CN110743103A - 一种促进脊髓来源神经干细胞修复损伤的磁场干预装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种促进脊髓来源神经干细胞修复损伤的磁场干预装置及方法，所述装置使用亥姆霍兹线圈，并设有用于测量磁场强度的高斯计。所述方法为将原代培养的脊髓源性神经干细胞用诱导分化培养基培养，并给予磁场辐射，磁场辐射的强度为0.2‑1.0mT。本发明提供了一种适于研究磁场对神经干细胞增殖分化和形成神经环路的影响的磁场干预装置，通过特定频率、强度参数的调控，激活脊髓内源性神经干细胞，动员神经干细胞的增殖分化能力，促进形成突触和神经环路，促进脊髓损伤修复，取得了预料不到的技术效果。

Description

一种促进脊髓来源神经干细胞修复损伤的磁场干预装置及 方法

技术领域

本发明涉及物理刺激促进神经修复技术领域，具体地说，涉及一种促进脊髓来源神经干细胞修复损伤的磁场干预装置及方法。

背景技术

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)通常是指由于外伤等多种原因所造成的脊髓直接损伤，导致损伤平面以下的运动和感觉功能不同程度的缺失，甚至运动和感觉功能完全丧失出现截瘫。SCI具有较高的发病率，除了造成机体四肢瘫痪和半身瘫痪外，还可能产生其他继发性疾病，严重影响患者生活的质量。SCI的治疗和康复一直是基础和临床医学领域的重大难题之一。

经颅磁刺激(transcranial magnetic stimulate，TMS)是磁刺激所产生的磁场在脑内诱发出局部的感应电流，这种感应电流可以促使神经细胞去极化，从而起到神经刺激和神经调节作用的一种技术。重复的经颅磁刺激(rTMS)被用于精神性疾患、神经系统疾病、疼痛综合症等的治疗。rTMS的基本原理是以不同频率脉冲磁场连续作用于脑组织，当可兴奋性脑组织处于瞬变磁场中，可产生垂直于磁场的感应电场和感应电流，当感应电流超过组织的兴奋阈值时，引起细胞膜局部去极化，使组织兴奋发生一系列的改变，从而产生相应的生物学效应。目前也有rTMS应用于SCI治疗的报道，其对于脊髓损伤的治疗主要是改善脊髓损伤的运动功能及各种并发症，机制可能在于经颅磁刺激刺激大脑运动皮质，使运动区的神经元产生去极化，增强皮质脊髓束的传导作用，促进轴突的生长，从而改善运动功能。但目前在磁场能否促进神经干细胞增殖分化并形成神经环路实现功能恢复方面鲜有报道，其相关修复机制及相关参数尚不清晰，也缺乏适用于精细地研究磁场对神经干细胞影响的装置。虽然现有技术也公开了一些磁场作用于细胞的实验装置，如专利文献CN105675855A，公开日2016.06.15，公开的一种用于细胞实验研究的低频磁场发生器，其基本组成包括：磁场发生器部分、线圈部分以及膜片钳记录部分组成，磁场发生器部分主要包括：MCU、人机交互模块、信号发生模块、功率放大模块、电源模块，人机交互模块实现用户命令的输入和显示，MCU作为核心实现信号的发生及各种参数的控制等，线圈通过可移动塑料臂固定在膜片钳显微镜镜臂上，用户通过人机交互部分选择信号的波形、强度和占空比等，单片机根据所选的参数控制信号发生部分输出对应的信号，然后送给功率放大电路，输出大电流驱动膜片钳上线圈产生用户预期磁场，刺激同时通过膜片钳电极记录细胞电生理特性；又如专利文献CN107274760A，公开日2017.10.20，公开的一种可调动态磁场实验装置，由载物台和底座上下两大部分组成，所述的载物台是一个圆环状的圆盘，圆环内部包含一个同心圆的试验台，试验台呈圆柱形，嵌于载物台圆环中间，底座的箱体通过防磁隔板将箱体内腔分为上层的磁场隔离腔和下层的部件腔，在底座部件腔的底部平面上，固定安装有电源、脉冲电流发生模块、波形控制等模块部件。但以上磁场设备的形状和结构导致设备具有不能获得均匀的磁场、不能测量磁场强度、不便于培养物的取放、无法有效防止培养物污染、不能测定培养物环境温度等缺陷，因此均不适用于精细研究磁场对神经干细胞增殖分化和形成神经环路的影响。

