CN110760543B - 一种运用绝缘子组合构建的慢病毒多启动子稳定表达载体及构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种运用绝缘子组合构建的慢病毒多启动子稳定表达载体及构建方法，属于生物医学工程技术领域。其将绝缘子IS22·3和绝缘子IS2整合入慢病毒载体；所述IS22·3的序列如SEQ ID No.1所示；所述绝缘子IS2的序列如SEQ ID No.2所示。所述慢病毒载体为用于RNA干扰实验的慢病毒载体。本发明针对现有慢病毒载体功能方面的某些空白，将绝缘子IS22·3和IS2整合入慢病毒载体，一方面可以隔离启动子间的相互干扰，另一方面可以防止基因沉默。这样既可以实现多基因表达又可以保障其表达的稳定性。

Description

一种运用绝缘子组合构建的慢病毒多启动子稳定表达载体及 构建方法

技术领域

本发明涉及一种运用绝缘子组合构建的慢病毒多启动子稳定表达载体及构建方法，属于生物医学工程技术领域。

背景技术

慢病毒载体(Lentiviral vector，LV)由于其可有效转染多种类的细胞，尤其可以非分裂细胞，受到研究者普遍青睐。目前成为外源性基因转移的有效载体，被广泛应用于基础实验研究和基因治疗领域。

真核生物在发育和生长过程中存在着基因有序的开放和关闭，这一过程中基因组的特定基因或基因簇在不同时间、不同空间的特异性表达。决定上述过程的除了顺式作用元件、反式作用元件等基因转录调节因子，启动子是根本元件。因为启动子是转录调控因子作用的靶点。因此，将不同的启动子同时整合入慢病毒实现多基因的表达无论在实验研究还是在基因治疗均有其现实意义。

二十多年以来慢病毒载体不断改进从第一代发展到第三代，成为了安全有效的载具。但是因为外源基因插入基因组DNA的随机性，其稳定表达和多基因转染方面鲜有突破。尽管在腺病毒有科学家尝试构建包含多启动子载体，据报道收到比较满意的效果，但就慢病毒而言多次的努力均因启动子间的相互干扰影响其表达功能而未能如愿，更谈不上这方面的商业性载体。

绝缘子是真核生物基因组DNA内固有的特殊序列，诸如CCCTC binding factor(CTCF)可以与其结合，从而隔绝调控元件干扰和染色质凝聚，维持基因表达的基本稳定性。基因组中另一种结构：核基质附着区(SARs/MARs，scaffold/ matrix attachmentregions)也具有屏障活性，使染色质形成独立的环状结构，防止启动子逐渐失活。SAR序列是顺式调控元件，MARs是指能够与核基质(nuclear matrix)特异性结合的DNA序列。结合区域被识别并命名为SAR/MAR识别特征(SAR/MAR recognition signature，MRS)。

绝缘子IS2是Francisco Martin等研究、设计并验证的一种嵌合的绝缘子，由鸡β珠蛋白基因调控区具有绝缘子特点的cHS4的核心序列HS4-650和合成的 SAR元件(SAR2，包含4MRS)组合而成，命名为IS2(Francisco Martin,Karim Benabdellah,et al.A chimericHS4-SAR insulator(IS2)that prevents silencing and enhances expression oflentiviral vectors in pluripotent stem cells[J].PLoS ONE, 2014,9(1):e84268.)。基于IS2他们开发了具有IS2保护下的SFFV启动子的慢病毒蛋白表达载体；而且IS2对聚合酶ⅢRNA启动子也有同样的保护作用 (Linsong Yang,Fang Wang,Xuzhang Lu,Min Zhou,Chunyan Ye,Yiwu Sun.The influence of a chimeric insulator on thestabilization of shRNA expression transfected by lentivirus.Life ScienceJournal，2019；16(5)：19-25)。

发明内容

本发明的目的是克服上述不足之处，提供一种运用绝缘子组合构建的慢病毒多启动子稳定表达载体及构建方法，其一方面可以隔离启动子间的相互干扰，另一方面可以防止基因沉默；既可以实现多基因表达，又可以保障其表达的稳定性。

