CN110772505A - 紫草素在制备用于治疗对乙酰氨基酚诱导的急性肝衰竭相关病症的药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种紫草素在制备用于治疗对乙酰氨基酚诱导的急性肝衰竭相关病症的药物中的用途。本发明采用对乙酰氨基酚制备药物肝损伤模型，使用12.5 mg/kg剂量紫草素治疗，可以降低转氨酶水平，减轻炎症反应。本发明采用的紫草素还可以改善肝脏氧化应激损伤，促进抗氧化相关基因MsrA、MsrB1、HO‑1以及SOD2的表达。

Description

紫草素在制备用于治疗对乙酰氨基酚诱导的急性肝衰竭相关 病症的药物中的用途
技术领域
本发明涉及紫草素在制备用于治疗对乙酰氨基酚诱导的急性肝衰竭相关病症的药物中的用途，属于生物医药技术领域。
背景技术
治疗剂量的对乙酰氨基酚(APAP)是一种安全有效的解热药和镇痛药。但是，过量使用APAP则会导致急性肝衰竭，尤其多种复方感冒制剂中均含有APAP，非常容易导致其服用过量。APAP药物过量是我国及欧美国家急性肝衰竭的常见原因之一，在美国的比例更是高达50％以上。
APAP在肝细胞内经过CYP450代谢转化成N-乙酰-对苯醌亚胺(NAPQI)，其与细胞内亲核物质结合进入细胞核，产生细胞毒性作用。过量NAPQI与谷胱甘肽结合，导致谷胱甘肽耗竭，活性氧自由基增加，造成氧化应激损伤，最终导致肝细胞坏死。研究显示，APAP肝损伤与肝细胞线粒体功能障碍，自由基代谢产物增加以及氧化应激密切相关。另一方面，肝细胞坏死继发炎症反应，进一步加重肝损伤，固有免疫应答和炎性反应在APAP诱导的肝损伤中也发挥重要作用。
紫草是一种传统中药，主要活性成分为萘醌结构化合物紫草素，在我国有悠久的药用历史，中医临床主要用于治疗紫癜、血尿、烧伤、湿疹等。现代医学研究发现，紫草素具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等多重作用。紫草素也被证明可以通过降低细胞内谷胱甘肽耗竭并上调超氧化物歧化酶mRNA水平进而发挥神经元保护作用。同时，紫草素亦可通过抑制炎症反应，在自身免疫性肝炎及缺血再灌注肝损伤中发挥肝保护作用，但尚未有其在APAP引起肝衰竭中的作用报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种紫草素在制备用于治疗对乙酰氨基酚诱导的急性肝衰竭相关病症的药物中的用途，紫草素在对乙酰氨基酚诱导的急性肝衰竭中具有抗氧化和抗炎作用。
为解决上述技术问题，本发明提供一种紫草素在制备用于治疗对乙酰氨基酚诱导的急性肝衰竭相关病症的药物中的用途。
进一步地，所述的急性肝衰竭相关病症为氧化应激型肝损伤。
进一步地，所述的急性肝衰竭相关病症为肝脏炎性因子的分泌和表达。
其中，研究表明，紫草素促进抗氧化相关基因MsrA、MsrB1、HO-1以及SOD2的表达。
紫草素抑制NLRP3炎症小体通路，降低炎性因子IL-β的表达。
进一步地，紫草素在治疗对乙酰氨基酚诱导的急性肝衰竭相关病症的药物有效浓度中加入量为12.5mg/kg。
本发明所达到的有益效果：
(1)紫草素在APAP诱导的急性肝衰竭中具有抗氧化作用，抗氧化作用机制为增加甲硫氨酸还原酶活性，清除多余ROS。
(2)紫草素在APAP诱导的急性肝衰竭中具有抗炎作用，能抑制NLRP3炎症小体通路，降低炎性因子IL-β的表达。
附图说明
图1是APAP造模以及紫草素治疗后的血生化及肝组织病理HE染色结果。
图2是小鼠肝组织中GSH、SOD、MDA含量变化情况以及ROS染色结果。
图3是小鼠肝组织中MsrA、MsrB1、HO-1、SOD2、CYP2E1基因的表达以及SOD2蛋白表达情况。
图4是小鼠血清中及肝组织中炎症因子的表达情况。
图5是小鼠肝组织中NLRP3以及TLR9的表达结果。
图6是紫草素对APAP造成的细胞损伤的保护情况。
图7是紫草素对APAP造成的肝细胞氧化应激保护作用。
图8是抗氧化酶和炎症反应相关基因表达结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
本发明中Western blot、实时荧光定量PCR、流式细胞法的具体操作步骤如下：
Western blot：
