CN110767262A - 一种基于结构的核酸适配体优化设计方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于核酸适配体设计技术领域，具体为一种基于结构的核酸适配体优化设计方法。本发明从SELEX技术筛选所得核酸适配体的3D结构出发，通过自发结合模拟获得小分子结合核酸适配体所形成复合物的3D结构；并分析复合物的结构和关键结合位点，利用所得信息指导高亲和力核酸适配体的优化设计；进而采用核酸适配体表面结合能的能貌图评估设计方案。本发明已用于特异结合毒素GTX1/4的核酸适配体GO18‑T‑d的优化设计中；该核酸适配体通过SELEX技术筛选所得，亲和力为75.63 nM。通过优化得到GO18‑T‑d的一个截短型核酸适配体(GO18‑T‑d_S)，采用MST实验验证该核酸适配体的亲和力提高了20倍；说明本优化方法是合理且有效的。

Description

一种基于结构的核酸适配体优化设计方法
技术领域
本发明属于核酸适配体设计技术领域，具体涉及核酸适配体优化设计方法。
背景技术
核酸适配体是与特异性靶标产生高亲和力的核糖核酸(RNA)或单链脱氧核糖核酸(ssDNA)，能够通过链内碱基间的氢键作用折叠形成稳定的二级或三级结构(1,2)。核酸适配体一般由几十个核苷酸组成，相对分子质量小、性质稳定、容易制备和修饰，能与离子、小分子、蛋白质、细胞和微生物等靶标结合。与小分子靶标结合的核酸适配体可特异性识别和区分小分子间极微小的差异，通常作为化学和微生物传感器的识别分子，广泛应用于食品和环境监测等领域(3)。
核酸适配体主要由SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponentialenrichment, 指数富集配基进化)(1,2)技术筛选得到，其基本原理：首先合成大量的（约1014-17条）随机DNA或RNA寡核苷酸链，然后进行多次循环的筛选富集，选出能与靶分子高特异性、高亲和力结合的寡核苷酸链。随着循环的进行，所选出的寡核苷酸链与靶分子结合的特异性和亲和力逐渐提高，最终得到与靶分子特异性结合且亲和力最高的一种或几种寡核苷酸链，即为该靶分子的适配体。但是传统的SELEX技术往往存在效率和命中率低的问题。这是由于寡核苷酸库并不能合成所有可能的寡核苷酸链，而且不同类型的寡核苷酸链存在合成速度的差异，这都会影响核酸适配体的筛选。
因此，急需提出一种post-SELEX (后SELEX)优化设计方法，以提高核酸适配体对靶标小分子的亲和力，但是理性的优化设计都需要核酸适配体与靶标小分子结合的结构信息。理论上，小分子结合核酸适配体所形成复合物的3D结构能够通过X射线结晶衍射(X-rayCrystallography)(4)和核磁共振(NMR, Nuclear Magnetic Resonance)(5)实验方法获得。但是，核酸适配体具有较强的灵活性，这些方法难以大量应用。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种采用分子动力学模拟，并基于复合物的结构和关键结合位点的核酸适配体的优化方法，记为post-SELEX优化方法。
本发明的另一目的是提供靶向GTX1/4的核酸适配体GO18-T-d的截短型高亲和力变异体(GO18-T-d_S)。
本发明提出的采用分子动力学模拟优化核酸适配体的方法，采用自发结合模拟获得靶标小分子结合核酸适配体所形成复合物的稳定结构和关键结合位点，规避了核酸适配体因灵活性较强而难以通过实验方法获得其3D结构这一问题。随后通过分析复合物的结构和关键结合位点理性地设计亲和力增强的核酸适配体，并采用核酸适配体表面结合能的能貌图评估优化方案。为SELEX筛选所得的核酸适配体提供一种合理且有效的post-SELEX优化方法。
具体而言，本发明提供的基于结构的核酸适配体优化方法，记为post-SELEX优化方法，其具体步骤为：