本发明的技术方案，一种运用绝缘子组合构建的慢病毒多启动子稳定表达载体，将绝缘子IS22·3和绝缘子IS2整合入慢病毒载体；所述IS22·3的序列如 SEQ ID No.1所示；所述绝缘子IS2的序列如SEQ ID No.2所示。

IS22·3绝缘子位于具有螺旋结构域蛋白质基因(ZDHHC8)和网状内皮素-4受体基因之间的DNA序列，具有与CTCF结合特征(Groth AC,Liu M,Wang H,et al.Identificationand characterization of enhancer-blocking insulators to reduce retroviralvector genotoxicity[J].PLoS ONE,2013,8(10):e76528)。本发明用于构建慢病毒稳定表达载体，证明了其无论在RNAⅡ启动子还是RNAⅢ启动子慢病毒载体中的显著的稳定表达作用。

进一步地，所述慢病毒载体启动子为RNA聚合酶Ⅲ启动子，用于RNA i；具体为启动子U6和启动子H1。

进一步地，所述绝缘子IS2插入慢病毒载体3’长末端重复区3’LTR，绝缘子 IS22·3置于两个启动子之间，形成串链状组合结构。

进一步地，所述慢病毒载体骨架基于慢病毒载体pLenti6V5-GW-LaZ。

本发明的一种具体实施方式：

本发明所述双启动子慢病毒载体的基本设计及原理如图1所示；本发明将 IS2序列插入慢病毒3’长末端重复区(3’LTR)，IS22·3序列置于二个启动子之间 (图1A)。当病毒感染细胞并整合进入基因组DNA时，由于3’LTR替换5’LTR，形成串链状组合结构(图1B)，从而上述组合发挥它们维持外原基因表达和防止启动子相互干扰的作用。

具体的载体构建过程中尚使用了其他元件，具体如下：

构建成的完整慢病毒载体如图2所示，启动子使用了聚合酶ⅢRNA启动子 (U6、H1)，用于RNA i，MCS为多克隆位点。

(1)cPPT(HIV中央聚嘌呤区)：可以提高载体整合前核转位的效率。序列如SEQ IDNo.3所示。

(2)启动子U6和CMV/H1：U6和H1分别是小鼠和人RNA聚合酶Ⅲ启动子，CMV/H1由巨细胞病毒CMV增强子序列和H1嵌合产生的融合启动子，驱动作用远强于H1。

启动子U6序列如SEQ ID No.4所示；CMV序列如SEQ ID No.5所示H1序列如SEQ IDNo.6所示。

(3)PGK1-eGFP片段DNA：PGK1是小鼠Phosphoglycerate kinase 1启动子，eGFP为绿色增强荧光蛋白(eGFP),用于示踪。PGK1序列如SEQ ID No.7 所示。eGFP序列如SEQ IDNo.8所示。

(4)旱獭肝炎病毒的转录后调控元(Woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulation element,WPRE)可以进一步改善外源基因的表达。序列如SEQ ID No.9所示。

为了检测上述设计是否能够达到稳定表达的目的，本发明以红色荧光蛋白(DsRed)为靶点作RNA干扰(RNAi)实验。设计二条shDsRed,分别克隆入相应的多克隆位点(MCS)(如图3)。首先验证了IS2对RNA聚合酶Ⅲ启动子(U6、 H1)的稳定作用(图3A、B、C、D)，然后进一步比较多启动子(图3E)与单启动子的shDsRed质粒(图3C、D)的RNAi作用效果。

如图3所示，为表达shDsRed的慢病毒质粒，shDsRed1和shDsRed2作用于DsRed RNA的不同部位。

shDsRed1序列为：

CGGAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGCTCGAGCTTGAAGCGCATGAACT CCTTT；

shDsRed2序列为：

CGGAAGTTCATCGGCGTGAACTTCCTCGAGGAAGTTCACGCCGATGA ACTTT。

shDsRed慢病毒质粒在293T细胞中进行慢病毒包装并产生病毒，然后转染 293细胞进行病毒滴度测定。三组的含绝缘子的病毒质粒滴度明显达到一般病毒包装滴度标准>10⁶TU/ml。

首先对IS2对病毒滴度的影响做了比较，如图4所示，以未插入IS2的RNAi 病毒质粒为对照(LV-U6-R1-3’LTR；LV-H1-R2-3’LTR，图3A&B),IS2 (LV-U6-R1-IS2；LV-H1-R1-IS2；图3C&D)明显影响病毒的滴度。

