CN110770340A

CN110770340A - 在宿主细胞中丝氨酸蛋白酶的表达的优化

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Publication number: CN110770340A
Application number: CN201880035779.7A
Authority: CN
Inventors: A·佩尔策; B·凯莱蒂
Original assignee: BRAIN Biotechnology Research and Information Network AG
Current assignee: BRAIN Biotech AG
Priority date: 2017-05-31
Filing date: 2018-05-30
Publication date: 2020-02-07
Anticipated expiration: 2038-05-30
Also published as: EP3630969C0; KR102641645B1; SA519410599B1; BR112019023881A2; AU2018275751A1; US11091751B2; KR20200014380A; IN201947051091A; EP3630969A1; US20200140841A1; WO2018220032A1; EP3630969B1; AU2018275751B2; CN110770340B

Abstract

本发明涉及用于重组产生丝氨酸蛋白酶的方法，包括(a)培养包含一个或多个载体的宿主细胞，其中所述一个或多个载体以可表达的形式编码所述丝氨酸蛋白酶和所述丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂，其中所述丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂相对于所述丝氨酸蛋白酶是异源的，所述培养在其中所述丝氨酸蛋白酶和所述丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂被表达的条件下进行；或(a')培养宿主细胞，所述宿主细胞的基因组以可表达形式编码所述丝氨酸蛋白酶和所述丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂，所述培养在其中所述丝氨酸蛋白酶和所述丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂被表达的条件下进行，其中所述丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂相对于所述丝氨酸蛋白酶是异源的，且其中通过应用CRISPR技术已将所述丝氨酸蛋白酶和/或所述蛋白质抑制剂的编码序列导入宿主细胞基因组；以及(b)将步骤(a)或(a')中表达的丝氨酸蛋白酶从所述宿主细胞分离。本发明还涉及宿主细胞，其包括一个或多个载体，其中所述一个或多个载体以可表达的形式编码丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂。

Description

在宿主细胞中丝氨酸蛋白酶的表达的优化

本发明涉及用于重组产生丝氨酸蛋白酶的方法，包括(a)培养包含一个或多个载体的宿主细胞，其中所述一个或多个载体以可表达的形式编码丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂，其中所述丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂相对于所述丝氨酸蛋白酶是异源的，所述培养在其中所述丝氨酸蛋白酶和所述丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂被表达的条件下进行；或(a')培养宿主细胞，所述宿主细胞的基因组以可表达形式编码所述丝氨酸蛋白酶和所述丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂，所述培养在其中所述丝氨酸蛋白酶和所述丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂被表达的条件下进行，其中所述丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂相对于所述丝氨酸蛋白酶是异源的，且其中通过应用CRISPR技术已将所述丝氨酸蛋白酶和/或所述蛋白质抑制剂的编码序列导入所述宿主细胞基因组；以及(b)将步骤(a)或(a')中表达的所述丝氨酸蛋白酶从所述宿主细胞分离。本发明还涉及一种宿主细胞，其包括一个或多个载体，其中所述一个或多个载体以可表达的形式编码丝氨酸蛋白酶及所述丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂。

在本说明书中，引用了包括专利申请和制造商手册的大量文件。这些文件的公开内容虽然认为与本发明的可专利性无关，但通过全文引用并入本文中。更具体而言，所有参考文件都以相同程度通过引入并入，所述程度就像每个文件是具体且单独地通过引入并入。

在宿主细胞系统中重组产生蛋白质已经彻底改变了生物化学，因为不再需要大量的动物和/或植物组织或大量的生物液来生产大量指定的蛋白质。产生大量所需蛋白质的能力允许其的生化表征、其用于工业过程以及进行商品开发。尽管最期望的蛋白质可以在宿主细胞中方便地产生，某些蛋白质或某些类别的蛋白质仍然难以生产，特别是大量生产。

这类蛋白质的一个实例是蛋白酶，其中一个主要问题是在宿主细胞中在异源表达期间蛋白酶的自降解活性。因此，现有技术以其天然存在的无活性形式将蛋白酶作为酶原表达，随后在适当的时候活化。然而，蛋白酶作为酶原表达也没有完全解决这一问题。由于前肽的蛋白水解(自)切割，仍然存在不期望的蛋白酶活化，这尤其导致宿主细胞内不期望的酶降解级联反应。这种酶降解损害宿主细胞，并从而损害蛋白酶的产品产量。

在现有技术中，已描述了在宿主细胞中表达蛋白酶连同其天然蛋白酶抑制剂的一些实例，以防止由于蛋白水解(自)切割所致的不期望的蛋白酶活化。例如，在WO1998/012211中描述了在其抑制剂(MMPI)存在下，蛋白质基质金属蛋白酶(MMP)的表达。另一个例子是半胱氨酸内肽酶staphopain A及其抑制剂staphostatin A在大肠杆菌中的重组共表达(参见Wladyka et al.(2005),Biochem J.,385,181-187)。然而，并不是所有蛋白酶的天然蛋白酶抑制剂都是已知的。另外，对于丝氨酸蛋白酶，还没有成功建立这种表达系统。

因此，本发明所涉及的技术问题是提供用于在宿主细胞中重组产生几乎任何丝氨酸蛋白酶的改进的手段和方法，并且尤其是进一步提高要重组产生的丝氨酸蛋白酶的产量的手段和方法。

因此，本发明的第一方面涉及重组产生丝氨酸蛋白酶的方法，包括(a)培养包含一个或多个载体的宿主细胞，其中所述一个或多个载体以可表达的形式编码所述丝氨酸蛋白酶和所述丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂，其中所述丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂相对于所述丝氨酸蛋白酶是异源的，所述培养在其中所述丝氨酸蛋白酶和所述丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂被表达的条件下进行；或(a')培养宿主细胞，所述宿主细胞的基因组以可表达形式编码所述丝氨酸蛋白酶和所述丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂，所述培养在其中所述丝氨酸蛋白酶和所述丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂被表达的条件下进行，其中所述丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂相对于所述丝氨酸蛋白酶是异源的，且其中通过应用CRISPR技术已将所述丝氨酸蛋白酶和/或所述蛋白质抑制剂的编码序列导入所述宿主细胞基因组；以及(b)将步骤(a)或(a')中表达的所述丝氨酸蛋白酶从所述宿主细胞分离。

本发明还涉及重组生成丝氨酸蛋白酶的方法，包括(aⁱ)将一个或多个载体导入宿主细胞中，其中所述一个或多个载体以可表达的形式编码所述丝氨酸蛋白酶和所述丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂，其中所述丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂相对于所述丝氨酸蛋白酶是异源的；或(aⁱⁱ)将一个或多个核酸分子导入宿主细胞中，所述一个或多个核酸分子以可表达的形式编码(i)CRISPR核酸酶、(ii)用于将所述丝氨酸蛋白酶插入所述宿主细胞基因组的向导RNA和/或用于将所述丝氨酸蛋白酶的蛋白酶抑制剂插入所述宿主细胞基因组的向导RNA，其中所述丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂相对于所述丝氨酸蛋白酶是异源的，(a)在其中所述丝氨酸蛋白酶和所述丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂被表达的条件下，培养(aⁱ)或(aⁱⁱ)的宿主细胞；以及(b)将步骤(a)中表达的丝氨酸蛋白酶从所述宿主细胞分离。

也可以将CRISPR核酸酶作为蛋白质导入，代替向宿主细胞中导入以可表达形式编码CRISPR核酸酶的一个或多个核酸分子。将蛋白质导入活细胞的方法在本领域中已知。它们包括现有技术中众所周知的将蛋白直接导入细胞的方法，并且包括但不限于微注射、电穿孔、脂质转染(使用脂质体)、基于纳米颗粒的递送，以及蛋白质转导。可将CRISPR核酸酶作为活性酶或酶原导入细胞中。在后一情形中，CRISPR核酸酶在细胞内发生生物化学上的变化(例如，通过水解反应露出活性位点，或改变构象以露出活性位点)，使得酶原变成活性酶。

概括来说，丝氨酸蛋白酶的重组表达表示产生丝氨酸蛋白酶的生物技术过程。这通常通过在宿主细胞中操纵基因表达来实现，使得宿主细胞表达大量的编码丝氨酸蛋白酶的重组基因(即mRNA)。然后将mRNA翻译成氨基酸序列，该氨基酸序列在宿主细胞内进一步加工成丝氨酸蛋白酶，其中其具有可从宿主细胞中分离出来的形式。

术语“丝氨酸蛋白酶”特征在于在其成熟的酶促活性形式具有蛋白水解活性的蛋白，该蛋白属于一个亚组，其成员在其活性中心包含丝氨酸，所述丝氨酸与组氨酸和天冬氨酸一起形成大多数丝氨酸蛋白酶共有的催化三联体(Rawlings,N.D.,Barrett,A.J.(1994),Families of serine peptidases.Meth.Enzymol.244:19-61)。丝氨酸蛋白酶被归类为水解酶。其在真核和原核细胞中普遍发现。根据P1位点的理化性质，已定义了三个主要类型：胰蛋白酶样(优选位于P1处的带正电荷的残基Lys/Arg)、弹性蛋白酶样(位于P1处的小的疏水性残基Ala、Val)或胰凝乳蛋白酶样(位于P1处的大的疏水性残基Phe/Tyr/Leu)丝氨酸蛋白酶。关于P1的称谓，需要注意的是，Schechter和Berger在1967-68年创建了底物的切割位点的位置的一般命名法。切割位点的位置表示在P1-P1'之间的切割位点，沿断裂肽键的N端方向递增编号(P2、P3、P4，等等)。在切割位点的羧基侧，以相同方式递增编号((P1'、P2'、P3'，等等)。本发明的丝氨酸蛋白酶优选为胰凝乳蛋白酶样或胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，并且更优选为胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。