综上所述，有必要提供一种适用于研究磁场对神经干细胞增殖分化和形成神经环路的影响、能提供可控的均匀磁场、监控磁场强度、便于细胞材料取放、能有效防止细胞材料污染、能测定培养物环境温度的磁场干预装置，并进一步探索磁场对脊髓源性神经干细胞的作用及其刺激方法。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种适用于研究磁场对神经干细胞增殖分化和形成神经环路的影响、能提供可控的均匀磁场、监控磁场强度、便于细胞材料取放、能有效防止细胞材料污染、能测定培养物环境温度的磁场干预装置，以及促进脊髓来源神经干细胞修复损伤的磁场干预方法。

第一方面，本发明提供了一种促进脊髓来源神经干细胞修复损伤的磁场干预装置，设有稳压电源、函数信号发生器、功率放大器、电流表、高斯计、亥姆霍兹线圈；所述的稳压电源与交流电电源连接并稳定交流电；所述的函数信号发生器用于改变电流的频率或波形；所述的功率放大器用于产生更大的功率输出和调节功率输出；所述的亥姆霍兹线圈通过电流作用激发出均匀磁场；所述的电流表用于测量磁场的电流大小，所述的高斯计用于测量磁场强度。

作为一种优选的实施方式，所述的亥姆霍兹线圈包括水平放置、互相平行的两层线圈，分别为第一线圈和第二线圈。

更优选地，所述的第一线圈由第一固定板固定，所述的第一固定板为上下两层结构，所述的第一线圈位于第一固定板上下两层结构的中间；所述第二线圈由第二固定板固定，所述的第二固定板也为上下两层结构，所述的第二线圈位于第二固定板上下两层结构的中间。

更优选地，所述的第一固定板和第二固定板之间通过三根连接柱连接。

更优选地，所述的第一固定板的中央位置设有通孔，高斯计的磁场测定探头经由所述通孔垂直插入，悬垂在第一固定板和第二固定板之间。

更优选地，所述的第二固定板的中央位置设有隔离器皿，所述的隔离器皿包括上盖和底板。

作为另一种优选的实施方式，所述的磁场干预装置还设有温度计，所述的温度计用于监测整个系统的温度变化。

第二方面，本发明提供了一种促进体外脊髓源性神经干细胞向神经元分化的方法，包括以下步骤：将原代培养的脊髓源性神经干细胞用诱导分化培养基培养，并给予磁场辐射，磁场辐射的强度为0.2-1.0mT。

作为一种优选的实施方式，所述磁场辐射的强度为0.2或0.5mT。

作为另一种优选的实施方式，所述磁场辐射其频率为50Hz，为连续磁场，每12h处理一次，每天2次，每次处理1h，连续辐照5天。

作为另一种优选的实施方式，所述脊髓源性神经干细胞来自于成体小鼠。

作为另一种优选的实施方式，所述诱导分化培养基配方为：

试剂	终浓度
		DMEM/F12	64.66％
B-27 supplement 50x	2％
		N-2 supplement 100x	1％
双抗(Pen Strep)100x	1％
		FBS	1％

作为另一种优选的实施方式，在原代培养4-6d时开始给予磁场辐射。

作为另一种优选的实施方式，所述给予磁场辐射所使用的磁场干预装置为如前任一所述的促进脊髓来源神经干细胞修复损伤的磁场干预装置。

本发明优点在于：

1、本发明提供了一种适于研究磁场对神经干细胞增殖分化和形成神经环路的影响的磁场干预装置，填补了物理因素磁场促脊髓损伤修复的空白，该装置还具有以下优点：

1)亥姆霍兹线圈保证能获得均匀磁场；

2)设有高斯计，可测量磁场强度，并用电流表记录电流值，余下实验过程仅需将电流调节到所记录数值即可获得期望的恒定磁场。高斯计还能时刻监测磁场强度，有助于记录和获得精确的实验数据；

3)亥姆霍兹线圈使用上下两层结构的固定板固定，能获得有效保护；

4)固定板同时还提供了实验材料的放置平面，空间大，能放置多个培养板，并且便于取放；

5)设有隔离器皿，能将置于内部的实验细胞与外界隔离，有效防止污染；

6)设有温度计，可实时测定实验细胞所处环境温度。

2、本发明通过特定频率、强度参数的调控，激活脊髓内源性神经干细胞，而动员神经干细胞的增殖分化能力，形成突触并形成神经环路，促进脊髓损伤修复，并证实在本发明的诱导分化和刺激条件下促进脊髓内源性神经干细胞神经元突触形成和长度增加的作用最为显著，取得了预料不到的技术效果。

