CN110742172B - 一种改善牛血清蛋白热稳定性的方法，以及一种透明蛋白胶体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种改善牛血清蛋白热稳定性的方法，涉及蛋白改性领域，其将牛血清蛋白溶解在缓冲溶剂中配置成一定浓度的蛋白溶液，再加入植酸来改善牛血清蛋白的稳定性。该方法的操作简单方便，原料廉价易得，经过其改善后的牛血清蛋白在高温下可稳定存在，基本不会因蛋白质变性而沉淀析出。一种透明蛋白胶体及其制备方法，其同样是将牛血清蛋白溶解在缓冲溶剂中配置成特定浓度的蛋白溶液，再加入植酸以形成胶体。该制备方法的操作简单，条件温和，以牛血清蛋白为原料得到无色透明的蛋白胶体。该透明蛋白胶体无色透明的特性，使其在食品等领域具有较大的应用潜力。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白改性领域，具体而言，涉及一种改善牛血清蛋白热稳定性的方法，以及一种透明蛋白胶体及其制备方法。
背景技术
蛋白质的热稳定性主要取决于蛋白质的三维结构和蛋白质之间的相互作用，而双硫键和疏水作用在这些反应中发挥着重要的作用。蛋白质在加热的过程中，会通过双硫键或者其他非共价键作用形成大分子的聚合体，在酸化过程中这些聚合体会形成蛋白质的网状结构，氢键在这其中发挥着重要的作用。影响蛋白质热聚合的因素中，电荷、疏水性和巯基的含量起着至关重要的作用。
蛋白质的三维结构是由疏水相互作用、静电相互作用、氢键、范德华力这些弱相互作用力及二硫键所维持的。它们的稳定自由能⊿Gstab一般低于60kJ/mol,因此蛋白质构象稳定性很低。因此，用酸、碱、浓盐溶液、热和照射处理蛋白质能不同程度地改变蛋白质的构象。蛋白质的变性是它的构象以任何方式的改变（二级、三级或四级），它并不伴随着一级结构中肽键的断裂。热是引起蛋白质变性的最普通的物理因素。一般而言，大多数蛋白质在0-4℃之间较稳定，并且大多数的热变性都是不可逆的。变性的速度取决于温度，对于多数反应，温度提高10℃，反应速度提高约2倍。然而在典型的变性温度范围，对于蛋白质变性，温度提高10℃，反应速度提高约600倍。这正是稳定二级、三级和四级结构的每一个相互作用的能量较低的缘故结果。热处理被广泛地应用于蛋白质的分离纯化和加工保藏过程中，升温造成蛋白质的热变性对蛋白质的理化性质产生很大影响。在加工过程中，热变性可使蛋白质的功能性质发生不同程度的改变，为使得热变性的蛋白即可以增加蛋白的功能特性，也不形成沉淀影响它的应用，所以迫切需要改善蛋白质的热稳定性。
BSA（牛血清蛋白）是牛血浆蛋白的主要成分，主要影响牛血浆蛋白的功能特性，血浆或奶酪中的乳清和酪蛋白的生产，是众所周知的营养和功能蛋白的潜在来源，BSA是乳清蛋白的一个相对较小的组成部分，它有助于乳清蛋白的功能特性的改善，因此，有效利用血浆和乳清蛋白对于要提高BSA的功能特性至关重要。目前对改善BSA热稳定性的报道不多，且很多报道的热诱导形成不透明的蛋白胶体，而蛋白其中一个主要用途是在食品中使用，这样会局限了蛋白在食品领域和其他领域的应用范围。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种改善牛血清蛋白热稳定性的方法，其操作简单方便，原料廉价易得，可以有效改善牛血清蛋白的热稳定性，使其在高温环境下不易变性。
本发明的第二目的在于提供一种透明蛋白胶体的制备方法，其操作简单，条件温和，可以以牛血清蛋白为原料快速高效地制备得到透明蛋白胶体。
本发明的第三目的在于提供一种透明蛋白胶体，其由上述透明蛋白胶体的制备方法制备得到，该透明蛋白胶体的原料易得，生成条件简单，本身无色透明，在食品等领域具有较佳的应用潜力。
本发明的实施例是这样实现的：
一种改善牛血清蛋白热稳定性的方法，其包括：
将牛血清蛋白与缓冲溶液混合，制成浓度为1~10 mg/ml的蛋白溶液；
将蛋白溶液与植酸混合。
一种透明蛋白胶体的制备方法，其包括：
