CN110751990A - 以ido1为靶点的抑制剂及其虚拟筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以吲哚胺2,3双加氧酶1(IDO1)为靶点的抑制剂虚拟筛选方法及其应用，具体涉及以IDO1为靶点，利用配位键限制策略的虚拟筛选技术结合体外生物活性评价进行小分子抑制剂筛选的新方法。体外活性测试结果表明，本发明所述化合物对IDO1靶点表现出较强的抑制活性。本发明所述方法可以更有效和高命中率地获得具有IDO1抑制活性的化合物，所发现的化合物可进一步用于开发新型抗癌药物。
Description
技术领域
本发明属医药化学技术领域，涉及药物筛选方法，具体涉及利用配位键限制策略的虚拟筛选技术结合体外生物活性评价进行小分子抑制剂筛选的新方法，尤其涉及以吲哚胺2,3双加氧酶1(IDO1)为靶点的小分子抑制剂的虚拟筛选模型及体外模型的建立方法，应用该方法可以更有效和高命中率地获得的具有IDO1抑制活性的化合物，可进一步用于开发新型抗癌药物。
背景技术
吲哚胺2,3双加氧酶1(IDO1)催化色氨酸分解代谢的初始和限速步骤，导致色氨酸的消耗和犬尿氨酸代谢产物的产生，两者都有利于IDO1的免疫抑制能力。作为免疫反应内生的分子调节剂，IDO1可作为防止过量免疫活性和免疫病理学的检查点，癌细胞也有可能受益于IDO1的免疫抑制作用。新出现的证据表明IDO1是负责肿瘤逃避宿主免疫的免疫机制的重要调节因子。大量临床研究证明了IDO1基因的表达水平在多种肿瘤中上调，包括卵巢癌，子宫内膜癌，结直肠癌和肝细胞癌等。
目前，存在至少七种IDO1小分子抑制剂在临床开发中，如临床试验注册表ClinicalTrial.gov所示。其中，5种化学结构已公开。5类结构包括：(1)吲哚和[5,6]杂环芳烃，例如临床候选物吲哚莫德和PF-06840003，(2)羟胺类，例如临床候选者epacadostat，(3)4-苯基咪唑(4-PIs),如临床候选物 navoximod,(4)1,2-二氨基取代和1-羟基-2-氨基取代的芳烃，包括候选物 KHK2455，(5)其它如BMS类化合物，BMS-986205.
药物先导化合物的常规筛选方法是通过随机筛选，该方法需要合成或收集大量化合物，利用建立的药理筛选模型进行大量筛选，以期从中发现有潜力的化合物进入临床前研究。因为常规筛选的效率低、成本高，盲目性大，本领域迫切需要用高效、快速筛选方法，以满足IDO1抑制剂开发的需要。
随着分子模拟和计算化学在药物研发中的应用，虚拟筛选为先导化合物的发现提供了一种快速、高效的筛选技术。该技术针对重要疾病特定靶标生物大分子的三维结构，从现有小分子数据库中，搜寻与靶标结合较好的化合物，大大降低实验筛选化合物数量，缩短研发周期。因此，建立一种快速、高效的IDO1 抑制剂的虚拟筛选技术对于新骨架类型IDO1先导化合物的发现具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速、高效的IDO1抑制剂的虚拟筛选方法，并将其成功用于发现靶向IDO1的小分子抑制剂。
本发明的设计构思：首先利用分子对接程序对小分子化合物库中的化合物进行对接打分评价，在虚拟筛选过程中需要加入配位键限制，以提高虚拟筛选的命中率，通过对这些分子进行K-means clustering聚类，挑选出化合物在细胞水平进行验证，筛选出具有IDO1抑制活性的候选分子。
基于上述设计构思。本发明采用如下技术方案：
一种IDO1抑制剂的虚拟筛选方法，包括如下步骤：
(1)吲哚胺2,3双加氧酶三维结构的获取、分析及处理；
(2)建立对接用小分子配体库；
(3)基于步骤(1)获得的数据信息构建虚拟筛选系统；
(4)运用步骤(3)构建获得的虚拟筛选系统对步骤(2)中的小分子配体库进行筛选，获得备选小分子；
(5)针对步骤(4)获得的备选小分子进行生物活性测试；
(6)分子相似性检索：基于步骤(5)筛选获得的具有生物活性的先导骨架，在小分子配体库进行相似结构化合物的检索，搜索与先导骨架具有相似结构的分子。
本发明方法步骤(1)中，在蛋白数据库(https://www.rcsb.org/)中获得IDO1 的三维结构(PDB code:4PK5),该结构为IDO1与其抑制剂Amg-1的复合物 (Amg-1与IDO1的结合口袋如图1所示)；使用薛定谔软件包中的 Maestro10.1(2015-01,version 10.1)的Proteinpreparation wizard模块进行准备，首先对蛋白进行加氢，并删除蛋白中的水分子，然后在OPLS_2005力场条件下对蛋白进行能量优化和最小化。
本发明方法步骤(2)中，建立对接小分子配体库；小分子结构在chemdiv 数据库中获取，使用薛定谔软件包中的Ligprep模块对配体进行优化，分别利用 Lipinski’s五规则，是否具有可反应基团，对化合物进行对接前筛选工作。
本发明方法步骤(3)中，使用薛定谔软件包中的Grid Generation以配体 Amg-1作为格点盒子生成格点文件，加入金属配位键限制。
