Claims (13)
1.一种DNA编码化合物库构建中On-DNA芳基碘代物的合成方法，其特征在于，将摩尔浓度为0.1～2.0mM的On-DNA芳胺化合物水溶液与50～500摩尔当量的亚硝酸盐、5～100摩尔当量的酸类试剂溶液和10～500摩尔当量的碘化盐溶液混合后，在常温下反应1～24小时一锅法制得On-DNA芳基碘代物；
其中，所述On-DNA芳胺化合物的结构式为：DNA-Ar-NH2，所述On-DNA芳基碘代物的结构式为：DNA-Ar-I；
其中，结构式中的DNA是由经人工修饰的和/或未修饰的核苷酸单体聚合得到的单链或双链的核苷酸链；
其中，结构式中的Ar是单环或双环的芳香环，结构式中的DNA与Ar通过一个或多个化学键连接。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Ar可以选自以下基团：
R1为氢、卤素、氨基、硝基、氰基、羟基、巯基、芳基甲酮、烷基甲酮、C1-C12烷基、C1-C6烯烃基、C1-C6炔烃基、C3-C8环烷基、C1-C6烷基氧基、C1-C6烷基氨基中的任意一种至多种的随机组合；Ar上可以有一个或多个R1基团；R2为连接DNA部分的功能团，具体是一个可以与DNA上的功能团互补反应的功能团，可以是氨基、羧基、醛基、芳卤中的任意一种；R2可以直接与Ar相连，也可以间隔多个化学键相连；Y为O、S、NH或烷基取代氨基中的任意一种。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述On-DNA芳胺化合物溶于水溶液后的摩尔浓度是0.1～2.0mM；优选地，所述on-DNA芳胺化合物水溶液的摩尔浓度为1.0mM。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶液是含乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜、甲醇、乙醇、叔丁醇、异丙醇、四氢呋喃、无机盐缓冲液、有机酸缓冲液、有机碱缓冲液中的任意一种或几种的含水的混合溶剂；优选地，所述on-DNA芳胺化合物溶于水。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亚硝酸盐为是亚硝酸钠、亚硝酸钾、亚硝酸叔丁酯、亚硝酸异丁酯，或亚硝酸异戊酯中的一种或几种的混合物；优选地，所述亚硝酸盐为亚硝酸钠。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亚硝酸盐的摩尔当量是50～500当量；优选的，所述亚硝酸盐的摩尔当量是100当量。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酸类试剂为苯磺酸、对甲基苯磺酸、十二烷基苯磺酸、乙酸、草酸、盐酸，或甲磺酸中的一种或几种的混合物；优选地，所述酸类试剂为对甲基苯磺酸。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磺酸类试剂的当量是5～100当量；优选的，所述磺酸类试剂的当量是20当量。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碘化盐是碘化亚铜、碘化钾、碘化钠中的一种或几种的混合物；优选地，所述碘化试剂为碘化钾。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碘化盐的摩尔当量是10～500当量；优选的，所述碘化盐的摩尔当量是30当量。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应的常温是指-5～40℃；优选地，所述反应的反应温度为20℃。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应的反应时间为1～24小时；优选地的，所述反应的反应时间是16小时。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法用于批量的多孔板操作；优选的，所述方法用于多孔板的DNA编码化合物库的合成。
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