第一步：进行配体自发结合无偏性分子动力学模拟
第一步旨在获得稳定的靶标小分子结合核酸适配体所形成复合物的3D结构。配体自发结合的无偏性分子动力学（MD, molecular dynamics）模拟不仅能够可靠地确定配体的结合路径和结合位点，还可以获得复合物的稳定构象(6)。其中，靶标小分子的通用AMBER力场(GAFF, general AMBER force field)参数将采用AmberTools自带的Antechamber软件包生成(7)。获得小分子的力场参数后，为了避免长程相互作用的影响，小分子与核酸适配体表面的距离应在15 Å以上。同时采用Gromacs-5.1.4分子动力学软件包，AMBER99bsc1力场以及SPC水模型对核酸适配体系统进行建模(7,8)。在模拟系统中，核酸适配体置于水立方体的中心，水立方的表面与核酸适配体的最小距离为15 Å。为了与实验中的溶液环境保持一致，将插入金属阳离子和相应的阴离子使溶液环境保持中性，并达到所需的离子浓度。模拟过程采用周期性边界条件，静电和范德华相互作用分别采用Particle-MeshEwald (PME)(9)和Cut-off方法计算，截断距离均为14 Å。所有化学键均受LINCS算法(10)约束，因此积分时间步长为1~3 fs。通过v-rescale和berendsen耦合维持体系的温度和压强，最后对体系进行时间长度不少于1 μs（例如为1 -5μs）的分子动力学模拟。
第二步：分析复合物的结构和关键结合位点
在上一步结束后，获得了核酸适配体与靶标小分子的分子动力学模拟轨迹，这些轨迹显示了小分子结合到核酸适配体的整个过程，以及稳定的结合状态。核酸适配体复合物的3D原子结构有助于理性的优化设计。本发明根据靶标小分子结合到核酸适配体的分子动力学模拟轨迹，分析结构稳定期间核酸适配体和靶标小分子的相互作用，得到核酸适配体的关键结合位点。因为靶标小分子与核酸适配体之间的结合主要是通过氢键以及范德华相互作用，为了确定其关键结合位点，在结构稳定时间内，采用每个核苷酸与小分子形成氢键的数目以及距离靶标小分子最近的概率来表征这两个相互作用力；在范德华相互作用的分析中，计算每一帧中核酸适配体的每一个原子与靶标小分子每一个原子之间的距离，并识别最小距离的原子所属的核苷酸。
第三步：设计高亲和力的核酸适配体
通过分析靶标小分子与核酸适配体的结合过程、复合物的结构以及关键结合位点，理性地优化设计核酸适配体。具体而言，靶标小分子与核酸适配体的结合过程提供小分子进入结合位点的方位以及途径；复合物的结构提供核酸适配体与小分子的结合模式；关键结合位点的信息能够对核苷酸的重要程度进行排序。因此根据这些信息，针对性地突变特定位点的核苷酸、延长或截短核酸适配体，使得核酸适配体的亲和力提高。缺少这些信息，只能盲目的进行批量突变等实验，会造成时间和金钱的浪费。
第四步：绘制核酸适配体表面结合能的能貌图
表面结合能场对配体小分子结合在核酸适配体表面的概率起主导作用(11)。对于给定的模拟体系，利用AutoDock-4.2(12)中的半经验能量函数计算MD模拟中每一帧配体小分子结合核酸适配体的结合自由能，进而使用这些离散的能量值数据集绘制核酸适配体表面结合能的能貌图。为将所有靶标小分子定位在同一坐标系，将核酸适配体设定为一个球体，然后使用地理坐标系来定义小分子的MD位置。随后，采用等角投影法将球体展开为二维平面图，小分子的经度和纬度分别转换为横坐标和纵坐标。采用薄板样条(Thin-PlateSplines)法对核酸适配体与小分子的离散结合自由能进行平滑，投射到二维平面上。根据不同核酸适配体表面结合能的能貌图特征评估其亲和力。
本发明的一个实施例中，所述核酸适配体为G-四联体式的GO18-T-d，所述靶标小分子为靶向GTX1/4；优化得到核酸适配体，记为GO18-T-d_S。