本发明方法步骤(4)中，将准备的小分子配体与靶蛋白进行对接，首先使用薛定谔软件中Glide的HTVS(high-throughput virtual screening)模式进行初筛，并选取打分前10％的化合物用SP(standard precision)模式进行复筛，然后根据打分选取前10％的化合物用XP(extra precision)模式进行精筛，保留最后打分前30％的化合物(3800个)，然后对这些分子用薛定谔软件包中Canvas2.3 模块进行K-means clustering聚类，最后根据打分、配体的结合构象对化合物进行挑选，并筛选出具有IDO1抑制活性的化合物。
本发明方法步骤(5)中，根据虚拟筛选结果挑选化合物进行生物活性测试，以Hela细胞测试，最终筛选出具有IDO1抑制活性的化合物。
本发明方法通过三轮虚拟筛选得到24个化合物，其中化合物1,2和8具有 1,3,4-噁二唑和脲基核心结构(化合物1,2,8与IDO1的结合模式如图2,3,4所示) 因此对化合物1进行相似性检索，对检索到的化合物进行细胞抑制活性测试，得到11个化合物1的衍生物具有较好的细胞抑制活性。总共得到了35个具有较好细胞抑制活性的化合物。活性化合物具有如下特征：
化合物-1
英文名称：
1-(3,4-dimethoxyphenyl)-3-(3-(5-(4-methylbenzyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl)phenyl)urea
化合物结构：
化合物-2
英文名称：
1-(3-(5-(benzo[d][1,3]dioxol-5-ylmethyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl)phenyl)-3-(3,4-dimeth oxyphenyl)urea
化合物结构：
化合物-3
英文名称：
N-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-(4-oxo-5-(p-tolyl)thieno[2,3-d]pyrimidin-3(4H)-yl)aceta mide
化合物结构：
化合物-4
英文名称：
5-(4-methoxyphenyl)-N-(3-methylphenethyl)oxazole-4-carboxamide
化合物架构：
化合物-5
英文名称：
2-(chromeno[4,3-c]pyrazol-1(4H)-yl)-N-(3-(2-ethoxyphenyl)isoxazol-5-yl)acetamide
化合物结构：
化合物-6
英文名称：
2-(pyridin-4-ylthio)-N-((6-(p-tolyl)-[1,2,4]triazolo[4,3-b]pyridazin-3-yl)methyl)aceta mide
化合物结构：
化合物-7
英文名称：
2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yloxy)-N-(5-phenethyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)acetamide
化合物结构：
化合物-8
英文名称：
ethyl3-(3-(3-(5-(4-methylbenzyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl)phenyl)ureido)propanoate
化合物结构：
化合物-9
英文名称：
N-(3-acetylphenyl)-2-((5-phenylthiazolo[2,3-c][1,2,4]triazol-3-yl)thio)acetami de
化合物结构：
化合物-10
英文名称：
1-(5-(benzyl(methyl)amino)-1,3,4-thiadiazol-2-yl)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)urea
化合物结构：
化合物-11
英文名称：
2-((6-oxo-4-(pyridin-3-yl)-1,6-dihydropyrimidin-2-yl)thio)-N-(4-(p-tolyl)isoxazol-5- yl)acetamide
化合物结构：
化合物-12
英文名称：
5-cyano-2-((2-((4-methoxyphenyl)amino)-2-oxoethyl)thio)-4-oxo-6-phenyl-4,5-dihyd ropyrimidin-5-ide
化合物结构：
化合物-13
英文名称：
N-(4-acetylphenyl)-2-((5-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl)thio)aceta mide
