CN110779896B - 用于分析粒子的设备和方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及用于分析粒子的设备和方法。为了在此基础上提供分析设备，其中毛细管可以用作测量单元并且其同时允许以高信噪比进行可靠、可再现的测量，本发明建议所述中空通道的内径DH在10μm至60μm的范围内，所述光束有具备最小光束直径DL的径向光强度分布，其中以下关系适用于直径比DL/DH：0.05<DL/DH<2.00，以及进入所述中空通道时，所述光束相对于所述中空通道的纵轴的入射角小于2度。

Description

用于分析粒子的设备和方法
技术领域
本发明涉及一种用于分析粒子的设备，其包含：
·作为测量单元的玻璃毛细管，其具有用于接收或通过含有所述粒子的测试样品的中空通道，所述中空通道具有中空通道纵轴和中空通道内壁，
·用于产生光束的光源和在输入点处的用于将所述光束耦合到所述中空通道中以便照射所述测试样品的光学装置，以及
·用于检测从所述中空通道出射的散射光的检测器。
此外，本发明涉及一种分析粒子的方法，其包含以下方法步骤：
·提供呈玻璃毛细管形式的测量单元，所述玻璃毛细管具有中空通道，所述中空通道具有中空通道纵轴和中空通道内壁，
·将含有所述粒子的测试样品引入所述中空通道中，其中所述测试样品具有折射率ΔnM，
·使用光源生成光束，
·通过在输入点处的光学输入装置将所述光束耦合到所述中空通道中，以便照射所述测试样品，以及
·使用检测器检测从所述中空通道出射的散射光。
背景技术
在流体介质中表征样品的方法是基础医学和生物学研究中的标准实践，并且是医院中许多医学领域的常规诊断方法。
一种常用的方法是流式细胞术，其中分析从粒子散射的光。所要求的设备复杂性低，并且原则上其可用于经济有效的分析。由DE 10 2013 210 259 A1已知一种合适的散射光测量组合件。这里的流量测量单元是呈中空石英玻璃圆柱体的形式，其配备有中心纵向孔。使具有待表征粒子的液体流通过孔并用激光束照射，激光束经由中空圆柱体的包层注入。在圆柱形测量单元周围的各种角度处，布置有吸收散射光的检测器。分析液体中含有的分子或胶体物质，例如关于其大小、质量或结构。
然而，由于背景信号高且信噪比差，这里获得的测量灵敏度经常较低。因此，经常需要观察荧光而不是散射光以获得可以与背景分离的更强的信号。然而，极少有样品粒子会显示出天然荧光，因此在这些情况下需要通过添加荧光基团来制备样品。
使用根据如WO 2016/038015 A1中描述的上述类型的分析设备和分析方法获得了更高的测量灵敏度。这里使用光导中空通道作为测量单元，激发光散射的照射光耦合到其端面中。中空通道位于由石英玻璃构成的光波导的芯中，在径向方向上具有不均匀的折射率分布，使得耦合的照射光在光纤芯中且在一定程度上也是在中空通道自身中沿着中空通道的纵轴通过全内反射传播。
通过中空通道壁射出的散射光利用检测器检测。这被配置为测量例如散射光的相干散射强度、散射光的非相干散射强度、散射光的光谱分布、散射光的空间分布和/或待测量粒子的动态运动。此外，检测器还可以配置成检测通过照射待测量粒子所产生的散射荧光。
限于孔径横截面小于0.2μm2的中空通道填充有含有待研究粒子的液体。光与材料之间的相互作用的性质导致照射光在石英玻璃中仅在很小程度上散射，但是明显更强烈地从液体中存在的粒子散射。散射的测量光由相机捕获并加以处理以进行分析。芯横截面积小以及芯与包层之间的折射率差异大促进了光波导的芯区中的照射光的空间限制并且改进了中空通道的照射。提到了中空通道可以是毛细管的形式。在WO 2016/038108 A1中描述了类似的分析设备和分析方法。
JP 2006-125901 A描述了用于毛细管电泳的方法和设备。所述设备包含多个毛细管，所述多个毛细管包含照射部位，其中照射部位以平面方式布置。为了同时测量大量毛细管，布置毛细管阵列，其中激光照射位置形成共线。划分激光使得每个阵列的两侧都可以用高效激光照射。在一个实例中，384个毛细管经过捆扎以形成毛细管阵列。每个毛细管由石英制成并且在外表面上涂布有碳氟化合物材料，并且总长度为40cm，外径为130μm，且内径为50μm。