附图说明

附图1是本发明一种促进脊髓来源神经干细胞修复损伤的磁场干预装置的结构示意图。

附图2是一种亥姆霍兹线圈结构示意图。

附图3是另一种亥姆霍兹线圈结构示意图。

附图4是本发明的促进脊髓来源神经干细胞修复损伤的磁场干预装置的照片。

附图5是应用本发明的促进脊髓来源神经干细胞修复损伤的磁场干预装置干预脊髓来源神经干细胞的照片。

附图6是Tuj1免疫组化染色图。诱导分化5天后，极低频磁场辐照组的脊髓源神经干细胞分化出的神经元突起数量和长度增加。

附图7是神经元突起长度和突起数量的统计图。诱导分化5天后，极低频磁场辐照组的脊髓源神经干细胞分化出的神经元突起长度明显增加。

附图8是L型钙离子通道的表达。极低频磁场对Cav1.2和Cav1.3mRNA水平的表达没有影响。

附图9是T型钙离子通道的表达。极低频磁场明显上调了Cav3.1，Cav3.2，Cav3.3的mRNA表达水平。

附图10是T型钙离子通道蛋白的Western Blot实验结果和统计结果。不同强度极低频磁场辐照后，T型通道蛋白Cav3.1，Cav3.2，Cav3.3的表达上调。

附图11是I-V曲线。极低频磁场辐照后，钙电流增加。

附图12是I-V曲线。极低频磁场辐照后，T型钙电流明显增加。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

附图中涉及的附图标记和组成部分如下所示：

1.稳压电源 2.函数信号发生器

3.功率放大器 4.电流表

5.温度计 6.高斯计

61.磁场测定探头 7.亥姆霍兹线圈

71.第一线圈 72.第二线圈

81.第一固定板 82.第二固定板

9.连接柱 10.通孔

11.隔离器皿 111.上盖

112.底板 12.细胞培养皿

实施例1本发明促进脊髓来源神经干细胞修复损伤的磁场干预装置(一)

请参见图1，图1是本发明一种促进脊髓来源神经干细胞修复损伤的磁场干预装置的结构示意图。所述的磁场干预装置设有稳压电源1、函数信号发生器2、功率放大器3、电流表4、温度计5、高斯计6、亥姆霍兹线圈7。所述的稳压电源1与电源连接，以稳定交流电。所述的函数信号发生器2改变电流的频率、波形等，可以将交流电进行修改。所述的功率放大器3用于产生更大的功率输出。所述的电流表4用于测量磁场系统的电流大小。所述的温度计5用于监测整个系统的温度变化。所述的高斯计6用于测量磁场强度。所述的亥姆霍兹线圈7通过电流作用，激发出一定范围的均匀磁场。

请参照图2，图2是亥姆霍兹线圈结构示意图。所述的亥姆霍兹线圈7包括水平放置、互相平行的两层线圈，分别为第一线圈71和第二线圈72。所述的第一线圈71由第一固定板81固定，所述的第一固定板81为上下两层结构，所述的第一线圈71位于第一固定板81上下两层结构的中间。所述第二线圈72由第二固定板82固定，所述的第二固定板82也为上下两层结构，所述的第二线圈72位于第二固定板82上下两层结构的中间。所述的第一固定板71和第二固定板72之间通过三根垂直的连接柱9连接。所述的第一固定板71的中央位置还设有通孔10，高斯计6的磁场测定探头61经由通孔10垂直插入，悬垂在第一固定板71和第二固定板72之间。

本发明的磁场干预装置的使用方法为：1)连接交流电后通过函数信号发生器2和功率放大器3改变电流的频率和波形等，确定合适的参数。2)亥姆霍兹线圈7激发出一定强度的磁场，使用高斯计6检测磁场中心区域的强度。3)调节功率放大器3等设备，使得磁场强度达到所需要求，如100mt，记录此时电流表4的数值。4)每次使用时，调节参数，使得电流表4的数值达到记录数值，此时即为特定强度磁场。5)亥姆霍兹线圈7会激发出一定范围的均匀磁场，使用时将所需刺激的细胞或动物置于第二固定板82的中心区域即可。

