CN110754366A

CN110754366A - 一种广适性植物组织培养基及1/2培养基

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Publication number: CN110754366A
Application number: CN201911227289.XA
Authority: CN
Inventors: 陈新龙; 尚丽娜; 何光华; 桑贤春; 邢亚迪; 杜丹; 张莹莹; 赵芳明; 凌英华; 涂丹
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2019-12-04
Filing date: 2019-12-04
Publication date: 2020-02-07
Anticipated expiration: 2039-12-04
Also published as: CN110754366B

Abstract

本发明公开了一种广适性植物组织培养基及1/2培养基，每1000mL培养基中含有：KNO₃2662mg、(NH₄)₂SO₄264mg、NH₄H₂PO₄288mg、MgSO₄·7H₂O 370mg、CaCl₂332mg、MnSO₄·H₂O 15mg、ZnSO₄·7H₂O 4mg、H₃BO₃3mg、CoCl₂·6H₂O 0.02mg、CuSO₄·5H₂O 0.04mg、Na₂MoO₄·2H₂O 0.1mg、NaFeEDTA 37mg、肌醇100mg、烟酸2mg、盐酸硫胺素7mg、盐酸吡哆醇1mg、甘氨酸2mg；将大量元素含量减半，即得到1/2CS组织培养基。本发明植物组织培养基，其能广泛应用于多种植物组织培养，培养效果与MS培养基相当或优于MS培养基，且其在不引入新的易制爆成分的前提下，去除了现有培养基中含有的易制爆试剂NH₄NO₃，便于培养基的购买、储存及管理；而且用其配置的液体培养基的pH稳定性好。

Description

一种广适性植物组织培养基及1/2培养基

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，特别涉及一种植物组织培养基。

背景技术

MS培养基于1962年由Murashige和Skoog设计，是目前植物组织培养中应用最为广泛的培养基。据《危险化学品安全管理条例》(国务院令第591号)、《民用爆炸物品安全管理条例》及《易制爆危险化学品名录》(2017年版)可知，MS培养基的主要成分硝酸钾、硝酸铵均为易制爆管制试剂，随着国家监管越发严格，所有易制爆试剂的购买、储存及使用变得越来越困难，尤其是兼有硝态氮和铵态氮的硝酸铵，其纯品被禁止市场流通，为植物组织培养带来很大难度。B5培养基于1968年由Gamborg等为培养大豆根细胞而设计，N6培养基于1974年由朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计，两者均由MS培养基衍生而来，在有些植物组织培养研究中广泛应用，虽然B5和N6培养基除了硝酸钾外不含其他易制爆成分，但两者中的钙离子和镁离子含量均大幅降低，且B5培养基中铵离子大幅减少、N6培养基中钾离子大幅增加，这些离子浓度的大幅波动对一些植物的组织培养是不利的。CN102224802A草莓增殖培养基公开了一种无硝酸铵培养基，但其硝酸钾及硫酸铵含量过高，仅适用于草莓组织培养；CN105104208A一种草莓组织培养基及其配制方法公开了一种无硝酸铵培养基，在草莓组织培养中取得很好的效果，但其引入的尿素和硫酸铵成分含量过高，这对多种植物生长不利；CN108812313A一种植物组织培养的基本培养基及CN108812329A一种无NH4NO3植物组织培养用培养基分别公开了一种无硝酸培养基，获得较好的培养效果，但新引入的硝酸钙和硝酸镁两种成分均为易制爆试剂；CN109717076A一种植物组培专用培养基公开了一种无硝酸铵培养基，可提高植物组培成功率，但引入了易制爆试剂硝酸钠，且其仅适用于植物离体培养，不具有通用性。此外，现有的植物组织培养基，包括MS、B5、N6以及其他公开的植物组织培养基，它们被用于配制液体培养基时的pH值波动大，在用于植物水培时均需要调节pH，过程繁琐，耗费时间。因此，急需一种既无硝酸铵、也不引入新的易制爆成分，并且培养效果与MS培养基相当或优于MS培养基的广泛适用于多种植物组织培养的pH稳定型培养基。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种在不额外引入易制爆成分的前提下，去除了市场禁止流通的易制爆成分NH₄NO₃，且pH稳定的广泛适用于多种植物组织培养的植物基本培养基，以解决现有植物组织培养基存在的技术问题。