丝氨酸蛋白酶通常最初以前蛋白原的形式在宿主细胞中产生。前蛋白原是初级翻译产物。前缀“前”表示在宿主中初始产生具有N-端信号肽的蛋白，所述N-端信号肽将丝氨酸蛋白酶靶向分泌。这样的信号肽在例如宿主细胞的内质网中在分泌过程期间被切割。信号肽是短的氨基酸序列(优选3-60个氨基酸长)。通过这样的切割，前蛋白原转化成丝氨酸蛋白酶的蛋白原。该蛋白原基本上无酶促活性。尽管部分蛋白原被切割并因而在宿主细胞中变得有活性，该蛋白原是其中根据本发明的第一方面的方法产生的丝氨酸蛋白酶的主要形式。通过将前肽(或也为指定的抑制性肽)从蛋白原上切割下来，可以将蛋白原经酶促处理成成熟蛋白(即酶促活性蛋白)。更具体而言，许多丝氨酸蛋白酶、特别是许多胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的活化需要蛋白水解处理无酶促活性的蛋白原前体。因此，根据本发明，术语“丝氨酸蛋白酶”是指并包括丝氨酸蛋白酶的所有三种形式：前蛋白原、蛋白原和成熟蛋白。

术语“丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂”或“蛋白质丝氨酸蛋白酶抑制剂”特征在于具有抑制丝氨酸蛋白酶的蛋白水解活性的能力的蛋白质或肽。有两种类型的胰蛋白酶抑制剂：Kunitz胰蛋白酶抑制剂(KTI)和Bowman-Birk抑制剂(BBI)。Bowman–Birk蛋白酶抑制剂家族的蛋白质主要在植物中发现，并且这些蛋白质抑制S1家族的丝氨酸肽酶，也抑制S3肽酶。它们由属于MEROPS抑制剂家族I12(IF族)的真核朊酶抑制剂组成。另一组蛋白质丝氨酸蛋白酶抑制剂的成员是一类明确定义的分子，其通常并且优选地以Kunitz结构域(InterPro标识符IPR002223)的存在为特征。Kunitz结构域相对较小，具有约50至60个氨基酸的长度和约6kDa的分子量。Kunitz结构域的结构包括富含二硫化物的的α/β-折叠。该折叠受到3个二硫键的限制。Kunitz结构域的基本结构优选是xxCxxC#xxxCxxxCxxxxxxCxxxxCxx，其中“C”是参与到二硫键中的保守半胱氨酸，并且“#”是活性位点氨基酸残基。Kunitz型蛋白酶抑制剂的实例是抑肽酶(牛胰腺胰蛋白酶抑制剂，BPTI)、蛇毒碱性蛋白酶、哺乳动物间α胰蛋白酶抑制剂、胰蛋白酶抑素(trypstatin)(啮齿类肥大细胞的胰蛋白酶的抑制剂)、在Alzheimer淀粉样β蛋白的交替剪接的形式中发现的结构域、VII型和VI型胶原的α(1)和α(3)链的C末端的结构域、以及组织因子途径抑制剂前体。

例如，苯甲基磺酰氟(PMSF)和4-脒苯基甲基磺酰氟(amidinophenylmethylsulfonyl fluoride)(APMSF)是通用的非蛋白质丝氨酸蛋白酶抑制剂，其通常例如用于制备细胞裂解液。PMSF和APMSF与丝氨酸蛋白酶中的活性位点丝氨酸残基共价结合，从而产生不可逆的酶-(A)PMS复合物。非蛋白质丝氨酸蛋白酶抑制剂，例如PMSF和APMSF，是在结构上不同于本发明的蛋白质丝氨酸蛋白酶抑制剂的化学分子。

蛋白质丝氨酸蛋白酶抑制剂可以不同的方式起作用以抑制丝氨酸蛋白酶的作用。可逆抑制剂通常以多个非共价相互作用与蛋白酶结合，而抑制剂本身不起任何反应。这些抑制剂可以通过稀释或透析除去。可逆抑制剂包括竞争性抑制剂、反竞争性抑制剂(uncompetitive inhibitor)和非竞争性抑制剂(non-competitive inhibitor)。竞争性抑制剂与蛋白酶的活性位点结合，与底物竞争以进入活性位点残基。竞争性抑制剂的一个实例是抑酶肽。竞争性抑制剂的结构通常与天然底物的过渡态相似。底物的过渡态是与丝氨酸蛋白酶最紧密结合的结构。因此，模拟该结构的化合物以比底物(在其初始状态)可以的更高的强度结合丝氨酸蛋白酶，并且不能进行正常的酶促反应。反竞争性抑制剂仅与已经与底物结合时的蛋白酶结合。非竞争性抑制剂以相似的亲和力结合带有或没有结合底物的丝氨酸蛋白酶，并通过变构机制抑制丝氨酸蛋白酶活性。例如，来自大豆的胰蛋白酶抑制剂BBI是非竞争性抑制剂。不可逆抑制剂通过形成共价键特定地改变其特定靶向的活性位点而发挥作用。一旦与抑制剂结合，丝氨酸蛋白酶的活性位点被改变，并且其不再能进行肽键水解。一些抑制剂不与蛋白酶共价结合，而是以很高的亲和力相互作用，使得其不易去除。自杀型抑制剂通常是底物的类似物，其是一类与丝氨酸蛋白酶共价结合的不可逆抑制剂。自杀型丝氨酸蛋白酶抑制剂的一个实例是丝酶抑制蛋白(serpin)家族的蛋白质，其在凝血和炎症中发挥作用。本发明的蛋白质丝氨酸蛋白酶抑制剂优选为可逆抑制剂，并且更优选为可逆的且竞争性抑制剂。

根据本发明，丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂相对于丝氨酸蛋白酶是异源的。这意味着丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂和丝氨酸蛋白酶不是在同一物种中天然表达的。此外，丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂更优选不是丝氨酸蛋白酶(包括任何直系同源物种的丝氨酸蛋白酶)的天然抑制剂。

如本文所用，术语“蛋白质”可替代术语“多肽”使用，其描述了氨基酸的线性分子链，包括单链蛋白质或其片段，优选包含超过30个氨基酸。30个氨基酸以及少于30个氨基酸的氨基酸段将一般仅称为“肽”。依情形，本文中的术语“蛋白质”可以表示成熟蛋白、成熟蛋白的蛋白原或成熟蛋白的前蛋白原。蛋白质可以进一步形成由至少两个相同或不同分子组成的寡聚物。这样的多聚体的相应的更高阶结构相应地被称为同源二聚体或异源二聚体，同源三聚体或异源三聚体等。此外，本发明还涵盖这样的蛋白质的模拟肽，其中氨基酸和/或肽键已被功能性类似物替代。这样的功能性类似物包括除20种基因编码的氨基酸以外的所有已知氨基酸，例如硒代半胱氨酸。术语“蛋白质”和“肽”还指天然修饰的蛋白质和肽，其中所述修饰例如通过糖基化、乙酰化、磷酸化和本领域熟知的类似修饰产生。

宿主细胞可以是原核宿主细胞或真核宿主细胞，后者包括真菌、昆虫、酵母和哺乳动物宿主细胞。

合适的原核宿主细胞包含例如埃希氏菌属(Escherichia)的细菌，诸如源自以下的菌株：大肠杆菌BL21(例如BL21(DE3)、BL21(DE3)PlysS、BL21(DE3)RIL、BL21(DE3)PRARE、BL21codon plus、BL21(DE3)codon plus)、

XL1Blue、NM522、JM101、JM109、JM105、RR1、DH5α、TOP 10、HB101或MM294。其他合适的细菌宿主细胞是链霉菌(Streptomyces)、沙门氏菌(Salmonella)或芽孢杆菌(Bacillus)，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。就本发明而言，大肠杆菌菌株为优选的原核宿主细胞。

合适的真核宿主细胞例如为酵母，诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)或毕赤酵母属(Pichia sp.)(例如巴斯德毕赤酵母(P.pastoris))；昆虫细胞，诸如果蝇(Drosophila)S2或夜蛾(Spodoptera)Sf9细胞；或植物细胞。其他合适的真核宿主细胞是曲霉菌属(Aspergillus spec.)细胞，诸如黑曲霉(Aspergillus niger)细胞。

可以使用的哺乳动物宿主细胞包括人Hela、HEK293、H9和Jurkat细胞、小鼠NIH3T3和C127细胞、COS 1、COS 7和CV1，鹌鹑QC1-3细胞、小鼠L细胞、Bowes黑色素瘤细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

适合于培养原核或真核宿主细胞以表达丝氨酸蛋白酶及其抑制剂的条件是本领域技术人员众所周知的。例如，适合培养细菌的条件是将它们在Luria Bertani(LB)培养基中在通气下生长。为了增加表达产物的产量和溶解度，可以用已知增强或促进两者的合适的添加剂缓冲或补充培养基。大肠杆菌通常可在4至约37℃下培养，确切的温度或温度顺序取决于要过表达的分子。通常，本领域技术人员还知道这些条件可能必须适应宿主的需要和所表达的多肽的需求。在诱导型启动子控制存在于宿主细胞中的载体中的本发明的核酸的情况下，可以通过添加适当的诱导剂来诱导蛋白质的表达。合适的表达方案和策略是本领域技术人员已知的。

取决于宿主细胞及其特定要求，哺乳动物细胞培养可以例如在RPMI或DMEM培养基中进行，该培养基含有10％(v/v)FCS、2mM L-谷氨酰胺和100U/ml青霉素/链霉素。这些细胞可以在5％CO₂、水饱和空气中保持在37℃。

适合昆虫细胞培养的培养基为例如TNM+10％FCS或SF900培养基。昆虫细胞通常在27℃下以粘附或悬浮培养的方式生长。

适合真核细胞的表达方案为本领域技术人员已熟知且可从Sambrook et al.,(2012),Molecular cloning:a laboratory manual,4th ed.,Cold Spring HarborLaboratory Press,New York中获取。

本文所用的术语“一个或多个载体”是指一个或多个核酸(例如DNA)分子，其用作载体以将重组遗传物质人工携带到在其中可以表达它的宿主细胞中。如本文所定义，重组遗传物质包含编码丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂的核酸。在一个或多个载体中，编码丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂的核酸序列可以被组织在同一表达盒或两个不同的表达盒中。本文所用术语“表达盒”是指核酸分子，其形成载体的完整部分并涵盖能够指导编码丝氨酸蛋白酶和/或其蛋白质抑制剂的核酸序列的表达的核酸序列。表达盒通常包含启动子序列，编码要产生的蛋白质的基因和终止子序列，其中所述启动子序列起始表达而终止子序列终止表达。如果所述一个或多个载体包含两个或两个以上表达盒，则能够指导表达的核酸序列在表达盒中可以是相同的或不同的。