需要说明的是，本发明中，磁场刺激的核心是亥姆霍兹线圈，由于亥姆霍兹线圈具有开敞性质，很容易地可以将其它仪器置入或移出，也可以直接做视觉观察，因此适用于研究磁场对神经干细胞增殖分化和形成神经环路的影响。当一对彼此平行且连通的共轴圆形线圈，其线圈内电流方向一致，大小相同，且线圈之间距离d正好等于圆形线圈的半径R时即为亥姆霍兹线圈。本实施例中所述的亥姆霍兹线圈7是上下分布的，因此可以产生一个圆柱形恒定磁场。将细胞或活体动物置于其中心圆柱区域，可对其进行恒定的磁场刺激。由于磁场强度与电流大小是相关的，因此使用高斯计6测量磁场强度，并用电流表4记录电流值，余下实验过程仅需将电流调节到所记录数值即可获得期望的恒定磁场。所述的第一固定板81和第二固定板82用于固定亥姆霍兹线圈，第一固定板81和第二固定板82均采用上下两层结构，能有效地保护亥姆霍兹线圈。所述的第二固定板82还提供了实验材料的放置平面。所述的通孔10便于高斯计6的磁场测定探头61的放置。所述的高斯计6能时刻监测磁场强度，有助于记录和获得精确的实验数据。本发明的磁场干预装置非常有利于磁场干预脊髓来源神经干细胞的研究，通过给予特定频率、强度的磁场，研究磁场与神经再生与神经环路重构的关系，用于修复脊髓损伤。

实施例2本发明促进脊髓来源神经干细胞修复损伤的磁场干预装置(二)

本实施例的促进脊髓来源神经干细胞修复损伤的磁场干预装置与实施例1所述的促进脊髓来源神经干细胞修复损伤的磁场干预装置基本相同，不同之处仅在于：请参见图3，图3是另一种亥姆霍兹线圈结构示意图，所述的第二固定板82的中央位置设有隔离器皿11，所述的隔离器皿11包括上盖111和底板112，所述的上盖111扣合在底板112上部以实现隔离器皿11内部与外部的隔离。使用过程中，将盛放培养基和实验细胞的细胞培养皿12放置于隔离器皿11的底板112上，然后盖好上盖111，即可开启磁场，以刺激实验细胞。

本实施例中，所述的隔离器皿11在使用前需灭菌，用于将置于内部的实验细胞与外界隔离，有效防止污染；隔离器皿11可以是圆柱形、正方体或长方体。

实施例3本发明促进脊髓来源神经干细胞修复损伤的磁场干预方法

1、极低频磁场辐照对脊髓源神经干细胞分化的神经元形态和功能的调控

为了探讨极低频磁场对脊髓源神经干细胞分化形成神经网络和神经回路的调控，我们利用形态学分析，统计了神经突起长度和突起数量。

处理方法：将来源于成年小鼠胸段脊髓的细胞使用小鼠成体脊髓神经干细胞完全培养液培养，将部分原代培养细胞使用增殖培养液进行传代鉴定其为脊髓源性神经干细胞，另取原代培养5d后的细胞制成单细胞悬液，使用诱导分化培养基诱导贴壁并促进分化，并自原代细胞消化后12h开始给予细胞磁场辐射，频率为50Hz，强度为0.2、0.5或1.0mT，连续磁场，每12h处理一次，每天2次，每次处理1h，连续辐照5天。

表1小鼠成体脊髓神经干细胞完全培养液配方

试剂	终浓度
		DMEM/F12	64.66％
B-27 supplement 50x	2％
		N-2 supplement 100x	1％
Neurobasal	10％
		双抗(Pen Strep)100x	1％
EGF	30ng/mL
		bFGF	30ng/mL
BDNF	10ng/mL
		GDNF	10ng/mL
Insulin	20μg/mL
		GlutaMAX supplement 100x	1％

表2小鼠成体脊髓神经干细胞增殖培养液配方

试剂	终浓度
		DMEM/F12	64.66％
B-27 supplement 50x	2％
		N-2 supplement 100x	1％
双抗(Pen Strep)100x	1％
		EGF	10ng/mL
bFGF	20ng/mL

表3小鼠成体脊髓神经干细胞诱导分化培养液配方

试剂	终浓度
		DMEM/F12	64.66％
B-27 supplement 50x	2％
		N-2 supplement 100x	1％
双抗(Pen Strep)100x	1％
		FBS	1％

在诱导分化并磁场处理5天后收细胞进行免疫荧光染色，用神经突起特异性标记物Tuj1标记神经元，再用显微镜成像并统计分析。Tuj1的免疫荧光染色(图6)和统计结果如图(图7)所示，诱导分化5天后，与对照组相比，0.2mT和0.5mT极低频磁场辐照组的脊髓源神经干细胞向神经元分化的比例也显著增加，神经元的突起数量增加，神经元的突起长度明显增加。而1.0mT强度的极低频磁场辐照组，脊髓源神经干细胞分化出的神经元数量和神经突起长度，与低强度的磁场辐照组相比反而有所减少。以上结果表明极低频磁场对分化而成的神经元的形态也有调控作用，可以明显促进神经元的突起生长，而更多的神经突起有助于其更好的形成突触联系及神经回路。

