CN110799518B - 钴胺素衍生物及其用于治疗因缺乏维生素b12供应引起的疾病的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及式(I)的钴胺素衍生物及其用于因缺乏维生素B12支持引起的疾病中的用途，其中X是具有选自以下式的配体：‑(CH2)1‑5‑S‑(CH2)0‑3‑CH3、‑S‑(CH2)1‑5‑NH2或其中R1＝H、甲基或乙基，和R3＝‑H或

Description

钴胺素衍生物及其用于治疗因缺乏维生素B12供应引起的疾病 的用途
哺乳动物利用B12或钴胺素衍生物作为两种酶(即甲硫氨酸合成酶和甲基丙二酰-CoA变位酶)的辅因子。甲硫氨酸合成酶催化高半胱氨酸甲基化形成氨基酸甲硫氨酸，同时伴有5-甲基四氢叶酸再生为四氢叶酸。该反应严格依赖于甲基钴胺素(MeCbl)。需要四氢叶酸来支持嘌呤和嘧啶的生物合成，因此其对于细胞增殖和稳态是至关重要的。甲基丙二酰-CoA变位酶是胆固醇分解过程中产生的甲基丙二酰CoA、支链氨基酸和奇数链脂肪酸的交换所，其将甲基丙二酰-CoA转化为琥珀酰-CoA，其支持能量代谢。甲基丙二酰-CoA变位酶的反应严格依赖于5’-脱氧腺苷钴胺素(AdoCbl)。由于哺乳动物缺乏从头合成钴胺素的能力，它们进化出吸收膳食B12的两种生物活性辅因子形式(MeCbl和AdoCBl)的策略。
为了向哺乳动物细胞中充分供应钴胺素，钴胺素必须首先从食物中转运到体细胞，其次哺乳动物有机体必须能通过适当的胞内加工途径来使用钴胺素，这严格依赖于CblC酶(也称为MMACHC，B12分子伴侣，和CblC分子伴侣)的活性。B12的吸收及其随后在体内的分布由一系列复杂的载体蛋白、受体和转运蛋白介导，并且可以描述B12从食物到体细胞的相关途径。B12在胞外流体中的转运依赖于三种同源的载体蛋白，即内因子、钴胺传递蛋白(也称为钴胺传递蛋白II)和钴胺素结合蛋白(haptocorrin，也称为R-蛋白或钴胺传递蛋白I)。胃肠道摄取途径障碍是非膳食诱导的B12缺乏症的最常见诱因(Nielsen et al.,NatureReviews(2012),345-354).
已有报道称在老年人中，潜在的维生素B12缺乏症可能与进行性脑萎缩相关。高半胱氨酸浓度的适度升高可能与痴呆(尤其是阿尔茨海默病)风险升高相关。维生素B12缺乏症的诱因可能有若干不同原因。一个可能原因是因维生素B12膳食摄入不足引起，因此高风险组包括一般素食主义者、绝对素食主义者和老年人。另一个原因可能是因壁细胞的内在因子缺乏引起的维生素B12吸收不良，因胃酸不足或因药物相互作用而导致的维生素B12从食物中的摄入收到干扰。其它原因可见于例如肠切除、热带口炎性腹泻或克罗恩病的肠病中。
对于细胞中的维生素B12加工，有非常罕见和常染色体隐性遗传形式的钴胺素病。钴胺素病被分类为若干个不同的互补组。通常，突变导致生物合成MeCbl和AdoCBl的生物化学途径存在缺陷该病表现为高半胱氨酸尿症和甲基丙二酸尿症。CblC将进入细胞的钴胺素加工为普通中间体cob(II)alamin/cob(I)alamin。CblC中的突变代表最常见的钴胺素代谢的先天障碍(Gherasim et al.,The Journal of Biological Chemistry,vol.290(2015)pp 11393-11402)。
本发明的目的是提供含硫钴胺素衍生物，其可有助于治疗由以下原因引起的维生素B12相关缺陷：从食物摄入到需要维生素B12的细胞中的维生素B12不足，B12的转运和胞内加工途径的遗传缺陷或其它干扰。这样的钴胺素衍生物可特别地具有改善的生物活性。
本发明中所述的含硫钴胺素衍生物的用途与维生素B12缺乏症相关，所述维生素B12缺乏症是由以下引起的：1)患有使转运和胞内钴胺素利用受损的遗传代谢病的患者；2)暴露于低维生素B12摄入的个体(极端贫困和严格的素食主义者/绝对素食主义者)；3)老人。这些类别的受试者可因胞内CblC-钴胺素加工机制及其下游的酶反应增强而受益。