本发明广适性植物组织培养基，其每1000mL培养基中含有：KNO₃ 2662mg、(NH₄)₂SO₄ 264mg、NH₄H₂PO₄ 288mg、MgSO₄·7H₂O 370mg、CaCl₂ 332mg、MnSO₄·H₂O 15mg、ZnSO₄·7H₂O 4mg、H₃BO₃ 3mg、CoCl₂·6H₂O 0.02mg、CuSO₄·5H₂O 0.04mg、Na₂MoO₄·2H₂O 0.1mg、NaFeEDTA 37mg、肌醇100mg、烟酸2mg、盐酸硫胺素7mg、盐酸吡哆醇1mg、甘氨酸2mg。

本发明广适性植物组织1/2培养基，其每1000mL培养基中含有：KNO₃ 1331mg、(NH₄)₂SO₄ 132mg、NH₄H₂PO₄ 144mg、MgSO₄·7H₂O 185mg、CaCl₂ 166mg、MnSO₄·H₂O 15mg、ZnSO₄·7H₂O 4mg、H₃BO₃ 3mg、CoCl₂·6H₂O 0.02mg、CuSO₄·5H₂O 0.04mg、Na₂MoO₄·2H₂O0.1mg、NaFeEDTA 37mg、肌醇100mg、烟酸2mg、盐酸硫胺素7mg、盐酸吡哆醇1mg、甘氨酸2mg。

本发明的有益效果：

1、本发明植物组织培养基，其能广泛应用于多种植物组织培养，培养效果与MS培养基相当或优于MS培养基，可规模化推广使用。

2、本发明植物组织培养基，其在不新增加易制爆试剂种类的情况下，去除了现有培养基中含有的市场禁止流通的易制爆试剂NH₄NO₃，不仅消除了培养基的安全隐患，也便于培养基的购买、储存及管理。

3、本发明植物组织培养基，其配方用适量的(NH₄)₂SO₄和NH₄H₂PO₄取代NH₄NO₃及KH₂PO₄，该替换减少的钾离子和硝态氮通过适当增加KNO₃成分来补充，并且适当提高钾离子含量，可促进植物发芽，有利于维管束、纤维组织以及胚的发育。

4、本发明植物组织培养基，其不含碘化钾，在绝大多数植物中，碘元素不是必需元素，实验发现去除碘化钾对植物组织培养没有影响，并且植物在脱离培养基进行后期培养时仍可以从土壤等基质中富集碘元素，去掉碘化钾成分，也简化了培养基配制过程。

5、本发明植物组织培养基，其用NaFeEDTA取代Na₂·EDTA和FeSO₄·7H₂O，该替换减少的硫酸根离子通过适当增加硫酸铵成分来补充，该替换主要基于两个特征，一方面，NaFeEDTA是可溶性螯合铁，更容易被植物吸收，有利于植物叶绿体发育，另一方面，发明人发现，Na₂·EDTA和FeSO₄·7H₂O水溶液pH偏酸是MS、B5和N6等众多植物组织培养基原始pH偏低及pH波动大的主要原因，本发明培养基中使用NaFeEDTA之后，经pH为6.5-7.6的超纯水配制的CS培养基及1/2CS培养基的pH值稳定在5.24-6.68，而植物最适宜生长的pH一般为5.2-6.8，因此，使用NaFeEDTA既促进了植物对铁离子的吸收，又有利于培养基pH的稳定。

6、本发明植物组织培养基，其配方降低了MnSO₄·H₂O、ZnSO₄·7H₂O、H₃BO₃、CoCl₂·6H₂O、Na₂MoO₄·2H₂O的用量，增加了CuSO₄·5H₂O、烟酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇的用量，该改变特征在于，有效减少愈伤组织玻璃化发生，减少酚类物质产生，提高愈伤组织的出愈率，实验发现，优化后的培养基出愈时间提前，对多种植物的愈伤组织诱导是有益的。

附图说明

图1是1/2CS和1/2MS两种培养基上，哥伦比亚型拟南芥无菌苗培养的对比效果图，A：无菌苗在培养基中生长情况；B：无菌苗莲座叶及根系发育；C：萌发率；D主根长度；A和B中bar＝0.80cm；

图2是1/2CS和1/2MS两种培养基上，兰兹贝格型拟南芥无菌植株培养的对比效果图，A：无菌植株在培养基中生长情况；B：无菌植株地上部分及根系发育；C：无菌植株花器官发育(左)和花粉的亚历山大染色(右)；D：主根长度；E：株高；F：莲座叶长度；G：成熟花粉活力；A中bar＝1.10cm、B中bar＝1.60cm、C中花器官bar＝0.20cm、C中花粉bar＝15um；