US 2014/2960689 A1描述了一种生物样品处理装置，其包含细胞计数站，所述细胞计数站包含成像装置和用于接收显微镜比色皿的平台，以及检测站。在另一个实施例中，描述了毛细管电泳方法，其中填充缓冲液的毛细管悬浮在填充有缓冲液的两个储库之间。在毛细管的两端施加电场。含有一或多种组分或物种的样品通常在高电位端并在电场的影响下引入。可以将毛细管阵列保持在导向器中，并将毛细管的进口端浸入含有样品的小瓶中。在样品被毛细管吸入后，将毛细管的末端从样品小瓶中取出并浸没在缓冲液中，缓冲液可以是在共同的容器中或在单独的小瓶中。样品向低电位端移动。在迁移过程中，样品的组分通过电泳分离。分离后，通过检测器检测组分。当样品仍在毛细管中或在其离开毛细管后，可以进行检测。毛细管的内径可以在约5至300μm的范围内，且优选是约20至100μm。毛细管的长度通常可在约100至3000mm的范围内。其通常由非导电材料构成，因此可以在毛细管上施加高电压而不会产生过多的热量。无机材料如石英、玻璃和熔融石英等可有利地用于制造毛细管。在通过毛细管壁实现激发和/或检测的情况下，特别有利的毛细管是由透明材料构成的毛细管。
技术问题
此类分析方法中的测量速率受到中空通道的孔径横截面的限制。根据WO 2016/038015 A1，这限于小于0.2μm2。与这种狭窄的中空通道相比，具有在几微米范围内的相对大的直径的毛细管不仅可以允许更高的测量速率，而且可以允许多个平行测量和更大粒子的检测。
因此，在分析粒子时使用毛细管作为中空通道，例如，在流式细胞术中，原则上是理想的，但是会引起许多其它技术问题，例如足够高的信噪比，这在现有技术中既没有处理也没有解决。
因此，本发明的目的是提供一种用于分析粒子的设备，其中毛细管可以用作测量单元并且其允许以高信噪比进行可靠、可再现的测量。
此外，本发明的目的是明确提出一种分析粒子的方法，所述方法允许以高信噪比进行可靠、可再现的测量。
发明内容
关于所述设备，根据本发明，这一目的是通过以下事实从上述类型的设备开始实现的：
·所述中空通道的内径DH在10μm至60μm的范围内，
·进入所述中空通道时，所述光束相对于所述中空通道的纵轴的入射角小于2度，以及
·所述光束有具备最小光束直径DL的径向光强度分布，其中以下关系适用于直径比DL/DH：0.05<DL/DH<2.00。
在根据本发明的分析设备中，测量单元被配置为玻璃毛细管，其内孔形成用于接收或通过待分析测试样品的中空通道。将测试样品限制在中空通道中或使其以连续流形式通过中空通道。
在最简单的情况下，玻璃毛细管被配置为由光学均匀的玻璃材料制成的中空圆柱体，使得毛细管壁在径向方向上具有均匀的折射率分布。与已知的测量单元相比，中空通道因此不具有基于全内反射且促成以光波导结构的形式照射中空通道的光导。这种中空圆柱体壁的波导结构可以允许理论上在中空圆柱体轴的横向上无耗散的光引导，并且因此允许在由中空圆柱体内壁形成的内孔中的长距离上的均匀照射。然而，具有均匀折射率分布的毛细管(如此处)通常不会在由毛细管壁形成的中空通道的内部容积中引导任何光。尽管如此，为了实现以高信噪比和高测量灵敏度进行测量，期望光束有效地耦合到中空通道中以及对于应用而言足够低的传输损耗。
因此，在这里呈现的设备中提供了通过选择和调整用于光束引导的设计措施，将光引入到中空通道中，使得在垂直于中空通道的纵轴的平面中形成限定的强度分布(所谓的模式)，其沿着中空通道的纵轴被引导但在物理上固有地由于能量的横向耗散而经历能量损耗。为了使这种能量损耗降到最低，必须确保将光耦合到毛细管的中空通道中，使得以所谓的基模引导大部分功率，特别是功率的最大部分。基模的强度分布一方面与所有其它可能的模式相比有助于中空通道容积的特别均匀的照射，使得可以对待分析的粒子进行特别无故障的测量。另一方面，这确保了光沿着毛细管的纵轴被引导，并且特别是沿着预定的测量距离被引导而具有尽可能低的损耗。其原因在于，与所有其它模式相比，基模的由横向于中空通道的纵轴的能量耗散引起的损耗更低。
此外，优选将光功率注入基模，减少了所谓的“模式混合”的不良影响。在这种情况下，沿着光波导发生从一种模式到另一种模式的光能分布。这导致沿光波导的纵轴在其法向平面内变化的强度分布，其中多种因素使得难以精确地确定强度分布。然而，知道这种强度分布以使得待分析的粒子合格是很有帮助的。
上面提到的设计措施将在下面更详细地说明：
(1)毛细管中空通道中相对较弱的光导导致耦合输入光束的高光学衰减。已经表明，衰减取决于毛细管的内径，并且内径越小，衰减越大。
