CN110787847A - 一种基于dep的微粒换液方法及装置 - Google Patents

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Abstract

本发明属于固液分离提取领域，具体涉及一种基于DEP的微粒换液方法及装置。本发明的基于DEP的微粒换液方法为：以含有微粒的液体A与将拟作为溶剂的液体B构建同速同向的双层均匀液流，以层流效应确保两种液体不相混合；沿着液流方向垂直插入2枚及以上的电极构成的阶梯电极，呈阶梯状等距排列，相邻电极两两之间分别接入交流的的正负极；液体A内的微粒流经电极时被极化，受到负介电力，使其偏离原始流向的运动轨道，从而实现从溶液A转移至新液B的换液过程。本发明还提供相应的装置及其制备方法。本发明基于DEP的微粒换液方法避免了传统离心机换液的种种缺陷，并具有便捷高效、效果良好的优点。

Description

一种基于DEP的微粒换液方法及装置
技术领域
本发明属于固液分离提取领域，具体涉及一种基于DEP的微粒换液方法及装置。
背景技术
当前微流控芯片借助其成本低、设备小等优点被广泛应用到医学领域。特别是微流控技术还具有消耗样品量少、有较高的分辨精度及灵敏度、易于集成及微型化等优点被广泛地应用于细胞处理的研究中，并表现出良好的发展前景。
在细胞实验的操作过程中，为了得到特定的样本，需要对细胞进行换液与清洗。例如在细胞培养和流式细胞检测等实验中，换液步骤十分重要。目前，人们常使用离心的方式进行换液，例如悬浮细胞，通常需要多次重复实施离心-吸液-加液-吹打步骤。在对细胞进行离心操作时，受离心力和流体静压力的作用，细胞的活性、内部结构、转录模式等会受到一定的影响。而液体如果长时间高转速离心，细胞容易破裂，极易导致细胞的死亡；但液体如果离心时间短、转速低，细胞又很难沉淀到底部，在吸除废液时，很容易造成细胞的损失。而且，离心换液的操作时间一般较长，操作步骤繁琐，很难提高效率，并进一步实现自动化。同时，细胞长时间暴露在空气中，也容易引起细菌、支原体污染。另外，采用离心方式换液还需要使用离心机，而离心机在运行过程中会产生很大的震动，震动会影响到整个系统装置的稳定性，甚至会使其他设备无法正常工作。除了离心换液方法，人们还会采用过滤法进行换液操作。过滤换液方法主要是使用微米级过滤网对样本进行处理，但此方法中使用的过滤器容易出现堵塞从而干扰实验的进行。并且，在一些实验测试中我们需要连续地多次提取微量样本，离心法和过滤法均无法高效的实现目的。
因此，人们需要一种高效、便捷、可微量处理的细胞清洗、换液装置及方法。
发明内容
针对现状，本发明提供一种基于DEP的微粒换液方法及装置。
介电泳(dielectrophoresis or DEP)是指介电质在非均匀电场中被极化而产生的运动现象。介电泳存在于非均匀电场中，无需微粒带电，非均匀电场可以用交流电来构建。介电泳中，细胞的运动取决于细胞与周围介质的相对极化程度。当细胞极化程度高于流体的极化程度时，细胞做正介电泳，向场强高的地方运动；反之做负介电泳，向场强低的地方运动。
本发明提供一种基于DEP的微粒换液方法，其为：以含有微粒的液体A与将拟作为溶剂的液体B构建同速同向的双层均匀液流，以层流效应确保两种液体不相混合；沿着液流方向垂直插入2枚及以上的电极，第一个电极尖端没入液体A构成的流层，最后一个电极尖端没入液体B构成的流层，两者之间的电极长度为等差数列，呈阶梯状等距排列，相邻电极两两之间分别接入交流的的正负极；液体A内的微粒流经电极时被极化，受到负介电力(nDEP)，使其偏离原始流向的运动轨道，从而实现从溶液A转移至新液B的换液过程。
其中，所述构建同速同向的双层均匀液流，通过在一均匀流道的一端设置对称的两个入口，并在流道另一端相应位置设置两个出口，通过两个入口分别同速度注入两种溶液来构建。
