CN110818801A - 一种基于单层多孔膜的卵清蛋白的固定化方法 - Google Patents
一种基于单层多孔膜的卵清蛋白的固定化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110818801A CN110818801A CN201911146582.3A CN201911146582A CN110818801A CN 110818801 A CN110818801 A CN 110818801A CN 201911146582 A CN201911146582 A CN 201911146582A CN 110818801 A CN110818801 A CN 110818801A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ovalbumin
- porous membrane
- layer porous
- solution
- microemulsion
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000012528 membrane Substances 0.000 title claims abstract description 122
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 title claims abstract description 117
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 title claims abstract description 116
- 239000002356 single layer Substances 0.000 title claims abstract description 81
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 39
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 title claims description 13
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 54
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 claims abstract description 41
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims abstract description 35
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims abstract description 31
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims abstract description 23
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 19
- XRWMGCFJVKDVMD-UHFFFAOYSA-M didodecyl(dimethyl)azanium;bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCCCCCCCCCC XRWMGCFJVKDVMD-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 69
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 38
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 28
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 claims description 8
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 5
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 claims description 4
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 20
- 238000012545 processing Methods 0.000 abstract description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 11
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 8
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 3
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 2
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 2
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 2
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001878 scanning electron micrograph Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920000491 Polyphenylsulfone Polymers 0.000 description 1
- 229920001986 Vinylidene chloride-vinyl chloride copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 238000004630 atomic force microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000022 bacteriostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 238000005530 etching Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000001459 lithography Methods 0.000 description 1
- 239000008204 material by function Substances 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000005693 optoelectronics Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000002411 thermogravimetry Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
- C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
- C07K17/08—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/76—Albumins
- C07K14/77—Ovalbumin
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N13/00—Investigating surface or boundary effects, e.g. wetting power; Investigating diffusion effects; Analysing materials by determining surface, boundary, or diffusion effects
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N5/00—Analysing materials by weighing, e.g. weighing small particles separated from a gas or liquid
- G01N5/04—Analysing materials by weighing, e.g. weighing small particles separated from a gas or liquid by removing a component, e.g. by evaporation, and weighing the remainder
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Manufacture Of Porous Articles, And Recovery And Treatment Of Waste Products (AREA)
Abstract
本发明公开了一种基于单层多孔膜的卵清蛋白的固定化方法，以聚苯乙烯和双十二烷基二甲基溴化铵为原料，加入二氯甲烷，制备成单层多孔膜溶液；将卵清蛋白溶液和所述单层多孔膜溶液混匀，得微乳液；将所述微乳液滴在玻璃片上，置于温度25～35℃、湿度75％～85％的环境下，放置6～10小时，形成附有卵清蛋白的单层多孔膜。本发明实现了简单易操作的蛋白固定化，制备的附有卵清蛋白的单层多孔膜，膜结构均匀、稳定性良好且实现了卵清蛋白的精准捕获。在食品加工、生物传感、生物检测等领域有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于多孔膜的制备和蛋白固定化领域，具体涉及一种基于单层多孔膜的卵清蛋白的固定化方法。
背景技术