患有钴胺素代谢遗传缺陷的患者属于CblC组，其表现出甲硫氨酸合成酶和甲基丙二酰-CoA变位酶受损，这与基因产物MMACHC(对于丙型甲基丙二酸尿症和高半胱氨酸尿症)一致。已建议将该蛋白重命名为氰钴胺素脱氰酶(Kim et al.,PNAS(2008)pp 14551-14554)。Hannibal等人(Molecular Genetics and Metabolism(2009)pp 260-266)报道了来源于具有突变cblC蛋白的患者的细胞系不能以与正常皮肤成纤维细胞系相同的程度加工烷基钴胺素。
本发明中所述的化合物是含硫钴胺素，其特征在于Co-S或Co-C轴向键，其通过增强正常CblC酶的活性、通过修复CblC蛋白的致病变体或通过替换缺少的CblC蛋白来发挥作用。
维生素B12衍生物也称为钴胺素，其在B12酶中具有重要作用。钴胺素结构是具有六个结合Co3+离子的配位点的配位复合物，所述Co3+离子与四吡咯咕啉环中的四个氮原子以赤道方式相连(ligated equatorially)，并且在上面的β位和下面的α位与配体轴向相连。α-位配体从核苷酸碱基5,6-二甲基苯并咪唑(DMB)的氮原子与Co配位，所述核苷酸碱基通过核苷酸结构连接至咕啉环。复合物可以三种钴氧化态存在，即Co(III)、Co(II)和Co(I)。钴胺素具有如下所示的式(I)。
在式(I)中，可结合到β-位的可能配体由“X”表示。重要的β-配体是氰钴胺素(CNCbl(III))中的氰基(CN-)、水钴胺素(H2OCbl(III))中的水(H2O)、甲钴胺素(MeCbl(III))中的烷基(如CH3-)以及腺苷钴胺素(AdoCbl(III))中的5-脱氧腺苷，以上是B12依赖型人源酶的辅因子。
本发明提供了具有维生素B12的结构式的含硫钴胺素衍生物，然而，其中的配体X具有不同的含义。这样的钴胺素是有用的，因为它们在治疗各种维生素B12缺乏症方面具有改善的功效。本发明提供式(I)的钴胺素衍生物：
其中X是具有选自以下式的配体：
-(CH2)1-5-S-(CH2)0-3-CH3、-S-(CH2)1-5-NH2或
其中R1＝H、甲基或乙基，R3＝-H或/>
在特别优选的实施方式中，式(I)的钴胺素具有以下配体：
X＝-S-CH2-CH2-NH2，-CH2-S-CH3或-CH3-CH2-S-CH3。
本发明的钴胺素衍生物可用于治疗与维生素B12支持减少相关的疾病。这些疾病可能因罕见的cblC基因遗传缺陷引起，其显示高半胱氨酸尿症和甲基丙二酸尿症或细胞中维生素B12正确利用受损的其它情况。或者，钴胺素衍生物可用于治疗没有足够维生素B12支持的老年患者。此类人通常显示心智受损(诸如痴呆或阿尔茨海默病)的迹象。
本发明的钴胺素衍生物可以口服应用制剂来应用，其中药物制剂优选被制成在小肠和结肠释放药物活性成分。优选的是具有耐酸性包衣的片剂或胶囊。在片剂或胶囊通过胃之后，由于pH值的变化，包衣在肠道中溶解并在小肠中释放出高浓度的活性成分。这可通过用具有一个或多个根据pH溶解的膜层进行包衣来实现。优选地，这样的包衣是聚合物，其是耐酸性的，并且在约5.8-7.0的pH溶解。
或者，钴胺素衍生物可以肠胃外应用制剂形式(如注射液)来应用。由于本发明的钴胺素衍生物在光的作用下容易分解，优选提供冻干形式的注射液，其可通过在马上使用前加入无菌水或缓冲液来复液。冻干钴胺素衍生物的容器可避光保护。
在可替代的实施方式中，本发明的钴胺素衍生物可作为食物补充剂提供。食物补充剂可包含颗粒形式的钴胺素，其还包含添加剂如载体或基质助剂。优选的实例是淀粉、卡拉胶、瓜尔胶或糖(如乳糖、果糖或蔗糖)。
在进一步的实施方式中，本发明提供了一种制备式(I)的钴胺素衍生物的方法：
其中X配体具有如下定义：
-(CH2)1-5-S-(CH2)0-3-CH3，-S-(CH2)1-5-NH2或
其中R1＝H、甲基或乙基，R3＝-H或/>
优选使用如羟钴胺素盐酸盐之类的可商购钴胺素作为起始材料。羟钴胺素盐酸盐与具有硫醇基团的配体结构(如半胱胺或巯丙酰甘氨酸)或具有含反应性C的基团的配体结构(如例如氯-甲基-甲基硫醚或1-氯-2-甲基硫烷)反应。所有合成优选在仅红光条件下进行，这是因为硫醇钴胺素(thiolatocobalamin)和烷基钴胺素二者都可能有光敏感性。通常合成在需氧条件下进行。
本发明的钴胺素衍生物的优点在于改善的生物活性。因此，钴胺素衍生物可用于治疗与钴胺素支持减少或细胞加工步骤中钴胺素加工减少相关的疾病。本发明的钴胺素衍生物可用于治疗影响CblC的遗传病。疾病还可能因维生素B12摄入减少而引起。