因此，中空通道的内径DH在10μm至60μm的范围内。在中空通道内径小于10μm的情况下，会发生高光学衰减，这使得难以以高信噪比执行可靠、可重复的测量。因此，优选地，中空通道的内径为至少20μm。中空通道含有待分析的样品粒子，其能够在可用的中空通道容积中自由移动。横向方向(垂直于中空通道的纵轴)的移动性受到中空通道内径的限制。在中空通道内径超过60μm的情况下，容积且特别是粒子在横向方向上的移动性如此大，以至于检测器由于景深有限而难以进行可靠检测。
由光源产生的光束在端面输入点(＝中空通道的端面孔)进入中空通道，并且当其进一步传播通过中空通道时，其从其中所含的样品粒子散射，发射散射光，且因此衰减。散射光由检测器检测。散射光检测可以直接在输入点开始，虽然在输入点处会发生额外的反射和寄生散射效应，使得精确检测和粒子散射评估更加困难。因此，散射光检测优选地开始于在照射方向上观察的输入点的下游，例如，在至少2mm的长度上。
“散射光”在此应理解为意谓通过毛细管壁离开中空通道并由检测器检测的照射光。所述壁对照射光是透明的。
(2)为了将光束从光源传输到输入点，提供光传输装置。这包含例如光纤或用于传输自由光束的光学组件的布置。光束到中空通道中的耦合基本上由光传输装置的数值孔径(以下称为“NA”)和最小光束直径与中空通道内径的直径比决定。在根据本发明的设备中，使用具有相对较小NA的光传输装置。这通过以下事实表明：光束有具备最小光束直径DL的径向光强度分布，最小光束直径DL近似地与中空通道的内径DH一样大；更确切地说，以下关系适用于直径比DL/DH：0.05<DL/DH<2.00，优选地：0.1<DL/DH<1.00，并且尤其优选地：0.2<DL/DH<0.5。
在自由光束的情况下从光束焦点中的束腰宽度以及在光纤馈送的情况下从光纤的光输出端处的芯直径确定最小光束直径DL。
具有最小光束直径DL的平面与中空通道的端面孔之间的距离尽可能小；其优选小于10mm，且理想地为零。
(3)原则上，上述(2)中说明的措施可以通过光束的足够强的聚焦来实现。然而，强聚焦与光束的高发散有关。然而，已经表明，需要较小的发散角，且因此期望光束的聚焦低。如果光束以平角照射在中空通道的端面孔上，则作为入射角的函数，光的一部分在中空通道的内壁处被反射，而另一部分将穿透到毛细管壁中，且以损耗光离开毛细管，具有高度的能量损耗。为了有利于与最大可能的检测长度相关联的高比例的反射光和尽可能低的损耗光，光束在进入中空通道时相对于中空通道的纵轴的入射角小于2度，且优选小于1度。入射角在此定义为中空通道侧接受角(对应于孔径角的一半)。
一方面要求光束直径相对小而另一方面要求发散角小在一定程度上是矛盾的。然而，在根据本发明的设备中这些措施的组合引起上面解释的光束引导，其中高比例的耦合光功率被传递到基模。
在这方面，优选设备的一个实施例，其中玻璃毛细管由石英玻璃组成。
石英玻璃在介于约150nm与3000nm之间的宽波长范围内基本上是透明的。因此，玻璃毛细管允许波长范围从UV到红外的照射辐射，且毛细管壁的散射贡献较小。此外，石英玻璃材料使得即使中空通道的孔径横截面小，也容易实现特别光滑的内壁，这是由于毛细管可以通过热成形来拉伸的温度范围相对较大。毛细管的石英玻璃可以是未掺杂的。其也可含有一或多种掺杂剂。
毛细管的玻璃折射率ΔnK优选地与待根据说明书或其它使用条款吸收的样品的折射率ΔnM匹配。ΔnK优选比ΔnM大，且尤其优选比ΔnM大至少0.1(在每种情况下在532nm的测量波长和20℃的测量温度下测量)。通常将测试样品吸收于水性介质中。对于与空气相比的水的折射率，在文献中给出了约1.33的值(如上所述的测量参数)。石英玻璃的折射率约为1.45，且因此，原则上，由石英玻璃制成的毛细管满足上述优选的尺寸规则ΔnM<ΔnK-0.1。
就中空通道中的低传输损耗而言，已证明有用的是，玻璃毛细管尽可能不弯曲，而且相反，沿其整个长度、尤其至少沿信号检测长度是笔直的。这里的“笔直的”打算意谓这样的轮廓，其中毛细管在信号检测长度的开始和结束处的纵轴的位置在垂直于照射方向的方向上彼此的距离小于1mm。信号检测长度对应于毛细管长度的部分，沿着所述部分进行散射光检测；从输入点起测量，这一部分长度至少为2mm且不超过20cm。
“模式混合”的不良影响也通过毛细管中的弯曲和局部作用的机械拉伸或压缩应力而加剧。通过建立高弯曲刚度和/或足够高的面积惯性矩(特别是由高厚度的毛细管壁引起的)，可以吸收机械应力并抑制弯曲。
另一方面，中空通道壁可以有含散射中心，并且其有助于待由检测器检测的散射光的光学衰减。