于是，根据本发明，所述一个或多个载体可包含或由以下组成：(i)包含一个表达盒的一个载体，所述表达盒能够指导编码丝氨酸蛋白酶及其蛋白质抑制剂的核酸的表达，(ii)包含两个表达盒的一个载体，其中第一表达盒能够指导编码丝氨酸蛋白酶的核酸序列的表达，并且第二表达盒能够指导编码丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂的核酸序列的表达，或(iii)两个载体，每一载体包含一个表达盒，其中第一载体中的表达盒能够指导编码丝氨酸蛋白酶的核酸序列的表达，并且第二载体中的表达盒能够指导编码丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂的核酸序列的表达。在这些选项(i)至(iii)中，选项(ii)和(iii)是优选的，并且选项(iii)是最优选的。

载体可以是游离载体或染色体整合载体。本文所用的游离载体(或游离体载体或非整合型载体)是指在宿主细胞中自主复制的载体以及在染色体外停留的载体。相反，染色体整合载体(或整合型载体)被整合到宿主细胞的染色体DNA中，从而成为宿主细胞基因组的稳定部分。整合型载体可用于实现在宿主细胞中的长期基因表达。在这方面，应理解，至少所述一个或多个载体的全部表达盒优选整合入宿主基因组中，从而在整合后维持对编码丝氨酸蛋白酶及其蛋白质抑制剂的核酸的整个表达的控制。

在优选实施例中，载体是质粒、黏粒、病毒、细菌噬菌体或例如在基因工程中常规使用的其他载体。可以将本发明的编码丝氨酸蛋白酶和/或蛋白质抑制剂的核酸序列插入若干可商购的载体中。该核酸序列也可以插入载体中，从而产生与另一核酸分子的翻译融合。其他核酸分子可以编码促进本发明的丝氨酸蛋白酶的纯化的蛋白质。这样的载体的非限制性实例包括pET32、pET41、pET43。载体还可包含编码一种或多种蛋白质(例如伴侣蛋白)的额外的可表达多核苷酸，以促进正确的蛋白质折叠。

对于载体修饰技术，请参见Sambrook and Russel,2001,Molecular Cloning,4^thed.CSH Press。通常，载体可包含一个或多个用于克隆或表达的复制起点(ori)和遗传系统，一个或多个用于在宿主中选择的标志物(例如抗生素耐药性)，以及一个或多个表达盒。适合的复制起点包括，例如，Col E1、SV40病毒和M13复制起点。插入载体中的编码序列可以例如通过标准方法合成，或从天然原料中分离出来。编码序列与转录调控元件和/或其他氨基酸编码序列的连接可以使用已建立的方法进行。确保在宿主细胞中表达的转录调控元件(表达盒的一部分)是本领域技术人员众所周知的。这些元件包含确保转录起始的调控序列(例如翻译起始密码子，启动子，例如天然相关或异源启动子和/或隔离子(insulator))。其它调控元件可以包括转录和翻译增强子。优选地，本发明的编码丝氨酸蛋白酶和/或蛋白质抑制剂的核酸序列与这样的表达控制序列可操作地连接，所述表达控制序列允许在宿主细胞中的表达。载体还可以包括选择性标志物。选择性标志物的实例包括新霉素、氨苄青霉素、氯霉素、潮霉素、庆大霉素、卡那霉素、利福平抗性等。用于哺乳动物细胞培养的选择性标志物基因包括dhfr、gpt、新霉素、潮霉素抗性基因。转染的核酸也可以扩增以表达大量编码的(多)肽。DHFR(二氢叶酸还原酶)标志物有利于开发携带几百或者甚至几千份感兴趣基因拷贝的细胞系。另一个有用的选择标志物是酶谷氨酰胺合酶(GS)(Murphy等人，1991；Bebbington等人，1992)。使用这样的标记，使细胞在选择性培养基中生长，并选择具有最高抗性的细胞。

载体的非限制性实例包括原核质粒载体，例如pUC系列、pBluescript(Stratagene)、pET系列的表达载体(Novagen)或pCRTOPO(Invitrogen)、λgt11、pJOE、pBBR1-MCS系列、pJB861、pBSMuL、pBC2、pUCPKS、pTACT1以及与在哺乳动物细胞中表达相容的载体，例如E-027pCAG Kosak-Cherry(L45a)载体系统、pREP(Invitrogen)、pCEP4(Invitrogen)、pMC1neo(Stratagene)、pXT1(Stratagene)、pSG5(Stratagene)、EBO-pSV2neo、pBPV-1、pdBPVMMTneo、pRSVgpt、pRSVneo、pSV2-dhfr、pIZD35、Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogene)、pSPORT1(GIBCOBRL)、pGEMHE(Promega)、pLXIN、pSIR(Clontech)、pIRES-EGFP(Clontech)、pEAK-10(EdgeBiosystems)、pTriEx-Hygro(Novagen)和pCINeo(Promega)。可在本文中使用的特定细菌表达载体的非限制性实例为pACYC177、pASK75、pBAD/His A、pBAD/His B、pBAD/His C、pBAD/MCS、pBADM-11、pBADM-20、pBADM-20(+)、pBADM-30、pBADM-30(+)、pBADM-41(+)、pBADM-52、pBADM-52(+)、pBADM-60、pBADM-60(+)、pBAT4、pBAT5、pCal-n、pET-3a、pET-3b、pET-3c、pET-3d、pET-12a、pET-14b、pET-15b、pET-16b、pET-19b、pET-20b(+)、pET-21d(+)、pET-22b(+)、pET-24d(+)、pET-28a、pET-28c、pET-32a(+)、pET-32b(+),pET-32c(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pETM-10、pETM-11、pETM11-SUMO3GFP、pETM-12、pETM-13、pETM-14、pETM-14_ccdB、pETM-20、pETM-21、pETM-22、pETM-22_ccdB、pETM-30、pETM-33、pETM-33_ccdB、pETM-40、pETM-41、pETM-43、pETM-44、pETM-44_ccdB、pETM-50、pETM-51、pETM-52、pETM-54、pETM-55、pETM-60、pETM-66、pETM-70、pETM-80、pETM-82、pGAT、pGAT2、pGEX-3X、pGEX-4T-1、pGEX-4T-2、pGEX-4T-3、pGEX-5X-1、pGEX-5X-2、pGEX-5X-3、pGEX-6P-1、pGEX-6P-2、pGEX-6P-3、pHAT、pHAT2、pKK223-3、pKK223-2、pMal-c2、pMal-p2、pProEx HTa、pProExHTb、pProEx HTc、pQE-16、pQE-30、pQE-31、pQE-32、pQE-60、pQE-70、pQE-80L、pQE-81L、pQE-82L、pRSET A、pRSET B、pRSET C、pTrcHis2A、pTrcHis2B、pTrcHis2C、pTrcHis2LacZ、pZA31-Luc、pZE12-Luc、pZE21-MCS-1和pZS*24-MCS-1。适合在非洲爪蟾(xenopus)胚胎、斑马鱼(zebrafish)胚胎以及各种各样的哺乳动物和禽类细胞中表达蛋白质的另一种载体是多用途表达载体pCS2+。

可以与本发明结合使用的酵母表达载体在本领域是已知的。用于毕赤酵母属(Pichia)的酵母表达载体的实例是pPIC系列或pHIL系列载体。pPIC载体通常使用可用甲醇诱导的AOX1启动子。适用于巴斯德毕赤酵母的质粒载体的实例包括例如质粒pAO815、pPIC9K和pPIC3.5K(全部来自Invitrogen)。

将所述一个或多个载体导入宿主细胞中的方法为本领域技术人员已熟知且例如在Sambrook et al.,(2012),Molecular cloning:a laboratory manual,4th ed.,ColdSpring Harbor Laboratory Press,New York中描述。非限制性实例是转导、转化、接合或转染。转化是这样的过程，通过该过程将供体DNA分子从外部环境中吸收并整合到受体细胞基因组中。转导涉及通过细菌噬菌体将遗传物质从一个细菌转移到另一个细菌。噬菌体充当载体，承载自己的基因组加上来自最近感染的细菌的DNA片段。如果宿主细菌在病毒攻击中存活下来，则可能发生重组。接合是两个细菌细胞之间暂时的直接接触，导致DNA交换。这种交换是单向的，即一个细菌细胞是DNA的供体，并且另一个是受体。以这种方式，基因在现有细菌中横向转移，这与垂直基因转移相反，在所述垂直基因转移中基因会传给后代。转染是通过非病毒方法将裸露或纯化的核酸故意导入细胞的过程。转染尤其可以经以下来进行：使用磷酸钙(即磷酸三钙)、通过电穿孔、通过细胞挤压或通过将阳离子脂质与该物质混合以产生脂质体，所述脂质体与细胞膜融合并将其货物沉积在其内。对于原核细胞的转化，在本领域中经常使用CaCl₂和热激或电穿孔。为了转化酵母细胞，在本领域中经常使用乙酸锂、电穿孔、原生质球、基因枪和玻璃珠。

在一实施方式中，通过CRISPR技术进行的基因组编辑可用于使用II类cas核酸酶(例如cas9或cpf1)稳定调节基因表达和/或位点特异性整合(Shmakov et al.(2015)Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2CRISPR-CasSystems.Mol Cell.2015Nov 5；60(3):385-97)。

在此实施方式中，使用了宿主细胞，该宿主细胞已经通过CRISPR技术进行了基因组编辑，并以可表达的形式编码丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶的异源蛋白质抑制剂。基因组编辑也可以构成本发明方法的部分。在此情形下，将一个或多个核酸分子导入宿主细胞中，该一个或多个核酸分子以可表达形式编码(i)(任选地)CRISPR核酸酶，(ii)用于将丝氨酸蛋白酶插入宿主细胞基因组中的向导RNA和用于将丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂插入到宿主细胞基因组中的向导RNA。所述一个或多个核酸分子可以是如下所述的一个或多个载体。

根据本发明，基因组编辑(也称为基因组工程)使用成簇的规律间隔短回文重复(CRISPR/Cas)系统的核酸酶(在本文中也称为CRISPR核酸酶)。基因组编辑是一类基因工程化，其中可以在细胞基因组中插入、缺失、修饰或取代感兴趣的基因。在本文中，基因组编辑用于插入基因、导入基因至宿主细胞基因组中，该基因以可表达的形式编码丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂。