蛋白固定化是应用于药物传递、环境科学和蛋白质组学等许多领域的重要技术(Finbloom J A,Francis M B.Current Opinion in Chemical Biology,2018,46：91-98.)，其在生物技术和生物医学领域也有着广泛的应用(Sunanda N,Yanxiong P,Hui L,etal.ACS Applied Nano Materials,2018,1(8)：4053-4063.)。它将随机无序的蛋白质均匀有序的排布在固相载体的表面，以达到分子识别、临床诊断、环境监测、质量控制等目的(Xiang W J,Rehm B H A.Biomacromolecules,2018.)。特异性的将蛋白固定在固相载体的表面还可以实现对分析物的高通量检测。蛋白固定化具有可反应性和稳定性(Grajales D,Mateos J C,Padro D,et al.New Biotechnology,2018.)，还具有环境污染小、节约资源等优点，符合国家政策可持续发展的要求，能够在工业生产中大规模的使用，在生物领域和化工领域可以得到广泛应用，在应用价值上也具有重要的现实意义。通常，最常用的蛋白固定化方法有物理吸附法、化学偶联法(Liu D M,Chen J,Shi Y P.Talanta,2017,164：548-555.)、包衣法和交联聚合法(Lim S,Jung G A,Muckom R J,et al.ChemicalCommunications,2019,55(6)：806-809.)。但是，每种方法都有不足之处。例如，物理吸附固定化的蛋白质很容易从载体上脱落(Williams D M,Gilad K,Hadi I,et al.ACS AppliedNano Materials,2018.)。运用化学偶联法时虽然共价键能与蛋白质紧密结合，但多点共价键的连接可能会降低酶的活性。此外，包衣法和交联聚合法可能会遇到底物或产物的传质和扩散阻力。卵清蛋白为蛋清中的主要蛋白质(Abeyrathne E D N S,Huang X,Ahn DU.Poultry Science,2018,97(4).)，在食品加工领域有着广泛的应用。卵清蛋白使用方便、功能性佳，具有溶解性、持水力、起泡性、凝胶性、乳化性的特性。具有来源广泛、制备容易、价格低廉等优点，是开发新型天然生物抑菌剂的重要资源。长期以来，对卵清蛋白的研究多集中于结构、抗氧化性、功能特性等方面。实现卵清蛋白在单层膜上的固定化，有望实现在生物传感、生物医学等方面的应用。
多孔膜材料是一种孔洞均匀、排列规则的聚合物。由于其独特的优点，因此在化学、生物医学、功能材料学以及生命科学等领域具有广泛的应用前景和重要的科学价值。如催化剂负载，气体传感器件，光电器件，细胞培养基材，吸附或分离介质等方面(Xinya W,Changfa X,Hailiang L,et al.Materials,2018,11(3)：443-.)。多孔膜材料是常见的实现蛋白固定化的载体。常用的多孔膜材料有聚苯乙烯(JiChao Wang,Huihui Lou,Zeng-HuiCui,Separation and Purification Technology,2019,222.)、壳聚糖(Xiaoping Song,Jie Mei,Genlan Ye,Leyu Wang,Applied Materials Today,2019,15)、聚亚苯基砜(Darvishmanesh S,Tasselli F,Jansen J C,et al.Journal of Membrane Science,2011,384(1)：89-96)、偏二氯乙烯-氯乙烯共聚物(Pongprayoon T.,Nuangchamnong R.,Yanumet N.,Applied Clay Science,2013,86,179-184)等。目前多孔膜的制备方法有很多种，如石板印刷法、刻蚀法、模板法、自组装法和水滴模板法等。在众多方法中，水滴模板法因其工艺简单、实验条件温和以及结构规整可控等优点而受到了国内外研究者的广泛关注。该技术能够简单、高效地捕获目标蛋白，具有良好的经济价值和社会效益，这些研究为蛋白固定化的探索提供了新的思路和方向。现有的水滴模板法，首先需要制备聚合物的有机溶液，然后将混合溶液在高湿度条件下浇筑在固相基底上。待有机溶剂和水蒸气完全挥发后，在膜的表面形成空泡图案，即多孔膜。再将多孔膜浸泡在卵清蛋白溶液中，这样在膜的基础上，将卵清蛋白负载到了膜的孔洞内。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的缺点，提供一种基于单层多孔膜的蛋白固定化的简便方法。运用“一步法”制备了单层多孔膜，并用其实现了卵清蛋白的精准捕获。
本发明是通过以下技术方案实现的：采用“一步法”，将聚苯乙烯(PS)和双十二烷基二甲基溴化铵(DDA)溶于二氯甲烷中，再加入卵清蛋白(OVA)的PBS溶液，充分混匀超声后得到三者的微乳液。取一干净的玻璃片置于恒温恒湿箱中，在高湿度环境下取一滴混合液滴在玻璃片上，静置6～8小时拿出。待二氯甲烷和水蒸气全部挥发，得到附有卵清蛋白的单层多孔膜(简称OPD)。采用光学显微镜、原子力显微镜、扫描电镜对多孔膜进行形貌表征。用热重分析仪和接触角测量仪测试了多孔膜的热稳定性及表面浸润性。