因此，如果玻璃毛细管具有壁厚为至少100μm、至少500μm且优选至少1000μm并且壁厚不超过10mm、不超过5mm且优选不超过2mm的中空通道壁，其中中空通道壁具有在径向方向上观察的均匀的折射率分布，则证明是有用的。
在一个尤其优选的实施例中，光学装置被配置为呈多模或单模光纤形式的光纤，所述光纤具有光纤芯和围绕所述光纤芯的包层，并且其中所述光纤具有适用以下关系的数值孔径NA：NA<0.05。
NA非常低的光纤使得能够实现可能的最平坦的入射角，从而有助于提高光束在毛细管中空通道中的耦合效率和引导。
在多模光纤中引导的光模式在测试样品中具有不同的折射率并且不同地衰减。对于单模光纤的单模，可以优化耦合参数，以便获得相对较高的耦合效率，特别是在毛细管的基模中。
尽管如此，如果光纤具有相对于中空通道的内径DH具有以下关系的模场直径DM，则证明尤其在高耦合效率方面是有利的：0.05<DM/DH<2.00，优选：0.1<DM/DH<1.00，且尤其优选：0.2<DM/DH<0.5。
模场直径是用于表征单模光纤中基模的光分布的参数。对于可以通过高斯曲线(Gaussian curve)近似的径向光强度分布，模场直径是光强度的幅度下降到1/e(约37％)的直径。
检测器优选地配置成使得其沿着信号检测长度检测散射光，所述信号检测长度具有距输入点至少2mm且不超过20cm的长度。
对于超过20cm的检测长度，样品体积的均匀照射因沿检测长度的光束衰减而变得更加困难。
就更高的测量精度而言，如果中空通道有具备至少一个扁平部分的内部横截面和/或毛细管有具备至少一个扁平部分的外部横截面，则证明是有利的。
在圆形内部横截面和圆形外部横截面的情况下，检测器检测散射光的测量窗口是弯曲的。曲率导致图像的失真和散射光的不期望的偏转和/或图像中的光学误差，并且必须在分析中加以考虑。如果至少内部或至少外部测量窗口边界表面是平坦的，且特别是如果两个测量窗口边界表面都是平坦的，则便于分析。这通过毛细管壁的一侧或两侧上的扁平部分来实现。一侧或两侧上的扁平部分也可以通过多边形内部和/或外部横截面实现。
在所述设备的一个尤其优选的实施例中，中空通道在具有彼此相对的平坦侧面的板状主体中形成，其中主体的平坦侧面形成毛细管的外壁。
板状主体具有例如矩形形状，特别是显微镜载玻片的形状，并且优选地通过高弯曲刚度来区分。板状主体形成毛细管或毛细管集成在板状主体中。其可以例如在矩形内在纵向方向上延伸。
毛细管通常通过拉长中空圆柱体来生产。在此操作过程中，在中空通道的内壁和毛细管的外壁上都可能形成拉丝痕和其它表面结构，这代表了散射光测量的测量路径中的干扰，并通过反射和散射对测量结果产生负面影响。为了尽可能避免由寄生散射效应和界面引起的窜改，期望中空通道的内壁尽可能光滑，且表面粗糙度限定为平均粗糙深度Ra为小于1nm。
有利地，毛细管的外壁的表面粗糙度也限定为平均粗糙深度Ra为小于1nm。
粗糙深度通过原子力显微镜(AFM)测量。平均粗糙深度由根据DIN 4768(2010)的测量值确定。
关于分析粒子的方法，根据本发明，利用包含以下方法步骤的方法解决上述技术问题：
·使用测量单元，其中所述中空通道的内径DH在10μm至60μm的范围内，
·所述光束有具备最小光束直径DL的径向光强度分布，其中以下关系适用于直径比DL/DH：0.05<DL/DH<2.00，以及
·进入所述中空通道时，所述光束相对于所述中空通道的纵轴的入射角小于2度。
在根据本发明的分析方法中，测量单元被配置为玻璃毛细管，其内孔形成用于接收或通过待分析样品的中空通道。将测试样品限制在中空通道中或使其以连续流形式通过中空通道。
在最简单的情况下，玻璃毛细管被配置为由光学均匀的玻璃材料制成的中空圆柱体，使得毛细管壁在径向方向上具有均匀的折射率分布。与已知的测量单元相比，中空通道因此不具有基于全内反射且促成以光波导结构的形式照射中空通道的光导。这种中空圆柱体壁的波导结构可以允许理论上在中空圆柱体轴的横向上无耗散的光引导，并且因此允许在由中空圆柱体内壁形成的内孔中在长距离上的均匀照射。然而，具有均匀折射率分布的毛细管(如此处)通常不会在由毛细管壁形成的中空通道的内部容积中引导任何光。尽管如此，为了实现以高信噪比和高测量灵敏度进行测量，期望光束有效地耦合到中空通道中以及对于应用而言足够低的传输损耗。