图3是1/2CS和1/2MS两种培养基上，油菜无菌苗培养的对比效果图，A：无菌植株在培养基中生长情况；B：无菌苗地上部分及根系发育；C：茎高；D：茎中粗；E：主根长；F：大于1.00cm的根数；A中bar＝1.00cm、B中bar＝1.50cm；

图4是1/2CS和1/2MS两种培养基上，马铃薯无菌苗培养的对比效果图，A：无菌植株在培养基中生长情况；B：无菌苗地上部分及根系发育；C：茎高；D：茎中粗；E：根数；A和B中bar＝1.00cm；

图5是CS和MS两种培养基上，哥伦比亚型拟南芥叶片及根愈伤组织诱导的对比效果图，A：叶片愈伤组织；B：叶片愈伤组织诱导率；C：根愈伤组织；D：根愈伤组织诱导率；A和C中bar＝0.90cm；

图6是CS和MS两种培养基上，本氏烟草叶片及根愈伤组织诱导的对比效果图，A：叶片愈伤组织；B：叶片愈伤组织诱导率；C：根愈伤组织；D：根愈伤组织诱导率；A和C中bar＝0.95cm；

图7是CS和MS两种培养基上，水稻成熟胚愈伤组织诱导的对比效果图，A：水稻成熟胚愈伤组织；B：水稻成熟胚愈伤组织诱导率；A中bar＝0.80cm；

图8是用不同pH的超纯水(pH为6.5-7.6)配制的CS、MS、1/2CS和1/2MS液体培养基pH值稳定性比较效果图；

图9是在未调pH和将pH调至5.8的CS、MS、1/2CS和1/2MS液体培养基中马铃薯幼苗的生长状况的比较效果图，A：不同液体培养基培养前的无菌苗生长情况；B1、C1和D1：1/2MS未调pH液体培养基培养效果；B2、C2和D2：1/2CS未调pH液体培养基培养效果；B3、C3和D3：MS未调pH液体培养基培养效果；B4、C4和D4：CS未调pH液体培养基培养效果；B5、C5和D5：1/2MSpH 5.8液体培养基培养效果；B6、C6和D6：1/2CS pH 5.8液体培养基培养效果；B7、C7和D7：MS pH 5.8液体培养基培养效果；B8、C8和D8：CS pH 5.8液体培养基培养效果；A、B、C和D中bar＝2.20cm；

图10是对在未调pH和将pH调至5.8的CS、MS、1/2CS和1/2MS液体培养基中马铃薯幼苗的茎高(A)、茎中粗(B)、根长(C)、鲜重(D)进行统计的比较效果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。

实施例一，本实施例广适性植物组织培养基，其每1000mL培养基中含有：KNO₃2662mg、(NH₄)₂SO₄ 264mg、NH₄H₂PO₄ 288mg、MgSO₄·7H₂O 370mg、CaCl₂ 332mg、MnSO₄·H₂O15mg、ZnSO₄·7H₂O 4mg、H₃BO₃ 3mg、CoCl₂·6H₂O 0.02mg、CuSO₄·5H₂O 0.04mg、Na₂MoO₄·2H₂O 0.1mg、NaFeEDTA 37mg、肌醇100mg、烟酸2mg、盐酸硫胺素7mg、盐酸吡哆醇1mg、甘氨酸2mg。将本实施例中的广适性植物组织培养基命名为CS基本培养基。

实施例二，本实施例广适性植物组织1/2培养基，其每1000mL培养基中含有：KNO₃1331mg、(NH₄)₂SO₄ 132mg、NH₄H₂PO₄ 144mg、MgSO₄·7H₂O 185mg、CaCl₂ 166mg、MnSO₄·H₂O15mg、ZnSO₄·7H₂O 4mg、H₃BO₃ 3mg、CoCl₂·6H₂O 0.02mg、CuSO₄·5H₂O 0.04mg、Na₂MoO₄·2H₂O 0.1mg、NaFeEDTA 37mg、肌醇100mg、烟酸2mg、盐酸硫胺素7mg、盐酸吡哆醇1mg、甘氨酸2mg。将本实施例中的广适性植物组织1/2培养基命名为1/2CS基本培养基。