一种基于单层多孔膜的卵清蛋白的固定化方法，包括步骤：
S1、单层多孔膜溶液的制备：取聚苯乙烯(PS)和双十二烷基二甲基溴化铵(DDA)混合，再加入二氯甲烷，搅拌使其溶解并混匀，得单层多孔膜溶液；其中，所述单层多孔膜溶液中，聚苯乙烯的浓度为4～8mg/mL，双十二烷基二甲基溴化铵的浓度为0.3～0.7mg/mL；
S2、配制卵清蛋白溶液：取卵清蛋白(OVA)加入PBS缓冲液，配置成卵清蛋白浓度是4～6mg/mL的卵清蛋白溶液；所述卵清蛋白也可以是异硫氰酸荧光素标记的卵清蛋白；
S3、附有卵清蛋白的单层多孔膜微乳液的制备：将步骤S2所述卵清蛋白溶液和步骤S1所述单层多孔膜溶液按体积比15∶1～25∶1混合，搅拌、超声，使其均匀混合，形成微乳液；
S4、附有卵清蛋白的单层多孔膜OPD的制备：取步骤S3所述微乳液，滴在玻璃片上，置于温度25～35℃、湿度75％～85％的环境下，放置6～10小时，在玻璃片上形成乳白色薄膜，为附有卵清蛋白的单层多孔膜OPD。
优选方式下，步骤S1所述搅拌具体为每5分钟搅拌一次，共搅拌3～4次至完全溶解。
优选方式下，步骤S3所述搅拌具体为用玻璃棒不断搅拌1～2min；所述超声具体为频率40KHz，时间30秒。
优选方式下，步骤S4所述微乳液的体积是20μL。
优选方式下，所述基于单层多孔膜的卵清蛋白的固定化方法，包括步骤：
S1、单层多孔膜溶液的制备：称取0.03g的PS和0.0025g的DDA于小烧杯中，再向烧杯中加入5mL的二氯甲烷，每5分钟搅拌一次，搅拌4次至充分溶解，得单层多孔膜溶液；
S2、卵清蛋白溶液的制备：取5mg卵清蛋白于1.5mL的EP管中，加入1mL的PBS缓冲溶液(pH为7.4)，混匀，得到浓度为5mg/mL的卵清蛋白溶液；
S3、附有卵清蛋白的单层多孔膜微乳液的制备：取200μL步骤S2所述卵清蛋白溶液加入5mL步骤S1所述的单层多孔膜溶液，用玻璃棒不断搅拌1分钟、40KHz、超声30秒，使其均匀混合形成微乳液，得微乳液；
S4、附有卵清蛋白的单层多孔膜OPD的制备：取20μL步骤S3所制得的微乳液，滴在干净玻璃片上，置于温度为25℃，湿度为85％的环境下，静置8小时。在玻璃片上形成一乳白色薄膜，为附有卵清蛋白的单层多孔膜OPD。
本发明的有益效果是：
(1)运用传统的水滴模板法，首先需要在高湿度条件下，将聚合物的有机溶液浇筑在固相基底上制得多孔膜。再将多孔膜浸泡在卵清蛋白溶液中完成卵清蛋白的负载。但如本发明中步骤S3、S4所述，本发明直接完成制膜以及负载的过程。将卵清蛋白溶液直接与聚合物的有机溶液混合形成微乳液，将微乳液浇筑在固相基底上，一步制得附有卵清蛋白的多孔膜，步骤简单、操作方便；
(2)运用光学显微镜、扫描电镜、原子力显微镜对多孔膜进行形貌表征，可以观察到制备的附有卵清蛋白的单层多孔膜的膜结构良好，孔洞大小均匀且致密；
(3)通过热重曲线看出制备的附有卵清蛋白的单层多孔膜在180℃之前的热稳定性良好；
(4)本发明提供的蛋白固定化的方法简便，在生物传感方面可以制成类似ELISA的传感器、在营养传递方面可以实现有益蛋白的固定与输送等。
附图说明
图1为本发明实施例1所制得的OPD的光学显微镜图。采用光学显微镜观察膜的形貌。可以初步观察到在大范围内，多孔膜呈致密均匀的多孔形貌。
图2为本发明对比例1所制得的OP的光学显微镜图。由图可以看出在不加表面活性剂DDA时，膜的多孔形貌较差。
图3为本发明实施例1所制得的OPD的扫描电镜图。用扫描电镜进一步观察膜的结构，在更大的放大倍数下可以更加清晰的看到膜呈均匀的圆形多孔形状，且结构致密。
图4为本发明对比例1所制得的OP的扫描电镜图。由图可以更加清晰的看出膜的多孔形貌较差且空隙较大。
图5为本发明实施例1所制得的OPD的原子力显微镜2D图。由图可以看出膜较好的多孔形貌以及孔洞的大小尺寸，所得结果与扫描电镜结果相符。
图6为本发明实施例1所制得的OPD的原子力显微镜3D图。从立体的角度观察了膜结构，图像可以显示出膜的厚度。
图7为本发明对比例1所制得的OP的原子力显微镜2D图。由图可以看出FP膜的孔洞尺寸小且空隙大，这一形貌会导致蛋白的负载率低，因此不利于后续蛋白的负载。
图8为本发明对比例1所制得的OP的原子力显微镜3D图。从立体的角度观察了FD膜的形貌结构，由图可以看出膜的厚度。
图9为本发明实施例2所制得的FPD的激光共聚焦显微镜图。从图中可以看出绿色均匀的小点，证实了蛋白被成功负载到了多孔膜中。
图10为本发明对比例2所制得的FP的激光共聚焦显微镜图。
图11为本发明实施例1所制得的OPD的接触角测试图。从图中可以看出我们所制备的多孔膜具有疏水性。
图12为本发明实施例1所制得的OPD的热失重测试图。从图可以看出多孔膜在180℃之前的热稳定性良好。
具体实施方式
以下实施实例对本发明做更详细的描述，但所述实例不构成对本发明的限制。
1、OPD的制备
(1)单层多孔膜溶液的制备：称取一定量的PS和DDA于小烧杯中，再向烧杯中加入一定量的二氯甲烷，搅拌使其充分溶解。