因此，在根据本发明的方法中提供了通过选择和调整用于光束引导的设计措施，将光引入到中空通道中，使得在垂直于中空通道的纵轴的平面中形成限定的强度剖面(所谓的模式)，其沿着中空通道的纵轴被引导但在物理上固有地由于能量的横向耗散而经历能量损耗。为了使这种能量损耗降到最低，必须确保将光耦合到毛细管的中空通道中，使得以所谓的基模引导功率的大部分，特别是功率的最大部分。基模的强度分布一方面与所有其它可能的模式相比有助于中空通道容积的特别均匀的照射，使得可以对待分析的粒子进行特别无故障的测量。另一方面，这确保了光沿着毛细管的纵轴且特别是沿着预定的测量距离被引导而具有尽可能低的损耗。其原因在于，由横向于中空通道的纵轴的能量耗散引起的损耗对于基模来说低于所有其它模式。
此外，优选将光功率注入基模减少了所谓的“模式混合”的不良影响。在这种情况下，沿着光波导发生从一种模式到另一种模式的光能量分布。这导致沿光波导的纵轴在其法向平面内变化的强度剖面，其中多种因素使得难以精确地确定强度剖面。然而，了解此强度剖面有助于使得待分析的粒子合格。
上面提到的设计措施将在下面更详细地说明：
(1)毛细管中空通道中相对较弱的光导导致耦合输入光束的高光学衰减。已经表明，衰减取决于毛细管的内径，并且内径越小，衰减越大。
因此，中空通道的内径DH在10μm至60μm的范围内。在中空通道内径小于10μm的情况下，会发生高光学衰减，这使得难以以高信噪比执行可靠、可重复的测量。因此，优选地，中空通道的内径为至少20μm。
中空通道含有待分析的样品粒子，其能够在可用的中空通道容积中自由移动。横向方向(垂直于中空通道的纵轴)的移动性受到中空通道内径的限制。在中空通道内径超过60μm的情况下，容积且特别是粒子在横向方向上的移动性如此大，以至于检测器由于景深有限而难以进行可靠检测。
由光源产生的光束在端面输入点(＝中空通道的端面孔)进入中空通道，并且当其进一步传播通过中空通道时，其从其中所含的样品粒子散射，发射散射光，且因此衰减。散射光由检测器检测。散射光检测可以直接在输入点开始，虽然在输入点处会发生额外的反射和寄生散射效应，使得精确检测和粒子散射评估更加困难。因此，散射光检测优选地开始于在照射方向上观察的输入点的下游，例如，在至少2mm的长度上。
“散射光”在此应理解为意谓通过毛细管壁离开中空通道并由检测器检测的照射光。所述壁对照射光是透明的。
(2)为了将光束从光源传输到输入点，提供光传输装置。这包含例如光纤或用于传输自由光束的光学组件的布置。光束到中空通道中的耦合基本上由光传输装置的数值孔径(以下称为“NA”)和最小光束直径与中空通道内径的直径比决定。在根据本发明的方法中，使用具有相对较小NA的光传输装置。这通过以下事实表明：光束有具备最小光束直径DL的径向光强度分布，最小光束直径DL近似地与中空通道的内径DH一样大；更确切地说，以下关系适用于直径比DL/DH：0.05<DL/DH<2.00，优选地：0.1<DL/DH<1.00，并且尤其优选地：0.2<DL/DH<0.5。
在自由光束的情况下从光束焦点中的束腰宽度以及在光纤馈送的情况下从光纤的光输出端处的芯直径确定最小光束直径DL。
具有最小光束直径DL的平面与中空通道的端面孔之间的距离尽可能小；其优选小于10mm，且理想地为零。
(3)原则上，上述(2)中说明的措施可以通过光束的足够强的聚焦来实现。然而，强聚焦与光束的高发散有关。然而，已经表明，需要较小的发散角，且因此期望光束的聚焦低。如果光束以平角照射在中空通道的端面孔上，则作为入射角的函数，光的一部分在中空通道的内壁处被反射，而另一部分将穿透到毛细管壁中，且以损耗光离开毛细管，具有高度的能量损耗。为了有利于与最大可能的检测长度相关联的高比例的反射光和尽可能低的损耗光，光束在进入中空通道时相对于中空通道的纵轴的入射角小于2度，且优选小于1度。入射角在此定义为中空通道侧接受角(对应于孔径角的一半)。
一方面要求光束直径相对小而另一方面要求发散角小在一定程度上是矛盾的。然而，在根据本发明的方法中这些措施的组合引起上面解释的光束引导，其中高比例的耦合光功率被传递到基模。
根据本发明的方法的有利实施例可以从从属权利要求中获得。在从属权利要求中给出的方法的实施例基于与根据本发明的设备有关的权利要求中提到的实施例的情况下，应该参考上述关于相应的设备权利要求的陈述以进行补充说明。下面将更详细地解释根据本发明的方法的其它具体实施例。
例如，已证明方法变化形式特别有利，其中测试样品具有折射率ΔnM并且毛细管玻璃具有折射率ΔnK，其中适用以下关系：ΔnM<ΔnK，优选ΔnM<ΔnK-0.1。