在进一步的实施方式中，本发明的钴胺素衍生物可用于治疗维生素B12缺乏症，所述维生素B12缺乏症本身通过多种神经系统表现来表达，诸如感觉异常、皮肤麻痹、协调障碍和神经传导速度降低。在老年人中，潜在的维生素B12缺乏症可与进行性脑萎缩相关。已观察到高半胱氨酸血浆浓度升高与区域性脑萎缩和全脑萎缩相关，不仅在阿尔茨海默病而且在健康老年人中也是如此。
对于认知受损的治疗，在口服给药或肠胃外给药中进行选择是重要的。应理解，肠胃外给药维生素B12是有效的，因为特别是对于老年人，吸收不良(经常是影响维生素B12利用的肠道疾病或病症)起重要作用。因此，可能需要肠胃外施用。然而，肠胃外给药比口服给药更困难，这是因为需要经过医学训练的人如医生或护士。本发明的钴胺素的优点，即改善的生物活性和生物利用度，允许以口服应用制剂来应用钴胺素衍生物。
本发明的钴胺素衍生物可用于认知功能衰退的老年人。此外，其可用于治疗抑郁症，在老年人中这也经常与低维生素B12状态以及高半胱氨酸和甲基丙二酸水平升高相关。本发明的钴胺素衍生物也可用于治疗阿尔茨海默病或避免阿尔茨海默病的风险，因为高半胱氨酸水平升高与阿尔茨海默病风险相关。因此，本发明的钴胺素衍生物不仅可用于治疗还可用于预防痴呆或阿尔茨海默病。
本发明的含硫钴胺素化合物是指显示出以下性质的Co-S和Co-C键合的钴胺素，所述性质与某些国家(如日本)所用的现有治疗形式包括羟钴胺素(HOCbl)和氢钴胺素(CNCbl)和甲钴胺素(MeCbl)相比更为优越，即：
·碱进式(base-on))到碱退式(base-off)转换的pKa更高；
·钴中心还原的氧化还原电位更高；和，
·β-轴配体更容易去除。
此外，相对于硫醇钴胺素谷胱甘肽钴胺素(GsCbl)，本申请中所述的钴胺素化合物具有以下优点：
·极好地修复了钴胺素加工酶CblC的致病变体的酶活性；
·在cblC人成纤维细胞中持久地减少毒性MMA。
发明详述
在以下描述中，所用的缩写具有以下含义：
本发明涉及特征在于Co-S或Co-Cn-S-R轴向配位的新的含硫钴胺素衍生物的合成，所述衍生物具有以下性质：(a)碱进式转换为碱退式构型的pKa增加，(b)中间点电位更高，和(c)易去除β-轴配体。
选择并合成本发明中的某些β-轴配体以提供键合相互作用，这将补偿CblC蛋白异常变体的功能丧失，该功能丧失是由于导致疾病的天然突变。优选的半胱胺和巯丙酰甘氨酸部分中的官能团提供了与CblC蛋白的钴胺素结合位点中的氨基酸残基形成额外氢键的机会(相比于现有治疗形式HOCbl或CNCbl)，这对于恢复CblC的致病变体中的结合和酶活性是非常重要的。类似地，本发明中含硫的Co-C-连接的钴胺素是天然辅因子甲钴胺素的类似物，经证明为必不可少的钴胺素加工酶CblC的优选Co-C底物。
碱进式到碱退式构型的平衡
在生理pH下，所有钴胺素以碱进式构型存在，其中α-轴配体二甲基苯并咪唑经由氮原子配位到钴中心。在图1中提供了钴胺素从碱进式向碱退式转换的路线图。图1示出了碱进式和碱退式构型的氰钴胺素(可以口服补充剂以及注射液的治疗形式获得)。这一转换的pKa是0.10。这一pH在生理条件下难以达到。
这种转化需要高酸性pH，这在细胞环境中是不可能实现的。表1显示了若干β配体的pKa值。
从表1中可以看出，β-轴配体的性质对碱进式到碱退式平衡的pKa具有深远的影响。该性质与本发明有关，因为新的钴胺素衍生物特征在于碱进式向碱退式转换的pKa更高，这增加了它们的生物活性。这种生物活性增加是指加工酶CblC的野生型和致病变体利用新钴胺素作为底物生成活化中间体的能力更高，所述中间体被递送至受体钴胺素依赖性酶：甲硫氨酸合成酶和甲基丙二酰-CoA变位酶。
形成细胞生物活性cob(II)alamin和cob(I)alamin的氧化还原电位
Cb1化学中与其在生物系统中的行为相关的另一方面涉及钴中心还原的中点电位，这对于经由还原机理进行的后续加工(去除β轴配体)是非常重要的，包括通过还原性谷胱甘肽(GSH)进行的亲核攻击。表2显示了对生物活性Cbl的中点氧化还原电位的总结。
表2.所选择的钴胺素或钴啉醇酰胺(Cbi)的氧化还原电位
钴胺素的β-轴配体的去除