CRISPR-Cas系统已被开发用于在原核生物和真核生物中进行基因组编辑。生成一小段具有短“向导”序列的RNA，该RNA与基因组中的特定靶向DNA序列连接(结合)(所谓的向导RNA(gRNA)或单向导(sgRNA))。只要满足以下两个条件，gRNA的基因组靶位点就可以是任何～20个核苷酸DNA序列：(i)该序列与其余基因组相比是唯一的；以及(ii)该靶标紧邻前间区序列邻近基序(PAM)存在。PAM序列对于靶标结合是必需的，但是确切的序列取决于使用哪种CRISPR核酸内切酶。CRISPR核酸内切酶及其各自的PAM序列是本领域中已知的(参见https://www.addgene.org/crispr/guide/#pam-table)。因此，gRNA还与CRISPR核酸内切酶(例如Cas9或Cpf1酶)结合。就像在细菌中一样，gRNA用于识别DNA序列，并且CRISPR核酸内切酶在靶向的位置切割DNA。一旦切割完DNA，细胞自身的DNA修复机制(NHEJ或HDR)添加或缺失遗传物质的部分，或通过用定制的DNA序列取代现有片段来对DNA进行改变。因此，在CRISPR-Cas系统中，CRISPR核酸酶在由短(～20个核苷酸)gRNA确定的位点处使DNA中发生双链断裂，然后通过NHEJ或HDR在细胞内修复该断裂。CRISPR-Cas系统可以通过添加多个gRNA而多路复用。经证实，例如，可以通过使用五个不同的gRNA分子和一个CRISPR核酸内切酶将五个不同的同时突变导入小鼠胚胎干细胞中。参见Sanders and Young，NatBiotechnol.2014Apr；32(4):347–355。

可以将用于基因组编辑的核酸分子插入几种可商购的载体中。既包含CRISPR核酸内切酶又包含gRNA的单个载体是可商购的，从而充当了多合一载体。可选地，可以通过使用两个或三个包含CRISPR核酸内切酶和至少两个gRNA的载体来实施本发明的方法。也可能使用只有gRNA的载体，并使用其中CRISPR核酸内切酶已整合到基因组中的细胞。由于仅将一个载体导入细胞中，因此优选使用多合一载体，其表达至少两种gRNA和CRISPR核酸内切酶。可以表达CRISPR核酸内切酶和多达七个gRNA的载体例如描述于Sakuma et al,SciRep.2014；4:5400中。

在本领域中可获得许多单一gRNA空载体(含和不含CRISPR核酸内切酶)。同样，可获得一些空的多重gRNA载体，其能够用于表达来自单个质粒的多个gRNA(含或不含CRISPR核酸内切酶的表达)。最后，也可获得仅表达CRISPR核酸内切酶的载体(参见https://www.addgene.org/crispr/empty-grna-vectors/)。

术语“可表达形式”要求所述一个或多个载体以如下形式携带编码要产生的丝氨酸蛋白酶及其抑制剂的核酸分子：该核酸分子在宿主细胞中被转录成mRNA并翻译成蛋白质。在这方面，应理解，丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶的抑制剂被表达，使得所述丝氨酸蛋白酶的抑制剂在宿主细胞中与所述丝氨酸蛋白酶同时存在并且与所述丝氨酸蛋白酶存在于相同的细胞室内。这可以通过以下来实现：例如在宿主细胞中共表达丝氨酸蛋白酶及其抑制剂和/或通过首先起始丝氨酸蛋白酶抑制剂的表达，使得当丝氨酸蛋白酶的表达开始时，丝氨酸蛋白酶抑制剂在宿主细胞中已经存在。

分离所产生的丝氨酸蛋白酶的方法为本领域众所周知，并且包括但不限于诸如以下方法步骤：离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法(尺寸排阻色谱法)、亲和色谱法、高压液相色谱法(HPLC)、反相HPLC法、圆盘凝胶电泳法或免疫沉淀法，参见例如Sambrook et al.,(2012),Molecular cloning:a laboratory manual,4th ed.,Cold SpringHarborLaboratory Press,New York。

如下文实施例所证实，令人惊讶且有利地发现的是，当丝氨酸蛋白酶与丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂一起表达时，可以显著提高要重组产生的丝氨酸蛋白酶的产量。这一发现基于丝氨酸蛋白酶清创酶(debrilase)和总共十一种不同的异源丝氨酸蛋白酶抑制剂的表达来说明。用全部十一种经测试的抑制剂，清创酶以令人满意的产量产生。证实了I16.001、I20.001、I11.001、I07.001、I05.001、I02.026、I02.013对清创酶产生的有利效果。用抑肽酶获得的清创酶产生的效果最好。因此，已经意外地发现，丝氨酸蛋白酶的抑制剂可以在进化上不同于丝氨酸蛋白酶，但是仍然显著提高了丝氨酸蛋白酶的产品产量。例如，清创酶起源于丝光绿蝇(Lucilia sericata)的幼虫，而抑肽酶则起源于家牛(Bostaurus)的胰腺，并且已意外地发现抑肽酶仍然极大地提高了清创酶的产品产量。抑肽酶是一种胰蛋白酶抑制剂，而清创酶的天然抑制剂尚未被识别出。

根据本发明的第一方面的优选实施方式，通过尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法或疏水相互作用色谱法来分离丝氨酸蛋白酶。

在这些分离技术中，优选尺寸排阻色谱法和离子交换色谱法。

色谱法通常是分离混合物的技术。通常将混合物溶解在一种称为流动相的流体中，该流体携带其通过这样的结构，所述结构保持称为固定相的另一种材料。混合物的多种成分以不同的速度递送，造成其分离。分离基于流动相和固定相之间的差别分割。尺寸排阻色谱法(或分子筛色谱法)是这样的色谱方法，其中按溶液中的分子的大小、在某些情形下按分子重量分离溶液中分子。离子交换色谱法(或离子色谱法)是这样的色谱方法，其基于离子和极性分子对离子交换剂的亲和力将其分离。亲和色谱法是一种基于高度特异性相互作用(例如在抗原与抗体、受体与配体、酶与底物，或酶与抑制剂之间的高度特异性相互作用)分离生化混合物的方法。最后，疏水相互作用色谱法是一种利用疏水性质将蛋白质彼此分离的分离技术。在这种类型的色谱法中，疏水基团(例如苯基、辛基或丁基)附着到固定柱上。穿过柱的在其表面上具有疏水性氨基酸侧链的蛋白质能够与柱上的疏水基团相互作用并结合。

根据本发明第一方面的另一个优选实施例，该方法进一步包括蛋白水解处理分离的或纯化的丝氨酸蛋白酶，其中蛋白水解处理优选包括通过蛋白水解切割从丝氨酸蛋白酶中释放前肽。

如上所述，丝氨酸蛋白酶通常最初在宿主细胞中以前蛋白原的形式产生，所述前蛋白原作为初级翻译产物。前肽在宿主细胞的内质网中被切割。通过这样的切割，前蛋白原转化成丝氨酸蛋白酶的蛋白原。前蛋白基本上没有酶促活性，且为丝氨酸蛋白酶根据本发明第一方面的方法产生的主要形式。

根据本发明第一方面的上述优选实施方式，可通过从蛋白原上切下前肽将蛋白原酶促处理成成熟蛋白(即酶促活性蛋白)。可以通过不同的方法从丝氨酸蛋白酶上切下前肽，例如使其与伤口渗出物中包含的酶接触时。

在第二方面，本发明涉及宿主细胞，(i)其包含一个或多个载体，其中所述一个或多个载体以可表达的形式编码丝氨酸蛋白酶和所述丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂，或(ii)其基因组以可表达的形式编码丝氨酸蛋白酶和所述丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂，其中通过应用CRISPR技术已将所述丝氨酸蛋白酶和/或所述蛋白质抑制剂的编码序列导入所述宿主细胞基因组中，其中所述丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂相对于所述丝氨酸蛋白酶是异源的。

只要适用于本发明的第二方面，加上必要的修改来使用上文就本发明的第一方面所描述的优选实施方式、定义和解释。

根据本发明的第一和第二方面的优选实施方式，丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂选自根据MEROPS数据库的I02类所列的抑制剂。

MEROPS数据库是肽酶(也称为蛋白酶、朊酶(proteinase)和蛋白水解酶)以及抑制它们的蛋白质的信息资源。描述给定肽酶的概要页面可以使用其名称、MEROPS标识符或来源生物体的索引访问。该概要描述了肽酶的分类和命名，并提供了指向补充页面的链接，所述补充页面显示了序列标识符、结构(如果已知)、文献参考等。

根据MEROPS数据库的I02类(或抑制剂家族)包含丝氨酸和半胱氨酸肽酶的抑制剂。根据MEROPS数据库的11.0版本，I02类(或抑制剂家族)具有下表1中列出的成员。

表1

因此，丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂更优选选自上表1中所列的抑制剂。在下文的实施例中，测试了根据MEROPS数据库的I02类(或抑制剂家族)的五个成员。所有五个成员均可以令人满意的产量产生清创酶。

根据本发明的第一和第二方面的另一个优选实施方式，蛋白质抑制剂选自由以下组成的组：抑肽酶、plasminostreptin(I16.001)、2型朊酶抑制剂K(PIN2K,I20.001)、大肠杆菌素(ecotin)(I11.001)、胰蛋白酶抑制剂MCTI-1(I07.001)、海鞘胰蛋白酶抑制剂(I05.001)、肽酶抑制剂5(KappaPI-actitoxin-Avd3a,I02.026)，以及组织因子途径抑制剂-2抑制剂单元1(TFPI2,I02.013)。下文实施例显示，所有五个成员均以优良产量产生了清创酶。

根据本发明的第一和第二方面的更优选实施方式，丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂是抑肽酶。如下文实施例中所示，用抑肽酶获得的产生清创酶的效果最好。