毛细管玻璃的折射率ΔnK与待接收样品的折射率ΔnM相匹配。特别地，ΔnK优选地比ΔnM大，且尤其优选地比ΔnM大至少0.1(测量波长：532nm；测量温度为20℃)。通常将测试样品吸收于水性介质中。对于与空气相比的水的折射率，在文献中给出了约1.33的值(如上所述的测量参数)。石英玻璃的折射率约为1.45，且因此，原则上，由石英玻璃制成的毛细管满足上述优选的尺寸规则ΔnM<ΔnK-0.1。
根据本发明的分析设备和根据本发明的分析方法可用于在医学和非医学领域中进行粒子分析，特别是在流式细胞术中。这里，液体通过比色皿，并且分析其中含有的分子或胶体物质，例如关于其大小、质量或结构。在光学分析中，光束聚焦在液流上，从而可以分析单个分子。通过这种方法，可以实现每单位时间的大量测量(每秒超过1000次测量事件)，且因此可以快速实现关于样品的统计上合理的结论。
附图说明
下面参考示例性实施例和附图更详细地解释本发明。个别图式显示如下：
图1：使用根据本发明的设备的流式细胞术的基本测量设置，
图2：在示意图中的端面顶视图中具有中空通道的玻璃毛细管，
图3：用于解释光束耦合到毛细管中空通道中的草图，
图4：解释与中空通道内半径和光束直径相关的耦合效率的图式，
图5：解释有效折射率对中空通道半径的依赖性的图式，
图6：解释毛细管基模的反射角度对中空通道半径的依赖性的图式，
图7：解释数值孔径(NA)对中空通道半径的依赖性的图式，以及
图8：解释光束在中空通道半径上的光学衰减的图式。
具体实施方式
图1显示了使用根据本发明的设备的流式细胞术的基本测量设置。
测量原理是基于对散射光或荧光或由于照射样品粒子而另外发射的光的光学检测。这里的检测可以但不一定必须针对所选位置、所选频率或所选强度进行。通过适当的分析光学装置和算法，可以因此记录所研究的样品粒子的性质，例如尺寸、形状、扩散速率、迁移率或散射横截面。
在图1的测量设置中，使用根据本发明的流量测量单元，其呈具有壁3和中空通道4的石英玻璃毛细管1形式。液体流通过中空通道4，所述液体流含有待表征的样品粒子5。使用呈倍频Nd:YAG激光器形式的光源2照射液体流。波长为532nm的激光通过光纤6引导到石英玻璃毛细管1，并在端面输入点10处作为光束63进入中空通道4。
光纤6被配置为单模光纤。其具有芯61和围绕芯的包层62，其中芯61的折射率高于包层62的折射率，使得激光基本上通过全内反射在芯61中被引导。
芯61的直径为10μm，且模场直径为7μm。
作为单色激光的替代，使用多色激发辐射。
作为单模光纤的替代，使用多模光纤。这也具有芯和围绕芯的包层，其中芯的折射率高于包层的折射率，使得激光基本上通过全内反射在芯61中被引导。
这里的芯的直径为10μm，其中包层与芯之间的折射率阶梯与作为单模光纤的配置相比更高。
毛细管1联接到常规的显微镜设置7，显微镜设置7包含相机8，相机8的焦点或检测层面位于中空通道的中心轴9的区域中，并且通过所述相机8，观察并传递测试样品和其中含有的样品粒子5以用于数据分析。这涉及检测弹性光散射(瑞利散射(Rayleighscattering))，其由样品粒子以与激发频率相同的频率作为散射光发射。由于毛细管1的低衰减，在光纤材料本身中几乎不发生任何背景散射。相机8可以检测散射光的检测长度在2mm与20cm之间。在这一长度上，毛细管1完全笔直地延伸。换句话说，在垂直于照射方向的投影中，毛细管在这一长度的开始和结束处的纵轴9的位置彼此之间的距离小于1mm。
通过作为检测器的sCMOS相机8，可以检测散射光的相干散射强度、散射光的非相干散射强度、散射光的光谱分布、散射光的空间分布和/或待测量的粒子5的动态运动。另外，相机还被配置为检测由照射待测量的粒子产生的散射荧光。
图2示出了呈具有壁3和中空通道4的石英玻璃毛细管1形式的测量单元的端面的示意性顶视图。毛细管壁3由合成制造的、未掺杂的、折射率为1.4607的石英玻璃组成。这个值基于在532nm光波长和20℃测量温度下的测量。除非另有明确说明，否则这些测量条件也用于下面给出的折射率值。
毛细管1的外径为400μm。中空通道4的直径为30μm。中空通道4与毛细管的中心轴9(见图1)以及与激光束63的主传播方向同轴地延伸。包层3没有界面或者会导致任何显著散射的其它结构不连续或不均匀性。
毛细管1通过拉长由合成制造的、未掺杂的石英玻璃构成的中空圆柱体制成。由平均粗糙深度Ra表征的表面粗糙度小于1nm。