上述实施例中的CS基本培养基、1/2CS基本培养基与现有MS基本培养基及1/2MS基本培养基的成分对比如表1所示：

表1 MS、CS、1/2MS、1/2CS基本培养基成分表

上述实施例中的CS基本培养基和1/2CS基本培养基，若应用于植物组织培养中的固体培养基制作，可根据实际需要添加包含但不限于适量激素、蔗糖、葡萄糖、白糖、琼脂、植物凝胶、卡拉胶、大量元素水溶肥等，添加量同MS培养基一致，调节pH至5.8，121℃15min灭菌后摇匀分装；若应用于植物培养中的液体培养基制作，可不用调节pH，用超纯水(pH为6.5-7.6)充分溶解后定容，便可直接应用于大多数植物水培。

培养实例1：哥伦比亚型拟南芥无菌苗培养

(1)种子保存及消毒方法：

a、拟南芥种子保存方法：哥伦比亚(Col,Columbia)型拟南芥种子成熟后，收取种子于1.5mL离心管中，加入3-8颗变色硅胶干燥剂，用封口膜密封后置于4℃长期保存；

b、拟南芥种子杀菌消毒方法：取出经低温干燥保存的种子，于无菌环境下，将适量种子置于无菌1.5mL离心管中，加入适量体积的无菌水，将离心管颠倒几次后用低速离心机离心10s，小心倒掉上清，重复3次；加入75％酒精，将离心管颠倒几次后用低速离心机离心10s，小心倒掉上清；用无菌水清洗3次，低速离心10s后去除上清；加入适量体积的5％NaClO溶液，将离心管上下颠倒10-20次，低速离心10s后倒掉上清，重复2次；用无菌水清洗3次，低速离心10s后去除上清；加入无菌水，使种子完全浸泡在无菌水中，于4℃放置48h后播种。在种子质量良好的情况下，利用上述方法保存及消毒的无菌拟南芥种子，萌发率极高且几乎同时出苗。

(2)生长培养基配制：1/2CS基本培养基+蔗糖30g/L+植物凝胶8g/L，用超纯水溶解，pH 5.8。1/2CS基本培养基的成分及用量如表1所示。

(3)培养方法：将配制的1/2CS生长培养基分装于长7.5cm、宽7.5cm、高9cm的耐高温培养盒中，用移液枪吸取带有无菌水的无菌种子，吹打在无菌滤纸上，用无菌尖头镊子将种子均匀点播在培养基上；于温度22-24℃、湿度50-70％、光照强度1500-2000Lux、光照和黑暗交替(光照时间16h、黑暗时间8h)条件下培养。

(4)1/2CS生长培养基的培养结果为：哥伦比亚型拟南芥种子在1/2CS生长培养基上的萌发率为100％，培养16d的幼苗，表现为植株健壮，莲座叶均已伸展，叶色浓绿，根系发达、平均主根长为3.89cm。如图1所示。

对比培养例1：将1/2CS基本培养基替换为1/2MS基本培养基，其余完全同培养实例1，1/2MS基本培养基的成分及用量如表1所示。1/2MS生长培养基的培养结果为：哥伦比亚型拟南芥种子在1/2MS生长培养基上的萌发率为100％，培养16d的幼苗，表现为植株健壮，莲座叶部分伸展，叶色浓绿，根系发达、平均主根长为3.13cm。如图1所示。

培养实例1和对比培养例1的培养结果比较：哥伦比亚型拟南芥在1/2CS生长培养基和1/2MS生长培养基上的萌发率均为100％；在相同条件下培养16d时，与1/2MS生长培养基相比，1/2CS生长培养基中的幼苗长势更佳，主要表现为莲座叶长势更好、根系更为发达。如图1所示。

培养实例2：兰兹贝格型拟南芥无菌植株培养

培养实例2与培养实例1不同的地方在于：步骤(1)所用种子为兰兹贝格(Ler,Landsberg erecta)型拟南芥种子，兰兹贝格拟南芥较哥伦比亚拟南芥具有更早的花期，在适宜条件下培养，可以获得处于各发育时期的拟南芥无菌器官，包括根、胚轴、叶柄、子叶、莲座叶、茎、花、角果等，其余完全同培养实例1。

1/2CS生长培养基的培养结果为：兰兹贝格型拟南芥种子在1/2CS生长培养基上的萌发率为100％，培养28d的幼苗，表现为植株健壮、平均株高为4.79cm，莲座叶发达、平均最大莲座叶长为2.07cm，叶色浓绿，根系粗壮、平均主根长为7.16cm，花序含有较多花朵，花粉形态和活力均正常、平均有活力的花粉为93.1％。如图2所示。