化合物结构：
化合物-14
英文名称：
3-chloro-2-methyl-N-(2-(5-(4-methylbenzyl)-1H-1,2,4-triazol-3-yl)ethyl)benzenesulf onamide
化合物结构：
化合物-15
英文名称：
N-(4-methoxyphenyl)-5-oxo-3-(p-tolyl)-5H-thiazolo[3,2-a]pyrimidine-6-carboxamid e
化合物结构：
化合物-16
英文名称：
2-(4-ethylphenoxy)-N-(4-(4-propoxyphenyl)-1,2,5-oxadiazol-3-yl)acetamide
化合物结构：
化合物-17
英文名称：
3-fluoro-N-(2-(3-(4-methylbenzyl)-1H-1,2,4-triazol-5-yl)ethyl)benzenesulfonamide
化合物结构：
化合物-18
英文名称：
N-(2-methoxyethyl)-5-oxo-3-(p-tolyl)-5H-thiazolo[3,2-a]pyrimidine-6-carboxamide
化合物结构：
化合物-19
英文名称：
N-(benzo[d][1,3]dioxol-5-ylmethyl)-3-((5-(4-chlorophenyl)thiazolo[2,3-c][1,2,4]triaz ol-3-yl)thio)propanamide
化合物结构：
化合物-20
英文名称：
3-chloro-4-fluoro-N-(2-(3-(4-methylbenzyl)-1H-1,2,4-triazol-5-yl)ethyl)benzenesulfo namide
化合物结构：
化合物-21
英文名称：
(E)-3-(2-((2-hydroxynaphthalen-1-yl)methylene)hydrazinecarbothioamido)benzoate
化合物结构：
化合物-22
英文名称：
3-chloro-N-(2-(5-(4-methylbenzyl)-1H-1,2,4-triazol-3-yl)ethyl)benzenesulfonamide
化合物结构：
化合物-23
英文名称：
N-(3,4-dimethoxyphenethyl)-4-(4-methoxyphenyl)-1,2,3-thiadiazole-5-carboxamide
化合物结构：
化合物-24
英文名称：
(S)-1-(5-phenyl-1H-tetrazol-1-yl)-3-((3,4,5-trimethoxyphenyl)amino)propan-2-ol
化合物结构：
化合物-25
英文名称：1-isobutyl-3-(3-(5-(4-methylbenzyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl)phenyl)urea
化合物结构：
化合物-26，L604-1256
英文名称：
1-(4-acetylphenyl)-3-(3-(5-(4-methylbenzyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl)phenyl)urea
化合物结构：
化合物-27，L150-0770
英文名称：
1-(4-fluoro-3-(5-(4-methylbenzyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl)phenyl)-3-(4-fluorophenyl)ur ea
化合物结构：
化合物-28，L604-0616
英文名称：
ethyl 2-(3-(5-(4-methylbenzyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl)phenyl)ureido)acetate
化合物结构：
化合物-29
英文名称：
1-(2,3-dihydrobenzo[b][1,4]dioxin-6-yl)-3-(3-(5-(4-methylbenzyl)-1,3,4-oxadiazol-2- yl)phenyl)urea
化合物结构：
化合物-30
英文名称：
1-(3-(5-(benzo[d][1,3]dioxol-5-ylmethyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl)phenyl)-3-(3-methoxy phenyl)urea
化合物结构：
化合物-31
英文名称：
1-(3-(5-(benzo[d][1,3]dioxol-5-ylmethyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl)phenyl)-3-(3-fluoro-4- methoxyphenyl)urea
化合物结构：