图3的草图用于说明输入点10处的激光束63耦合到填充有测试样品的中空通道4中。在进入中空通道4时，光束63相对于中空通道的纵轴9的入射角小于1度。入射角φ(phi)通过求解基模31的光束方程获得。其对应于基模31的中空通道侧接受角(对应于孔径角的一半)，并且同时对应于使用光束模型方法在中空通道4中引导基模的角度。
在图4的图式中，对于其中所述中空通道4经水填充且照射以聚焦在毛细管的端面孔(输入点10)上的高斯光束的形式发生的情况，在532nm波长下的光束63的耦合效率W(以％为单位)相对于作为最小光束直径DL(以μm为单位)的函数的不同半径DH/2(以μm为单位)绘制。水的折射率为1.33，且因此获得了对中空通道壁的折射率阶梯为0.1307。
据此，每个中空通道半径的耦合效率在特定的光束直径下具有显著的最大值。随着中空通道半径的增加，最大值扩大，且同时向更大的光束直径移动。
据此，对于高达约30μm的中空通道半径，获得中空通道内径的约三分之一的最佳光束直径。对于直径比DL/DH，最佳值在0.3的范围内，且使用至少20％耦合效率的极限值。
这表明，最佳耦合不能通过使光束63的束腰达到毛细管内壁的直径而实现，但所述关系遵循取决于毛细管直径的复杂路径。
在图5的图式中，在充水中空通道4的情况下，在532nm波长下的光束的有效折射率Re(neff)相对于中空通道半径DH/2(以μm为单位)绘制。
这个值描述了毛细管基模的传播形状和类型的参数，并且是根据基础色散方程的完全求解计算的。这允许计算相同模式的数值孔径和发散角的说明性变量的曲线，如下面的图6和7所示。在图6的图式中，充水中空通道4的基模的反射角φ(以度为单位)相对于中空通道半径DH/2(以μm为单位)绘制。
这里通过求解基础方程获得角度，所述方程给出neff并且可以转换为这个角度。在光束模型中，角度在这里可以解释为基模的引导光束在通道内被壁反射的角度，且同时，解释为此光束在完全通过之后从毛细管的出射角度。为了以最大效率耦合，入射光也应该以恰好这个角度被引导到毛细管。
在这里可以看出，随着通道直径的增加，反射角度不断减小。这意味着随着毛细管直径的增加而耦合到毛细管中需要逐渐平坦的入射角，以便以恒定的效率耦合到基模中。
在图7的图式中，对于充水中空通道4，基模的数值孔径NA相对于中空通道半径DH/2(以μm为单位)绘制。据此，最佳NA随着中空通道半径的增加而减小，并且在中空通道半径为30μm时达到0.007的值。如在反射角的曲线的情况下，从图中可以看出，随着毛细管直径的增加，待耦合的光的NA必须越来越小，以便以相同的效率耦合到基模中。
在图8的图式中，对于充水中空通道4的情况，在基模内在中空通道4中引导的光强度的光衰减L(以dB/cm为单位)相对于中空通道半径DH/2(以μm为单位)绘制。据此，随着中空通道变窄，衰减迅速增加。对于30μm的中空通道半径，光束的理论衰减约为0.2dB/cm，而对于10μm的中空通道半径，光束的理论衰减约为5dB/cm。
为了进行测量，将待研究的粒子5吸收在水性介质中并作为液滴引入毛细管的一端。通过毛细力的抽吸作用，液体与所含有的粒子一起被吸入毛细管内部，且从而通过利用显微镜成像的测量区域。光纤6的数值孔径被配置成使得激光束2的入射角小于2度。
测试样品以连续流形式被引导通过中空通道4，其中除了通过填充物的定向运动之外，粒子5在中空通道4内的水性介质中自由扩散。同时，通过光纤6，来自Nd:YAG激光器的光束2耦合到中空通道4的孔10中，并用于照射中空通道4中的粒子5。取决于粒子的极化率和尺寸，照射产生荧光和相干和/或非相干光散射。部分散射光和荧光通过毛细管壁3离开中空通道4，并被sCMOS相机8检测到。然后使用软件处理并评估检测到的散射光。
由于激光束的小入射角小于2度且直径比DL/DH为0.3，故未被粒子5散射的激光在中空通道的内壁处被反射并沿着中空通道4被引导。由于这种光引导并且由于中空通道4的内壁的低表面粗糙度，沿着高达约20cm的信号检测长度的光学衰减低，并且这与可以评估的信背比和信噪比有关，使得每个被照射的粒子5能够在信号检测长度内被检测到。
代替以测试样品的连续流操作，中空通道4还提供了对样品体积的一维或二维容纳的可能性，因此待研究的样品粒子5可以在较长测量时间内保持在测量范围内。

Claims (19)

1.一种用于分析粒子的设备，其包含：
·作为测量单元的玻璃毛细管，其具有用于接收或通过含有所述粒子的测试样品的中空通道，所述中空通道具有中空通道纵轴和中空通道内壁，