其中，所述流道，优选设置为片状。
其中，所述微粒为直径1-30微米的粒子，可为细胞、聚苯乙烯微球等。
本发明还提供用于所述基于DEP的微粒换液方法的装置，其为由流道和阶梯电极共同构成的片状结构；所述流道以两个入口、两个出口和主流道组成，两个入口在主流道的一端且基于主流道流向对称设置，两个出口在主流道另一端与入口相对的位置；所述阶梯电极由两枚或以上的电极组成，第一个电极尖端没入液体A构成的流层，最后一个电极尖端没入液体B构成的流层，两者之间的电极长度为等差数列，呈阶梯状等距排列，相邻电极两两之间分别接入交流电的正负极。
其中，所述主流道长度5mm-15mm，主流道宽度0.5mm-1.5mm，主流道厚度1-1000μm。
其中，所述入口和所述出口为矩形或梯形的条状结构，宽度1mm-2mm。
其中，所述流道的总长度为15mm-20mm，流道总宽度4mm-5mm。
其中，所述交流电，频率为80kHz-1MHz，电压为0.1Vpp-100Vpp。
其中，所述用于所述基于DEP的微粒换液方法的装置，可以多种材料制备，例如PDMS(聚二甲基硅氧烷)、PMMA等。
其中，所述用于所述基于DEP的微粒换液方法的装置，可以塑料与激光键合技术，3-D打印技术等技术制备。
本发明还提供制备基于DEP的微粒换液方法的装置的方法，其为以常规芯片制备方法制备具有基于DEP的微粒换液方法的装置特有结构的芯片。
本发明还保护所述基于DEP的微粒换液方法在微粒清洗中的应用，其为将常规微粒清洗过程中的离心、过滤等步骤替换为基于DEP的微粒换液方法。
本发明与现有技术相比，有益效果为：
传统的细胞换液方法多采用离心法，但离心机由于体积大，震动感强烈难以集成在小型工作系统中。微流控芯片具有成本低，外形小巧，可塑性高，便于集成化的优点，本发明基于微流控芯片设计出新型细胞清洗与换液方法，避免了传统离心机换液的种种缺陷，并具有便捷高效、效果良好的优点。此前使用离心法的换液操作步骤繁琐，使用条件要求比较高，而这种基于微流控芯片的细胞清洗与换液方法大大减少了操作步骤，微型化的芯片模型适用范围更广，更有利于设计系统化、集成化的细胞处理一体化设备。
综上，基于介电泳的细胞清洗与换液方法制成的微流控芯片具有以下创新及优点：
(1)可自动化效率高：直接通过泵自动实现细胞的换液和清洗，无需像离心机一样手动将液体去除和加入，费时与费力
(2)可以微量样本换液(如5uL)和清洗，且保证较高的收获率(97％)。
(3)介电泳法避免离心时高速旋转产生的机械应力对细胞产生潜在的破坏
(4)此芯片无复杂机械结构，易于制造与量产。
附图说明
图1为本发明基于DEP的微粒换液装置的结构示意图。
图2为实施例2中微粒的受力分析图。
图3为实施例2中的电场仿真图。
图4为实施例2中添加流程后的电场仿真图。
图5为实施例3中流出芯片的两种液体在40倍显微镜下的照片。
图6为实施例4中流出芯片的两种液体在40倍显微镜下的照片。
其中，1流道，11为入口，12为出口，13为主流道，2为阶梯电极，3为交流电，41为负介电力，42为水流推力，43为液体阻力，44为微粒的运动方向，51为液体A，52为液体B，6为15微米的荧光微球，7为Hela细胞。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1装置的制备
根据图1的结构制备本发明基于DEP的微粒换液装置。本发明的基于DEP的微粒换液装置是一个微流控芯片，制备使用硅片及SU-82015光刻胶作为微流控芯片的模板，需要制作光学掩膜版。光学掩膜版是微纳加工技术常用的光刻工艺所使用的图形母版，由不透明的遮光薄膜在透明基板上形成掩膜图形结构，再通过曝光过程将图形信息转移到产品基片上，本实施例使用菲林胶片作为掩膜版。