(2)卵清蛋白溶液的配置：取5mg卵清蛋白于1.5mL的EP管中，加入1mL的PBS缓冲溶液(pH为7.4)，混匀，配置成浓度为5mg/mL的卵清蛋白溶液；
(3)附有卵清蛋白的单层多孔膜微乳液的制备：将卵清蛋白溶液加入(1)所述的溶液中，搅拌、超声使其均匀混合形成微乳液。
(4)附有卵清蛋白的单层多孔膜OPD的制备：取一滴(3)所制得的微乳液，滴在提前放入恒温恒湿箱的一干净玻璃片上，在高湿度环境下静置8小时。取出放在室温下，待有机试剂与水蒸气全部挥发，得到一乳白色薄膜，为附有荧光标记的卵清蛋白的单层多孔膜OPD。
2、OPD的形貌学研究
将聚苯乙烯(PS)溶于二氯甲烷中，再添加卵清蛋白的PBS溶液，充分混匀超声后得到二者的微乳液。取一干净的玻璃片置于恒温恒湿箱中，在高湿度环境下取一滴混合液滴在玻璃片上，静置8小时拿出。待二氯甲烷和水蒸气全部挥发，得到附有卵清蛋白的PS多孔膜(简称OP)。我们采用光学显微镜、扫描电镜、原子力显微镜分别对OP以及1.所述的OPD进行表征，对比两种膜的结构及形貌。结果发现OP多孔膜无较好的多孔结构，孔洞不均匀且稀疏，。OPD多孔膜形貌较好、呈致密的单层多孔结构。
3、OPD的稳定性研究
采用热重分析仪对1.所述的OPD膜进行表征，测试OPD膜的稳定性。结果发现OPD膜的热稳定性良好。
4、OPD的表面浸润性研究
采用接触角测量仪对1.所述的OPD膜进行表征，测试OPD膜的表面浸润性。结果发现OPD膜具有疏水性。
多孔膜材料是常见的实现蛋白固定化的载体。卵清蛋白为蛋清中的主要蛋白质，在食品加工领域有着广泛的应用。本发明实现卵清蛋白在单层膜上的固定化，有望实现在生物传感、生物医学等方面的应用
如无特殊说明，下述各例使用的异硫氰酸荧光素标记的卵清蛋白购置于北京博尔西科技有限公司，商品号BFR552。
如无特殊说明，下述各例使用的PBS(1X)缓冲溶液购置于大连美仑生物技术有限公司，商品货号MA0015。
实施例1
一种基于单层多孔膜的卵清蛋白的固定化方法，包括步骤：
S1、单层多孔膜溶液的制备：称取0.03g的PS和0.0025g的DDA于小烧杯中，再向烧杯中加入5mL的二氯甲烷，每5分钟搅拌一次，搅拌4次至充分溶解，得单层多孔膜溶液；
S2、卵清蛋白溶液的制备：取5mg卵清蛋白于1.5mL的EP管中，加入1mL的PBS缓冲溶液(pH为7.4)，混匀，得到浓度为5mg/mL的卵清蛋白溶液；
S3、附有卵清蛋白的单层多孔膜微乳液的制备：取200μL步骤S2所述卵清蛋白溶液加入5mL步骤S1所述的单层多孔膜溶液，用玻璃棒不断搅拌1分钟、40KHz、超声30秒，使其均匀混合形成微乳液，得微乳液。
S4、附有卵清蛋白的单层多孔膜OPD的制备：取20μL步骤S3所制得的微乳液，滴在干净玻璃片上，置于温度为25℃，湿度为85％的环境下，静置8小时。在玻璃片上形成一乳白色薄膜，为附有卵清蛋白的单层多孔膜OPD。
将本实施例所制得的附有卵清蛋白的单层多孔膜采用光学显微镜观察，如图1所示。可以初步观察到在大范围内，多孔膜呈致密均匀的多孔形貌。
将本实施例所制得的附有卵清蛋白的单层多孔膜采用扫描电镜观察，如图3所示。在500倍的放大倍数下，可以更加清晰的看到膜呈均匀的圆形多孔形状，且结构致密。
将本实施例所制得的附有卵清蛋白的单层多孔膜采用原子力显微镜观察，如图5、图6所示。可以从立体的角度进一步观察到所制得膜的形貌良好，孔洞均匀且致密。膜的厚度约为2μm，孔洞的尺寸为4～7μm。
将本实施例所制得的附有卵清蛋白的单层多孔膜用接触角测量仪测其表面浸润性。首先将粘附有OPD的玻璃片放在样品台上，再调整样品台和针尖的高度，至摄像头下的图像清晰。在室温下，采用坐滴法进行测量并用椭圆拟合方法进行分析。如图11所示，测得接触角为91.35℃，证明多孔膜具有疏水性。
取10mg本实施例所制得的直接附有卵清蛋白的单层多孔膜置于铂金坩埚中，用热重分析仪测量其热稳定性。在30℃～500℃的升温范围内，设置平衡温度为30℃，升温速率为10℃/min进行测量。如图12所示，从热失重曲线可以看出，膜在180℃以后开始失重，证明膜在180℃内热稳定性良好，可以满足日常的加工和测试需要。
实施例2
为了证明实施例1中所述的卵清蛋白被成功捕获到了多孔膜中，我们将卵清蛋白进行了荧光标记，重复实施例1中步骤，并用激光共聚焦显微镜进行验证。
一种基于单层多孔膜的异硫氰酸荧光素标记的卵清蛋白的固定化方法，包括步骤：
S1、单层多孔膜溶液的制备：称取0.03g的PS和0.0025g的DDA于小烧杯中，再向烧杯中加入5mL的二氯甲烷，每5分钟搅拌一次，搅拌4次至充分溶解，得单层多孔膜溶液；
S2、荧光标记卵清蛋白溶液的制备：取异硫氰酸荧光素标记的卵清蛋白(FITC-OVA)100μL于1.5mL的EP管中，加入900μL pH为7.4的PBS缓冲溶液，配置成卵清蛋白浓度为5mg/mL的荧光标记的卵清蛋白溶液。避光混匀，得荧光标记的卵清蛋白溶液；
S3、附有荧光标记的卵清蛋白的单层多孔膜微乳液的制备：将取200μL步骤S2所述卵清蛋白溶液加入5mL步骤S1所述的得单层多孔膜溶液，用玻璃棒不断搅拌1分钟、40KHz、超声30秒，使其均匀混合形成微乳液，过程中注意避光，得微乳液。