对比培养例2：将1/2CS基本培养基替换为1/2MS基本培养基，其余完全同培养实例2，1/2MS基本培养基的成分及用量如表1所示。1/2MS生长培养基的培养结果为：兰兹贝格型拟南芥种子在1/2MS生长培养基上的萌发率为100％，培养28d的幼苗，表现为植株健壮、平均株高为3.92cm，莲座叶发达、平均最大莲座叶长为1.79cm，叶色浓绿，根系粗壮、平均主根长为6.15cm，花序发育良好，花粉形态和活力均正常、平均有活力的花粉为92.7％。如图2所示。

培养实例2和对比培养例2的培养结果比较：兰兹贝格型拟南芥种子在1/2CS生长培养基和1/2MS生长培养基上的萌发率均为100％；在相同条件下培养28d时，与1/2MS生长培养基相比，1/2CS生长培养基中的幼苗长势更佳，在平均株高、莲座叶大小、根长、花朵数量等方面均优于1/2MS生长培养基；并且，采用上述培养方法，不论是1/2CS生长培养基还是1/2MS生长培养基，均能获得形态完整的花粉，且花粉活力高达92.7-93.1％，其特点在于选择了兰兹贝格型拟南芥作为培养对象，且选择了高度适中的培养盒进行培养，克服了传统培养方法无法获得拟南芥整个生育期无菌苗的缺点，所获无菌花器官可直接用于花药离体培养等研究内容。如图2所示。

培养实例3：油菜无菌苗培养

与培养实例1不同的地方在于：步骤(1)所用种子为中双11号油菜种子，其余完全同培养实例1。

1/2CS生长培养基的培养结果为：中双11号油菜种子在1/2CS生长培养基上的萌发率为100％，培养9d的幼苗，表现为植株健壮、平均株高为4.11cm，叶色浓绿，茎秆粗壮、平均茎中粗为1.51mm，根系发达、平均根数为9.25个(>1.00cm)、平均主根长为9.74cm。如图3所示。

对比培养例3：将1/2CS基本培养基替换为1/2MS基本培养基，其余完全同培养实例3，1/2MS基本培养基的成分及用量如表1所示。1/2MS生长培养基的培养结果为：中双11号油菜种子在1/2MS生长培养基上的萌发率为100％，培养9d的幼苗，表现为植株健壮、平均株高为3.61cm，叶色浓绿，茎秆粗壮、平均茎中粗为1.25mm，根系发达、平均根数为8.85个(>1.00cm)、平均主根长为9.53cm。如图3所示。

培养实例3和对比培养例3的培养结果比较：中双11号油菜种子在1/2CS生长培养基和1/2MS生长培养基上的萌发率均为100％；在相同条件下培养9d时，与1/2MS生长培养基相比，1/2CS生长培养基中的幼苗长势更佳，其株高、根的数目优于1/2MS生长培养基，茎粗及平均主根长度与1/2MS生长培养基相近。如图3所示。

培养实例4：马铃薯无菌苗培养

生长培养基配制：1/2CS基本培养基+蔗糖30g/L+植物凝胶8g/L，用超纯水溶解，pH5.8。1/2CS基本培养基的成分及用量如表1所示。

培养方法：以克新18号马铃薯为例，将配制好的1/2CS生长培养基分装于长7.5cm、宽7.5cm、高9cm的耐高温培养盒中，选择生长旺盛的马铃薯脱毒苗，于无菌环境下，根据实际需要，用手术剪刀剪取约1cm长的至少带有1个叶芽的茎端或茎段，用弯头镊子将其1/3-1/2长度垂直插入培养基中；于温度22-23℃、湿度50-70％、光照强度2000-3000Lux、光照和黑暗交替(光照时间14h、黑暗时间10h)条件下培养。

1/2CS生长培养基的培养结果为：马铃薯茎端在1/2CS生长培养基上的存活率为100％，培养16d的幼苗，表现为植株健壮、平均茎高6.41cm、平均茎中粗为1.72mm，叶色浓绿，根系发达、平均根数为8个。如图4所示。

对比培养例4：将1/2CS基本培养基替换为1/2MS基本培养基，其余完全同培养实例4，1/2MS基本培养基的成分及用量如表1所示。1/2MS生长培养基的培养结果为：马铃薯茎端在1/2MS生长培养基上的存活率为100％，培养16d的幼苗，表现为植株健壮、平均茎高5.83cm、平均茎中粗为1.41mm，叶色浓绿，根系发达、平均根数为6个。如图4所示。

培养实例4和对比培养例4的培养结果比较：马铃薯茎端在1/2CS生长培养基和1/2MS生长培养基上的存活率均为100％；在相同条件下培养16d时，与1/2MS生长培养基相比，1/2CS生长培养基中的幼苗长势更佳，其茎高、茎中粗、根的数量均优于1/2MS生长培养基。如图4所示。