将牛血清蛋白与缓冲溶液混合，制成浓度为100~300 mg/ml的蛋白溶液；
将蛋白溶液与植酸混合，加热至80~100℃。
一种透明蛋白胶体，其由上述透明蛋白胶体的制备方法制备得到。
本发明实施例的有益效果是：
本发明实施例提供了一种改善牛血清蛋白热稳定性的方法，其将牛血清蛋白溶解在缓冲溶剂中配置成一定浓度的蛋白溶液，再加入植酸来改善牛血清蛋白的稳定性。该方法的操作简单方便，原料廉价易得，经过其改善后的牛血清蛋白在高温下可稳定存在，基本不会因蛋白质变性而沉淀析出。
本发明实施例还提供了一种透明蛋白胶体及其制备方法，其同样是将牛血清蛋白溶解在缓冲溶剂中配置成特定浓度的蛋白溶液，再加入植酸以形成胶体。该制备方法的操作简单，条件温和，以牛血清蛋白为原料得到无色透明的蛋白胶体。该透明蛋白胶体无色透明的特性，使其在食品等领域具有较大的应用潜力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例8所提供的透明蛋白胶体的示意图；
图2为本发明试验例所提供的不同温度、不同比例下的蛋白性状示意图；
图3为本发明试验例所提供的不同温度、不同比例下的蛋白溶解性曲线图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的一种改善牛血清蛋白热稳定性的方法，以及一种透明蛋白胶体及其制备方法进行具体说明。
一种改善牛血清蛋白热稳定性的方法，其包括：
S1. 将牛血清蛋白与缓冲溶液混合，制成浓度为1~10 mg/ml的蛋白溶液；
S2. 将蛋白溶液与植酸混合。
牛血清蛋白是牛血浆蛋白的主要成分，主要影响牛血浆蛋白的功能特性，血浆或奶酪中的乳清和酪蛋白的生产，是众所周知的营养和功能蛋白的潜在来源。牛血清蛋白在70℃以上即会发生变性，出现浑浊并开始沉淀，目前对改善牛血清蛋白热稳定性的报道不多，仅有的少量报道，不仅使用的材料复杂，操作起来也不是很方便。
基于此，本申请发明提出了一种改善牛血清蛋白热稳定性的方法，其采用植酸与缓冲溶液配合使用，对于一定浓度范围（1~10 mg/ml）内的牛血清蛋白溶液的热稳定性具有明显的改善作用。该方法不仅操作简单，而且使用的材料简单易得，具有较佳的使用价值。
可选地，牛血清蛋白与植酸的质量比为1：0.4~2。经过发明人大量的创造性劳动发现，植酸与牛血清蛋白的质量比至少要达到0.4:1，才能在70℃以上的高温表现出热稳定性。并且随着植酸的用量的进一步增加，这种改善效果还有一定程度的提高。在植酸与牛血清蛋白的质量比为1:1的时候，已经能得到较佳的结果。继续增加植酸的用量，对于改善效果的增加就不再那么明显。综合考虑到改善效果和对于植酸的损耗，将牛血清蛋白与植酸的质量比限定为1：0.4~2的范围内最为合适。优选地，牛血清蛋白与植酸的质量比为1：0.4~1.4。
进一步地，本发明实施例所采用的缓冲溶液的浓度为30~100 mM，缓冲溶液的pH为7.0~8.0。具体地，缓冲溶液包括Tris-HCl缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液和PBS缓冲液中的至少一种。优选地，缓冲溶液为Tris-HCl缓冲液。具体缓冲溶液的种类，可根据牛血清蛋白的应用环境进行选择。在本发明实施例中，只需要保证缓冲溶液的pH值范围，即可得到想要的改善热稳定性的效果。
本发明实施例还提供了一种透明蛋白胶体的制备方法，其特征在于，包括：
S1. 将牛血清蛋白与缓冲溶液混合，制成浓度为100~300 mg/ml的蛋白溶液；
S2. 将蛋白溶液与植酸混合，加热至80~100℃。
如前文所述，牛血清蛋白是乳清蛋白的一个相对较小的组成部分，它有助于乳清蛋白的功能特性的改善，有效利用血浆和乳清蛋白对于要提高牛血清蛋白的功能特性至关重要。但是，现有技术中，牛血清蛋白经过热诱导，往往形成不透明的蛋白胶体。而对于蛋白而言，其中一个主要用途是在食品中使用，不透明的特性会局限了蛋白在食品领域和其他领域的应用范围。