图4为IS2对病毒滴度的影响：A.荧光显微镜下细胞内标记蛋白eGFP显示被病毒感染的细胞；B.流式细胞计数后获得病毒滴度。LV-U6-R1-3’LTR和 LV-H1-R2-3’LTR结构分别见图3A和B；LV-U6-R1-IS2和LV-H1-R1-IS2结构见图3C和D。图中，*,P<0.05；**,P<0.01；***，P<0.001。

然而，进一步比较可以看到表达shDsRed1和shDsRed2d的双启动子质粒 (LV-U6-R1-H1-R2-IS2，图3E)产生的病毒滴度明显高于单启动子表达质粒(图 5)，尤其与LV-U6-R1-IS2(图3C)相比较P<0.001。以往的研究表明绝缘子严重影响病毒滴度，而IS2与IS22·3的组合表现出与慢病毒其他构件的优良的兼容性。

如图5所示，为双启动子质粒的病毒滴度对比。A为荧光显微镜下细胞内标记蛋白eGFP显示被病毒感染的细胞。B为流式细胞分析病毒滴度。 LV-U6-R1-H1-R2-IS2(即图3E)滴度明显高于LV-U6-R1-IS2(图3C)和 LV-H1-R2-IS2(图3D)。病毒滴度(TU/mL)＝(10⁵细胞数×GFP+％)×1000×稀释倍数。

在DsRed小鼠纤维细胞进行靶向外源表达的DsRed基因的RNAi实验。通过检测红色荧光的相对平均荧光强度,图6比较了含IS2元件的DsRed质粒平均荧光强度的比较，显示其shDsRed对荧光强度的抑制明显强于原型质粒 (LV-U6-R1-3’LTR和LV-H1-R2-3’LTR)。

图6为IS2对平均荧光强度的影响。从图6可知，IS2增强了RNAi作用。 *,P<0.05；**,P<0.01.MFI：Mean Fluoresence Intensity.

相较与以上的比较，双启动子载体(LV-U6-R1-H1-R2-IS2)表现出了更强劲的DsRed荧光抑制作用，无论与其对照LV-U6-R1-IS2或LV-H1-R1-IS2相比。说明因其双shDsRed的稳定表达赋予了更有效的干扰活性(P<0.01)(图7)。这也证明，IS2-IS22·3组合结构因其屏障作用确实维持了二个启动子稳定的工作状态，增强了RNAi活性。

图7平均荧光强度比较(P<0.01)。LV-U6-R1-H1-R2-IS2(即图3E)滴度明显高于LV-U6-R1-IS2(图3C)和LV-H1-R2-IS2(图3D)。相对平均荧光强度 (Relative MFI)＝感染病毒细胞的MFI/未感染病毒细胞的MFI。

上述实验结果表明，IS2不仅对RNA聚合酶Ⅱ启动子(SSFV)具有屏障保护，而且对RNA聚合酶Ⅲ启动子(U6和H1)具有同样的作用。进一步利用二个绝缘子(IS2和IS22·3)组合成功构建了慢病毒双启动子稳定表达载体。与传统的慢病毒载体相比其不仅维持了较高的病毒滴度，而且展现了稳定和有效的双启动子表达功能。这种慢病毒载体为基因治疗和细胞转染研究提供新的工具。

本发明的有益效果：本发明针对现有慢病毒载体功能方面的某些空白，将绝缘子IS22·3和IS2整合入慢病毒载体。这种绝缘子的组合形成慢病毒的构件，一方面可以隔离启动子间的相互干扰，另一方面可以防止基因沉默。这样既可以实现多基因表达又可以保障其表达的稳定性。