根据MEROPS数据库，抑肽酶(或牛胰腺胰蛋白酶抑制剂(BPTI))是I02类(或抑制剂家族)的创始成员，并且其在下文的实施例中用作清创酶的丝氨酸蛋白酶的抑制剂。抑肽酶具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，该氨基酸序列由SEQ ID NO：2的核苷酸序列编码。如上所述，抑肽酶是牛胰腺胰蛋白酶抑制剂。抑肽酶是一种竞争性的丝氨酸蛋白酶抑制剂，其与酶形成稳定的复合物并阻断酶的活性位点。该结合是可逆的，并且大多数抑肽酶-蛋白酶复合物在pH>10或<3.2时会解离。SEQ ID NO：2是核苷酸序列，其经密码子优化以用于在巴斯德毕赤酵母细胞中表达。密码子优化已广泛用于设计合成基因，以改善其在异源宿主生物体中的表达。由于并非所有tRNA在生物体中都均等地表达或以相同水平表达，可以通过改变其密码子对特定核苷酸序列进行密码子优化，以匹配特定异源宿主生物体中最普遍的tRNA。与非密码子优化的核苷酸序列相比，密码子优化的核苷酸序列通常被更有效地翻译。

根据本发明的第一和第二方面的另一个优选实施方式，丝氨酸蛋白酶是具有EC号为3.4.21的丝氨酸蛋白酶。

丝氨酸蛋白酶在BRENDA数据库中分类为具有EC编号为3.4.21。酶委员会(EnzymeCommission)编号(EC编号)是基于其催化的化学反应，对酶的数字分类方案。酶命名方案的发展始于1955年，当时布鲁塞尔国际生物化学大会(the International Congress ofBiochemistry in Brussels)成立了酶委员会(Enzyme Commission)。第一版出版于1961年。BRENDA数据库是代表最全面的酶库之一的信息系统。BRENDA于1987年成立于前德国国家生物技术研究中心(German National Research Centre for Biotechnology)。它最初是作为一系列书籍出版，但现在是一个在线数据库，其中包含有关酶的分子和生化信息。表2列出了2017.1版本的BRENDA数据库中所包含的丝氨酸蛋白酶清创酶和具有EC编号3.4.21的丝氨酸蛋白酶。

表2

因此，丝氨酸蛋白酶更优选自上表2中所列的酶。

根据本发明的第一和第二方面的更优选实施方式，丝氨酸蛋白酶为清创酶。

清创酶(或

)通过分子克隆进行鉴定的且其来源于丝光绿蝇的幼虫(WO2010/099955)。清创酶的前蛋白原的氨基酸序列示于SEQ ID NO:3中，清创酶的蛋白原的氨基酸序列示于SEQ ID NO:4中，成熟的清创酶蛋白的氨基酸序示于SEQ ID NO:5中。SEQID NO:6的核苷酸序列编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列。SEQ ID NO:4由SEQ ID NO:7编码，并且SEQ ID NO:5由SEQ ID NO:8编码。成熟的清创酶具有切割纤维蛋白和酪蛋白的能力。清创酶的名称反映了该酶有利于伤口清创。

清创术定义为从伤口去除非活性组织。在慢性伤口中，清创术意味着消除坏死以及清除伤口敷料、异物和其他非活性物质。除治疗导致伤口愈合延迟的因素外，清创术应是适当治疗慢性伤口中的第一步。用于慢性伤口的清创术的不同方法已有描述，例如手术、蛆虫疗法、激光、超声、水疗、干湿法、自溶、渗透或化学清创以及使用蛋白水解酶。

在作为原核宿主的大肠杆菌BL21和作为真核宿主的巴斯德毕赤酵母中开发了用于清创酶的表达系统(WO 2010/99955)。

根据本发明的第一和第二方面的另一个优选实施方式，宿主细胞为(a)酵母细胞，优选巴斯德毕赤酵母细胞；(b)细菌细胞，优选大肠杆菌或枯草芽孢杆菌细胞，或(c)丝状真菌细胞，优选曲霉属细胞。

在本领域中，酵母细胞、丝状真菌细胞和细菌细胞经常用作宿主细胞以重组产生蛋白质。特别是对于这些宿主细胞，很好地确定了表达载体的分子生物学以及靶基因的启动子、标记和密码子优化的选择，从而可以实现高产量的蛋白产生。

宿主细胞更优选为酵母细胞，并且最优选巴斯德毕赤酵母细胞，注意在下文的实施例中将巴斯德毕赤酵母细胞用作宿主细胞。

根据本发明的第一和第二方面的又一个优选实施方式，丝氨酸蛋白酶不是丝氨酸蛋白酶抑制剂的天然底物。

如上所述，在实例中，来自丝光绿蝇的丝氨酸蛋白酶清创酶已经与来自家牛的丝氨酸蛋白酶抑制剂抑肽酶一起产生。尽管抑肽酶的天然底物是牛胰蛋白酶，但令人惊讶地发现抑肽酶有效抑制非天然底物和进化上有区别的丝氨酸蛋白酶清创酶。有利的是，清创酶与抑肽酶一起产生显著提高了重组清创酶的产品产量。在这方面，还应注意的是，就本发明人所知，具有清创酶作为其天然底物的抑制剂不是已知的。

根据本发明的第一和第二方面的另一个优选实施方式，丝氨酸蛋白酶和蛋白质丝氨酸蛋白酶抑制剂在宿主细胞中共表达。

就此而言，术语“共表达”要求丝氨酸蛋白酶和蛋白质丝氨酸蛋白酶抑制剂在宿主中同时表达。这可以通过几种方式来实现。举例而言，共表达可以通过使编码丝氨酸蛋白酶和蛋白质丝氨酸蛋白酶抑制剂的基因置于如下的控制下来实现：在相同的转录调控程序、功能相关的调控程序或相同途径或蛋白复合物的转录调控成员的控制下。

根据本发明的第一和第二方面的优选实施方式，在所述一个或多个载体中，丝氨酸蛋白酶由第一表达盒表达，并且丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂由第二表达盒表达，其中所述第一和第二表达盒优选在两个分开的载体上。

根据该优选的实施方式，丝氨酸蛋白酶和蛋白质抑制剂由不同的表达盒表达。这确保了在宿主细胞中，丝氨酸蛋白酶和蛋白质抑制剂是通过两个分开的mRNA翻译产生的。这也允许将丝氨酸蛋白酶和蛋白质抑制剂的表达置于相同或不同的启动子的控制下。在这点上，值得注意的是，本领域中有几种启动子是可用的，并且可以选择第一和第二表达盒中的启动子，以便例如分别对于每个表达盒或两个表达盒都以相同方式控制表达的量、位置和/或时机。所述至少两个表达盒可以存在于一个载体中，并且优选存在于至少两个载体中，使得丝氨酸蛋白酶和蛋白质抑制剂由两个不同的载体表达。在这方面，优选的是，将产生高水平的蛋白质抑制剂的时机与丝氨酸蛋白酶的表达相协调，使得在宿主细胞中高水平的蛋白质抑制剂和高水平的丝氨酸蛋白酶同时存在。

根据本发明的第一和第二方面的更优选的实施方式，丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂在相同或不同的强的、受调控的启动子的控制下。

根据本发明的第一和第二方面的另一个更优选的实施方式，丝氨酸蛋白酶与丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂在相同的强的、受调控的启动子的控制下。

在实施例中，由两个载体中的两个表达盒表达清创酶和抑肽酶，其中，清创酶和抑肽酶的表达都在相同的强的、受调控的启动子的控制下。已发现，如果使用这种表达模式则可以产生非常高水平的丝氨酸蛋白酶清创酶，而对宿主细胞无毒性作用。

根据本发明的第一和第二方面的甚至更优选的实施方式，宿主细胞为巴斯德毕赤酵母细胞，和/或强的、受调控的启动子为P_aox(醇氧化酶启动子)，优选P_aox1或P_aox2。

巴斯德毕赤酵母广泛用于通过重组DNA技术生产蛋白质。巴斯德毕赤酵母具有两个醇氧化酶基因Aox1和Aox2，它们具有强诱导型启动子。这些基因允许巴斯德毕赤酵母使用甲醇作为碳和能源。AOX启动子通过甲醇诱导，并被例如葡萄糖抑制。

在下文的实施例中，用巴斯德毕赤酵母细胞作为宿主细胞，在强的、受调控的启动子P_aox(醇氧化酶启动子)的控制下表达清创酶以及抑肽酶。

关于在本说明书中，特别是在权利要求中所表征的实施方式，其旨在将从属权利要求中提及的每个实施方式与所述从属权利要求所从属的每个(独立或从属)权利要求的每个实施方式组合。例如，在独立权利要求1列举了3个可选方案A、B和C、从属权利要求2列举了3个可选方案D、E和F，并且从属权利要求3从属于权利要求1和2并且列举了3个可选方案G、H和I的情形下，应理解，说明书清楚地公开了对应于以下组合的实施方式：A、D、G；A、D、H；A、D、I；A,E,G；A、E、H；A、E、I；A、F、G；A、F、H；A、F、I；B、D、G；B、D、H；B、D、I；B、E、G；B、E、H；B、E、I；B、F、G；B、F、H；B、F、I；C、D、G；C、D、H；C、D、I；C、E、G；C、E、H；C、E、I；C、F、G；C、F、H；C、F、I，除非另有具体说明。

类似地，并且也在独立和/或从属权利要求没有列举可选方案的那些情况下，应理解，如果从属权利要求引用大部分前述权利要求，则认为所涵盖的主题的任何组合因而被明确地公开。例如，在独立权利要求1、引用权利要求1的从属权利要求2、以及引用权利要求2和1的从属权利要求3的情形下，于是则清楚且明确地公开了权利要求3和1的主题的组合，就像清楚且明确地公开了权利要求3、2和1的主题的组合一样。如果存在引用权利要求1至3中任一项的另一从属权利要求4的情形，于是则清楚且明确地公开了权利要求1和4的主题的组合，权利要求4、2和1的主题的组合，权利要求4、3和1的主题的组合，以及权利要求4、3、2和1的主题的组合。

以上考虑加上必要的修改后适用于所有所附权利要求。

如图所示：

图1

抑制清创酶活性的抑肽酶的半最大抑制浓度(IC50)。使用在PBS缓冲液(pH 8)中的荧光标记的底物肽Z-Gly-Gly-Arg-AMC确定清创酶的活性。将未添加抑肽酶的清创酶活性定义为100％活性。

图2

用于共表达清创酶和抑肽酶的表达载体的质粒图谱。用于构建巴斯德毕赤酵母AurPlus的构建质粒pPpT4_P_AOX_Apr_Pp，卡那霉素^r的方案。在强诱导型启动子Paox的控制下克隆了修饰的抑肽酶编码基因(SEQ ID NO:3)。