本发明提供的post-SELEX优化方法，是通过自发结合模拟获得复合物的稳定结构，并采用核酸适配体表面结合能的能貌图评估核酸适配体与小分子的结合能力和概率。理性的优化设计需要复合物的3D原子结构信息，由于核酸适配体具有很强的灵活性，采用常规的实验方法很难获得其3D构型，而自发结合分子动力学模拟可以很好的替代这一过程。表面结合能的能貌图可以从结合能力和结合概率两个方面对亲和力的提升进行指导。因此采用这一优化方法，可以理性地优化核酸适配体以提高其亲和力。
附图说明
图1为post-SELEX优化方法的流程图。
图2为GO18-T-d序列和GTX1/4结构式。
图3为随时间变化GO18-T-d:GTX1/4体系的结合能。
图4为GO18-T-d:GTX1/4复合物的结构变化图。
图5为十个能量最低的GO18-T-d:GTX1/4复合物的叠加图。
图6为GO18-T-d中每个核苷酸最接近GTX1/4的概率和形成的氢键数目。
图7为核酸适配体表面结合能的能貌图。
图8为核酸适配体的MST实验。
具体实施方式
下面以靶向GTX1/4 (gonyautoxin 1/4)的G-四联体式核酸适配体GO18-T-d优化设计方法为例，进一步说明本发明方法具体过程。
第一步：进行自发结合分子动力学模拟
第一步是无偏好的自发结合模拟，目的是获得稳定且合理的GO18-T-d:GTX1/4复合物3D结构。核酸适配体GO18-T-d的序列和毒素小分子GTX1/4的结构如图2所示。GO18-T-d的结构由3D-Nus(13)和VMD(14)中的AutoPSF插件生成，并由温度依赖型分子动力学模拟筛选所得。毒素分子GTX1/4的GAFF参数采用AmberTools自带的Antechamber软件包生成。获得小分子的力场参数后，为了避免相互作用的影响，小分子GTX1/4与GO18-T-d表面的距离在15Å以上。同时采用Gromacs-5.1.4分子动力学软件包、AMBER99bsc1力场以及SPC水模型对核酸适配体模拟系统进行建模。在模拟系统中，核酸适配体置于水立方体的中心，水立方的表面与核酸适配体的最小距离为15Å。因为核酸适配体GO18-T-d为G-四联体，因此需要在G-四联体的两个平面中心置入一个金属阳离子——Mg2+，一方面是稳定G-四联体的结构，另一方面是吸引小分子GTX1/4(15)。为了保证实验与模拟的一致性，加入溶液中的金属阳离子和阴离子分别为Mg2+和Cl-，目的是确保G-四联体中心离子为Mg2+，溶液保持中性以及溶液中离子浓度为0.15nmol/L。模拟过程采用周期性边界条件，静电和范德华相互作用分别采用PME和Cut-off方法计算，截断距离均为14 Å。所有化学键均受LINCS算法约束，积分时间步长为2fs。具体过程为：首先利用最陡下降算法对模拟系统进行5000步的能量最小化。然后采用v-rescale恒温器控制系统在300K的温度下平衡50ps，berendsen压力耦合将系统压力耦合到1atm下平衡50 ps。最后，在md集成器中对体系进行长达1μs的分子动力学模拟。
第二步：分析复合物的结构和关键结合位点
通过自发结合模拟，能够得到GO18-T-d与GTX1/4的分子动力学模拟轨迹，这些轨迹显示了GTX1/4结合到GO18-T-d的整个过程，如图3、图4所示。GTX1/4在11.0 ns以前游离在溶液中。然后从A16右方进入结合区域，与GO18-T-d的5’-end的主链部分结合。在~168 ns后，5’-end的主链与GTX1/4的相互作用减弱，使GTX1/4大幅地调整自身构象，最终横跨在G-四联体上方。在此后的100 ns模拟中，5’-end在GTX1/4的作用下进行结构调整，最终在360.7ns时刻形成了稳定的复合物构象，如图5所示。我们将十个能量最低的复合物构象叠加在一起，它们与能量最低构象之间的平均RMSD值为2.827 Å，证明复合物的结构非常稳定。在这些构象中，GTX1/4位于G-四联体平面右上方，同时被GO18-T-d的5’-end所包围，形成一个紧密的结合构象。