膳食钴胺素的β-轴配体(在图2中标记为“X”)的破裂是人利用微量营养素必不可少的步骤。这一步骤由酶CblC催化。图2示出了钴胺素的结构。钴胺素是在以钴为金属中心的咕啉大环中组装成的四吡咯。钴胺素具有七个侧链，即，乙酰胺和丙酰胺。来自二甲基苯并咪唑部分的氮原子占据了第五个轴配位位置(α-配体)。第六个配位位置(在本文中称为'X')被称为β-配体，其可被不同类型的配体占据。天然存在的配体包括甲基(甲钴胺素)、5-脱氧腺苷(腺苷钴胺素)、羟基或水(羟钴胺素，水钴胺素)、氰基(氰钴胺素)、谷胱甘肽基(谷胱甘肽钴胺素)等。
本文所公开的新的配体连接到位置X，从而保留钴胺素的结构以得到最佳结合和通过钴胺传递蛋白来转运。除了小的可更换配体(诸如例如亚硫酸盐、亚硝酸盐和咪唑)之外，Co-S和Co-C键合的钴胺素需要在细胞中进行酶加工，以变为具有生物活性和适合于完成受体酶甲硫氨酸合成酶(MS)和甲基丙二酰-CoA变位酶(MCM)的酶反应。CblC蛋白在所有膳食钴胺素的胞内加工中均具有不可或缺的作用：CblC产生钴胺素的碱退式构型，这又升高了钴中心还原的氧化还原电位，从而通过反向弱化作用(由碱退式构型介导)和容易的还原性消除(由升高的氧化还原电位介导)促进β-轴配体的消除。在具有突变CblC蛋白的患者中，这种热力学和动力学上吸能的反应被阻断，导致钴胺素加工失败，随即导致高半胱氨酸和甲基丙二酸(两种B12依赖性酶MS和MCM的底物)增加。本发明中所述的新的含硫钴胺素衍生物经化学“引发”了自主的生物活性，从而绕开了重要蛋白CblC。
本文所述的钴胺素衍生物具有自主的、增加的生物活性。
本文所述的新一代维生素B12衍生物呈现如下特性：其不仅对治疗患有cblC病症的患者有利，而且还对治疗患有其他维生素B12遗传病(诸如cblA、cblB、cblD、cblF、cblJ、cblX、mut、cblG)的个体有利或对其进行有利的补充。这包括对携带涉及维生素B12代谢的任何基因中的突变的母亲的胚胎和胎儿进行宫内治疗，以作为胚胎形成和早期发育期间的预防措施。新的生物活性钴胺素也可适于为老人(患有自然的、年龄相关的维生素B12吸收不良)、患有与年龄或膳食相关的维生素B12利用度差的神经疾病的患者和其微量营养素的膳食摄入可能低于最佳健康所需的一般素食主义者和绝对素食主义者提供补充或治疗。而且，某些硫醇钴胺素在氧化应激条件下对细胞存活率的积极作用表明除了本文中所述的具体作用之外，新设计的化合物还有其他的生理学优点。
实施例1:特征在于Co-S键形成的配体(硫醇钴胺素)。硫醇钴胺素衍生物的合成。
如针对其他硫醇钴胺素所述的，从水钴胺素(或羟钴胺素，二者均为cob(III)alamin)与1.3-1.9当量的相应配体以相似的方式进行的反应来制备新的硫醇钴胺素。
可商购的羟钴胺素盐酸盐作为水溶液(通常10-15％)提供。将羟钴胺素盐酸盐溶液与配体反应，其中所有的合成在仅红光条件下进行，这是因为硫醇钴胺素的光敏感性。
图3示出了具有半胱胺(左)和巯丙酰甘氨酸(右)结构的两种示例性配体，半胱胺和巯丙酰甘氨酸。半胱胺是可商购的用于治疗胱氨酸病的氨基硫醇。巯丙酰甘氨酸是可商购的。这些氨基硫醇经由配体取代反应与水钴胺素反应形成相应的硫醇钴胺素。
反应于室温或在冰上在正常条件下避光进行。用冷丙酮(-20℃)沉淀分离硫醇钴胺素，随后用冷丙酮清洗，真空过滤，并于60℃干燥过夜。Cbl产物的纯度通过1H-NMR、质谱和通过将使用本领域标准程序转化成二氰钴胺素来测定。新合成的Cbl衍生物使用HPLC进一步纯化。一直要使样品避光，因为Co-S键对光不稳定。
实施例2:特征在于Co-C键形成(烷基钴胺素)的配体。含甲基硫醚的甲钴胺素类似物的合成。
如图4中所示的氯甲基甲基硫醚和氯乙基甲基硫醚在暗红色光下与用硼氢化钠预先还原的cob(I)alamin厌氧反应，如针对其他烷基钴胺素所述的。图4示出了氯-甲基硫基-甲烷(左)和1-氯-2-甲基硫基-乙烷(右)的结构。这两种卤化含硫烃与超亲核试剂cob(I)alamin反应产生相应的烷基钴胺素衍生物。卤素用作这些反应中的离去集团。添加过量配体，并使反应混合物于室温反应10分钟。用冷丙酮沉淀Cbl产物，清洗，并于60℃干燥过夜。Cbl产物的纯度通过1H-NMR、质谱和通过使用标准程序转化为二氰钴胺素来测定。当纯度低于95％时，新合成的Cbl衍生物使用HPLC纯化。一直避光保护样品。
实施例3:紫外-可见光光谱法。