本实施例使用4英寸硅片晶圆作为芯片的模具基底，首先对硅片进行清洁，plasma处理2分钟，使用的SU-8 2015光刻胶需经过水浴30°加热。之后将光刻胶倾倒在硅片中心，进行匀胶(500rpm 10s，1000rpm30s)操作。
静置10分钟后，95℃软烘5分钟，进行14s曝光，95℃后烘6分钟。之后，将硅片晶圆显影5分钟，清洗干净后150℃坚膜12分钟，即制备完成。
由于使用负胶进行制作，被紫外光线照射的区域形成“凸起”的结构，黑色圆形阵列会使这个“凸起”结构上形成“凹槽”阵列。
本发明的基于DEP的微粒换液装置是一个微流控芯片，可用材料广泛，比如聚二甲基硅氧烷(PDMS)，塑料与激光键合技术，3-D打印技术等等。
本实施例中选取了PDMS作为微流控芯片的基底。PDMS是一种高分子有机硅化合物，具有光学透明，在一般情况下表现惰性，无毒无害，不易燃，其广泛运用在生物微机电中的微流道系统领域。未经加热的PDMS呈粘稠液体状，在实验室中取用20g PDMS，并按10:1比例添加硬化剂，充分搅拌3分钟后，以抽真空的方式使混合液中的气泡浮至表面并破裂，再倒入硅片晶圆制成的模具中。使用气吹将表面的气泡吹去，然后将覆盖PDMS的模具放在120℃的加热台上，直至PDMS凝固为固态。之后，用超声波清洗载玻片。
使用真空氧等离子体键合方法，使PDMS与载玻片结合，这样便形成了一个内含孔道与微柱阵列，包裹良好的板状结构。
此时，本发明基于DEP的微粒换液装置的微流控芯片制作完成，其结构如图1所示：由流道1和阶梯电极2共同构成的片状结构；所述流道以两个入口11、两个出口12和主流道13组成，两个入口在主流道的一端且基于主流道流向对称设置，两个出口在主流道另一端与入口相对的位置；所述阶梯电极2由两枚或以上的电极组成，第一个电极尖端没入液体A构成的流层，最后一个电极尖端没入液体B构成的流层，两者之间的电极长度为等差数列，呈阶梯状等距排列，相邻电极两两之间分别接入交流电3的正负极。
其中，所述主流道长度5mm-15mm，主流道宽度0.5mm-1.5mm，主流道厚度1-1000μm。
其中，所述入口和所述出口为矩形或梯形的条状结构，宽度1mm-2mm。
其中，所述流道的总长度为15mm-20mm，流道总宽度4mm-5mm。
其中，所述交流电，频率为80kHz-1MHz，电压为0.1Vpp-100Vpp。
下面开始对其进行性能测试。
实施例2原理实验
使用COMSOL Multiphysics物理仿真软件对此芯片进行仿真测试，观察此模型结构的电场仿真结果、流场仿真结果。
微粒在装置中的受力分析图见图2，微粒在阶梯电极2的作用下受到负介电力41，负介电力41、水流推力42和液体阻力43的共同作用下，微粒的运动方向44见图2。绘制模型结构，芯片的电极区域的电场仿真如图3中的(A)所示，在物理场中选择施加电压±5V，频率100kHz，从仿真结果可以看出相邻两电极间有强烈电场存在。图3中的(C)每一根曲线对应图3中的(B)的每一根截线，表示在该截线位置的电场强度平方的大小，粒子会向场强减弱的方向移动。
在物理场中添加流场，仿真结果如图4中的(A)、图4中的(B)所示，两种浓度不同的液体基本不会发生明显的混合。在实验中，A液体51与B液体52从左侧上下分别以5μL/min注入，由于上下流速相同会发生层流效应，两种液体不相混合，如图4中的(C)所示。层流效应使出口处两种液体的分界线仍然在芯片的中间位置，保证了粒子清洗与换液操作中的液体不受污染。
实施例3应用实验——聚苯乙烯微球实验
在实验中，将使用此芯片对15微米的荧光微球作换液处理。