化合物-32
英文名称：
1-(3-(5-(benzo[d][1,3]dioxol-5-ylmethyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl)phenyl)-3-(2-methoxy phenyl)urea
化合物结构：
化合物-33
英文名称：
1-(3-(5-(benzo[d][1,3]dioxol-5-ylmethyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl)phenyl)-3-(2,3-dihydr obenzo[b][1,4]dioxin-6-yl)urea
化合物结构：
化合物-34
英文名称：
1-(3-acetylphenyl)-3-(3-(5-(benzo[d][1,3]dioxol-5-ylmethyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl)ph enyl)urea
化合物结构：
化合物-35英文名称：
1-(3-(5-(benzo[d][1,3]dioxol-5-ylmethyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl)phenyl)-3-(4-fluoroph enyl)urea
化合物结构：
本发明还公开了所述的虚拟筛选方法筛选出上述化合物在制备以吲哚胺2,3 双加氧酶为靶点的小分子抑制剂药物中的应用。
本发明还公开了所述的虚拟筛选方法筛选出上述化合物在制备抗癌药物中的应用。
本发明根据筛选结果挑选化合物进行生物活性测试。结果显示，筛选的化合物具有IDO1抑制活性(如表1所示)，相似性检索的化合物也具有较好的IDO1 抑制活性(如表2所示)，证明本发明的筛选方法具有有效性。筛选的具有IDO1 抑制活性的苗头化合物可进一步作为抗肿瘤药物进行开发。
表1筛选得到的24个化合物的理化性质和活性数据。
a:氢键供体b:氢键受体c:脂水分配系数d:可旋转键的数目e:分子量
试验中每个处理设两次重复，表中数据为两次重复的平均值,SD为标准偏差
表2显示了通过相似性检索得到的11个化合物1的衍生物的理化性质和活性数据。
表2
本发明的吲哚胺2,3双加氧酶1的筛选方法，具有快速、经济、高效的优势，为寻找吲哚胺2,3双加氧酶1小分子抑制剂提供了基础。
附图说明
图1,IDO1的活性口袋。
图2,IDO1蛋白的活性结合位点(包含抑制剂Amg-1)。
图3，化合物1与IDO1蛋白的对接图。
图4，化合物2与IDO1蛋白的对接图。
图5，化合物8与IDO1蛋白的对接图。
具体实施方式
实施例1
按下述步骤筛选以吲哚胺2,3双加氧酶1为靶点的小分子抑制剂，
(1)吲哚胺2,3双加氧酶1(IDO1)蛋白三维结构的获取、分析和处理；
在蛋白数据库(https://www.rcsb.org/)中获得吲哚胺2,3双加氧酶1的三维结构(PDB code:4PK5)该结构为IDO1与其抑制剂Amg-1的复合物；使用薛定谔软件包中的Protein preparation wizard模块进行准备，首先对蛋白进行加氢，并删除蛋白中的水分子，然后在OPLS_2005力场条件下对蛋白进行能量优化和最小化。
(2)构建及处理对接用小分子配体库；
建立对接小分子配体库；小分子结构在chemdiv数据库中获取，使用Ligprep模块对配体进行优化，分别利用Lipinski’s五规则，是否具有可反应基团，对化合物进行对接前的预处理。
(3)构建虚拟筛选系统
使用薛定谔软件包中的Grid Generation以配体Amg-1作为格点盒子生成格点文件，其中加入金属配位键限制。
(4)用步骤(3)的计算机筛选系统对步骤(2)中的小分子配体库进行筛选：将准备的小分子配体与靶蛋白进行对接，首先使用薛定谔软件中的Glide的HTVS(high-throughputvirtual screening)模式进行初筛，并选取打分前10％的化合物用SP(standardprecision)模式进行复筛，然后根据打分选取前10％的化合物用XP(extra precision)模式进行精筛，保留最后打分前30％的化合物(3800 个)，然后对这些分子用薛定谔软件包中Canvas2.3模块进行K-means clustering 聚类，最后根据打分、配体的结合构象对化合物进行挑选，并筛选出具有吲哚胺2,3双加氧酶1抑制活性的苗头化合物。
(5)生物活性测试