新合成的钴胺素衍生物的紫外-可见光光谱在EPPS缓冲液(40mM,pH7.6,I＝1.0M，含有三氟甲磺酸钠)中测量。水钴胺素与半胱胺和巯丙酰甘氨酸的反应通过对包含固定量的水钴胺素(10-25μM(微摩尔))和不同浓度的配体的反应混合物进行时间分辨光谱扫描来测定。
巯丙酰甘氨酸容易与水钴胺素在pH 7.2反应形成稳定的MPGCbl复合物。实测的反应速率kobs)显示与配体巯丙酰甘氨酸的浓度的线性相关。
将固定浓度的水钴胺素与不同浓度的MPG反应。反应通过时间分辨紫外-可见光光谱法监测总共50分钟(图5)。光谱变化与水钴胺素经由涉及无可检测反应中间体的机理转化为MPGCbl(图5a)的光谱变化一致。分析最初和最终的光谱以证实硫醇钴胺素产物的真实性(图5b)。在每种类型物质的最大吸收处(350nm,H2OCbl+，和372nm,MPGCbl)产生时程(图5c)。
图6示出了实测反应速率(kobs)与用于形成MPGCbl的巯丙酰甘氨酸配体在缓冲液EPPS(40mM,pH 7.2,I＝1.0M)中的浓度的相关性。
图7示出了实测反应速率(kobs)与用于形成CyaCbl的半胱胺配体在缓冲液EPPS(40mM,pH 7.2,I＝1.0M)中的不同浓度的相关性。
半胱胺容易与水钴胺素在pH 7.2反应形成稳定复合物。实测反应速率(kobs)显示与配体半胱胺的浓度的线性相关。
重要的是，新的Cbl衍生物的浓度依赖性反应速率与针对其他硫醇钴胺素所报道的那些是非常一致的。
钴胺素 K[M-1s-1] 条件
MPGCbl 39,71 pH 7.2,I＝1,三氟甲磺酸钠
CyaCbl 28,66 pH 7.2,I＝1,三氟甲磺酸钠
GSCbl 20,74 pH 7.2,I＝1,三氟甲磺酸钠
GSCbl 18,09 pH 7.72,I＝0.5,KNO3
CaptoprilCbl 24,7 pH 7.72,I＝0.5,KNO3
表3示出了与已知的硫醇钴胺素相比CyaCbl和MPGCbl(本发明)的形成速率。
实施例4:新Cb1衍生物的pKa碱进式(/-碱退式构型。
钴胺素从碱进式转换到碱退式构型，其紫外-可见光光谱经历了显著偏移，对其进行研究以测定这种转换的pKa。使用通用型缓冲液混合物，记录了不同pH下的钴胺素衍生物的紫外-可见光光谱。对于Co-S键合的钴胺素，碱进式转换为碱退式的pKa通过在生理范围内的不同pH下的停流法测定，使用人CblC蛋白作为引起转换的试剂。硫醇钴胺素经历了质子催化的分解(伴有硫醇盐配体的丢失)，因此不能使用标准技术测定其pKa。
紫外-可见光光谱在图8中显示。新合成的硫醇钴胺素显示了与先前合成的Co-S结合型物质相同的光谱特性。CyaCbl和MPGCbl的最大吸收出现在370nm和531nm，符合先前所述的Co-S钴胺素的特性。
图8示出了MPGCbl和CyaCbl在40mM EPPS(pH 7.6)中的紫外-可见光光谱。每种钴胺素的最大吸收与先前公开的硫醇钴胺素吻合。
吸收系数在表4中显示。还使用分光光度法测定了摩尔消光系数。该值显示在表4中。GSCbl用作正对照，代表了已知并且充分表征的硫醇钴胺素。
表4.CyaCbl、MPGCbl和GSCbl的吸收系数，使用水作为溶剂。其显示了主要吸收带和与每次测量相关的误差。
实施例5:钴胺素中点(氧化还原)电位的测定。
使用光谱化学技术和电化学技术测定新合成的Cbl的中点电位。与已充分研究的钴胺素相比，MeCbl和CNCbl的氧化还原电位用作这些测量的标准物。
实施例6:Co-C和Co-S衍生物的结晶。
为阐明新的Cbl衍生物的分子结构，获得了适合于X射线晶体学分析的晶体。将Cb1衍生物(50-100mg/mL)设置在丙酮-蒸汽扩散小瓶中，使用如文献报道的多种pH、盐和温度。
通过在丙酮中的蒸汽扩散，于4℃避光成功地生长了CyaCbl和MPGCbl的晶体(图9)。添加CsCbl有利于形成尺寸适合于x-射线分析的晶体。在有和没有丙酮蒸汽扩散的情况下均合成了CyaCbl的晶体；然而，MPGCbl的晶体仅在丙酮蒸汽扩散下生长。以晶体纯形式分离本发明的化合物的能力构成了进一步治疗开发的优势。质谱分析证实了合适的分子质量，如下所示：对于MPGCbl，[M/2+1]，m/z＝765；和对于CyaCbl，m/z＝722。
图9示出了在不同试验条件下生长的CyaCbl和MPGCbl的晶体。最初的晶体是红色的。