将芯片放置在电子显微镜上，左侧两通道为入口，使用搭建在微泵上的针管，分别通入DI水、微球水溶液，流速为1～10μL/min。芯片右侧为出口，导出流经芯片的两种液体。40倍显微镜下观察现象如图5中的(A)、图5中的(B)、图5中的(C)。
从实验现象可以看出，15微米的荧光微球6在芯片内会按照阶梯电极倾斜方向移动，而两种液体会因层流现象不会发生混合，最终微球会从一种液体中转移向另外一种液体，从而实现换液操作，根据出口处收集细胞统计收获率达98％。
实施例3应用实验——Hela细胞实验
将使用此芯片对Hela细胞作换液处理。
将芯片放置在电子显微镜上，左侧两通道为入口，使用搭建在微泵上的针管，分别通入荧光标记的Hela细胞培养液、PBS溶液，流速为1～10μL/min。芯片右侧为出口，导出流经芯片的两种液体。40倍显微镜下观察现象如图6中的(A)、图6中的(B)、图6中的(C)。
从实验现象可以看出，Hela细胞7在芯片内会按照阶梯电极倾斜方向移动，而两种液体会因层流现象不会发生混合，最终细胞会从一种液体中转移向另外一种液体，从而实现换液操作，根据出口处收集细胞统计收获率达97％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种基于DEP的微粒换液方法，其特征在于，其为：以含有微粒的液体A与将拟作为溶剂的液体B构建同速同向的双层均匀液流，以层流效应确保两种液体不相混合；沿着液流方向垂直插入2枚及以上的电极，第一个电极尖端没入液体A构成的流层，最后一个电极尖端没入液体B构成的流层，两者之间的电极长度为等差数列，呈阶梯状等距排列，相邻电极两两之间分别接入交流的的正负极；液体A内的微粒流经电极时被极化，受到负介电力，使其偏离原始流向的运动轨道，从而实现从溶液A转移至新液B的换液过程。
2.权利要求1所述基于DEP的微粒换液方法，其特征在于，所述构建同速同向的双层均匀液流，通过在一均匀流道的一端设置对称的两个入口，并在流道另一端相应位置设置两个出口，通过两个入口分别同速度注入两种溶液来构建。
3.权利要求2所述基于DEP的微粒换液方法，其特征在于，所述流道，设置为片状。
4.权利要求1-3任一项所述基于DEP的微粒换液方法，其特征在于，所述微粒为直径1-30微米的粒子。
5.用于权利要求1-4任一项所述基于DEP的微粒换液方法的装置，其特征在于，其为由流道和阶梯电极共同构成的片状结构；所述流道以两个入口、两个出口和主流道组成，两个入口在主流道的一端且基于主流道流向对称设置，两个出口在主流道另一端与入口相对的位置；所述阶梯电极由两枚或以上的电极组成，第一个电极尖端没入液体A构成的流层，最后一个电极尖端没入液体B构成的流层，两者之间的电极长度为等差数列，呈阶梯状等距排列，相邻电极两两之间分别接入交流电的正负极。
6.权利要求5所述用于所述基于DEP的微粒换液方法的装置，其特征在于，所述主流道长度5mm-15mm，主流道宽度0.5mm-1.5mm，主流道厚度1-1000μm；所述入口和所述出口为矩形或梯形的条状结构，宽度1mm-2mm。
7.权利要求5所述用于所述基于DEP的微粒换液方法的装置，其特征在于，所述流道的总长度为15mm-20mm，流道总宽度4mm-5mm。
8.权利要求7所述用于所述基于DEP的微粒换液方法的装置，其特征在于，所述交流电，频率为80kHz-1MHz，电压为0.1Vpp-100Vpp。
9.制备权利要求5-8任一项基于DEP的微粒换液方法的装置的方法，其特征在于，以常规芯片制备方法制备具有基于DEP的微粒换液方法的装置结构的芯片。
10.权利要求1-4任一项所述基于DEP的微粒换液方法在微粒清洗中的应用，其特征在于，其为将常规微粒清洗过程中的离心、过滤等步骤替换为基于DEP的微粒换液方法。
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