GO18-T-d的5’-end与G22和A16形成π-π堆积，在G-四联体平面上方形成一个稳定的拱形结构，同时G-四联体提供了一个足够大的平面以容纳GTX1/4，组成了一个结合空腔。以C3和C4之间的主链扭转为分割点，可以将5’-end划分为两部分。第一部分(A1A2C3)通过与A16形成π-π堆积作用稳定构象，芳香环之间的平均中心距离分别为3.59、3.49和3.79 Å。第二部分(C4T5T6T7)与G22之间也同样通过π-π堆积形成稳定的构象，芳香环之间的平均距离分别为3.69、3.88、4.05和3.78 Å。因此，π-π堆积作用是GO18-T-d构成紧凑构象的主要贡献作用力。
本发明根据小分子GTX1/4结合到GO18-T-d的分子动力学模拟轨迹，分析结构稳定期间GTX1/4和GO18-T-d的相互作用，得到核酸适配体的关键结合位点。与导致GO18-T-d本身形成稳定构象的贡献力不同的是，GO18-T-d和GTX1/4之间没有π-π堆积相互作用，主要是范德华和氢键相互作用。因此采用核苷酸距离小分子GTX1/4最近的概率表征范德华相互作用，核苷酸与小分子形成的氢键数目表征氢键相互作用。在范德华相互作用的分析中，计算每一帧中核酸适配体的每一个原子与GTX1/4每一个原子之间的距离，并识别最小距离的原子所属的核苷酸。具体过程为：将700~900 ns共2000帧作为结构稳定阶段，通过计算得到每一个核苷酸距离小分子最近的平均概率。如图6所示，GTX1/4倾向于结合在四个主要的核苷酸上：A2、C3、T7和G12，概率分别为0.06、0.06、0.27和0.59。氢键的计算则采用Gromacs-5.1.4中的gmxhbond模块分析所有可能的氢键，氢键定义的标准为：r≤rHB=0.35nm,α≤αHB=30°。氢键仍然采用平均2000帧的方法计算GTX1/4与每一个核苷酸形成的平均氢键数目。与距GTX1/4最近的概率相似，大多数的氢键是GTX1/4与A2、C3、T7和G12形成，氢键数目分别为0.93、0.84 、1.97和3.37。除此之外，GTX1/4还会与G13形成0.31个氢键。按照结合贡献进行排序，结果为：G12>T7>A2≥C3。结合能力强弱的排序有助于理性地设计高亲和力的核酸适配体。
第三步：设计亲和力增强的核酸适配体
分子动力学模拟轨迹显示，在GO18-T-d形成稳定的构象之前，5’-end具有很强的灵活性。因此5’-end与A16形成稳定的π-π堆积具有较大的难度，同时会阻碍GTX1/4进入结合位点。因此，认为截去5’-end的部分核苷酸，能够将GO18-T-d的结合位点暴露出来，提高GTX1/4与GO18-T-d的结合效率。同时由第二步所知，T7与GTX1/4具有较强的氢键和范德华相互作用，为了防止T7直接暴露在溶液中造成波动性增加，因此，5’-end截去前5个核苷酸，保留T6和T7。通过综合分析复合物的结构和关键结合位点，设计出新的核酸适配体，记为GO18-T-d_S。
第四步：绘制核酸适配体表面结合能的能貌图
为了评估优化后的核酸适配体，通过绘制GO18-T-d和GO18-T-d_S两个核酸适配体表面结合能的能貌图来阐述。对于给定的核酸适配体:GTX1/4体系，用AutoDock-4.2中的半经验能量函数计算MD模拟中每一帧GTX1/4结合核酸适配体的结合自由能。然后使用这些离散的能量值数据集绘制核酸适配体表面结合能的能貌图。为了将所有小分子定位在同一个坐标系中，我们将核酸适配体设定为一个球体，然后使用地理坐标系来定义GTX1/4的MD位置。其中原点为G-四联体两个平面中心的Mg2+离子；X轴和Y轴分别为原点与G19和G14(GO18-T-d)或G14和G9(GO18-T-d_S)中P原子的连线；Z轴则是X-Y平面的垂线，正轴方向依右手定则确定。最后采用薄板样条(Thin-Plate Splines)法对核酸适配体与GTX1/4的离散结合自由能进行平滑，投射到二维平面上。