·用于产生光束的光源和在输入点处的用于将所述光束耦合到所述中空通道中以便照射所述测试样品的光学装置，以及
·用于检测从所述中空通道出射的散射光的检测器，
其中，所述中空通道的内径DH在10μm至60μm的范围内，
其中，所述光束有具备最小光束直径DL的径向光强度分布，其中以下关系适用于直径比DL/DH：0.05<DL/DH<2.00，以及
其中，进入所述中空通道时，所述光束相对于所述中空通道的纵轴的入射角(Ψ)小于2度。
2.根据权利要求1所述的设备，其中，所述玻璃毛细管至少沿信号检测长度是笔直的。
3.根据权利要求1所述的设备，其中，所述玻璃毛细管具有中空通道壁，所述中空通道壁的壁厚为至少100μm，并且壁厚不超过10mm，并且在径向方向上观察的所述中空通道壁具有均匀的折射率分布。
4.根据权利要求1所述的设备，其中，所述玻璃毛细管具有中空通道壁，所述中空通道壁的壁厚为至少500μm并且壁厚不超过5mm，并且在径向方向上观察的所述中空通道壁具有均匀的折射率分布。
5.根据权利要求1所述的设备，其中，所述玻璃毛细管具有中空通道壁，所述中空通道壁的壁厚为至少1000μm并且壁厚不超过2mm，并且在径向方向上观察的所述中空通道壁具有均匀的折射率分布。
6.根据权利要求1所述的设备，其中，所述玻璃毛细管由石英玻璃组成。
7.根据权利要求1所述的设备，其中，所述光学装置被配置成呈多模光纤或单模光纤形式的光纤，所述光纤具有光纤芯和围绕所述光纤芯的包层，并且其中所述光纤具有适用以下关系的数值孔径NA：NA<0.05。
8.根据权利要求7所述的设备，其中，所述毛细管在具有彼此相对的平坦侧面的板状主体中形成，其中所述主体的所述平坦侧面形成所述毛细管的外壁。
9.根据权利要求1所述的设备，其中，所述中空通道有具备至少一个扁平部分的内部横截面和/或所述毛细管有具备至少一个扁平部分的外部横截面。
10.根据权利要求1所述的设备，其中，所述检测器被配置成使得散射光能沿着高达20cm的信号检测长度检测。
11.根据权利要求3所述的设备，其中，所述中空通道壁的内表面的表面粗糙度限定为平均粗糙深度Ra为小于1nm。
12.一种用于分析粒子的方法，其包含：
·提供呈玻璃毛细管形式的测量单元，所述玻璃毛细管具有中空通道，所述中空通道具有中空通道纵轴和中空通道壁，
·将含有所述粒子的测试样品引入所述中空通道中，其中所述测试样品具有折射率ΔnM，
·使用光源生成光束，
·通过在输入点处的光学输入装置将所述光束耦合到所述中空通道中，以便照射所述测试样品，以及
·使用检测器检测从所述中空通道出射的散射光，
其中，使用玻璃毛细管，其中所述中空通道的内径DH在10μm至60μm的范围内，
其中，所述光束有具备最小光束直径DL的径向光强度分布，其中以下关系适用于直径比DL/DH：0.05<DL/DH<2.0，以及
其中，进入所述中空通道时，所述光束相对于所述中空通道的纵轴的入射角(Ψ)小于2度。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述玻璃毛细管具有中空通道壁，所述中空通道壁的壁厚为至少100μm并且壁厚不超过10mm，并且在径向方向上观察的所述中空通道壁具有均匀的折射率分布。
14.根据权利要求12所述的方法，其中，所述玻璃毛细管具有中空通道壁，所述中空通道壁的壁厚为至少500μm并且壁厚不超过5mm，并且在径向方向上观察的所述中空通道壁具有均匀的折射率分布。
15.根据权利要求12所述的方法，其中，所述玻璃毛细管具有中空通道壁，所述中空通道壁的壁厚为至少1000μm并且壁厚不超过2mm，并且在径向方向上观察的所述中空通道壁具有均匀的折射率分布。
16.根据权利要求12所述的方法，其中，使用由石英玻璃构成的玻璃毛细管。
17.根据权利要求12所述的方法，其中，使用呈多模光纤或单模光纤形式的光纤作为所述光学输入装置，所述光纤具有光纤芯和围绕所述光纤芯的包层，并且其中所述光纤具有适用以下关系的数值孔径NA：NA<0.05。
18.根据权利要求12所述的方法，其中，所述测试样品具有折射率ΔnM并且所述毛细管的玻璃具有折射率ΔnK，其中适用以下关系：ΔnM<ΔnK。
19.根据权利要求12所述的方法，其中，所述测试样品具有折射率ΔnM并且所述毛细管的玻璃具有折射率ΔnK，其中适用以下关系：ΔnM<ΔnK-0.1。
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