2、极低频磁场增加T型钙离子通道的表达和活性

为了阐明从脊髓源神经干细胞分化而来的神经元具有正常神经元的功能，具备相应的离子通道以便形成新的神经突触联系，我们利用膜片钳实验研究了钙通道的特性。

首先我们检测了极低频磁场辐照后钙离子通道蛋白的表达情况。我们收集了诱导分化5天后的细胞进行RNA抽提和Real-time实验，主要检测了L型钙离子通道和T型钙离子通道的表达情况。结果如图8所示，不同强度极低频磁场辐照后，Cav1.2和Cav1.3的mRNA表达没有明显变化。如图9所示，不同强度的极低频磁场辐照后，Cav3.1，Cav3.2，Cav3.3的mRNA表达水平明显上调。其中0.5mT这一强度磁场辐照的效果最为显著。

同时我们也收集了诱导分化5天后的细胞进行Western Blot实验，检测了不同强度极低频磁场辐照后T型钙离子通道蛋白水平的表达情况。结果如图10所示，与对照组相比，极低频磁场辐照组的Cav3.1，Cav3.2，Cav3.3的蛋白表达都有所增加，其中0.5mT和1.0mT强度的增强效果较为明显。根据以上结果，我们认为极低频磁场可以明显上调T型钙离子通道的表达，但对L型钙离子通道没有明显作用。

结合上述实验结果，我们选择了0.5mT和1.0mT强度磁场辐照并诱导分化5天后的细胞，进行全细胞膜片钳记录实验，记录钙电流。以钙电流/膜电容表示电流密度，绘制I-V曲线。结果如图11所示，0.5mT和1.0mT强度极低频磁场辐照后，钙电流明显增加。将膜电位钳制在-30mV时，钙电流达到最大。如图12所示，加入T型钙离子通道阻断剂TTA-P2后，钙电流基本被阻断。以上结果表明，极低频磁场辐照增强了T型钙离子通道的表达和活性。

根据以上实验结果，我们基本确定了极低频磁场促进脊髓源神经干细胞向神经元方向分化的分子机制。极低频磁场辐照增强了细胞钙离子通道的表达和活性，钙电流增加，从而使细胞内钙离子浓度增加。

因此，通过特定频率、强度的磁场，可实现神经再生与神经环路重构，有效修复脊髓损伤。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种促进脊髓来源神经干细胞修复损伤的磁场干预装置，其特征在于，设有稳压电源、函数信号发生器、功率放大器、电流表、高斯计、亥姆霍兹线圈；所述的稳压电源与交流电电源连接并稳定交流电；所述的函数信号发生器用于改变电流的频率或波形；所述的功率放大器用于产生更大的功率输出和调节功率输出；所述的亥姆霍兹线圈通过电流作用激发出均匀磁场；所述的电流表用于测量磁场的电流大小，所述的高斯计用于测量磁场强度。

2.根据权利要求1所述的磁场干预装置，其特征在于，所述的亥姆霍兹线圈包括水平放置、互相平行的两层线圈，分别为第一线圈和第二线圈。

3.根据权利要求2所述的磁场干预装置，其特征在于，所述的第一线圈由第一固定板固定，所述的第一固定板为上下两层结构，所述的第一线圈位于第一固定板上下两层结构的中间；所述第二线圈由第二固定板固定，所述的第二固定板也为上下两层结构，所述的第二线圈位于第二固定板上下两层结构的中间。

4.根据权利要求3所述的磁场干预装置，其特征在于，所述的第一固定板和第二固定板之间通过三根连接柱连接。

5.根据权利要求3所述的磁场干预装置，其特征在于，所述的第一固定板的中央位置设有通孔，高斯计的磁场测定探头经由所述通孔垂直插入，悬垂在第一固定板和第二固定板之间。

6.根据权利要求3所述的磁场干预装置，其特征在于，所述的第二固定板的中央位置设有隔离器皿，所述的隔离器皿包括上盖和底板。

7.根据权利要求1所述的磁场干预装置，其特征在于，所述的磁场干预装置还设有温度计，所述的温度计用于监测整个系统的温度变化。

8.一种促进体外脊髓源性神经干细胞向神经元分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：将原代培养的脊髓源性神经干细胞用诱导分化培养基培养，并给予磁场辐射，磁场辐射的强度为0.2-1.0mT。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述磁场辐射的强度为0.2或0.5mT。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述磁场辐射其频率为50Hz，为连续磁场，每12h处理一次，每天2次，每次处理1h，连续辐照5天。

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