为了阐明核酸适配体与GTX1/4的结合能力，根据局部能量极小值将结合能分为四个等级：深势阱(binding energy ≤ -8.0 kcal·mol-1)、浅势阱(-8.0＜binding energy≤ -4.0 kcal·mol-1)、能量壁垒(-4.0＜binding energy≤0 kcal·mol-1)和能量山冈(binding energy ≥ 0 kcal·mol-1)。同时定义只有当GTX1/4进入深势阱时，才认为核酸适配体:GTX1/4复合物的组合是成功的结合。通过对比GO18-T-d和GO18-T-d_S两个核酸适配体的能貌图，如图7所示，GO18-T-d含有一个深势阱和两个浅势阱而GO18-T-d_S含有两个深势阱和一个浅势阱，同时浅势阱的网格数较少。GO18-T-d的深势阱共包含167的格点，相较于GO18-T-d_S的284个格点少117个。这表明GTX1/4与GO18-T-d_S结合的可能性更高，不易被困在浅势阱当中，GO18-T-d_S具有更高的亲和力。
第五步：MST实验验证
本实验采用微量热泳动(MST, microscale thermophoresis)(16)实验确定核酸适配体与GTX1/4的结合亲和力。MST实验是利用分子的热泳动现象，通过测量温度梯度下的分子耦合时水化层、分子大小和表面电荷等微小变化引发的热泳动变化来分析分子之间的相互作用，目前该方法已广泛用于分析蛋白质与蛋白质、蛋白质和核酸、蛋白质与小分子、核酸与核酸、核酸与小分子之间的相互作用。实验中所用的毒素小分子GTX1/4购于加拿大国家研究委员会，所用核酸适配体以及其余化学试剂均购自上海生工生物工程有限公司。实验所用的设备为德国NanoTemperTechnologies的Monolith NT.115分子间相互作用仪。
1、样品准备：本发明用于MST实验的缓冲液与模拟条件保持一致，为150mmol/LMgCl2，并添加20 mmol/L Tris-HCl以维持体系的 pH为7.5。缓冲液制备完后用0.2μm的水相过滤膜过滤以除去溶液中的颗粒物。本实验所用的核酸适配体用缓冲液稀释到20μmol/L，取200μL核酸样品置于加热器中95 ℃加热10分钟,关闭加热器，再以2 ℃/min降至室温。
2、MST实验检测：MST实验用于测量KD值时，采用梯度稀释的方法，将GTX1/4溶液依次稀释成16组。具体操作为：①准备16个PCR管，编号为1到16。向第一个管中加入20μL的8 μmol/LGTX1/4溶液。②第2个到第16个管中分别加入10μL的缓冲液。③将前一管中的10μL依次转移到下一管中，并充分混匀，最后从第16管20μL溶液中吸走10μL。最终得到16管10μL且浓度依次减半的GTX1/4溶液。④每管中依次加入10μL的0.4 μmol/L荧光标记的核酸适配体溶液。分子动力学模拟显示，GTX1/4的结合位点为G-四联体上方，因此荧光标记(6-FAM)连接在核酸适配体的3’-end。此时体系中GTX1/4的初始稀释浓度为4μmol/L，核酸适配体缓冲液的浓度为10μmol/L，核酸适配体的浓度为0.2 μmol/L。避光室温孵育2h后用于MST实验。
确定核酸适配体和GTX1/4的浓度后，将样品置于毛细管中，并依此放入毛细管架的凹槽中，毛细管架装入MST仪器后，关闭仪器舱门。在操作界面上依次填写16个毛细管中GTX1/4的终浓度，然后将MST Power设定为40%，再点击操作界面的Start Cap Scan，查看扫描出来的16个毛细管的初始荧光值是否一致（保证荧光标记分子浓度一致）。如果不一致将会影响数据的收集和拟合，一般荧光值的偏差控制在10%之内。通过扫描毛细管中的样品还可以判断分子是否聚集于毛细管表面，当扫描结果为一个光滑的峰形图时，则说明管壁未聚集样品分子。当结果显示正常时，点击Start MST Measurement按钮进行MST实验。待实验结束后，将数据导入MO.Affinity Analysis软件进行分析。测量结果如图8所示，GO18-T-d的KD值为75.63nM，GO18-T-d_S的KD值为3.60nM。这表明新设计的核酸适配体——GO18-T-d_S的亲和力明显提高(> 20倍)。证明基于结构的核酸适配体post-SELEX优化方法是合理且有效的。