基于此，发明人在利用植酸和缓冲溶液改善牛血清蛋白热稳定的基础上，开发了一种同样利用植酸和缓冲溶液，来热诱导牛血清蛋白产生透明蛋白胶体的方法。相比于前述改善牛血清蛋白热稳定的方法，在制备透明蛋白胶体的时，更适合蛋白浓度达到100~300mg/ml的蛋白溶液，蛋白浓度过低或过高都难以形成稳定的胶体。
进一步地，经过发明人大量的创造性劳动发现，要形成稳定的透明蛋白胶体，牛血清蛋白与植酸的质量比为1：0.05~0.25。如果植酸的用量过少，只会形成不透明的蛋白的胶体；而如果植酸的用量过多，则胶体难以稳定存在，最终出现浑浊甚至沉淀。
可选地，在制备透明蛋白胶体时，缓冲溶液的浓度为30~100 mM，缓冲溶液的pH为7.2~7.6。缓冲溶液包括Tris-HCl缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液和PBS缓冲液中的至少一种；优选地，缓冲溶液为Tris-HCl缓冲液。同样地，具体缓冲溶液的种类，可根据透明蛋白胶体的应用环境进行选择。在制备透明蛋白胶体时，只需要保证缓冲溶液的pH值范围即可。
进一步地，蛋白溶液与植酸混合后需要经过加热才能形成透明蛋白胶体，加热的温度为80~100℃，加热的时间为10~30 min。加热完成后冷却至室温，即可得到稳定的透明蛋白胶体。加热的温度不宜过高，加热时间不宜过长，否则牛血清蛋白有进一步变形沉淀的可能，从而难以得到透明蛋白胶体。同时，加热的温度过低，加热时间过短，则会导致牛血清蛋白未能形成稳定的胶体结构，冷却至室温后重新变回溶液形态。
本发明实施例还提供了一种透明蛋白胶体，其由上述透明蛋白胶体的制备方法制备得到。该透明蛋白胶体的原料易得，生成条件简单，本身无色透明，在食品等领域具有较佳的应用潜力。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种改善牛血清蛋白热稳定性的方法，其包括：
S1. 将牛血清蛋白溶于50 mM pH-7.0的Tris-HCl缓冲液中，配制浓度为1 mg/ml的样品溶液。
S2. 将蛋白溶液与植酸混合。其中，牛血清蛋白和植酸的质量比为1:0.4。
实施例2~4
实施例2~4提供了一种改善牛血清蛋白热稳定性的方法，其具体操作方法与实施例1类似，区别在于牛血清蛋白和植酸的质量比分别为1:0.6、1:1、1:2。
实施例5~7
实施例5~7提供了一种改善牛血清蛋白热稳定性的方法，其具体操作方法与实施例1类似，区别在于蛋白溶液的浓度分别为2 mg/ml、5 mg/ml、10 mg/ml。
实施例8
本实施例提供了一种透明蛋白胶体的制备方法，其包括：
S1. 将牛血清蛋白溶于50 mM pH-7.4的Tris-HCl缓冲液中，配制浓度为120 mg/ml的样品溶液。
S2. 将蛋白溶液与植酸混合，加热至90℃，维持15 min，取出放入冰浴中冷却。其中，牛血清蛋白和植酸的质量比为6:1。
得到的透明蛋白胶体如图1所示。图1中左侧为与本实施例相同条件下，不加植酸，由蛋白溶液加热后直接得到的不透明蛋白胶体。右侧为本实施例得到的透明蛋白胶体。
实施例9
本实施例提供了一种透明蛋白胶体的制备方法，其包括：
S1. 将牛血清蛋白溶于50 mM pH-7.4的Tris-HCl缓冲液中，配制浓度为120 mg/ml的样品溶液。
S2. 将蛋白溶液与植酸混合，加热至90℃，维持15 min，取出放入冰浴中冷却。其中，牛血清蛋白和植酸的质量比为12:1。
对比例1~3
对比例1~3提供了一种改善牛血清蛋白热稳定性的方法，其操作方法与实施例基本类似，区别在于，牛血清蛋白和植酸的质量比分别为1:0.1、1:0.2、1:0.3。
试验例1