实施例7:在生理学相关的低分子量硫醇存在下Co-C和Co-S衍生物的β-轴配体的稳定性。
通过时间分辨紫外-可见光光谱法检验了在过量GSH、Cys和Hcy存在下新合成的Cbl衍生物的稳定性。利用了这些细胞硫醇的相关浓度，例如，1-10mM GSH(还原型谷胱甘肽)。
使用分光光度法研究了新设计的化合物的反应性，其为与主要的胞内低分子量硫醇谷胱甘肽结合的Co-S或Co-C型。在pH 7.4和需氧条件下未观察到反应，表明新合成的钴胺素在近生理条件下是稳定的。
实施例8:与生物学相关蛋白还原酶的反应性。
使用分光光度法评估了新的Cbl衍生物对非专用细胞还原酶的反应性。简言之，将新的钴胺素与新的还原酶1(NR1)、甲硫氨酸合成酶还原酶(MSR)和黄素氧还蛋白还原酶(FLDR)以及合适的辅因子(NADPH、NADH、FAD等)一起厌氧孵育。分别通过在450和467nm形成吸收带来检测Co-S或Co-C键合的钴胺素向cob(II)alamin或cob(I)alamin的转化。
实施例9:新的钴胺素衍生物与钴胺传递蛋白(TC)和与CblC的结合。
由于维生素B12的细胞摄取需要与钴胺传递蛋白结合和通过钴胺传递蛋白受体CD320识别TC-B12复合物，因此测定合成的Cbl衍生物是否与牛重组TC和人TC结合。结合测定法和亲和力测量使用紫外-可见光光谱法和凝胶过滤法进行。收集包含TC的级份，并使用分光光度法测定结合钴胺素的存在。到目前为止，所有测试的钴胺素均与TC稳定结合，并且相应的TC·Cbl复合物以可观的速率和产量被培养细胞摄入，如在现有治疗剂HOCbl和CNCbl中所见的那样。
新的化合物的生物活性中的一个重要方面是其结合加工酶CblC的能力和经历向碱退式构型转化的能力，这提高了它们的反应性。这是维生素B12代谢的所有胞内途径中的重要步骤，所述维生素B12代谢的胞内途径与cblC疾病的发病机制相关，并且当然与cblC疾病本身相关。例如，在人类中为致病性的cblC蛋白突变变体可以用新的生物活性钴胺素进行挽救，条件是它们的内在化学优于膳食同工型MeCbl、AdoCbl和HOCbl。在pH 7.6(EPPS缓冲液，0.04M)下进行结合研究，并通过紫外-可见光分光光度法进行分析。从图10可以看出，CyaCbl或MPGCbl与人野生型CblC的结合诱导了它们的碱退式构型。这表明所选的β-配体不会破坏蛋白质稳定结合新的钴胺素的能力。
图10.CyaCbl和MPGCbl与人野生型CblC在7.0下的结合。碱进式CyaCbl或MPGCbl(黑色细迹线)与CblC的结合诱导了其相应的碱退式构型(粗迹线)。
实施例10:新的钴胺素衍生物与CblC蛋白的野生型和突变变体型的结合。
新的Cbl衍生物与野生型和突变CblC的结合通过紫外-可见光光谱法检验，如针对天然Cb1同工型所述的那样。结合亲和力通过等温滴定量热法(ITC,Microcal)或微量热泳(MST,Nanotemper)测定。
MPGCbl产物在丙酮沉淀和真空过滤后的紫外-可见光光谱分析显示，至少一部分的这种Cbl衍生物可以其碱退式构型存在，即使在不存在CblC蛋白的情况下也是如此(图11)。该图的左图示出了在丙酮沉淀和真空过滤之后MPGCbl在水中的紫外-可见光光谱。右图示出了当与CblC蛋白结合时MPGCbl的真实碱退式光谱。这表明由于轴配体的供电子效应，在不存在CblC蛋白的情况下，MPGCbl可自行满足其碱进式向碱退式的转换。这一发现与患有CblC基因全部缺失从而显示出cblC疾病最严重表型的患者特别相关。
图11.溶解在水中的新鲜纯化的MPGCbl与结合到人重组CblC蛋白的MPGCbl的碱退式构型之间的光谱相似性。
实施例11:CblC活性测定。
检验了新合成的Cbl衍生物用作CblC底物的能力(图12)。CblC活性通过紫外-可见光光谱法根据公开的操作测量。反应产物的分析通过质谱进行。我们分别通过野生型和突变型CblC蛋白对Co-C和Co-S-键合的Cbl衍生物的脱烷基和脱硫醇作用进行测量，以测定在携带具有低酶活性或无酶活性CblC异构体的患者中是否可以支持这些反应。
图12.与CyaCbl或MPGCbl在GSH存在下结合到人CblC的反应相关的光谱变化。反应在不到10秒内完成。初始光谱显示为浅灰色迹线。在两种情况下，反应的产物都是结合到人CblC蛋白的H2OCbl+。