培养实例5：哥伦比亚型拟南芥叶片及根愈伤组织诱导

(1)拟南芥叶片愈伤组织诱导培养基：CS基本培养基+6-BA 0.5mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+植物凝胶8g/L，用超纯水溶解，pH 5.8。CS基本培养基的成分及用量如表1所示。

(2)拟南芥根愈伤组织诱导培养基：CS基本培养基+2,4-D 0.5mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+植物凝胶8g/L，用超纯水溶解，pH 5.8。CS基本培养基的成分及用量如表1所示。

(3)拟南芥叶片愈伤组织的诱导方法：用手术剪刀剪开长势良好的无菌叶片，用镊子将其取出摆放在步骤(1)的诱导培养基中，使伤口接触培养基；于温度23-25℃、湿度50-70％、光照强度1500-2500Lux、光照和黑暗交替(光照时间16h、黑暗时间8h)条件下培养。

(4)拟南芥根愈伤组织的诱导方法：用镊子取出无菌苗的根，用手术剪刀剪开后平铺于步骤(2)的诱导培养基中，培养条件同步骤(3)。

(5)CS诱导培养基的诱导结果为：拟南芥叶片愈伤组织诱导时，培养6-8d在切口处出现颗粒状愈伤组织，培养24-26d获得嫩绿色致密的团块状愈伤组织，颗粒状愈伤组织诱导率及愈伤组织总诱导率均为100％；拟南芥根愈伤组织诱导时，培养5-7d在切口处开始出现少量颗粒状愈伤组织，培养20-22d获得较大体积的淡黄色松脆型愈伤组织，且在愈伤组织周围观察到大量致密分布的白毛，颗粒状愈伤组织诱导率及愈伤组织总诱导率均为100％。如图5所示。

对比培养例5：将CS基本培养基替换为MS基本培养基，其余完全同培养实例5，MS基本培养基的成分及用量如表1所示。MS诱导培养基的诱导结果为：拟南芥叶片愈伤组织诱导时，培养7-10d在切口处出现颗粒状愈伤组织，培养24-26d获得嫩绿色致密的团块状愈伤组织，颗粒状愈伤组织诱导率及愈伤组织总诱导率均为100％；拟南芥根愈伤组织诱导时，培养6-9d在切口处开始出现少量颗粒状愈伤组织，培养20-22d获得淡黄色松脆型愈伤组织，在愈伤组织周围观察到大量致密分布的白毛，颗粒状愈伤组织诱导率及愈伤组织总诱导率均为100％。如图5所示。

培养实例5和对比培养例5的诱导结果比较：用上述方法进行哥伦比亚拟南芥叶片和根愈伤组织诱导时，CS诱导培养基与MS诱导培养基的颗粒状愈伤组织诱导率及愈伤组织总诱导率均为100％，但CS诱导培养基的愈伤组织出愈时间比MS诱导培养基提前至少1d；在相同培养条件下，与MS诱导培养基相比，经CS诱导培养基诱导的叶片团块状愈伤组织更大、诱导的根愈伤组织更多。如图5所示。

培养实例6：本氏烟草叶片及根愈伤组织诱导

培养实例6与培养实例5不同的地方在于，步骤(1)将6-BA 0.5mg/L替换为6-BA2mg/L；步骤(2)将2,4-D 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L替换为6-BA 2mg/L+NAA 0.5mg/L；步骤(3)所取叶片为本氏烟草无菌苗叶片，用手术剪刀将无菌叶片剪成0.5-1cm的小方块，用镊子将其平铺于诱导培养基；步骤(4)所取根为本氏烟草无菌苗的根，

CS诱导培养基的诱导结果为：本氏烟草叶片愈伤组织诱导时，培养15-18d的叶片明显增大增厚，叶片四周产生大量的淡绿色致密的愈伤组织，愈伤组织诱导率为100％，且在愈伤组织团块上已开始产生多个嫩绿色的不定芽；本氏烟草根愈伤组织诱导时，培养9-11d在切口处产生大量淡黄色致密的愈伤组织，愈伤组织诱导率为100％。如图6所示。

对比培养例6：将CS基本培养基替换为MS基本培养基，其余完全同培养实例6，MS基本培养基的成分及用量如表1所示。MS诱导培养基的诱导结果为：本氏烟草叶片愈伤组织诱导时，培养15-18d的叶片略微增厚，在叶片四周产生较少的淡绿色愈伤组织，愈伤组织诱导率为90％，在愈伤组织团块上产生的嫩绿色不定芽数量较少；本氏烟草根愈伤组织诱导时，培养9-11d在切口处产生大量淡黄色致密的愈伤组织，愈伤组织诱导率为100％。如图6所示。