S4、附有荧光标记的卵清蛋白的单层多孔膜FPD的制备：取20μL步骤S3所制得的微乳液，滴在干净玻璃片上，置于温度为25℃，湿度为85％的环境下，静置8小时。在玻璃片上形成一乳白色薄膜，为附有荧光标记的卵清蛋白的单层多孔膜FPD。
将本实施例所制得的附有荧光标记的卵清蛋白的单层多孔膜采用激光共聚焦显微镜观察，如图9所示。可以观察到均匀的绿色斑点，证明了该发明实现了卵清蛋白的精准捕获。
对比例1
一种直接附有卵清蛋白的聚苯乙烯多孔膜的制备方法，包括步骤：
S1、聚苯乙烯多孔膜溶液的制备：称取0.03g的聚苯乙烯(PS)于小烧杯中，再向烧杯中加入5mL的二氯甲烷，每5分钟搅拌一次，搅拌4次至充分溶解。
S2、卵清蛋白溶液的制备：取5mg卵清蛋白于1.5mL的EP管中，加入1mL pH为7.4的PBS缓冲溶液，混匀，得到浓度为5mg/mL的卵清蛋白溶液；
S3、附有卵清蛋白的聚苯乙烯多孔膜微乳液的制备：取200μL步骤S2所述卵清蛋白溶液加入5mL步骤S1所述的单层多孔膜溶液，用玻璃棒不断搅拌1分钟、40KHz、超声30秒，使其均匀混合形成微乳液，得微乳液；
S4、附有卵清蛋白的聚苯乙烯多孔膜OP的制备：取20μL步骤S3所制得的微乳液，滴在干净玻璃片上，置于温度为25℃，湿度为85％的环境下，静置8小时。在玻璃片上形成一乳白色薄膜，为附有卵清蛋白的单层多孔膜OP。
采用光学显微镜、扫描电镜、原子力显微镜分别对本对比例制备的附有卵清蛋白的聚苯乙烯多孔膜OP进行表征，结果如图2、4、7、8所示。如图2所示，在不加表面活性剂DDA时，膜的多孔形貌较差。
与实施例1制备的OPD的结果进行比较，比较两种膜的结构及形貌。发现OP多孔膜的孔洞尺寸小、数量少、间隙大。而OPD多孔膜形貌较好、排列均匀、呈致密的单层多孔结构。
对比例2
为了证明对比例1中所述的卵清蛋白被成功捕获到了聚苯乙烯多孔膜中，我们将卵清蛋白进行了荧光标记，重复对比例1中步骤，并用激光共聚焦显微镜进行验证。
一种直接附有荧光标记的卵清蛋白的聚苯乙烯多孔膜的制备方法，包括步骤：
S1、聚苯乙烯多孔膜溶液的制备：称取0.03g的聚苯乙烯(PS)于小烧杯中，再向烧杯中加入5mL的二氯甲烷，每5分钟搅拌一次，搅拌4次至充分溶解；
S2、荧光标记的卵清蛋白溶液的制备：取100μL异硫氰酸荧光素标记的卵清蛋白(FITC-OVA)于1.5mL的EP管中，加入900μL pH为7.4的PBS缓冲溶液，配置成卵清蛋白浓度为5mg/mL的荧光标记的卵清蛋白溶液。避光混匀，得荧光标记的卵清蛋白溶液；
S3、附有荧光标记的卵清蛋白的聚苯乙烯多孔膜微乳液的制备：将取200μL步骤S2所述卵清蛋白溶液加入5mL步骤S1所述的得单层多孔膜溶液，用玻璃棒不断搅拌1分钟、40KHz、超声30秒，使其均匀混合形成微乳液，过程中注意避光，得微乳液；
S4、附有荧光标记的卵清蛋白的聚苯乙烯多孔膜FP的制备：取20μL步骤S3所制得的微乳液，滴在干净玻璃片上，置于温度为25℃，湿度为85％的环境下，静置8小时。在玻璃片上形成一乳白色薄膜，为附有荧光标记的卵清蛋白的聚苯乙烯多孔膜FP。
采用激光共聚焦显微镜对本对比例制备的附有荧光标记的卵清蛋白的聚苯乙烯多孔膜FP进行表征。结果如图10所示，因没加表面活性剂DDA，膜的多孔形貌较差，不利于卵清蛋白的负载。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种基于单层多孔膜的卵清蛋白的固定化方法，其特征在于，包括步骤：
S1、单层多孔膜溶液的制备：取聚苯乙烯和双十二烷基二甲基溴化铵混合，再加入二氯甲烷，搅拌使其溶解混匀，得单层多孔膜溶液；其中，所述单层多孔膜溶液中，聚苯乙烯的浓度为4～8mg/mL，双十二烷基二甲基溴化铵的浓度为0.3～0.7mg/mL；
S2、配制卵清蛋白溶液：取卵清蛋白加入PBS缓冲液，配置成卵清蛋白浓度是4～6mg/mL的卵清蛋白溶液；
S3、附有卵清蛋白的单层多孔膜微乳液的制备：将步骤S2所述卵清蛋白溶液和步骤S1所述单层多孔膜溶液按体积比15:1～25:1混合，搅拌、超声，使其均匀混合，得微乳液；
S4、附有卵清蛋白的单层多孔膜OPD的制备：取步骤S3所述微乳液，滴在玻璃片上，置于温度25～35℃、湿度75％～85％的环境下，放置6～10小时，在玻璃片上形成的薄膜为附有卵清蛋白的单层多孔膜OPD。
2.根据权利要求1所述基于单层多孔膜的卵清蛋白的固定化方法，其特征在于，步骤S1所述搅拌具体为每5分钟搅拌一次，共搅拌3～4次。
3.根据权利要求1所述基于单层多孔膜的卵清蛋白的固定化方法，其特征在于，步骤S3所述搅拌具体为用玻璃棒搅拌1～2min。
4.根据权利要求1所述基于单层多孔膜的卵清蛋白的固定化方法，其特征在于，步骤S3所述超声为：频率40KHz，时间30秒。
5.根据权利要求1所述基于单层多孔膜的卵清蛋白的固定化方法，其特征在于，步骤S4所述微乳液的体积是20μL。
6.根据权利要求1所述基于单层多孔膜的卵清蛋白的固定化方法，其特征在于，包括步骤：
S1、单层多孔膜溶液的制备：称取0.03g的聚苯乙烯和0.0025g的双十二烷基二甲基溴化铵，加入5mL的二氯甲烷，每5分钟搅拌一次，搅拌4次至溶解，得单层多孔膜溶液；
S2、卵清蛋白溶液的制备：取5mg卵清蛋白，加入1mL、pH为7.4的PBS缓冲溶液，混匀，得到浓度为5mg/mL的卵清蛋白溶液；