图3

在摇瓶规模通过巴斯德毕赤酵母AurPlus产生的清创酶和抑肽酶的分析。在SDS-PAGE上显现清创酶原和抑肽酶的产生。箭头表示两个分子。M:Benchmark Protein Ladder(kDa)；1：t＝诱导后0分钟，2：t＝诱导后24小时，3：t＝诱导后48小时，4：t＝诱导后72小时。

图4

巴斯德毕赤酵母AurPlus分泌产物的分析

a)巴斯德毕赤酵母的可能的分泌产物。数字表示分子量。b)清创酶PK为活化的清创酶的样品。针对来自新型表达菌株的上清液样品对这些样品进行分析，显示清创酶被分泌为清创酶原(较高分子量)。运行SDS-PAGE以仅分析清创酶分子。由于SDS-PAGE的长时间运行，因此未监测抑肽酶。

图5

清创酶原的活化。将来自巴斯德毕赤酵母AurPlus的上清液的清创酶原在pH 8下孵育0–60分钟。在孵育前，清创酶溶液的pH从pH 5变为pH 8。孵育10分钟后，发生活化(大小转变)。M:benchmark protein ladder(kDa)，起始：pH从pH 5变为pH 8。

图6

清创酶产生的定量

用于量化清创酶原产生水平的巴斯德毕赤酵母AurPlus上清液与参考清创酶的光密度分析。M:benchmark protein ladder(kDa),1–5：巴斯德毕赤酵母AurPlus上清液的稀释组(1:2)，6-10：已知浓度的参考清创酶的稀释组(1：2)。

图7

由巴斯德毕赤酵母产生的清创酶和不同抑制剂的分析。在SDS-PAGE上显现清创酶和来自同抑制剂类别的不同抑制剂的产生。M:benchmark protein ladder(kDa),1：参考1-巴斯德毕赤酵母AurPlus，2：参考2-巴斯德毕赤酵母(US8623810 B2)，3-9：共表达菌株，根据MEROPS ID的表达的抑制剂。抑制剂的分子量：I16_001(11.4kDa)，I20_001(13.8kDa)，I11_001(16.1kDa)，I07_001(3.4kDa)，I05_001(6.1kDa)，I02_026(6.9kDa)，I02_013(7.4kDa)。

实施例说明本发明。

实施例1：作为合适的清创酶抑制剂的抑肽酶的的鉴定和表征

通过文献检索(蛋白数据库(Protein Databank))选择能够抑制胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的蛋白质蛋白酶抑制剂。选择了来自牛肺的蛋白酶抑制剂抑肽酶(SigmaAldrich)，其是MEROPS I02类的成员，并测试了其在抑制清创酶蛋白水解活性方面的潜在活性。

将抑肽酶添加到的清创酶样品(5mg/L清创酶)中，浓度从0.005至0.5μM，并在4℃下孵育0.5h。孵育后，使用Z-Gly-Gly-Arg-AMC(Bachem)作为底物分析残留的清创酶活性。在37℃下的PBS缓冲液(pH 8)中确定活性动力学。用BMC Novostar荧光计(λex 365nm，λem440nm)测量7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)的释放。出人意料的是，抑肽酶被鉴定为有效的非天然清创酶抑制剂。确定的半最大抑制浓度(IC50)为0.076μM(图1)。

被测试的第二种可商购的蛋白质蛋白酶抑制剂为来自莱豆(Phaseoluslimensis)(利马豆(lima bean))的胰蛋白酶抑制剂。这种属于Bowman-Birk类抑制剂的抑制剂不能够抑制清创酶活性。因此，首先关注的是抑肽酶，并然后成功测试了MEROPS数据库的其他成员(参见实施例7)。

实施例2：抑肽酶基因序列的设计和巴斯德毕赤酵母共表达菌株的构建

巴斯德毕赤酵母是合适的用于异源产生抑肽酶的表达宿主(Vedvick Vedvick,T.et al.(1991)High-level secretion of biologically active aprotinin from theyeast Pichia pastoris.J Ind Microbiol 7,197–201)。抑肽酶氨基酸序列(SEQ ID NO:1)用于设计密码子优化的基因序列。如Zsebo et al.(1986),Protein secretion fromSaccharomyces cerevisiae directed by the prepro-alpha-factor leader region.JBiol Chem 261:5858-5865中所述，向编码抑肽酶的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)添加碱基GAAGCT的N端延伸用于在巴斯德毕赤酵母中有效分泌和加工。该融合构建体具有的氨基酸序列为SEQ ID NO:9，并且核苷酸序列为SEQ ID NO:10。将设计的抑肽酶融合序列进一步融合至来自酿酒酵母的α交配因子的基因序列。所述进一步的融合构建体具有的氨基酸序列为SEQ ID NO:11，并且核苷酸序列为SEQ ID NO:12。

将pPpT4表达质粒用作穿梭载体，以将修饰的抑肽酶序列转移到产生清创酶的巴斯德毕赤酵母中(US8623810 B2)，其中编码清创酶的表达盒稳定地整合于基因组中。为了构建pPpT4_P_AOX_Apr_Pp(图2)，将抑肽酶序列连接入pPpT4质粒的EcoRI和NotI位点中。该质粒用于转化巴斯德毕赤酵母，所述巴斯德毕赤酵母在AOX1启动子的控制下表达清创酶基因(US8623810 B2)。转化前，针对pPpT4_P_AOX_Apr_Pp将质粒用SacI切割以线性化质粒。使用来自New England Biolabs的限制性核酸内切酶和连接酶在大肠杆菌中进行基因克隆。用线性化的pPpT4_P_AOX_Apr_Pp转化原始清创酶表达菌株以随后整合到巴斯德毕赤酵母基因组中。为了选择阳性整合物，使用抗生素标记。质粒pPpT4_P_AOX_Apr_Pp携带卡那霉素6抗性的基因信息。将菌株在YPD琼脂平板上培养3天，所述YPD琼脂平板包含博来霉素(100μg/ml)(选择清创酶表达盒，如WO2010099955中所述)博来霉素+遗传霉素(50μg/ml)(在P_AOX启动子控制下选择抑肽酶的表达盒)。

实施例3：鉴别强的清创酶产生者

挑选出在选择琼脂平板上显示正确表型的克隆，并进行小规模培养用于表达研究。在500μl EnPresso Y培养基(Biosilta)中将来自每种类型的12个克隆培养90小时。用标准方案补料和诱导。经由SDS-PAGE随机分析克隆。为了识别出阳性克隆，将显示强的清创酶产生且无蛋白水解活性的这些克隆作为命中来确定。使用荧光标记的肽Z-Gly-Gly-Arg-AMC的活性评估用于活性确定。从筛选中检测出一个命中。该克隆显示有高潜力产生清创酶，产生可检测量的抑肽酶且显示无蛋白水解活性。这种改良的清创酶产生菌株称为巴斯德毕赤酵母AurPlus。

将巴斯德毕赤酵母AurPlus转移到摇瓶规模。使用补料和诱导的标准方案在20mlEnPresso Y培养基中完成90小时的培养。通过SDS-PAGE分析清创酶和抑肽酶产生能力(图3)。巴斯德毕赤酵母AurPlus显示出清创酶以及抑肽酶的强的产生。

经由SDS-PAGE分析来自巴斯德毕赤酵母AurPlus的分泌的清创酶，来确定其所产生的是被抑肽酶抑制的成熟清创酶还是清创酶原(图4a和b)。将分泌的清创酶与成熟且活性清创酶比较。在成熟清创酶与分泌的清创酶(更高分子量)之间可见的大小转变说明巴斯德毕赤酵母AurPlus产生无活性的前体形式的分子(清创酶原)。

实施例4：分离清创酶原和抑肽酶

为分离前清创酶和抑肽酶，使用几种色谱方法。这些方法之一是离子交换色谱法(阳离子交换)，其在pH 5下使用5ml Sepharose SP柱进行。将巴斯德毕赤酵母AurPlus的上清液样品用7个置换体积(diavolume)的柠檬酸盐缓冲液(1.05g/L柠檬酸一水化物、1.42g/L磷酸氢二钠、11.69g/L NaCl)缓冲液透滤。将30ml透滤过的样品以3ml/min的流速过柱。使用缓冲液A(柠檬酸盐缓冲液)和缓冲液B(含有1M NaCl的柠檬酸盐缓冲液)。离子交换以用10个柱体积的100％缓冲液A的洗涤步骤开始，以线性梯度过柱。为了洗脱，用超过15个柱体积的缓冲液B以0-100％的线性梯度过柱。收集2ml级分，并针对蛋白质分布，在SDS-PAGE上分析级分10–29。经由离子交换色谱法分离清创酶原和抑肽酶。清创酶原在级分17–22中早期洗脱。抑肽酶在级分24–28中洗脱。

实施例5：清创酶原的活化

将来自离子交换色谱法的包含清创酶原的级分合并并用于活化实验。将合并的样品的pH在离子交换色谱法后从pH 5调至pH 8。将样品在37℃并且pH 8下孵育1小时以诱导蛋白酶的自动催化活化(加工)。经由SDS-PAGE分析通过释放前肽加工清创酶(大小转变)(图5)。

实施例6：量化由巴斯德毕赤酵母AurPlus的清创酶原产生

在2L发酵罐中培养巴斯德毕赤酵母AurPlus。通常，使用Gasser培养基(高盐)进行发酵。发酵的三个阶段包括：用40g/L甘油的批处理阶段，以80％甘油、μ＝0.1的指数补料超过12小时的第一补料阶段，以及用100％甲醇，μ＝0.03超过48小时的第二指数补料阶段。在发酵后，通过离心收集生产菌株的上清液并将其用于光密度分析以确定清创酶原产生水平。在1:2稀释步骤中将上清液从1:1稀释至1:8，并在SDS-PAGE上分析。作为参照，使用已知浓度为4.8g/L的成熟清创酶来计算清创酶原的量(图6)。光密度分析揭示巴斯德毕赤酵母AurPlus能够产生1.4g/L(+/-0.05g/L)清创酶原，其相较于原始清创酶产生菌株增长了接近十三倍。