培养实例6和对比培养例6的诱导结果比较：用上述方法进行本氏烟草叶片愈伤组织诱导时，CS诱导培养基愈伤组织诱导率为100％，而MS诱导培养基的诱导率仅为90％，在所述相同培养条件下，与MS诱导培养基相比，CS诱导培养基可更快诱导出大量致密的叶片愈伤组织、产生更多的不定芽；用上述方法进行本氏烟草根愈伤组织诱导时，CS诱导培养基与MS诱导培养基诱导出的根愈伤组织形态相近，两种培养基的根愈伤组织诱导率均为100％。如图6所示。

培养实例7：水稻成熟胚愈伤组织诱导

(1)水稻种子消毒及筛选：

a、选种：以籼稻缙恢10号为例，将水稻种子晾晒干燥后于4℃下长期保存，挑选籽粒饱满、大小基本一致的水稻种子，用剪刀从种子中部剪开，去除谷壳，将未发生霉变的带有胚的一半种子用于愈伤组织诱导实验；

b、杀菌消毒：于无菌环境下，将挑选的种子置于无菌三角瓶中，用无菌水清洗3-5次，75％酒精摇动清洗5min，无菌水清洗3-5次，5％NaClO浸泡30min(期间每隔5-10min摇动30s)，清水洗3-5次，种子表面的无菌水可用干燥的无菌滤纸吸去。

(2)配制诱导培养基：CS基本培养基+6-BA 0.5mg/L+2,4-D 2mg/L+蔗糖30g/L+植物凝胶8g/L，用超纯水溶解，pH 5.8。CS基本培养基的成分及用量如表1所示。

(3)愈伤组织的诱导方法：用弯头镊子将无菌种子的缺口一端倾斜插入CS水稻成熟胚愈伤组织诱导培养基，胚贴于培养基表面；于温度24-26℃、湿度50-70％、光照强度1500-2500Lux、光照和黑暗交替(光照时间16h、黑暗时间8h)条件下培养。

(4)CS诱导培养基的诱导结果为：水稻成熟胚愈伤组织诱导时，经CS诱导培养基诱导培养12-14d产生大量淡黄色结构致密的团状愈伤组织，出愈率为100％。如图7所示。

对比培养例7：将CS基本培养基替换为MS基本培养基，其余完全同培养实例7，MS基本培养基的成分及用量如表1所示。MS诱导培养基的诱导结果为：水稻成熟胚愈伤组织诱导时，经MS诱导培养基诱导培养12-14d产生大量淡黄色结构致密的团状愈伤组织，出愈率为100％。如图7所示。

培养实例7和对比培养例7的诱导结果比较：：用上述方法进行水稻成熟胚愈伤组织诱导时，CS诱导培养基与MS诱导培养基诱导出的愈伤组织形态大小均相近，出愈率均为100％。如图7所示。

培养实例8：液体培养基在植物水培中的应用

(1)用不同pH的超纯水配制的液体培养基pH值稳定性比较：

a、用不同pH的超纯水配制液体培养基：通常多种因素会导致相同超纯水制水机产出的超纯水pH变动较大，pH通常为6.5-7.0。分别选取pH为6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0和7.6的超纯水，分别配制MS液体培养基、CS液体培养基、1/2MS液体培养基、1/2CS液体培养基，制作方法为：MS液体培养基为取MS基本培养基置于不同pH的超纯水中溶解并定容至1L；CS液体培养基为取CS基本培养基置于不同pH的超纯水中溶解并定容至1L；1/2MS液体培养基为取1/2MS基本培养基置于不同pH的超纯水中溶解并定容至1L；1/2CS液体培养基为取1/2CS基本培养基置于不同pH的超纯水中溶解并定容至1L。

b、结果为：用pH为6.5-7.6的超纯水配制液体培养基时，MS液体培养基pH为4.34-6.44，CS液体培养基pH为5.24-6.35，1/2MS液体培养基pH为4.06-6.74，1/2CS液体培养基pH为5.43-6.68。植物最适宜生长的pH一般为5.2-6.8，观察可知，MS液体培养基及1/2MS液体培养基的pH偏酸性且波动较大，其应用于液体培养基时通常需要调节pH，过程繁琐，相比之下，CS液体培养基和1/2CS液体培养基在用不同pH超纯水(pH为6.5-7.6)配制时的pH都较为稳定，在未调pH的情况下，可直接用于多种植物培养。如图8所示。