采用实施例1~4和对比例1~3所提供的一种改善牛血清蛋白热稳定性的方法，并以未添加植酸的由牛血清蛋白溶液作为空白例，由室温开始逐步升温至100℃，每间隔10℃加热10 min，冷却后拍照，照片如图2所示（图中，BSA为牛血清蛋白，PA为植酸）。随后，于4℃下，以5000rpm的转速离心30 min，取上清液加1ml Tris-HCl缓冲液，再取1 ml稀释4倍，采用Lowry法测定上清液中蛋白质的含量。结果如图3所示。
如图2所示，空白例的牛血清蛋白溶液在加热到70℃时开始浑浊，80℃时大量出现沉淀。对比例1~2在加热到70℃时开始浑浊并出现沉淀，对比例3在加热到60℃时开始浑浊并出现沉淀。可见，在添加植酸量过少的情况下，不仅没能起到改善热稳定性的效果，反而导致了沉淀的提前出现。而实施例1~4一直升温至100℃都没有明显的浑浊现象，表明本发明实施例的方法对于蛋白热稳定性的改善有效。
此外，如图3所示，本发明实施例1~4的蛋白质溶解性均在50%以上，随着植酸含量的增加，蛋白质溶解性还有进一步提高，在牛血清蛋白：植酸为1：1的情况下，蛋白质溶解性在100℃范围内基本能达到100%。相比之下，对比例1~3以及空白例，在温度达到70℃以上时，蛋白溶解性急剧降低，连50%都不到，最差的甚至达到20%以下。可见，本发明实施例的方法对于蛋白热稳定性的改善效果较佳。
综上所述，本发明实施例提供了一种改善牛血清蛋白热稳定性的方法，其将牛血清蛋白溶解在缓冲溶剂中配置成一定浓度的蛋白溶液，再加入植酸来改善牛血清蛋白的稳定性。该方法的操作简单方便，原料廉价易得，经过其改善后的牛血清蛋白在高温下可稳定存在，基本不会因蛋白质变性而沉淀析出。
本发明实施例还提供了一种透明蛋白胶体及其制备方法，其同样是将牛血清蛋白溶解在缓冲溶剂中配置成特定浓度的蛋白溶液，再加入植酸以形成胶体。该制备方法的操作简单，条件温和，以牛血清蛋白为原料得到无色透明的蛋白胶体。该透明蛋白胶体无色透明的特性，使其在食品等领域具有较大的应用潜力。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种改善牛血清蛋白热稳定性的方法，其特征在于，包括：
将牛血清蛋白与缓冲溶液混合，制成浓度为1~10 mg/ml的蛋白溶液；
将所述蛋白溶液与植酸混合；
所述牛血清蛋白与所述植酸的质量比为1：0.4~2；
所述缓冲溶液的浓度为30~100 mM，所述缓冲溶液的pH为7.0~8.0。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲溶液包括Tris-HCl缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液和PBS缓冲液中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述缓冲溶液为Tris-HCl缓冲液。
4.一种透明蛋白胶体的制备方法，其特征在于，包括：
将牛血清蛋白与缓冲溶液混合，制成浓度为100~300 mg/ml的蛋白溶液；
将所述蛋白溶液与植酸混合，加热至80~100℃；
所述牛血清蛋白与所述植酸的质量比为1：0.05~0.25；
所述缓冲溶液的浓度为30~100 mM，所述缓冲溶液的pH为7.2~7.6。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲溶液包括Tris-HCl缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液和PBS缓冲液中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲溶液为Tris-HCl缓冲液。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述蛋白溶液与所述植酸混合后加热的时间为10~30 min。
8.一种透明蛋白胶体，其特征在于，由权利要求4~7任一项所述的透明蛋白胶体的制备方法制备得到。
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