组织裂解液提取肾脏组织总蛋白，采用BCA法测定蛋白质浓度，取30μg蛋白上样，10％或12％聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS.PAGE)，320mA×1.5h湿转转至PVDF膜上，封闭液室温封闭1h，TBST洗脱后加入一抗，SOD2(Cell Signaling Technology)，NLRP3(CellSignaling Technology)，IL-1β(Cell Signaling Technology)，GAPDH(Cell SignalingTechnology)，4℃孵育过夜。TBST洗膜5次，每次5min，以相应二抗室温孵育1h，TBST洗膜5次。抗原抗体复合物用增强化学发光法(ECL)显示，用伯乐凝胶成像分析系统曝光并扫描，蛋白质定量采用对目的条带进行灰度值分析，以目的条带灰度值/GAPDH灰度值表示目的蛋白的相对表达量。
实时荧光定量PCR(QPCR)：
提取肝脏组织总RNA，用分光光度法测定RNA溶液浓度和纯度。利用逆转录试剂盒(Takara,DaLian)将1μgRNA逆转录成cDNA，按照下面的反应体系检测不同基因的变化情况。
a.反应体系
Figure BDA0002296467690000031
b.PCR热循环参数
Figure BDA0002296467690000032
HE染色：
取小鼠肝脏用生理盐水洗净，吸干水分，取材后常规固定于10％中性甲醛固定液，经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片(厚4-5μm)、苏木素-伊红(H-E)染色，光学显微镜下观察。
活性氧自由基(ROS)测定：
取对数生长期小鼠肝细胞(AML-12)接种于6孔板中，分别给予APAP及紫草素，药物作用24h后，去除细胞培养液，加入1ml 10μmol/L的DCFH-DA，37℃细胞培养箱内孵育20分钟。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。收集细胞后使用流式细胞仪检测。
Annexin V/PI凋亡双染实验：
取对数生长期小鼠肝细胞(AML-12)接种于6孔板中，分别给予APAP及紫草素，药物作用24h后，用无EDTA胰酶消化细胞，以1000rpm转速离心5min，收集细胞，弃掉培养基。用预冷过的PBS溶液洗涤细胞两次，在其中加入400μL1×BindingBuffer悬浮细胞，细胞密度大约为1×106cells/mL。每组细胞悬液分别加入5μL Annexin V和5μL PI，轻轻混匀后室温避光条件下孵育15min。1h内用流式细胞仪检测。
下面通过具体的实施案例详细说明本发明。
实施例1紫草素对APAP诱导的急性肝衰竭后肝功能的影响。
取雄性Balb/c小鼠(23±2g)，分为3组，即对照组，APAP模型组以及紫草素治疗组(n＝10).
对照组：腹腔注射等体积介质(PBS)。
APAP模型组：腹腔注射300mg/kg APAP。
紫草素治疗组：紫草素(12.5mg/kg)提前2h给药，然后给予APAP造模，12h后再给予紫草素(12.5mg/kg)一次，APAP注射24h后取血，留取肝组织。
血液标本在4000rpm 4℃条件下离心10min，采用自动生化仪测定ALT、AST以及LDH等肝损伤指标，实验结果见图1A。图1B为APAP造模后及紫草素治疗后的肝组织切片H&E染色结果。从图中可以看出，APAP造模后，肝组织中转氨酶和乳酸脱氢酶水平显著升高，病理表现为肝脏出血，脂肪变性，坏死性炎症，肝细胞气球样病变和坏死；使用紫草素治疗后，各生化指标显著下降，病理结果亦提示肝损伤得到缓解。
以上结果表明，紫草素可以有效缓解APAP所致的急性肝衰竭。
实施例2紫草素对APAP诱导的急性肝衰竭后肝脏氧化应激能力的影响。
利用QPCR法、western blot法以及ROS测定研究紫草素对APAP诱导的急性肝衰竭后肝脏氧化应激能力的影响。
如图2A所示，利用商品试剂盒测定肝组织中GSH、SOD以及MDA的表达情况。APAP造模后，导致肝中GSH和SOD含量显著降低，MDA水平升高(P<0.05)；紫草素治疗后，有效改善这种改变(P<0.05)。如图2B所示，利用DCH染色法检测肝组织中ROS表达水平，APAP造模后肝中ROS表达显著增加，紫草素治疗后降低ROS水平。