附图说明

图1是双启动子慢病毒载体的基本设计及原理。

图2是慢病毒多启动子稳定表达载体结构。

图3是表达shDsRed的慢病毒质粒。

图4是单启动子病毒滴度对比。A、荧光显微镜下细胞内标记蛋白eGFP显示被病毒感染的细胞；B、流式细胞分析病毒滴度。

图5是双启动子质粒的病毒滴度对比。

A、荧光显微镜下细胞内标记蛋白eGFP显示被病毒感染的细胞。B、流式细胞分析病毒滴度。

图6是IS2对平均荧光强度的影响。

图7是单和双启动子质粒平均荧光强度比较(P<0.01)。

图8是克隆流程示意。

图9是pLenti6V5-GW-LaZ示意图。

图10是慢病毒骨架示意图。

图11是RRE-cPPT元件电泳图。

图12是嵌合绝缘子IS2电泳图。

图13是慢病毒架构构建示意图。

图14是含嵌合隔离子IS2的慢病毒载体构件基础质粒示意图和电泳图。

图15是PCR获得mU6启动子元件电泳图。

图16是PGK1-GFP-WPRE元件电泳图。

图17是LV-U6-IS2质粒鉴定电泳图。

图18是pLenti-IS22-3-CMV/H1慢病毒载体示意图。

图19是LV-U6-H1--IS2质粒鉴定。A、酶切鉴定；B、SnapGene软件质粒图谱。

图20是shDsRed1(R1)测序序列(碱基322-389)。

图21是shDsRed2(R2)测序序列(碱基493-558)。

图22是稳定转染后PT67细胞中DsRed表达。A、红色荧光视野；B、明场视野。

图23是转染1月后流式细胞仪检测PT67细胞中DsRed表达。A.PT67细胞；B.转染后的PT67细胞。

具体实施方式

以下实施例首先采用Snapgene软件在Invitrogen公司慢病毒载体序列(pLenti6V5-GW-LaZ)基础上分析其构件及酶切位点，然后将绝缘子、启动子及其他序列插入，设计、构建完整的新的慢病毒载体。载体DNA构件由高保真 PCR(Takara公司PrimerStar Polymeras)产生或从质粒酶切获得。引物由苏州泓迅公司合成(见表1),PCR反应体系如表2。然后采用经典分子克隆技术构建质粒(图8)。

表1

表2.PCR反应体系

实施例1基本慢病毒载体构建

(1)以Invitrogen公司的病毒载体(pLenti6V5-GW-LaZ)为模板，具体如图 9所示，图9中标示限制性内切酶及PCR引物位点。通过PCR产生病毒骨架的大部片段，病毒骨架如图10所示，其中5’引物(Bone-F)带有NsiI位点。M： Marke:14、10、8、6、5、4、3、2.5、2、1.5、1、0.5、0.2kb；泳道1：PCR获得骨架DNA片段，4280bp。PCR反应程序如表2所示。

表3

(2)cPPT由PCR产自质粒pLL3.7。5’端和3’端引物(cPPT-F；cPPT-R) 分别带有NotI和EcoRI酶切位点(见表1)。PCR反应具体体系及条件见表2和 4。RRE-cPPT元件如图11所示，M：Marker 14、10、8、6、5、4、3、2.5、2、 1.5、1、0.5、0.2kb；泳道1：PCR获得RRE-cPPT元件，1096bp。

表4.PCR反应程序

(3)IS2的DNA片段以慢病毒质粒pHR’SINcppt-SE-HS650pSAR2 (FranciscoMartin馈赠)为模板经PCR产生(表5)。所用引物IS2-F和IS2-R分别设计有EcoRI/KpnI和NsiI酶切位点。

表5.PCR反应程序

如图12所示，为嵌合绝缘子IS2。M：Marker 14、10、8、6、5、4、3、2.5、 2、1.5、1、0.5、0.2kb；泳道1：PCR获得IS2元件，1264bp。

(4)以上PCR产生的片段与相应的限制性内切酶反应过夜，酶切片段经凝胶电泳进行鉴定并分离,然后采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(北京庄盟)按照其方法回收纯化。三个PCR片段在T4 DNA ligase作用下连接成环状质粒(表6)。连接产物转化Stale大肠杆菌感受态细胞(New England Lab，NEB)，克隆由氨苄青霉素筛选，然后进一步酶切鉴定，最终获得含IS2的慢病毒基本质粒(图 13A，图14)。

表6.T4 Ligase连接反应，在14℃过夜

如图13所示，慢病毒架构构建示意，带下划线的酶切位点为片段连接的克隆位点。A.LV-IS2质粒；B.LV-U6-IS2质粒；C.LV-U6-H1-IS2质粒。

如图14所示，含嵌合隔离子IS2构件的慢病毒载体基础质粒(LV-IS2)及酶切鉴定。三片段链接(NotⅠ-EcoRⅠ-NsiⅠ)。M：Marker 14、10、8、6、5、4、 3、2.5、2、1.5、1、0.5、0.2kb；泳道1：KpnⅠ单酶切鉴定，6574bp。