(2)以克新18号马铃薯无菌苗为例，观察在未调pH和将pH调至5.8的液体培养基中马铃薯幼苗的生长状况：

a、培养基制作方法：随机选取超纯水，测得其pH为6.7-6.8，用于配制8种不同的液体培养基。第一种：1/2MS未调pH液体培养基，其为取1/2MS基本培养基置于pH为6.7-6.8的超纯水中溶解并定容至1L；第二种：1/2CS未调pH液体培养基，其为取1/2CS基本培养基置于pH为6.7-6.8的超纯水中溶解并定容至1L；第三种：MS未调pH液体培养基，其为取MS基本培养基置于pH为6.7-6.8的超纯水中溶解并定容至1L；第四种：CS未调pH液体培养基，其为取CS基本培养基置于pH为6.7-6.8的超纯水中溶解并定容至1L；第五种：1/2MS pH 5.8液体培养基，其为取1/2MS基本培养基置于pH为6.7-6.8的超纯水中溶解，调pH至5.8并定容至1L；第六种：1/2CS pH 5.8液体培养基，其为取1/2CS基本培养基置于pH为6.7-6.8的超纯水中溶解，调pH至5.8并定容至1L；第七种：MS pH 5.8液体培养基，其为取MS基本培养基置于pH为6.7-6.8的超纯水中溶解，调pH至5.8并定容至1L；第八种：CS pH 5.8液体培养基，其为取CS基本培养基置于pH为6.7-6.8的超纯水中溶解，调pH至5.8并定容至1L。

b、培养方法：从培养实例4所述培养基获得长势优良的马铃薯幼苗，在清水中缓苗2-3d后选取长势一致的马铃薯幼苗，如图9-A所示，置于上述8种不同液体培养基8d，每隔2d更新1次液体培养基；于温度22-23℃、湿度50-70％、光照强度2000-3000Lux、光照和黑暗交替(光照时间14h、黑暗时间10h)条件下培养。

c、结果为：在用未调pH液体培养基进行培养时，整体长势从优至弱分别为1/2CS未调pH液体培养基、CS未调pH液体培养基、1/2MS未调pH液体培养基、MS未调pH液体培养基；在用pH调至5.8的液体培养基进行培养时，整体长势从优至弱分别为1/2CS pH 5.8液体培养基、CS pH 5.8液体培养基、1/2MS pH 5.8液体培养基、MS pH 5.8液体培养基；不论是否调pH至5.8，CS液体培养基培养的马铃薯幼苗长势均优于MS液体培养基；不论是否调pH至5.8，1/2CS液体培养基培养的马铃薯幼苗长势均优于1/2MS液体培养基。如图9和图10所示。说明，1/2CS液体培养基和CS液体培养基应用于植物水培时，不论是否调节pH至5.8，均能获得很好的培养效果，克服了传统液体培养基必须调节pH后才适用于植物水培的缺点。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而其不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，则均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种广适性植物组织培养基，其特征在于：每1000mL培养基中含有：KNO₃ 2662mg、(NH₄)₂SO₄ 264mg、NH₄H₂PO₄ 288mg、MgSO₄·7H₂O 370mg、CaCl₂ 332mg、MnSO₄·H₂O 15mg、ZnSO₄·7H₂O 4mg、H₃BO₃ 3mg、CoCl₂·6H₂O 0.02mg、CuSO₄·5H₂O 0.04mg、Na₂MoO₄·2H₂O0.1mg、NaFeEDTA 37mg、肌醇100mg、烟酸2mg、盐酸硫胺素7mg、盐酸吡哆醇1mg、甘氨酸2mg。

2.一种广适性植物组织1/2培养基，其特征在于：每1000mL培养基中含有：KNO₃ 1331mg、(NH₄)₂SO₄ 132mg、NH₄H₂PO₄ 144mg、MgSO₄·7H₂O 185mg、CaCl₂ 166mg、MnSO₄·H₂O 15mg、ZnSO₄·7H₂O 4mg、H₃BO₃ 3mg、CoCl₂·6H₂O 0.02mg、CuSO₄·5H₂O 0.04mg、Na₂MoO₄·2H₂O0.1mg、NaFeEDTA 37mg、肌醇100mg、烟酸2mg、盐酸硫胺素7mg、盐酸吡哆醇1mg、甘氨酸2mg。