实施例7：其他合适的异源蛋白质抑制剂的鉴别

从蛋白质抑制剂的MEROPS数据库筛选出来自不同抑制剂组的抑肽酶替代物。为了测试其他的抑制剂，选择10个基因：I02.013组织因子途径抑制剂-2抑制剂单元1(TFPI2)，I02.018胰凝乳蛋白酶抑制剂SCI-I(胰凝乳蛋白酶抑制剂SCI-I(Clb1))，I02.026肽酶抑制剂5(KappaPI-actitoxin-Avd3a)，I02.968胶原α3(VII)链(CO6A3)，I05.001海鞘胰蛋白酶抑制剂，I07.001胰蛋白酶抑制剂MCTI-1，I11.001大肠杆菌素，I16.001Plasminostreptin，I20.001 2型朊酶抑制剂K(PIN2K)，以及I83.001AmFPI-1。这些基因作为巴斯德毕赤酵母密码子优化的DNA串订购(Thermo Fisher Scientific)。用AatII和NotI切割质粒pPpT4_P_AOX_Apr_Pp以移除抑肽酶。经由来自New England Biolabs的Gibson克隆，将基因串通过与质粒同源的区域整合到开放的pPpT4_P_AOX_Apr_Pp中。在大肠杆菌中进行克隆。通过DNA测序来检验所构建的pPpT4质粒的序列正确性，并最后将其整合到如实施例2中所述的原始巴斯德毕赤酵母(US8623810 B2)表达菌株的基因组中。为将新的抑制剂与清创酶组合表达，在装有500μl培养基的96孔板中将不同的巴斯德毕赤酵母转化体培养52小时(m2p-labs MediaDevelopment试剂盒M-KIT-500)。在每孔500μl表达培养基中接种25μl YPD(100μg/mL博来霉素和50μg/mL遗传霉素)预培养物。通过一天两次(在接种后的0、8、24、32和48小时)添加1％v/v酶混合物诱导葡萄糖补料。在接种后每24小时添加一次0.5％v/v无菌甲醇且之后一起加入酶混合物以诱导aox1启动子。52小时之后，在600nm下确定光密度并收集上清液。在直接荧光分析法中使用Z-Gly-Gly-Arg-AMC(Bachem)作为底物测量Aurase活性。在SDS-PAGE上分析与原始巴斯德毕赤酵母(US8623810 B2)表达菌株相比显示无清创酶活性的克隆(7种抑制剂/清创酶组合)，以分析抑制剂和清创酶产生(图7)。用全部10种经测试的抑制剂均以令人满意的产量产生清创酶。对于I16.001、I20.001、I11.001、I07.001、I05.001、I02.026、I02.013，证明对清创酶产生具有有利效果。用抑肽酶获得了对清创酶产生最有益的效果且在上述实施例中得到证实。与参考巴斯德毕赤酵母(US8623810 B2)和巴斯德毕赤酵母AurPlus相比，与不同抑制剂组合产生的清创酶的分子量表明清创酶作为清创酶原产生，就像实施例3中所示与抑肽酶组合的一样。

序列表

<110> B.R.A.I.N. Biotechnology Research And Information Network AG

<120> 在宿主细胞中丝氨酸蛋白酶的表达的优化

<130> AA1177 PCT

<150> EP17 17 3813.1

<151> 2017-05-31

<160> 12

<170> BiSSAP 1.3

<210> 1

<211> 58

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 1

Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala

1 5 10 15

Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gln Thr

20 25 30

Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala

35 40 45

Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala

50 55

<210> 2

<211> 177

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Codon-optimized nucleotide sequence of aprotinin

<400> 2

agaccagact tctgtttgga accaccatac actggtccat gtaaggctag aatcatcaga 60

tacttctaca acgctaaggc tggtttgtgt cagactttcg tttacggtgg ttgtagagct 120

aagagaaaca acttcaagtc cgctgaggac tgtatgagaa cttgtggtgg tgcttaa 177

<210> 3

<211> 254

<212> PRT

<213> Lucilia sericata

<400> 3

Met Phe Arg Phe Val Ala Leu Phe Ala Phe Val Ser Cys Ala Leu Ala

1 5 10 15

Gly Ala Ile Pro Asn Asp Leu Asp Gly Arg Ile Val Asn Gly Val Asp

20 25 30

Thr Thr Ile Gln Ala His Pro Tyr Gln Val Ser Leu Gln Thr Asn Asn

35 40 45

Gly Phe His Phe Cys Gly Gly Ser Ile Ile Ser Glu Asp Ile Ile Val

50 55 60

Thr Ala Ala His Cys Met Gln Ser Tyr Lys Ala Tyr Gln Phe Lys Val

65 70 75 80

Arg Leu Gly Ser Thr Glu Tyr Asp Asn Gly Gly Glu Leu Val Ala Val

85 90 95

Lys Ser Phe Lys Tyr His Glu Gly Tyr Asn Pro Glu Thr Met Val Asn

100 105 110

Asp Val Ala Val Ile Lys Leu Ala Thr Pro Val Arg Glu Ser Ser Lys

115 120 125

Val Arg Tyr Val Lys Leu Ala Glu Lys Thr Pro Ala Thr Gly Thr Pro

130 135 140

Ala Val Val Thr Gly Trp Gly Ser Lys Cys Phe Leu Phe Cys Gln Thr

145 150 155 160

Ala Pro Lys Val Leu Gln Lys Val Glu Val Asp Ile Val Asp Glu Lys

165 170 175

Thr Cys Ala Ser Ser Glu Tyr Lys Tyr Gly Asp Asp Ile Lys Glu Thr

180 185 190

Met Leu Cys Ala Tyr Ala Val Lys Lys Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser

195 200 205

Gly Gly Pro Leu Val Ala Asn Asn Lys Leu Val Gly Val Val Ser Trp

210 215 220

Gly Lys Gly Cys Ala Leu Ala Gly Tyr Pro Gly Val Tyr Cys Asp Val

225 230 235 240

Ala Thr Val Arg Ser Trp Ile Glu Lys Thr Ala Lys Ser Leu

245 250

<210> 4

<211> 238

<212> PRT

<213> Lucilia sericata

<400> 4

Gly Ala Ile Pro Asn Asp Leu Asp Gly Arg Ile Val Asn Gly Val Asp

1 5 10 15

Thr Thr Ile Gln Ala His Pro Tyr Gln Val Ser Leu Gln Thr Asn Asn

20 25 30

Gly Phe His Phe Cys Gly Gly Ser Ile Ile Ser Glu Asp Ile Ile Val

35 40 45

Thr Ala Ala His Cys Met Gln Ser Tyr Lys Ala Tyr Gln Phe Lys Val

50 55 60

Arg Leu Gly Ser Thr Glu Tyr Asp Asn Gly Gly Glu Leu Val Ala Val

65 70 75 80

Lys Ser Phe Lys Tyr His Glu Gly Tyr Asn Pro Glu Thr Met Val Asn

85 90 95

Asp Val Ala Val Ile Lys Leu Ala Thr Pro Val Arg Glu Ser Ser Lys

100 105 110

Val Arg Tyr Val Lys Leu Ala Glu Lys Thr Pro Ala Thr Gly Thr Pro

115 120 125

Ala Val Val Thr Gly Trp Gly Ser Lys Cys Phe Leu Phe Cys Gln Thr

130 135 140

Ala Pro Lys Val Leu Gln Lys Val Glu Val Asp Ile Val Asp Glu Lys

145 150 155 160

Thr Cys Ala Ser Ser Glu Tyr Lys Tyr Gly Asp Asp Ile Lys Glu Thr

165 170 175

Met Leu Cys Ala Tyr Ala Val Lys Lys Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser

180 185 190

Gly Gly Pro Leu Val Ala Asn Asn Lys Leu Val Gly Val Val Ser Trp

195 200 205

Gly Lys Gly Cys Ala Leu Ala Gly Tyr Pro Gly Val Tyr Cys Asp Val

210 215 220

Ala Thr Val Arg Ser Trp Ile Glu Lys Thr Ala Lys Ser Leu

225 230 235

<210> 5

<211> 228

<212> PRT

<213> Lucilia sericata

<400> 5

Ile Val Asn Gly Val Asp Thr Thr Ile Gln Ala His Pro Tyr Gln Val

1 5 10 15

Ser Leu Gln Thr Asn Asn Gly Phe His Phe Cys Gly Gly Ser Ile Ile

20 25 30

Ser Glu Asp Ile Ile Val Thr Ala Ala His Cys Met Gln Ser Tyr Lys

35 40 45

Ala Tyr Gln Phe Lys Val Arg Leu Gly Ser Thr Glu Tyr Asp Asn Gly

50 55 60

Gly Glu Leu Val Ala Val Lys Ser Phe Lys Tyr His Glu Gly Tyr Asn

65 70 75 80

Pro Glu Thr Met Val Asn Asp Val Ala Val Ile Lys Leu Ala Thr Pro

85 90 95

Val Arg Glu Ser Ser Lys Val Arg Tyr Val Lys Leu Ala Glu Lys Thr

100 105 110

Pro Ala Thr Gly Thr Pro Ala Val Val Thr Gly Trp Gly Ser Lys Cys

115 120 125

Phe Leu Phe Cys Gln Thr Ala Pro Lys Val Leu Gln Lys Val Glu Val

130 135 140

Asp Ile Val Asp Glu Lys Thr Cys Ala Ser Ser Glu Tyr Lys Tyr Gly

145 150 155 160

Asp Asp Ile Lys Glu Thr Met Leu Cys Ala Tyr Ala Val Lys Lys Asp

165 170 175

Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Ala Asn Asn Lys Leu

180 185 190

Val Gly Val Val Ser Trp Gly Lys Gly Cys Ala Leu Ala Gly Tyr Pro

195 200 205

Gly Val Tyr Cys Asp Val Ala Thr Val Arg Ser Trp Ile Glu Lys Thr

210 215 220

Ala Lys Ser Leu

225

<210> 6

<211> 765

<212> DNA

<213> Lucilia sericata

<400> 6

atgttccggt ttgtagctct attcgctttc gttagctgtg ccttggcggg cgctattccc 60

aatgatttgg atggccgcat tgtcaatggt gtggatacca ccattcaggc ccatccctat 120

caggtttctt tgcaaaccaa caatggtttc catttctgcg gtggttccat catcagcgaa 180

gacattattg taactgctgc tcattgcatg caatcctaca aggcctacca attcaaagta 240

cgtttgggtt ccactgaata cgataatggt ggtgaattgg ttgccgtcaa gtctttcaaa 300

taccacgaag gttacaatcc cgaaaccatg gttaatgatg ttgccgttat caaattagcc 360

actccagtgc gtgaatcttc caaggtacgt tatgttaaat tggctgagaa gacacctgct 420

actggcaccc cagctgtcgt tactggttgg ggttctaagt gcttcttgtt ctgccaaact 480

gcccctaaag ttttgcaaaa ggttgaggtc gatattgttg atgagaagac ctgcgcttcc 540

agcgaataca aatatggtga tgacatcaag gaaactatgt tgtgtgctta tgctgttaag 600

aaggatgctt gccaaggtga ttctggtggt cctttggttg ccaacaacaa attggtcggt 660

gttgtttcct ggggtaaagg ttgtgccctt gctggctatc ccggtgtata ctgcgatgtt 720

gctactgtcc gcagctggat tgaaaagact gccaagagtt tgtaa 765

<210> 7

<211> 717

<212> DNA

<213> Lucilia sericata

<400> 7

ggcgctattc ccaatgattt ggatggccgc attgtcaatg gtgtggatac caccattcag 60

gcccatccct atcaggtttc tttgcaaacc aacaatggtt tccatttctg cggtggttcc 120

atcatcagcg aagacattat tgtaactgct gctcattgca tgcaatccta caaggcctac 180

caattcaaag tacgtttggg ttccactgaa tacgataatg gtggtgaatt ggttgccgtc 240

aagtctttca aataccacga aggttacaat cccgaaacca tggttaatga tgttgccgtt 300

atcaaattag ccactccagt gcgtgaatct tccaaggtac gttatgttaa attggctgag 360

aagacacctg ctactggcac cccagctgtc gttactggtt ggggttctaa gtgcttcttg 420

ttctgccaaa ctgcccctaa agttttgcaa aaggttgagg tcgatattgt tgatgagaag 480

acctgcgctt ccagcgaata caaatatggt gatgacatca aggaaactat gttgtgtgct 540

tatgctgtta agaaggatgc ttgccaaggt gattctggtg gtcctttggt tgccaacaac 600

aaattggtcg gtgttgtttc ctggggtaaa ggttgtgccc ttgctggcta tcccggtgta 660

tactgcgatg ttgctactgt ccgcagctgg attgaaaaga ctgccaagag tttgtaa 717

<210> 8

<211> 687

<212> DNA

<213> Lucilia sericata

<400> 8

attgtcaatg gtgtggatac caccattcag gcccatccct atcaggtttc tttgcaaacc 60

aacaatggtt tccatttctg cggtggttcc atcatcagcg aagacattat tgtaactgct 120

gctcattgca tgcaatccta caaggcctac caattcaaag tacgtttggg ttccactgaa 180

tacgataatg gtggtgaatt ggttgccgtc aagtctttca aataccacga aggttacaat 240

cccgaaacca tggttaatga tgttgccgtt atcaaattag ccactccagt gcgtgaatct 300

tccaaggtac gttatgttaa attggctgag aagacacctg ctactggcac cccagctgtc 360

gttactggtt ggggttctaa gtgcttcttg ttctgccaaa ctgcccctaa agttttgcaa 420

aaggttgagg tcgatattgt tgatgagaag acctgcgctt ccagcgaata caaatatggt 480

gatgacatca aggaaactat gttgtgtgct tatgctgtta agaaggatgc ttgccaaggt 540

gattctggtg gtcctttggt tgccaacaac aaattggtcg gtgttgtttc ctggggtaaa 600

ggttgtgccc ttgctggcta tcccggtgta tactgcgatg ttgctactgt ccgcagctgg 660

attgaaaaga ctgccaagag tttgtaa 687

<210> 9

<211> 60

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Aprotinin fused to EA-Tag

<400> 9

Glu Ala Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro Cys

1 5 10 15

Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys

20 25 30

Gln Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg Asn Asn Phe Lys

35 40 45

Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala

50 55 60

<210> 10

<211> 183

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Aprotinin fused to GAAGCT-Tag

<400> 10

gaagctagac cagacttctg tttggaacca ccatacactg gtccatgtaa ggctagaatc 60

atcagatact tctacaacgc taaggctggt ttgtgtcaga ctttcgttta cggtggttgt 120

agagctaaga gaaacaactt caagtccgct gaggactgta tgagaacttg tggtggtgct 180

taa 183

<210> 11

<211> 438

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Aprotinin sequence fused to sequence of the alpha mating factor

from S. cerevisiae

<400> 11

atgagattcc catctatttt caccgctgtc ttgttcgctg cctcctctgc attggctgcc 60

cctgttaaca ctaccactga agacgagact gctcaaattc cagctgaagc agttatcggt 120

tactctgacc ttgagggtga tttcgacgtc gctgttttgc ctttctctaa ctccactaac 180

aacggtttgt tgttcattaa caccactatc gcttccattg ctgctaagga agagggtgtc 240

tctctcgaga aaagagaagc tagaccagac ttctgtttgg aaccaccata cactggtcca 300

tgtaaggcta gaatcatcag atacttctac aacgctaagg ctggtttgtg tcagactttc 360

gtttacggtg gttgtagagc taagagaaac aacttcaagt ccgctgagga ctgtatgaga 420

acttgtggtg gtgcttaa 438

<210> 12

<211> 145

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Aprotinin sequence fused to sequence of the alpha mating factor

from S. cerevisiae

<400> 12

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

1 5 10 15

Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln

20 25 30

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

35 40 45

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

50 55 60

Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val

65 70 75 80

Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro

85 90 95

Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala

100 105 110

Lys Ala Gly Leu Cys Gln Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys

115 120 125

Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly

130 135 140

Ala

145

Claims

1.一种用于重组产生丝氨酸蛋白酶的方法，包括：

(a)培养包含一个或多个载体的宿主细胞，其中所述一个或多个载体以可表达的形式编码所述丝氨酸蛋白酶和所述丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂，其中所述丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂相对于所述丝氨酸蛋白酶是异源的，所述培养在其中所述丝氨酸蛋白酶和所述丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂被表达的条件下进行；或

(a')培养宿主细胞，所述宿主细胞的基因组以可表达形式编码所述丝氨酸蛋白酶和所述丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂，所述培养在其中所述丝氨酸蛋白酶和所述丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂被表达的条件下进行，其中所述丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂相对于所述丝氨酸蛋白酶是异源的，且其中通过应用CRISPR技术已将所述丝氨酸蛋白酶和/或所述蛋白质抑制剂的编码序列导入所述宿主细胞基因组；以及

(b)分离步骤(a)或(a')中表达的丝氨酸蛋白酶。

2.权利要求1的方法，其中在步骤(b)中通过尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法或疏水相互作用色谱法分离所述丝氨酸蛋白酶。

3.权利要求1或2的方法，其进一步包括：

(c)蛋白水解处理分离的或纯化的丝氨酸蛋白酶，其中蛋白水解处理优选包括通过蛋白水解切割从所述丝氨酸蛋白酶中释放前肽。

4.一种宿主细胞，

(i)包括一个或多个载体，其中所述一个或多个载体以可表达的形式编码丝氨酸蛋白酶及所述丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂，或

(ii)所述宿主细胞的基因组以可表达的形式编码丝氨酸蛋白酶及所述丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂，其中通过应用CRISPR技术已将所述丝氨酸蛋白酶及/或所述蛋白酶抑制剂的编码序列导入所述宿主细胞基因组中，

其中，所述丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂相对于所述丝氨酸蛋白酶是异源的。

5.权利要求1至3任一项的方法或权利要求4的宿主细胞，其中所述丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂选自根据MEROPS数据库的I02类中所列出的抑制剂。

6.权利要求1至3任一项的方法或权利要求4的宿主细胞，其中所述蛋白质抑制剂选自由以下组成的组：抑肽酶、plasminostreptin(I16.001)、2型朊酶抑制剂K(PIN2K,I20.001)、大肠杆菌素(I11.001)、胰蛋白酶抑制剂MCTI-1(I07.001)、海鞘胰蛋白酶抑制剂(I05.001)、肽酶抑制剂5(KappaPI-actitoxin-Avd3a,I02.026)，以及组织因子途径抑制剂-2抑制剂单元1(TFPI2,I02.013)，并且优选是抑肽酶。

7.权利要求1至3、5和6任一项的方法或权利要求4-6任一项的宿主细胞，其中所述丝氨酸蛋白酶为具有EC编号3.4.21的丝氨酸蛋白酶。

8.权利要求7的方法或宿主细胞，其中所述丝氨酸蛋白酶为清创酶。

9.权利要求1至3以及5至8任一项的方法或权利要求4至8任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞为：

(a)酵母细胞，优选巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞；

(b)细菌细胞，优选大肠杆菌或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)细胞；或

(c)丝状真菌细胞，优选曲霉属(Aspergillus spec.)细胞。

10.权利要求1至3以及5至9任一项的方法或权利要求4至9任一项的宿主细胞，其中所述丝氨酸蛋白酶不是所述丝氨酸蛋白酶抑制剂的天然底物。

11.权利要求1至3以及5至10任一项的方法或权利要求4至10任一项的宿主细胞，其中所述丝氨酸蛋白酶与所述蛋白质丝氨酸蛋白酶抑制剂在所述宿主细胞中共表达。

12.权利要求1至3以及5至11任一项的方法或权利要求4至11任一项的宿主细胞，其中在所述一个或多个载体中，所述丝氨酸蛋白酶由第一表达盒表达，且所述丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂由第二表达盒表达，其中所述第一和第二表达盒优选在两个分开的载体上。

13.权利要求12的方法或宿主细胞，其中所述丝氨酸蛋白酶和所述丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂在相同或不同的强的、受调控的启动子的控制下。

14.权利要求13的方法或宿主细胞，其中所述丝氨酸蛋白酶与所述丝氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂在相同的强的、受调控的启动子的控制下。

15.权利要求14的方法或宿主细胞，其中所述宿主细胞为巴斯德毕赤酵母细胞，和/或所述强的、受调控的启动子为P_aox(醇氧化酶启动子)，优选为P_aox1或P_aox2。