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Claims (4)

1.一种基于结构的核酸适配体优化设计方法，其特征在于，具体步骤为：
第一步：进行配体自发结合无偏性分子动力学模拟，以获得稳定的靶标小分子结合核酸适配体所形成复合物的3D结构；
其中，靶标小分子的通用AMBER力场参数采用AmberTools自带的Antechamber软件包生成；获得小分子的力场参数后，为了避免长程相互作用的影响，小分子与核酸适配体表面的距离在15 Å以上；同时采用Gromacs-5.1.4分子动力学软件包，AMBER99bsc1力场以及SPC水模型对核酸适配体系统进行建模；在模拟系统中，核酸适配体置于水立方体的中心，水立方的表面与核酸适配体的最小距离为15 Å；为了与溶液环境保持一致，将插入金属阳离子和相应的阴离子使溶液环境保持中性，并达到所需的离子浓度；模拟过程采用周期性边界条件，静电和范德华相互作用分别采用 PME方法计算，截断距离均为14 Å；所有化学键均受LINCS算法约束；其中，积分时间步长为1~3 fs；通过v-rescale和berendsen耦合维持体系的温度和压强，最后对体系进行时间长度不少于1 μs的分子动力学模拟；
第二步：分析复合物的结构和关键结合位点
由第一步获得了核酸适配体与靶标小分子的分子动力学模拟轨迹，这些轨迹显示了小分子结合到核酸适配体的整个过程，以及稳定的结合状态；根据靶标小分子结合到核酸适配体的分子动力学模拟轨迹，分析结构稳定期间核酸适配体和靶标小分子的相互作用，得到核酸适配体的关键结合位点；
由于靶标小分子与核酸适配体之间的结合主要通过氢键以及范德华相互作用，为了确定其关键结合位点，在结构稳定时间内，采用每个核苷酸与小分子形成氢键的数目以及距离小分子最近的概率来表征这两个相互作用力；在范德华相互作用的分析中，计算每一帧中核酸适配体的每一个原子与靶标小分子每一个原子之间的距离，并识别最小距离的原子所属的核苷酸；
第三步：设计高亲和力的核酸适配体
通过分析靶标小分子与核酸适配体的结合过程、复合物的结构以及关键结合位点，优化设计核酸适配体；其中，靶标小分子与核酸适配体的结合过程提供小分子进入结合位点的方位以及途径；复合物的结构提供核酸适配体与小分子的结合模式；根据关键结合位点的信息对核苷酸的重要程度进行排序；根据这些信息，针对性地突变特定位点的核苷酸、延长或截短核酸适配体，使得核酸适配体的亲和力提高；
第四步：绘制核酸适配体表面结合能的能貌图
表面结合能场对配体小分子结合在核酸适配体表面的概率起主导作用，对于给定的模拟体系，利用AutoDock-4.2中的半经验能量函数计算MD模拟中每一帧配体小分子结合核酸适配体的结合自由能，进而使用这些离散的能量值数据集绘制核酸适配体表面结合能的能貌图；为把所有靶标小分子定位在同一坐标系，将核酸适配体设定为一个球体，然后使用地理坐标系来定义小分子的MD位置；随后，采用等角投影法将球体展开为二维平面图，小分子的经度和纬度分别转换为横坐标和纵坐标；采用薄板样条法对核酸适配体与小分子的离散结合自由能进行平滑，投射到二维平面上；根据不同核酸适配体表面结合能的能貌图特征评估其亲和力。
2.根据权利要求1所述的基于结构的核酸适配体优化设计方法，其特征在于，其中，所述核酸适配体为G-四联体式的GO18-T-d，所述靶标小分子为靶向GTX1/4；优化得到核酸适配体，记为GO18-T-d_S。
3.一种由权利要求1所述优化设计方法得到的核酸适配体。
4.一种由权利要求2所述优化设计方法得到的核酸适配体。
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