实施例2含U6启动子的RNAi慢病毒载体构建

(1)U6启动子片段的产生：PCR以质粒pLL3.7为模板，5’引物(U6-F) 带有EcoRI位点；3’引物(U6-R)带有BamHI/PmlI/MluI/SalI位点。

表7.生成U6的PCR反应程序

如图15所示，PCR获得mU6启动子元件M：Marker 14、10、8、6、5、4、 3、2.5、2、1.5、1、0.5、0.2kb。A.泳道1：PCR获得314bp的mU6启动子元件。

(2)PGK1-GFP-WPRE如表1使用高保真Taq酶产自质粒pLL 3.7。其5’端引物(PGK-WPRE-F)带有SalI/BsiWI/XbaI位点，3’端引物(带PGK-WPRE-R) KpnI位点。PCR反应体系和条件如表2和4。

如图16所示，PGK1-GFP-WPRE元件。泳道2：PCR获得2087bp的 PGK-GFP-WPRE元件。M:Marker 14、10、8、6、5、4、3、2.5、2、1.5、1、 0.5、0.2kb。

(3)U6和PGK1-GFP-WPRE片段经相应的内切酶反应后产生匹配的粘端。在T4 DNALigase作用下(如表6)上述二个DNA片段插入基本病毒质粒的EcoRI 和KpnI位点。如图13B。

如图17所示，LV-U6-IS2质粒鉴定。M：Marker 10000、8000、6000、5000、 4000、3000、2000、1000bp；泳道1：SalⅠ单酶切质粒形成的单一条带8988bp；泳道2：EcoR V酶切形成2231bp和6144bp条带。

实施例3双启动子RNAi慢病毒载体的构建

IS22·3-CMV/H1片段以本发明人开发的pLenti-IS22·3-CMV/H1慢病毒载体 (图18)为模板，经MluI和SalI酶切产生粘端DNA片段，然后克隆入LV-U6-IS2 质粒的对应位点(图13B)。最终获得双启动子慢病毒载体LV-U6-H1-IS2质粒(图 13C)。

如图18所示，pLenti-IS22·3-CMV/H1慢病毒载体，含绝缘子IS22·3及融合启动子CMV/H1。

如图19所示，LV-U6-H1-IS2质粒鉴定。A.酶切鉴定，M：Marker 10000、 8000、6000、5000、4000、3000、2000、1000bp；泳道1：NdeⅠ单酶切质粒形成的单一条带9725bp；泳道2：EcoR V酶切形成2556bp和7169bp条带。B. SnapGene软件质粒图谱。

实施例4 shDsRed表达质粒构建

shDsRed根据Sigma公司的资料由泓迅公司合成引物(表1)。5’和3’引物分别带相应的酶切位点，在Taq酶(南京诺维赞)的存在下二条引物退火-延伸形成全长双链DNA，其茎环部带XhoI位点，以便克隆筛选鉴别。生成shDsRed 的反应体系95℃变性3分钟，后在72℃孵育10分钟，具体反应体系如表8所示。

表8

(1)LV-U6-R1-IS2：双链shDsRed1(R1)BamH1/MluI酶切后克隆入含 U6启动子的RNAi慢病毒载体(LV-U6-IS2，图13B和图3C)。

(2)LV-U6-R1-H1-R2-IS2：shDsRed1(R1)和shDsRed2(R2)分别经 BamH1/MluI和SalI/XbaI酶切克隆入LV-U6-H1-IS2载体(图13C和图3E)。

转化的克隆经XhoI酶切鉴定和进一步测序验证(图20、21)。图20为 shDsRed1(R1)测序序列(碱基322-389)；图21为shDsRed2(R2)测序序列 (碱基493-558)。

(3)LV-H1-R2-IS2：从LV-U6-R1-H1-R2-IS2经HpaI和XbaI酶切获得 CMV/H1-R2片段，该片段与前面的PGK1-GFP-WPRE片段(XbaI/KpnI)克隆入基本慢病毒载体的EcoRV和KpnI位点(图13A和图3D)。