如图3A-E所示，利用QPCR法检测各抗氧化酶的mRNA变化情况，APAP造模后导致肝中MsrA、MsrB1、HO-1、SOD2的降低以及CYP2E1的增加(P<0.05)，紫草素的治疗有效逆转这些改变(P<0.05)。如图3F-G所示，利用western blot法检测肝中SOD2蛋白的表达水平，结果与mRNA变化一致(P<0.05)。
结果表明，紫草素通过抑制氧化应激损伤发挥肝保护作用。
实施例3紫草素对APAP诱导的急性肝衰竭后肝脏炎症反应的影响。
利用ELISA法、QPCR法、western blot法以及免疫组化法研究紫草素对APAP诱导的急性肝衰竭后肝脏炎症反应的影响。
如图4A-B所示，利用ELISA法测定血清中TNF-α、IL-6以及IL-1β的含量变化，利用QPCR法测定肝组织中TNF-α、IL-6以及IL-1β的含量变化，与对照组相比，APAP造模后各炎性因子表达显著升高(P<0.05)，紫草素治疗后显著降低炎性因子的分泌(P<0.05)。如图4C所示，利用免疫组化法检测肝组织中IL-1β的表达，结果与mRNA变化一致。
利用QPCR法、western blot法研究紫草素对APAP诱导的急性肝衰竭后肝脏中NLRP3炎性小体及TLR9的表达变化。
如图5A所示，与对照组相比，APAP造模后NLRP3炎性小体及TLR9的mRNA表达水平显著增加(P<0.05)，紫草素治疗后降低NLRP3炎性小体及TLR9的表达(P<0.05)；如图5B所示，NLRP3炎性小体的蛋白表达变化与mRNA变化一致(P<0.05)。
结果表明，紫草素通过抑制炎性反应发挥肝保护作用。
实施例4紫草素在体外对APAP诱导的肝细胞损伤的影响。
体外应用AML-12细胞(小鼠正常肝细胞系)，选择对数生长期的细胞接种于6孔板中，分别给予APAP及紫草素(5μmol)，药物作用24h后，利用CCK-8和LDH试剂盒及流式细胞仪检测AML-12细胞损伤情况。结果如图6A-B所示，APAP不同浓度刺激后AML-12细胞生长受到抑制，LDH释放增加(P<0.05)，紫草素治疗后，生长抑制情况及LDH释放降低(P<0.05)；如图6C所示，APAP刺激后细胞发生凋亡的比率明显升高，可以观察到约40％的凋亡率，紫草素治疗组与APAP模型组相比，发生凋亡的比率明显降低(P<0.05)。
以上结果表明紫草素在体外能够有效减少APAP所致的肝细胞凋亡作用。
实施例5紫草素在体外对APAP诱导的肝细胞氧化应激及炎性因子分泌的影响。
体外应用AML-12细胞(小鼠正常肝细胞系)，选择对数生长期的细胞接种于6孔板中，分别给予APAP及紫草素(5μmol)，药物作用24h后，检测细胞内GSH和ROS水平。如图7A-B所示，与对照组相比，APAP刺激后AML-12细胞内GSH含量降低，ROS水平增加(P<0.05),紫草素治疗后改善以上变化(P<0.05)。利用QPCR法检测细胞内各抗氧化酶及炎性因子的mRNA的表达情况，结果如图8所示，与体内实验结果一致。
以上结果表明紫草素在体外通过抑制氧化应激损伤及炎性因子分泌进而保护肝细胞免受APAP刺激。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.紫草素在制备用于治疗对乙酰氨基酚诱导的急性肝衰竭相关病症的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征是，所述的急性肝衰竭相关病症为氧化应激型肝损伤。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征是，所述的急性肝衰竭相关病症为肝脏炎性因子的分泌和表达。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征是，紫草素促进抗氧化相关基因MsrA、MsrB1、HO-1以及SOD2的表达。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征是，紫草素抑制NLRP3炎症小体通路，降低炎性因子IL-β的表达。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征是，紫草素在治疗对乙酰氨基酚诱导的急性肝衰竭相关病症的药物有效浓度中加入量为12.5 mg/kg。
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