S3、附有卵清蛋白的单层多孔膜微乳液的制备：取200μL步骤S2所述卵清蛋白溶液加入5mL步骤S1所述的单层多孔膜溶液，用玻璃棒搅拌1分钟，40KHz、超声30秒，使其混合均匀，得微乳液；
S4、附有卵清蛋白的单层多孔膜OPD的制备：取20μL步骤S3所述微乳液，滴在玻璃片上，置于温度为25℃，湿度为85％的环境下，静置8小时，在玻璃片上形成的薄膜为附有卵清蛋白的单层多孔膜OPD。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911146582.3A CN110818801A (zh) | 2019-11-21 | 2019-11-21 | 一种基于单层多孔膜的卵清蛋白的固定化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911146582.3A CN110818801A (zh) | 2019-11-21 | 2019-11-21 | 一种基于单层多孔膜的卵清蛋白的固定化方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110818801A true CN110818801A (zh) | 2020-02-21 |
Family
ID=69557627
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201911146582.3A Pending CN110818801A (zh) | 2019-11-21 | 2019-11-21 | 一种基于单层多孔膜的卵清蛋白的固定化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110818801A (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101672847A (zh) * | 2009-09-30 | 2010-03-17 | 青岛科技大学 | 一种蛋白质芯片玻璃载体的制备方法 |
| CN102352053A (zh) * | 2011-10-13 | 2012-02-15 | 吉林大学 | 构筑基于聚合物薄膜的蛋白图案化结构的方法 |
-
2019
- 2019-11-21 CN CN201911146582.3A patent/CN110818801A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101672847A (zh) * | 2009-09-30 | 2010-03-17 | 青岛科技大学 | 一种蛋白质芯片玻璃载体的制备方法 |
| CN102352053A (zh) * | 2011-10-13 | 2012-02-15 | 吉林大学 | 构筑基于聚合物薄膜的蛋白图案化结构的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| DE LEON, AS ET AL.: "Fabrication of honeycomb films from highly functional dendritic structures: electrostatic force driven immobilization of biomolecules", 《POLYMER CHEMISTRY》, 31 December 2016 (2016-12-31), pages 4112 - 4120 * |
| 黄俊杰: "水滴模板直接致孔技术的研究及其应用", 《中国优秀硕士论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》, 15 February 2018 (2018-02-15), pages 020 - 968 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wu et al. | Three-dimensional basswood-based membrane with well-designed multilevel/hierarchical imprinting surface: A high-efficiency selective separation system | |
| Yao et al. | Porous MOF microneedle array patch with photothermal responsive nitric oxide delivery for wound healing | |
| Wu et al. | A multiple‐functional Ag/SiO2/organic based biomimetic nanocomposite membrane for high‐stability protein recognition and cell adhesion/detachment | |