(4)LV-U6-R1-3’LTR(图3A):从LV-U6-R1-IS2经EcoRI/SalI酶切获得 U6-R1片段，然后克隆入pLenti-IS22·3-CMV/H1慢病毒载体(图18)的EcoRI 和SalI位点。

(5)LV-H1-R2-3’LTR(图3B):上述(3)中的CMV/H1-R2片段克隆入 pLenti-IS22·3-CMV/H1慢病毒载体(图18)的EcoRV和XbaI位点。

实施例5病毒包装

五组质粒(图3)分与包装质粒(pLP1、pLP2、pLP-VSVG)分别转染293T 细胞，根据Invitrogen说明书，病毒包装时：包装质粒(pLP1、pLP2、pLP-VSVG) 9μg，载体质粒3μg，CPT高效转染试剂购自武汉维诺赛生物科技公司。转染前一天接种5×10⁶个293T细胞/100mm培养皿，于37℃，5％CO₂培养箱中过夜培养。第二天转染前3-4h，将培养基换为无抗性的完全培养基。准备两个无菌干净的离心管，分别标上A和B：在B管中加入适量无菌水，质粒DNA，50μL Buffer B(总量500μL)，混匀后，缓慢逐滴加入含500μL Buffer A的A管中；换一吸头用气泡法混匀转染混合物，室温静置30min。将转染混合物逐滴加入到细胞培养板中，轻轻晃动培养皿使转染混合物均匀铺至全板，混匀后放入37℃， 5％CO2培养箱中培养4-6h后换液。第三天将培养液换为含双抗的新鲜完全培养基，于37℃，5％CO₂培养箱中继续培养24-48h，收集病毒上清，并储存于-80 ℃备用。

实施例6 PT67DsRed细胞系

pCMV-DsRed-Express质粒(Invitrogen)以Lipo3000转染试剂为介质转染小鼠纤维细胞(PT67)，三天后传代细胞并加入G418(600μg/mL)进行筛选，3周后获得稳定表达红色荧光蛋白(DsRed)的小鼠纤维细胞(PT67DsRed)。

图22为稳定转染后PT67细胞中DsRed表达.A.红色荧光视野；B.明场视野。

图23为转染1月后流式细胞仪检测PT67细胞中DsRed表达。A.PT67细胞；B.转染后的PT67细胞。

实施例7病毒滴度测定

将生长状态良好的293T细胞消化计数后，铺24孔板，每孔1×105个细胞。第二天，将病毒按10倍梯度稀释，做连续5个稀释度后分别放入上述准备的细胞。第三天追加培养液每孔追加入500μL完全培养液。第五天收集细胞，流式细胞仪上样检测表达GFP阳性细胞的比例。病毒滴度(TU/mL)＝(10⁵细胞数× GFP+％)×1000×稀释倍数。

实施例8 RNAi检测

将PT67DsRed细胞消化计数并接种于96孔板，每孔1.5×104个细胞；第二天，更换培养液，50μL新鲜DMEM培养液中加入浓缩慢病毒，并加入聚凝胺 (polybrene)至终浓度8μg/mL，混合均匀后感染细胞；6-8h后，补加100μL 新鲜DMEM培养液，于37℃，5％CO2培养箱中培养过夜；第三天，收集细胞并用PBS清洗两遍，将细胞转移至六孔板培养；六孔板细胞生长90％以上时，收集细胞行流式细胞分析。为了更精确地反映两条两段DsRed-shRNA对红色荧光蛋白表达的RNAi效果，以同组未感染病毒的细胞测定的荧光强度为基准(以排除因细胞生长状态对红色荧光强度产生的影响)，测定感染病毒细胞的荧光强度，计算相对平均荧光强度。通过与对照比较DsRed的相对平均荧光强度判断对外源基因表达的影响，也就说明所设计的病毒载体的成功与非。

相对平均荧光强度(Relative MFI)＝感染病毒细胞的MFI/未感染病毒细胞的MFI。

序列表

<110> 常州市第二人民医院

<120> 一种运用绝缘子组合构建的慢病毒多启动子稳定表达载体及构建方法

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 896

<212> DNA

<213> IS22-3序列(IS22-3)