实施例12:候选前药的细胞表征。
在我们的培养对照和cblC突变型人类成纤维细胞集合中检测了显示出有前途的生化活性的Cbl衍生物。来自对照(健康新生儿受试者)或cblC成纤维细胞的培养细胞不补充外源Cbl(阴性对照)、补充市售CNCbl(现有治疗剂对照)或补充新合成的钴胺素(测试组)。通过监测条件培养基中的疾病生物标志物即代谢物Hcy和MMA的水平来检验在不存在CblC的情况下这些化合物支持胞内Cbl代谢的能力。
在与用于检测MeCbl和AdoCbl的脱烷基作用的相同实验条件下，评估CblC在CyaCbl和MPGCbl作为底物存在下的酶活性。值得注意的是，CyaCbl和MPGCbl的脱硫醇反应比用MeCbl和AdoCbl进行的脱硫醇反应快几个数量级。反应在不到10秒的时间内完成，这是将结合CblC的CyaCbl或MPGCbl与5mM GSH混合后记录第一张光谱所花费的时间。这些结果表明，在由CblC蛋白进行酶加工方面，新的钴胺素衍生物具有显著提高的生物活性。
图12示出了CyaCbl和MPGCbl在支持人重组CblC酶反应中的生物活性的评价。
实施例13:使用新药物的放射性衍生物恢复胞内钴胺素代谢。
合成含(57Co)的物质以用作胞内Cbl谱图的Cb1源，即将新的(57Co)-硫醇-或(57Co)-含硫烷基钴胺素转化为57Co-AdoCbl和57Co-MeCbl，如在先前的公开出版物Hannibalet al.(Mol.Genet.Metab.(2009)p.260)中描述的那样。
实施例14:与使用本领域中可得的羟钴胺素的研究相比，用新的Co-S或Co-C钴胺素治疗后的cblC蛋白质组检查。
文献中的先前的蛋白组学研究表明，从患有cblC疾病的患者分离出的皮肤成纤维细胞蛋白质组对现有治疗剂CNCbl或HOCbl的治疗反应较差。进行了一项使用SILAC(细胞培养物中氨基酸的稳定同位素标记)的全球蛋白组学研究以比较当前疗法(羟钴胺素/氰钴胺素)相对于候选新药将cblC细胞蛋白质组恢复为从健康新生儿受试者分离的细胞表达模式的能力。使用与健康受试者表型相反的cblC表型(或涉及钴胺素输送或加工异常的其他代谢疾病的表型)作为离体治疗成功的量度。
实施例15:相对于先前描述的硫醇钴胺素GSCbl(Co-S模型)和天然辅因子甲钴胺素(Co-C模型)评估CyaCbl、MPGCbl和Me-S-MeCbl的生物活性。
首先，测试了本申请所述的新的钴胺素作为野生型CblC底物和使导致早期发作型cblC疾病的致病性变体(诸如突变体Arg161Gly)丧失的活性恢复的能力。表5示出了用人重组CblC野生型和致病性突变体Arg161Gly进行酶活性测定的结果。
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表5.CblC、野生型和致病突变体Arg161Gly在新的含硫钴胺素存在下在谷胱甘肽(GSH)驱动的反应中的酶活性。
首先，数据表明，含硫烷基钴胺素Me-S-MeCbl和Me-S-EtCbl优于天然辅因子MeCbl及其相应的无硫类似物丙钴胺素和丁钴胺素。实际上，PrCbl和BuCbl不能恢复致病性CblC变体Arg161Gly的酶活性，而本发明中描述的两种新的钴胺素可以支持该反应，从而产生cob(II)alamin作为产物。先前已经描述了在MeCbl和高浓度GSH存在下，突变体Arg161Gly对cob(II)alamin的稳定作用。在本申请中，鉴定了相似的机制，但是具有增加的生物活性，即具有与野生型CblC相当的反应半衰期。
其次，对硫醇钴胺素的分析结果表明，先前报道的硫醇钴胺素GSCbl能够支持CblC、野生型和致病性变体Arg161Gly的反应，但它们比本发明中所述的两种硫醇钴胺素衍生物(即MPGCbl和CyaCbl)的效率低4-5倍。
实施例16:从健康受试者或cblC患者中分离得到的人培养细胞中CyaCbl和MPGCbl的生物活性的评估：对钴胺素缺乏的生物标志物甲基丙二酸的分析。