| Gunnewiek et al. | Creeping proteins in microporous structures: polymer brush-assisted fabrication of 3D gradients for tissue engineering | |
| CN110052182A (zh) | 一种多孔材料超高负载量混合基质膜的制备方法 | |
| Liu et al. | Construction of a novel macroporous imprinted biosensor based on quartz crystal microbalance for ribonuclease Adetection | |
| Wang et al. | Zwitterionic nanohydrogels–decorated microporous membrane with ultrasensitive salt responsiveness for controlled water transport | |
| Wang et al. | Immobilization of firefly luciferase on PVA-co-PE nanofibers membrane as biosensor for bioluminescent detection of ATP | |
| Demirel et al. | Surface-induced self-assembly of dipeptides onto nanotextured surfaces | |
| US9840701B2 (en) | Porous membrane having immobilized enzyme, porous membrane composite including the same, and preparation method thereof | |
| Dong et al. | “Click-chemical” modification of cellulose acetate nanofibers: a versatile platform for biofunctionalization | |
| Melnikov et al. | On the use of polymer-based composites for the creation of optical sensors: A review | |
| CN101791439A (zh) | 医用钛合金植入物表面生长因子缓释系统的构建方法 | |
| CN108602022A (zh) | 制备聚甲基丙烯酸甲酯（pmma）膜的方法及其应用 | |
| CN109457472A (zh) | 一种纤维素纳米纤维水凝胶及其制备方法 | |
| Yan et al. | Multifunctional-imprinted nanocomposite membranes with thermo-responsive biocompatibility for selective/controllable recognition and separation application | |
| Pei et al. | Cellulose-based hydrogels with excellent microstructural replication ability and cytocompatibility for microfluidic devices | |
| CN110818801A (zh) | 一种基于单层多孔膜的卵清蛋白的固定化方法 | |
| Zhang et al. | Cloud-point PEG glass surfaces for imaging of immobilized single molecules by total-internal-reflection microscopy | |
| Leonardo et al. | Addressed immobilization of biofunctionalized diatoms on electrodes by gold electrodeposition | |
| Skopinska‐Wisniewska et al. | PEG‐dialdehyde–the new cross‐linking agent for collagen/elastin hydrogels | |
| CN106754859B (zh) | 一种透明质酸混纺纳米纤维固定酶的制备方法 | |
| CN115216034A (zh) | 丝蛋白/溶菌酶可转移蛋白质纳米薄膜或涂层及其制备 | |
| CN109735036B (zh) | 一种基于ws2纳米片的变色防伪材料及其制备方法 | |
| CN110075352B (zh) | 表面化学改性的杂萘联苯聚芳醚腈骨植入材料及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200221 |