<400> 1

gtgaggctca gagaggtaag ggcgcaccct ttgtctgccc cctccccagc atggccaagt 60

cgctcccagg gtgcaggcga tggcaggcca tttgtctccc tcctgggtga gtctctggac 120

atggattctc acatttttta tttaagaatc agagagatat aagaatgtca aggaaaaatc 180

ctctcatgga caatgcagcc ccagtaaatg actgtcagcc ggcgtgtcca gggcttcaag 240

gccccaggaa gtggccatgc tggggctgcc aggcctctgg ctccagggtc actggggctg 300

aactgtctgc ccaggcccgg agacaccctg cccctgagga gcccaccggc ttggccagtc 360

catcttcttg gcactccctg accaccactt accttctagt cggacagtgg agcctggggg 420

gacagcgtgg cagagtgcct gatggtcggt gacaaagtca tctccaaagt ccttgctggg 480

gccaagagcc aggactcctt gcccgtcccc gtcactgccc tgtgcccgcc cagcacctgc 540

tggggactag gctgcccatt ggagaaggaa acacagtgct gggctgtgag ctcctgaagc 600

ctgtctctgt gccccaggac caggctcctg ggtggaggga gagaccaggg gcaggtgagg 660

aaaggcaggg cccccagaat ccctccatgc ctgcccctca gtctccagga cttatgtgca 720

ggtaccgttt ggagctgtgg tgcagttccc agtctcacca ccagatggca ccatgcccct 780

gcagaagcag tgcccagagc aggccaggtg gttctcgggg gctgcggtgg aggaatccac 840

ccagccgaag ctctggcagg gaaggggcag tgctaggtgg agccccctcc ccactt 896

<210> 2

<211> 1032

<212> DNA

<213> IS2序列(IS2)

<400> 2

gatcttgtct tcgaatatat cttattttaa aatcagttaa tataccttaa tggtatttaa 60

tgccaaattc aaagtgaatt gatcaagccc tcagtggcca ggtcatgggt gtgattttta 120

ctctgaaaga attacatatt tcattctttt ttattattct tttgttattg tctttgggct 180

gtttcttata tattttaaat gaggttgaca agttaacaaa cagctttttt ggggtgaaca 240

tattgggcgc aggcttatta ttaaagaaag tataccttca caatattaag tctttaagtt 300

caaaaataaa tgaggagcct ccgtttctgc attaacttag acattcatta atttctctca 360

caatttataa gtttatttaa atattctcac tgactccgtc ctggagttgg atgagagata 420

atggccttac gttgtgccag gggagggtcg ggctggattt agcaagattt accttctcca 480

aagagcggtg ctgcagtggc acagctgccc acggaggtgg gggggtcacc gtccctggag 540

gtgatgaaga actgtgggga tgtggcactg agggacatgg ccagtgggca cggtgggtgg 600

gttggggttg gtcttgggga tcttggaggg cttttccagc cttcatgatt tgacgattgt 660

atgaacatct acatggcaat tctccagctg cctgtcccag tcctactgac ccagctgtat 720

ctctccaggc aagctcttcc accccttctg cttgcatcca gacaccatca aacatgcagg 780

ctcagacaca ttttccccgt atccccccag gtgtctgcag gctcaaagag cagcgagaag 840

cgttcagagg aaagcgatcc cgtgccacct tccccgtgcc cgggctgtcc ccgcacgctg 900

ccggctcggg gatgcggggg gagcgccgga ccggagcgga gccccgggcg gctcgctgct 960

gccccctagc gggggaggga cgtaattaca tccctggggg ctttgggggg gggctgtccc 1020

cgtgagcaga tc 1032

<210> 3

<211> 180

<212> DNA

<213> cPPT序列(cPPT)

<400> 3

cgccaaatgg cagtattcat ccacaatttt aaaagaaaag gggggattgg ggggtacagt 60

gcaggggaaa gaatagtaga cataatagca acagacatac aaactaaaga attacaaaaa 120

caaattacaa aaattcaaaa ttttcgggtt tattacaggg acagcagaga tccagtttgg 180

<210> 4

<211> 314

<212> DNA

<213> 启动子U6(U6)