测量了与现有治疗剂CNCbl相比，用新衍生物CyaCbl和MPGCbl治疗的细胞反应。如先前公开的实验方案中所述，检查了新的钴胺素衍生物CyaCbl和MPGCbl实现代谢控制的能力，即，通过培养物中的cblC成纤维细胞减少例如MMA产生。图13提供了对来自健康受试者(HFF、NHDF、PCS、Wiesel、对照)或来自cblC患者(WG1801、WG2176、WG3354、GM10011、GM02345B、GM02452C)的经培养成纤维细胞给予CNCbl(0.001mM)与相同剂量的CyaCbl或MPGCbl，然后比较效果。从这些结果可以看出，CyaCbl和MPGCbl在将MMA减少到在健康受试者的成纤维细胞中所观察到的水平方面比CNCbl优越得多。
为进行比较，还对硫醇钴胺素CyaCbl和MPGCbl以及含硫烷基钴胺素Me-S-MeCbl相对于不适用于治疗的结构类似物的效果进行了进一步检查。表6提供了针对钴胺素治疗的细胞反应(健康对照和cblC患者成纤维细胞)的结果，通过MMA的水平来体现。
表6示出了使用不同细胞系获得的结果，所述不同细胞系的一部分从患有cblC疾病的患者获得。
总体来说，这些结果显示了以下事件的证据。
(a)使用正规TC转运蛋白及其细胞受体CD320成功地将CyaCbl和MPGCbl转运到细胞中。
(b)CyaCbl和MPGCbl在我们的实验条件下不是细胞毒性的。
(c)CyaCbl和MPGCbl可以比现有治疗剂之一即CNCbl更大程度地促进线粒体MCM的反应。
(d)通过使用CyaCbl或MPGCbl治疗可以恢复维生素B12的线粒体代谢，这一事实表明，新的衍生物在胞液(发生Cbl加工的地方)和在线粒体中(在这里微量营养素是MCM反应所不可或缺的)具有生物活性。
(e)Me-S-MeCbl、MPGCbl和CyaCbl支持CblC致病性变体Arg161Gly(早期发作型cblC疾病)的酶活性，显示与它们相应的抗衡物GSCbl(对于硫醇钴胺素)和MeCbl(对于Co-C含硫钴胺素)相比，β-轴配体被更有效去除。
(f)Me-S-MeCbl与其结构类似物MeCb1相比更大程度地减少MMA，表明这种含硫烷基钴胺素在恢复胞内钴胺素代谢方面显示了优越的活性。与MPGCb1相似，这种含硫烷基钴胺素减少培养基中的MMA积累。
(g)虽然GSCbl可以有效降低cblC成纤维细胞中的MMA浓度，但清除实验表明，与GSCbl相比，用MPGCbl和CyaCbl进行的代谢校正持续时间更长，即防止了在细胞缺乏补充性钴胺素之后有毒MMA的积累(表6)。我们的数据显示，MPGCbl和CyaCbl与其结构类似物GSCbl相比，在随时间维持cblC成纤维细胞中的钴胺素代谢方面表现优越。

Claims (13)

1.式(I)的钴胺素衍生物
其中X是具有选自以下式的配体：
-(CH2)1-5-S-(CH2)0-3-CH3、-S-(CH2)1-5-NH2或
其中R1＝H、甲基或乙基，R3＝-H或/>
2.根据权利要求1所述的式(I)的钴胺素衍生物，其中
X＝-S-CH2-CH2-NH2、-CH2-S-CH3或
-CH2-CH2-S-CH3。
3.药物组合物，其包含根据权利要求1或权利要求2所述的钴胺素衍生物。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其是口服应用制剂。
5.根据权利要求3所述的药物组合物，其是肠胃外应用制剂。
6.食物补充剂，包含根据权利要求1或2所述的钴胺素衍生物和合适的添加剂。
7.制备根据权利要求1所述的式(I)的钴胺素衍生物的方法：
其中将羟钴胺素盐酸盐与具有选自以下式的硫醇反应：
H-S-(CH2)1-5-NH2,
或者与选自以下的经活化的含硫烃反应：
Z-(CH2)1-5-S-(CH2)0-3-CH3
其中Z是离去基团，
随后分离并纯化式(I)产物。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述Z是卤原子。
9.根据权利要求1或2所述的钴胺素衍生物在制备用于治疗B12-相关疾病的药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述疾病由cblC受损引起。
11.根据权利要求9所述的用途，其中所述疾病是年龄相关的心智退化。
12.根据权利要求11所述的用途，其中年龄相关的心智退化是痴呆。
13.根据权利要求11所述的用途，其中年龄相关的心智退化是阿尔茨海默病。
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