为了进行基于HeLa细胞的IDO1抑制实验，以化合物BMS-986205化合物作为阳性对照，将HeLa细胞以50,000个细胞/孔接种到96孔微量培养板的100 μl生长培养基中，将细胞在37℃和5％CO 2下孵育过夜。第二天，100μL稀释抑制剂被加入生长培养基中的以使最终人IFNγ的浓度为100ng/mL。一系列的稀释液都是用0.1％DMSO配置，使得所有溶液中DMSO的浓度均为0.1％。将细胞在37℃下在CO2培养箱中温育24小时。第三天，将140μl培养夜移入新的96孔板中，并加入10μl的6.1N TCA，将孔板在50℃温育30分钟，以将IDO 产生的N-甲酰基犬尿氨酸水解成犬尿氨酸，然后将板以2500rpm离心10分钟以除去沉淀物。将每孔100μl上清液转移到另一个96孔板中并与100μl2％(w/ v)4-(二甲基氨基)苯甲醛在乙酸中混合，将板在室温下孵育10分钟，通过使用酶标仪((PerkinElmer，USA)测量480nm处的吸光度来记录来自犬尿氨酸的黄色。使用计算机软件Graphpad Prism分析吸光度数据。在不存在化合物和存在100ng/mLIFNγ的情况下，每个数据集中的吸光度(At)定义为100％，每个数据集中培养基空白(Ab)的吸光度定义为0％。根据下式计算每种化合物存在下的吸光度百分比：％吸光度＝(A-Ab)/(At-Ab)，其中A＝化合物和 IFNγ存在下的吸光度，Ab＝培养基空白吸光度，At＝不存在化合物但存在IFN γ时的吸光度。使用GraphPad Prism 6.0软件计算IC50值。
(6)相似性检索
基于命中的先导骨架进行相似性检索，搜索到14个化合物1的类似物，与步骤(5)同样方法测出这些化合物的IC50，发现有11个类似物的IC50小于 100μM。(表2所示) 。
Claims (8)
1.一种以吲哚胺2,3双加氧酶为靶点的小分子抑制剂的筛选方法，其步骤包括：
(1)吲哚胺2,3双加氧酶三维结构的获取、分析及处理；
(2)建立对接用小分子配体库；
(3)基于步骤(1)获得的数据信息构建虚拟筛选系统；
(4)运用步骤(3)构建获得的虚拟筛选系统对步骤(2)中的小分子配体库进行筛选，获得备选小分子；
(5)针对步骤(4)获得的备选小分子进行生物活性测试；
(6)分子相似性检索：基于步骤(5)筛选获得的具有生物活性的先导骨架，在小分子配体库进行相似结构化合物的检索，搜索与先导骨架具有相似结构的分子。
2.如权利要求1所述的以吲哚胺2,3双加氧酶为靶点的小分子抑制剂的筛选方法，其特征在于，所述步骤(1)中，在蛋白数据库https://www.rcsb.org/中获得吲哚胺2,3双加氧酶的三维结构PDB code:4PK5，该结构为吲哚胺2,3双加氧酶与其抑制剂Amg-1的复合物；使用薛定谔软件包中的maestro10.1的Protein preparation wizard模块进行准备，首先对蛋白进行加氢，并删除蛋白中的水分子，然后在OPLS_2005力场条件下对蛋白进行能量优化和最小化。
3.如权利要求1所述的以吲哚胺2,3双加氧酶为靶点的小分子抑制剂的筛选方法，其特征在于，所述步骤(2)的建立对接小分子配体库中；小分子结构在chemdiv数据库中获取，使用薛定谔软件包中maestro10.1的Ligprep模块对配体进行优化，分别利用Lipinski’s五规则，是否具有可反应基团，对化合物进行对接前筛选工作。
4.如权利要求1所述的以吲哚胺2,3双加氧酶为靶点的小分子抑制剂的筛选方法，其特征在于，所述步骤(3)中，使用薛定谔软件包中maestro10.1中的Grid Generation以配体Amg-1作为格点盒子生成格点文件，其中加入金属配位键限制。
5.如权利要求1所述的以吲哚胺2,3双加氧酶为靶点的小分子抑制剂的筛选方法，其特征在于，所述步骤(4)中，将准备的小分子配体与靶蛋白进行对接，首先使用薛定谔软件中maestro10.1里的Glide的HTVS(high-throughput virtual screening)模式进行初筛，并选取打分前10％的化合物用SP(standard precision)模式进行复筛，然后根据打分选取前10％的化合物用XP(extra precision)模式进行精筛，保留最后打分前30％的化合物，然后对这些分子用薛定谔软件包中Canvas2.3模块进行K-means clustering聚类，最后根据打分、配体的结合构象对化合物进行挑选，并筛选出具有吲哚胺2,3双加氧酶抑制活性的化合物，化合物的结构特征如下所示：
6.如权利要求1的以吲哚胺2,3双加氧酶为靶点的小分子抑制剂的筛选方法，并且对活性较好的化合物1,2和8的核心骨架进行相似性检索，其特征在于，筛选的具有吲哚胺2,3双加氧酶抑制活性的化合物为：
7.权利要求1至6任一项所述的虚拟筛选方法筛选出的化合物在制备以吲哚胺2,3双加氧酶为靶点的小分子抑制剂药物中的应用。
8.权利要求1至6任一项所述的虚拟筛选方法筛选出的化合物在制备抗癌药物中的应用。
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| CN109748838A (zh) * | 2019-01-31 | 2019-05-14 | 中国科学院南海海洋研究所 | 蒽醌类化合物及其制备方法和在制备酶抑制剂中的应用 |
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