<400> 4

gatccgacgc cgccatctct aggcccgcgc cggccccctc gcacagactt gtgggagaag 60

ctcggctact cccctgcccc ggttaatttg catataatat ttcctagtaa ctatagaggc 120

ttaatgtgcg ataaaagaca gataatctgt tctttttaat actagctaca ttttacatga 180

taggcttgga tttctataag agatacaaat actaaattat tattttaaaa aacagcacaa 240

aaggaaactc accctaactg taaagtaatt gtgtgttttg agactataaa tatcccttgg 300

agaaaagcct tgtt 314

<210> 5

<211> 403

<212> DNA

<213> CMV序列(CMV)

<400> 5

acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg cccattgacg 60

tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg 120

gtggactatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt 180

acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg 240

accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg 300

gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt 360

ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggc 403

<210> 6

<211> 93

<212> DNA

<213> H1序列(H1)

<400> 6

atatttgcat gtcgctatgt gttctgggaa atcaccataa acgtgaaatg tctttggatt 60

tgggaatctt ataagttctg tatgagacca ctc 93

<210> 7

<211> 516

<212> DNA

<213> PGK1序列(PGK1)

<400> 7

aattctaccg ggtaggggag gcgcttttcc caaggcagtc tggagcatgc gctttagcag 60

ccccgctggg cacttggcgc tacacaagtg gcctctggcc tcgcacacat tccacatcca 120

ccggtaggcg ccaaccggct ccgttctttg gtggcccctt cgcgccacct tctactcctc 180

ccctagtcag gaagttcccc cccgccccgc agctcgcgtc gtgcaggacg tgacaaatgg 240

aagtagcacg tctcactagt ctcgtgcaga tggacagcac cgctgagcaa tggaagcggg 300

taggcctttg gggcagcggc caatagcagc tttgctcctt cgctttctgg gctcagaggc 360

tgggaagggg tgggtccggg ggcgggctca ggggcgggct caggggcggg gcgggcgccc 420

gaaggtcctc cggaggcccg gcattctgca cgcttcaaaa gcgcacgtct gccgcgctgt 480

tctcctcttc ctcatctccg ggcctttcga cctgca 516

<210> 8

<211> 720

<212> DNA

<213> eGFP序列(eGFP)

<400> 8

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtag 720

<210> 9

<211> 588

<212> DNA

<213> 旱獭肝炎病毒的转录后调控元(WPRE)

<400> 9

tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt attcttaact atgttgctcc 60

ttttacgcta tgtggatacg ctgctttaat gcctttgtat catgctattg cttcccgtat 120

ggctttcatt ttctcctcct tgtataaatc ctggttgctg tctctttatg aggagttgtg 180

gcccgttgtc aggcaacgtg gcgtggtgtg cactgtgttt gctgacgcaa cccccactgg 240

ttggggcatt gccaccacct gtcagctcct ttccgggact ttcgctttcc ccctccctat 300

tgccacggcg gaactcatcg ccgcctgcct tgcccgctgc tggacagggg ctcggctgtt 360

gggcactgac aattccgtgg tgttgtcggg gaaatcatcg tcctttcctt ggctgctcgc 420

ctgtgttgcc acctggattc tgcgcgggac gtccttctgc tacgtccctt cggccctcaa 480

tccagcggac cttccttccc gcggcctgct gccggctctg cggcctcttc cgcgtcttcg 540

ccttcgccct cagacgagtc ggatctccct ttgggccgcc tccccgca 588

Claims (2)

1.一种运用绝缘子组合构建的慢病毒多启动子稳定表达载体，其特征是：将绝缘子IS22∙3和绝缘子IS2整合入慢病毒载体；所述IS22∙3的序列如SEQ ID No.1所示；所述绝缘子IS2的序列如SEQ ID No.2所示；

所述慢病毒载体启动子为聚合酶Ⅲ RNA启动子，用于RNA i；具体为启动子U6和启动子H1；

所述绝缘子IS2插入慢病毒载体3’长末端重复区3’LTR，绝缘子IS22∙3置于两个启动子之间，形成串链状组合结构。

2.如权利要求1所述运用绝缘子组合构建的慢病毒多启动子稳定表达载体，其特征是：所述慢病毒载的骨架基于慢病毒载体Lenti6V5-GW-LaZ。

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